CN117512070A - 在载体上生成探针的方法和样品中靶物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了在载体上生成探针的方法和样品中靶物质的检测方法。该方法包括以下步骤：将探针模板与固定于载体上的寡核苷酸杂交，延伸所述寡核苷酸得到具有不同空间条码段的探针；一次扩增探针形成探针簇；对探针的空间条码段进行测序；再次扩增探针簇；在探针上形成用于捕获靶物质分子的捕获段。本申请中，在测序确定空间条码后，尝试对探针簇进行了再次的扩增，借助载体上多余的寡核苷酸进行的再次扩增增加了探针的数量，使得样品中靶物质能够更容易“接触”到探针，而不需要依赖于更长距离的扩散，也改善了样品中靶物质的捕获在空间上不均匀的问题，提升了捕获效率。

Description

在载体上生成探针的方法和样品中靶物质的检测方法

技术领域

本发明属于空间组学领域，具体涉及在载体上生成探针的方法和样品中靶物质的检测方法。

背景技术

空间组学技术通过对组织转录组的原位表征，为细胞分型、细胞状态表征、细胞-细胞相互作用提供重要的生物信息支持，在神经科学、肿瘤微环境研究、免疫学、疾病标志物寻找等多个生物医学领域具有广泛应用。目前的空间组学技术主要由10XGenomics提供，其空间转录组学产品Visium Spatial Gene Expression可对FFPE切片和冰冻切片组织进行转录组的空间表征。然而，该技术利用DNA microarray的方法进行mRNA捕获芯片构建，在分辨率上有比较大的局限性。因此，有必要提供具有更高捕获效率的空间组学方法。

发明内容

本申请旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种在载体上生成探针的方法和样品中靶物质的检测方法，采用该方法在载体上生成的探针具有更高的密度，对mRNA的可接触性提高，可以更均匀高效捕获mRNA。

根据本申请的一个方面，提出了一种在载体上生成探针的方法，包括以下步骤：

将探针模板与固定于载体上的寡核苷酸杂交，延伸寡核苷酸得到具有不同空间条码段的探针；

一次扩增探针形成探针簇；

对探针的空间条码段进行测序；

再次扩增探针簇；

在探针上形成用于捕获靶物质的捕获段。

根据本申请实施例的方法，至少具有如下有益效果：

申请人发现，现有空间组学技术在构建捕获探针的过程中，通过空间条码段的测序确定载体上不同位置的探针簇所对应的空间条码时，为了正确识别特定空间条码的探针簇在载体上对应的位置，通常要求探针簇之间存在一定的间隙，但这也造成了探针簇在载体上的不连续分布，进而导致捕获的靶物质的来源在空间上分布的不均匀性。而在本申请中，在测序确定空间条码后，尝试对探针簇进行了再次的扩增，借助载体上多余的寡核苷酸进行的再次扩增增加了探针的数量，使得样品中靶物质能够更容易“接触”到探针，而不需要依赖于更长距离的扩散，也改善了样品中靶物质的捕获在空间上不均匀的问题，提升了捕获效率。

在本申请的一些实施方式中，再次扩增探针簇包括再次扩增探针簇使具有不同空间条码段的探针簇在载体上连续分布。

在本申请的一些实施方式中，捕获段通过连接酶形成于探针上。

在本申请的一些实施方式中，连接酶包含T4连接酶。

在本申请的一些实施方式中，捕获段包括多个连续的碱基T。

在本申请的一些实施方式中，连续的碱基T的个数为10～50个。

在本申请的一些实施方式中，碱基T中的至少一个被锁核酸修饰。

在本申请的一些实施方式中，碱基T中的至少两个、三个、四个、五个或者更多个被锁核酸修饰。

本申请的第二方面，提供一种载体，该载体采用前述的方法生成有探针。

在本申请的一些实施方式中，载体为固相载体。

在本申请的一些实施方式中，固相载体包括流动槽。

本申请的第三方面，提供一种样品中靶物质的检测方法，包括以下步骤：

按照前述的方法在载体上生成探针或提供前述的载体；

使样品与载体接触，探针通过捕获段特异性结合靶物质。

在本申请的一些实施方式中，还包括：

延伸探针，并得到包含空间条码段和靶物质的核酸分子；

根据核酸分子的空间条码段对靶物质进行定位。

在本申请的一些实施方式中，靶物质为mRNA或寡核苷酸。

在本申请的一些实施方式中，延伸探针，得到包含空间条码段和靶物质的核酸分子包括：逆转录延伸探针，得到包含空间条码段和靶物质逆转录序列的核酸分子。

在本申请的一些实施方式中，根据核酸分子的空间条码段对靶物质进行定位包括：将核酸分子从载体上分离，测序，根据空间条码段的序列确定靶物质的定位。

在本申请的一些实施方式中，将核酸分子从载体上分离可以是将双链核酸分子的双链从载体上分离，或者将双链核酸分子的合成链从载体上分离。因而，空间条码段的序列可以是其本身的对应序列或其互补序列。

在本申请的一些实施方式中，样品为组织切片。

在本申请的一些实施方式中，使样品与载体接触，探针通过捕获段特异性结合靶物质包括：使样品与载体接触，透化所述样品，使探针能够通过捕获段特异性结合样品中的靶物质。

附图说明

图1为本发明的实施例中在载体上生成探针的方法的示意图。其中，a为载体上固定有寡核苷酸，b为探针模板与寡核苷酸杂交，c为寡核苷酸延伸得到探针，d为变性移除探针模板，e为一次扩增，f为线性化，g为测序，h为洗去测序链脱磷酸化，i为再次扩增，j为再次扩增后的线性化，k为利用引导段通过连接酶在引物上连接捕获段，l为变性移除引导段。

图2为本申请中不进行再次扩增和再次扩增的比较的示意图。

图3是本申请中未形成捕获段的探针的结构示意图。

图4是本申请中靶物质的检测方法中探针捕获mRNA并进行测序的方法，其中，a为靶物质被捕获并通过逆转录在探针上生成的靶物质cDNA，b为以包含靶物质cDNA的探针为模板生成合成链，c为合成链变性洗脱后建库测序。

图5是本申请实施例2中mRNA捕获的空间分布热图。

图6是本申请实施例2中捕获基因数的空间分布热图。

图7是本申请实施例3中mRNA捕获的空间分布热图。

图8是本申请实施例3中捕获基因数的空间分布热图。

图9是本申请实施例4中mRNA捕获的空间分布热图。

图10是本申请对比例1中mRNA捕获的空间分布热图。

图11是Visium芯片对小鼠脑组织的捕获分子数热图。

图12是本申请实施例的芯片对小鼠脑组织的捕获分子数热图。

附图标记：载体100、第一接头101、第二接头102、探针模板200、第一接头模板201、第二接头模板202、中间模板210、第一探针300、第二互补接头302、连接序列303、捕获序列304、靶物质cDNA段305、第一探针中间部分310、第一接头测序引物311、空间条码段312、空间条码段测序引物313、第二探针320、第二接头对应序列401、连接对应序列402、捕获对应序列403、靶物质500、合成链600、第一建库引物701、第二建库引物702。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。在以下描述中，虽然在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于流程图中的顺序执行所示出或描述的步骤。

除非另有定义，本申请中所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述本申请实施例的目的，不是旨在限制本申请。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

本申请提出一种在载体上生成探针的方法，其中，载体包含能够固定寡核苷酸的刚性件，刚性件的材料可以选自聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚二甲基硅氧烷PDMS、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET、聚碳酸酯PC、聚苯乙烯PS、环氧树脂、玻璃、硅片等材料中的至少一种。寡核苷酸中核苷酸的数目在2～100个，进一步在2～50个，2～30个，例如可以是2、3、4、5、8、10、15、20、25、30个。而寡核苷酸固定于刚性件上的方式包括但不限于物理吸附(例如通过极性相互作用、疏水作用、静电作用等其中至少一种非共价形式)、共价偶联(例如氨基与羧基反应，使用诸如EDC、CMC、ATPES、戊二醛等作为偶联剂)、巯基偶联、点击化学反应、糖基固定(例如如高碘酸钠氧化法、亚硼酸钠连接法)、Staudinger反应、Diels-Alder反应、自然化学连接、亲和作用(例如亲和素-生物素)等其中的至少一种。

参考图1，在本申请的在载体上生成探针的方法中，载体100上预先固定有寡核苷酸101，将探针模板200与寡核苷酸101杂交，寡核苷酸101延伸得到第一探针300。参考图3，第一探针300具有空间条码段312，空间条码段312是指第一探针300上用于标识第一探针300在载体100上所处位置的核苷酸片段，其可以是连续的或不连续的，长度通常在6个核苷酸以上。在其中一些具体的实施方式中，空间条码段312的长度为6～30个核苷酸，进一步可以在6～25个核苷酸、6～20个核苷酸，例如可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸。位于载体100上不同位置的第一探针300具有不同的空间条码段312，而具有相同空间条码段312的第一探针300视为在载体100上处于同一位置，以此来区别载体100的不同位置，依据不同位置的第一探针300之间的距离，构成第一探针300的分辨率。

当寡核苷酸101延伸形成第一探针300后，通过扩增在载体100上形成探针簇。此时，需要获取载体100上不同第一探针300对应的位置，因此，对第一探针300的空间条码段312进行测序，载体100上不同位置的第一探针300具有不同的空间条码段312，因此，可以通过对特定位置的第一探针300进行测序来鉴定该位置的空间条码段312的序列，以此将各个探针簇的位置与其空间条码段312的特定序列两两关联。

申请人发现，由于此过程中，为了正确识别不同位置的探针簇的空间条码段，不同的探针簇之间需要保证一定的间隙，这样，不同的探针簇在载体上不连续分布。为此，在本申请中，在对空间条码段的测序完成后，重新进行再次扩增，以此来增加相同区域内探针的数量，使得后续检测时，样品中的靶物质能够更容易地“接触”到探针，而不需要依赖于靶物质在载体上更长距离的扩散。

参考图2，为本申请实施例中的方法与现有方法差别的原理示意图，A为原有的载体上经一次扩增而形成的a～e共5个探针簇，通过一次扩增形成探针簇实现在对空间条码段测序时探针信号的放大以区别于背景荧光，而为了测序时可以正确识别这5个不同的探针簇所在的位置，彼此之间相互间隔；这样，探针簇之间存在很多的寡核苷酸位点并未形成有探针，这些区域内样品中的靶物质可能无法结合到探针上从而造成空白，或者需要扩散更长距离才能够被探针所捕获，这就使得靶物质的捕获在空间上存在不均匀的问题，捕获效率也偏低。而B为本申请实施例中经过再次扩增后在载体上分布的a～e共5个探针簇，经过再次扩增，各个探针簇中探针的数量增加，样品中的靶物质也更容易接触到探针进而更容易被捕获，无论是在空间上的分布或者捕获靶物质的效率也都大大增加。

在其中一些具体的实施方式中，再次扩增使具有不同空间条码段的探针簇在载体上连续分布。其中，连续分布通常是指相邻的具有不同空间条码段的探针簇之间的适于形成探针的寡核苷酸位点上仅存在较少的寡核苷酸位点未形成探针，例如在这些适于形成探针的寡核苷酸位点中有最多1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/12、1/15、1/20、1/30、1/40、1/50、1/100、1/150、1/200的位点未形成探针，而其它位点在探针模板的杂交、一次扩增或再次扩增的过程中都形成了探针，进一步较为理想的状态可以是具有不同空间条码段的探针簇之间适于形成探针的寡核苷酸位点全部形成探针，相邻的探针簇彼此邻接。这样，尽可能多的探针使得样品中的靶物质能够最大程度的被捕获，捕获效率、分辨率等也都会有进一步的提高。

再次扩增完成后，在探针上形成用于捕获靶物质的捕获段。其中，捕获段是指能够特异性结合靶物质的核苷酸片段。通过对捕获段的核苷酸片段的具体设计，可以特异性结合靶物质。

在其中一些具体的实施方式中，捕获段由核苷酸片段经连接酶作用连接到探针上而形成。相比于采用酶切法将捕获段从原有的探针上暴露出来，采用连接酶将其接入探针可以突破酶切效率的限制。对于没有酶切成功的探针而言，虽然仍然可以利用捕获段与靶物质的特异性结合而将其捕获，但捕获的靶物质由于无法成功进行逆转录形成包含空间条码段和靶物质的核酸分子，而丧失了此部分靶物质的信息，使得最终获取的靶物质及其空间分布的信息有所缺失。但对于其中一些采用连接酶的方式连接捕获段的探针而言，如果没有连接上捕获段，靶物质虽然无法被此探针所捕获，但能够扩散到邻近的其它探针上捕获，不会直接造成靶物质的损失，其信息缺失的可能性大大减少。其中，连接酶可以是任选的能够将捕获段连接到探针上的连接酶，例如可以是借助ATP或NAD催化核苷酸片段连接到探针上形成捕获段的连接酶，来源不限于原核生物、真核生物、病毒等，可以是天然的连接酶，或经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的连接酶，具体包括但不限于T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶等。

对于捕获段所要捕获的靶物质，可以是任选的生物大分子、小分子、离子、生物体等，例如可以是蛋白质、多肽、核酸、核苷酸、多糖、脂质、脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、类固醇、阴离子、阳离子、病毒、细菌、细胞等其中至少一种。在其中一些具体的实施方式中，靶物质为核酸片段，进一步的，靶物质为RNA片段或DNA片段，更进一步为mRNA。由于mRNA通常具有polyA尾，因此可以通过在捕获段中设计多个连续的碱基T来实现与mRNA的特异性结合。可以理解的是，靶物质也可以是寡核苷酸，其可以作为标签与其他小分子或大分子连接，例如与抗体连接形成抗体与寡核苷酸偶联物，或本领域所知的其他作为标签连接的方式。在其中一些实施方式中，不同的寡核苷酸作为标签分别与不同的抗体结合，从而以寡核苷酸标签获取对应的抗体信息。在其中一些具体的实施方式中，捕获段中连续的碱基T的个数为10～50个，进一步可以是10～40个，10～30个，20～30个。在其中一些具体的实施方式中，连续的碱基T中引入至少一个锁核酸修饰T，以提高捕获段在对mRNA进行捕获时的亲和力，进一步的，碱基T中引入至少两个锁核酸修饰T，至少三个锁核酸修饰的碱基T，从而显著提高其对mRNA捕获的亲和力。

在其中一些具体的实施方式中，参考图1，固定于载体100上的寡核苷酸包括能够与探针模板200进行杂交的第一接头101，还包括另一部分第二接头102。在其中一些实施方式中，在第二接头102上还包括至少一个能够产生断裂的位点，例如可以是特异性的酶切位点，具体可以是在能够特定酶作用下发生酶切的经修饰的核苷酸，如i8oxoG和ideoxyU等，以此实现探针的线性化。在其中一些具体的实施方式中，在第二接头102上还包括两个能够产生断裂的位点，以此在不同的酶作用下分别实现线性化。这样可以在一次扩增后，通过其中一个酶切位点切除扩增产物双链中的一条单链，并在再次扩增后，通过另一个酶切位点切除扩增产物双链中的一条单链。

在其中一些具体的实施方式中，一次扩增为桥式扩增，探针模板200上分别具有第一接头模板201和第二互补接头模板202，第一接头模板201和第二互补接头模板202分别包含与第一接头101和第二互补接头102互补的序列，利用第一接头101和第二互补接头102实现探针的桥式扩增，得到第一探针300和第二探针320。在其中一些实施方式中，第一接头模板201和第二接头模板202之间还包括中间模板210，中间模板210包括对应空间条码段的模板序列。

在其中一些具体的实施方式中，参考图1，桥式扩增结束后，通过线性化，洗去第二接头102上的第二探针320，保留形成于第一接头101上的第一探针300，对其中的空间条码段进行测序。在其中一些实施方式中，对空间条码段的测序方式为桑格测序、NGS测序、纳米孔测序等方式，优选采用NGS测序的方式。在其中一些实施方式中，在测序结束后，洗去测序链，用载体100上剩余的其余的寡核苷酸进行再次扩增。在再次扩增结束后，通过类似的线性化处理，洗去第二接头102上再次扩增出的第二探针320，而保留第一接头101上的第一探针300，从而在大多数的第一接头101上都形成了第一探针300，进而这些第一接头101作为适于形成探针的寡核苷酸位点，有少量的位点未形成探针，而其它第一接头101的位点在探针模板的杂交、一次扩增或再次扩增的过程中都形成了探针。

在其中一些具体的实施方式中，捕获段通过引导段及连接酶在探针上形成，其中引导段包括与第二互补接头302至少部分互补的第二接头对应序列401(例如可以是与第二互补接头302中15～20个碱基互补)、连接对应序列402。在其中一些实施方式中，通过引导段上额外的与连接对应序列402相邻的捕获对应序列403，最终在探针上合成包含捕获序列304在内的捕获段。而在另一些优选的方式中，为减少错配，引导段中仅包含第二接头互补序列401以及连接对应序列402，利用第二接头互补序列401与第二互补接头302的互补配对将引导段杂交到探针上；同时捕获段包含连接序列303和捕获序列304，通过连接序列303与引导段的连接对应序列402的互补配对与引导段杂交；这样探针、引导段和捕获段两两杂交后，由连接酶通过连接序列303与第二互补接头302的连接将捕获序列304引入到探针上。在其中一些实施方式中，捕获序列304包括多个连续的碱基T，例如T30VN。在其中一些实施方式中，在探针上引入捕获段后，还包括洗去引导段，形成携带有捕获段的捕获探针。

因此，在上述的一些具体的实施方式中，第一探针包括第一接头、第一探针中间部分以及第二互补接头，而第一探针中间部分包括第一接头测序引物、空间条码段以及空间条码段测序引物。第一接头与探针模板中的第一接头模板互补，第一接头中间部分与探针模板的中间模板互补，第二互补接头与探针模板中的第二互补接头模板互补，同时第二互补接头与第二接头相同。其中，互补和/或相同是指其序列至少50％的碱基在其对应位置互补和/或相同，进一步为60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的碱基在其对应位置互补和/或相同。

在其中一些具体的实施方式中，参考图3，形成的探针包括第一接头101、第一接头测序引物311、空间条码段312、空间条码段测序引物313，以及第二互补接头302、连接序列303、捕获序列304。其中，空间条码段测序引物313用于在对空间条码段312进行测序时所用的对应引物，第一接头测序引物311用于在对捕获后形成的全长进行测序时所用的对应引物。

在其中一些具体的实施方式中，参考图1并结合图2，在载体上生成探针的方法包括以下步骤：

将探针模板200与固定于载体100上的包含第一接头101在内的寡核苷酸杂交，延伸寡核苷酸得到具有不同空间条码段312的第一探针300(图1中a～d)；

以桥式扩增的方式一次扩增探针形成分别包含第一接头101和第二接头102形成的第一探针300和第二探针320的探针簇(图1中的e)；

除去第二接头102上的第二探针320，对第一接头101上第一探针300的空间条码段312进行测序(图1中f～h)；

再次扩增探针簇，再次除去第二接头102上的第二探针320(图1中i和j)；

通过连接酶在第一探针300上连接上用于捕获靶物质的捕获段，得到捕获探针(图1中k和l)。

本申请实施例中还包括提供通过上述方法在载体上生成有探针的载体，通过这种方式制备得到的载体在表面上探针之间的间隙大大减小，捕获时空间上的均匀性更好。探针的密度、靶物质与探针的可接触性也更高，捕获效率得到了提升。

在其中一些具体的实施方式中，载体为固相载体，进一步包含流动槽。

本申请实施例还包括提供样品中靶物质的检测方法，该检测方法包括采用前述的方法在载体上生成探针。在生成探针后，使样品与载体接触，探针通过捕获段特异性结合靶物质。

空间组学为了对样品进行原位表征，需要对待测的靶物质进行定位，确定其来源于样品中的哪一位置。因此，本申请中通过上述的检测方法，在靶物质上添加能够标记位置来源的空间条码段，从而实现定位功能。由于载体上捕获探针的密度以及与靶物质的可接触性都有明显提高，因而捕获效率等都有所改善。

在其中一些具体的实施方式中，样品例如可以是组织样品，如组织切片等样品，具体可以是来源于动物细胞或植物细胞所形成的组织样品，例如可以是来源于运动系统、神经系统、内分泌系统、循环系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统等器官的组织样品。组织样品的组织可以是活体组织，也可以是经体外培养的活组织。可以理解的是，组织同样可以是由一种或多种组织或细胞形成的类器官的组织，例如是正常组织或肿瘤组织来源的类器官、诱导性多能干细胞来源的类器官等。同时，类器官的类型例如是眼类器官、脑类器官、心脏类器官、肺类器官、肝类器官、胰腺类器官、肾类器官、上皮类器官等其中至少一种。

为了方便探针对靶物质的捕获，通过透化的方法将样品中的靶物质释放。具体包括使样品与载体接触，透化样品使探针能够通过捕获段特异性结合样品中的靶物质。透化样品的方式可以是化学处理、热处理、超声处理、酶处理、低渗处理等方式，以此将靶物质从样品中释放。

在其中一些具体的实施方式中，靶物质为核酸或更进一步为mRNA，因而可以通过延伸探针的方式，将mRNA逆转录为cDNA，得到包含空间条码段和靶物质cDNA的核酸分子；根据核酸分子的空间条码段对靶物质进行定位。

在其中一些具体的实施方式中，根据核酸分子的空间条码段对靶物质进行定位包括：将核酸分子从载体上分离，对核酸分子进行测序，根据空间条码段的序列确定靶物质的定位。

在其中一些具体的实施方式中，样品中靶物质的检测方法包括以下步骤：

按照前述的方法在载体上生成探针；

提供样品，贴于载体上并固定；

对样品进行透化处理，从样品中释放靶物质mRNA，探针通过捕获段特异性结合靶物质mRNA；

通过逆转录在探针上延伸出对应靶物质mRNA的cDNA段，得到包含空间条码段和靶物质信息cDNA段的探针链；

将组织消化；

洗去捕获的靶物质mRNA，以探针链为模板，合成与其互补的合成链，并将其变性洗脱，测序，根据空间条码段对应的序列对靶物质mRNA来源于样品中的位置将其定位。

参考图4并结合图1，在载体100上生成第一探针，并捕获靶物质500后，通过逆转录在探针链上形成靶物质cDNA段305，随后变性去除靶物质500后，重新以第一探针的探针链为模板来合成合成链600，再次变性获取游离的合成链600后，通过第一测序引物701、第二测序引物702进行建库、测序，得到靶物质以及其对用的空间条码段的序列。根据空间条码段对应的序列得到其在载体100上对应的位置完成对靶物质的定位。

实施例1

本实施例涉及一种微流控芯片，在芯片上固定P7(5'DBCO/iSp18//iSp18/TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT，SEQ ID No.1)和P9(5'DBCO/iSp18//iSp18/TTTTTTTTTTAAT/i8oxoG/ATACGGCGACCACCGAGA/ideoxyU/CTACAC，SEQ IDNo.2)分别作为第一接头和第二接头，其中P9中引入了i8oxoG和ideoxyU两个核苷酸，作为USER(Uracil-Specific Excision Reagent)酶和fpg(Formamidopyrimidine Glycosylase)酶的酶切位点。这里采用重新设计的P9序列，避免在后续建库测序过程中与mRNA捕获文库中的P5引发冲突。

本实施例还涉及一组探针模板文库，其中的探针包括测序接头序列1、测序引物序列、空间条码段序列、空间条码段测序引物序列、测序接头序列2。

其中，测序接头序列1与P7序列反向互补，测序接头序列2与P9反向互补。测序引物序列可以参考具体的测序平台或自行设计，空间条码段序列为20～30个随机碱基序列，以此在载体上可以形成10⁸左右甚至更大量的空间编码进行位置区分，空间条码段测序引物序列根据空间条码段序列自行设计。

本实施例还提供一种在载体上生成探针的方法，参考标准双端测序程序，包括以下步骤：

(1)捕获探针种子文库杂交，桥式扩增：

在芯片上，杂交探针模板文库，延伸得到探针，并进行桥式扩增，使芯片上长出一个个探针簇，每个探针簇包含多条序列一致的探针，每个探针簇有唯一的空间条码段。

(2)空间条码段测序：

引物杂交，对空间编码序列进行测序，并根据图像对每个空间编码进行空间定位，获得空间坐标。

(3)再次桥式扩增及线性化：

用变性试剂洗去空间编码测序的DNA链，用清洗试剂清洗。用PNK酶进行末端去磷酸化后，进行二次桥式扩增，使芯片上长满mRNA捕获探针，形成彼此相接的连续探针簇。接着用fpg酶进行线性化，使芯片上只留下测序接头1上的DNA链。

(4)mRNA捕获序列连接：

利用包括测序接头2互补序列、连接对应序列以及捕获对应序列(A30BN)的引导段，通过T4连接酶，在探针上连接上mRNA捕获探针(包括连接序列和捕获序列T30VN)，反应体系如下：2 U/μL T4连接酶，1μM引导段(图1中第二接头对应序列401、连接对应序列402)，1μM mRNA捕获探针(图1中连接序列303、捕获序列304)，1X连接酶缓冲液，0.5％PEG2000，37℃，过夜反应。之后用变性试剂洗去引导段，用清洗试剂清洗三次。

实施例2

本实施例提供一种靶核酸的检测方法，该检测方法包括以下步骤：

(1)组织切片、贴片：

将小鼠肝组织在冷冻切片机上切出10μm厚切片，贴在实施例1中制备得到的带有mRNA捕获探针的芯片上。

(2)组织固定：

将甲醇预冷至-20℃，将带有组织的芯片在冰甲醇中固定30分钟。用超纯水洗涤三次。

(3)组织透化，mRNA释放：

用胶原酶(Collagenase I，0.2U/μL，HBSS缓冲液中，37℃，20分钟)对组织进行透化处理。用0.1×SSC进行洗涤。接着用胃蛋白酶(pepsin，1mg/mL溶解在0.1 MHCl中)进行处理(37℃，10分钟)。接着用0.1×SSC洗涤。

(4)逆转录：

加入逆转录混合试剂，包括：

2μL Maxima H-RTase，

1μL RNase inhibitor，

8μL 5X Maxima 5x RT Buffer，

4μL 10 mM dNTP mix，

8μL 20％Ficoll PM-400，

4 mL Actinomycin D，

13μL Nuclease free water；

并在42℃下过夜反应。反应结束后，弃去反应液，加入Exonuclease I(1U ExoIin50μL 1×ExoI buffer)，在37℃下反应45分钟。

(5)组织消化：

将组织在1×digestion buffer中进行消化，在37℃下反应45分钟。用0.1×SSC洗涤三次。

(6)洗去mRNA链：

用0.1 M NaOH溶液将mRNA链洗去(3次，每次5分钟)，用0.1 mM Tris(pH＝7.5)进行中和，并用超纯水洗涤三次。

(7)与cDNA互补的合成链合成：

以含有cDNA的捕获探针为模板链，加入第二链合成混合液(3μL KlenowFragment，3μL NEB buffer，3μL 10 mM dNTP mix，3μL 100μM带9个随机核苷酸序列的引物(TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN，SEQ ID No.3)18μLNuclease-free water)，在37℃下反应2小时，合成与模板链互补的合成链。用超纯水洗涤3次。

(8)合成链洗脱：

用0.1 M NaOH将合成链从芯片上洗脱，并用0.1 M Tris(pH＝7.5)进行中和。

(9)建库及测序：

合成链产物通过1.8×AMPure XP磁珠进行纯化。使用Kapa Hifi HotstartReadymix进行PCR扩增，体系中包含引物：

TCTTTCCCTACACGACGCTC(SEQ ID No.4)

TCAGACGTGTGCTCTTCCGA(SEQ ID No.5)，浓度为2μM。

PCR程序设置为：95℃3分钟，15个循环的(95℃30秒，60℃1分钟，72℃1分钟)，72℃2分钟，4度最终温度。PCR产物用1.2×AMPure XP磁珠纯化。

产物使用Kapa Hifi Hotstart Readymix进行第二次扩增，体系中包含引物：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC(SEQ ID No.6)

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA(SEQ ID No.7)，浓度各1μM。

PCR程序设置为：95℃3分钟，8个循环的(95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒)，72℃2分钟，4度最终温度。产物用0.8X AMPure XP磁珠进行纯化。文库最终进行测序(双端测序，PE100-150)。

根据测序结果构建小鼠肝脏空间转录组图谱，结果如图5和6所示，其中图5展示了mRNA捕获的空间分布热图，图6展示了捕获基因数的空间分布热图。

实施例3

将小鼠睾丸组织在冷冻切片机上切出合适大小的组织切片，并覆贴在实施例1中所得到的mRNA捕获芯片上。通过类似实施例2的组织处理过程，对小鼠睾丸组织转录组进行建库、测序。根据测序结果构建小鼠睾丸空间转录组图谱，结果如图7和8所示，其中图7展示了mRNA捕获的空间分布热图，图8展示了捕获基因数的空间分布热图。

实施例4

本实施例提供一种检测方法，与实施例3的区别在于，捕获段的poly-T序列中不含锁核酸修饰，均为天然核苷酸。捕获mRNA分子的分布热图如图9所示，与实施例3的图7相比，两者的捕获数量存在明显差别，表明在捕获段的poly-T序列中引进锁核酸修饰能够有效提升mRNA的捕获效率。

对比例1

本对比例提供一种检测方法，与实施例3的区别在于，在生成探针时，省去了再次扩增的步骤。捕获mRNA分子的分布热图如图10所示，与实施例3的图7相比，两者的捕获数量存在明显差别，表明再次扩增后，芯片能够捕获到更多的mRNA分子，有更高的捕获效率。

对比例2

将小鼠脑组织在冷冻切片机上切出合适大小的组织切片，采用Visium芯片按照其工作流程进行操作，构建小鼠脑组织空间转录组图谱。

同时，将类似的组织切片覆贴在实施例1中所得到的mRNA捕获芯片上，通过类似实施例2的实验过程，对小鼠脑组织进行空间转录组构建。

结果如图11和12所示，其中，图11展示了Visium芯片对小鼠脑组织的捕获分子数热图，图12展示了本发明对小鼠脑组织的捕获分子数热图。由mRNA分子捕获热图观察可得，采用本申请所提供的芯片和相应的方法，在单位面积内捕获的mRNA分子数要显著高于Visium芯片。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.在载体上生成探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将探针模板与固定于载体上的寡核苷酸杂交，延伸所述寡核苷酸得到具有不同空间条码段的探针；

一次扩增所述探针形成探针簇；

对所述探针的所述空间条码段进行测序；

再次扩增所述探针簇；

在所述探针上形成用于捕获靶物质的捕获段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述再次扩增所述探针簇包括再次扩增所述探针簇使具有不同空间条码段的探针簇在所述载体上连续分布。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获段通过连接酶形成于所述探针上；

优选地，所述连接酶包含T4连接酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获段包括多个连续的碱基T；

优选地，所述连续的碱基T的个数为10～50个。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碱基T中的至少一个被锁核酸修饰；

优选地，所述碱基T中的至少两个被锁核酸修饰。

6.载体，其特征在于，所述载体采用权利要求1至5任一项所述的方法生成有探针；

优选地，所述载体为固相载体；

优选地，所述固相载体包含流动槽。

7.样品中靶物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

按照权利要求1至5任一项所述的方法在载体上生成探针或提供权利要求6所述的载体；

使所述样品与所述载体接触，探针通过捕获段特异性结合所述靶物质；

优选地，还包括：

延伸所述探针，并得到包含空间条码段和靶物质的核酸分子；

根据所述核酸分子的空间条码段对所述靶物质进行定位。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述靶物质为mRNA或寡核苷酸，延伸所述探针，得到包含空间条码段和靶物质的核酸分子包括：逆转录延伸所述探针，得到包含空间条码段和靶物质逆转录序列的核酸分子。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，根据所述核酸分子的空间条码段对所述靶物质进行定位包括：

将所述核酸分子从所述载体上分离，对所述核酸分子进行测序，根据所述空间条码段的序列确定所述靶物质的定位。

10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述样品为组织切片；

优选地，使所述样品与所述载体接触，探针通过捕获段特异性结合所述靶物质包括：使所述样品与所述载体接触，透化所述样品，使探针能够通过捕获段特异性结合所述样品中的所述靶物质。