KR20210084352A

KR20210084352A - 핵산의 비특이 결합 억제제, 하이브리디제이션용 시약, 및 핵산의 하이브리디제이션 방법

Info

Publication number: KR20210084352A
Application number: KR1020207037795A
Authority: KR
Inventors: 타카시 세리자와
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2018-10-30
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2021-07-07
Also published as: EP3875586A1; BR112021007527A2; CA3117823A1; CN112955552A; JPWO2020090822A1; US20210395802A1; JP7415284B2; CN112955552B; EP3875586A4; WO2020090822A1

Abstract

하이브리디제이션에 의해 표적 핵산을 검출할 때에 표적 핵산과, 그 유사 서열 상보쇄를 갖는 핵산 사이의 크로스 하이브리디제이션을 효과적으로 억제하고, 또한 제조 로트 간에서의 품질이 안정된 비특이 결합 억제제 및 그것을 사용한 핵산의 하이브리디제이션 방법이 개시되어 있다. 핵산의 비특이 결합 억제제는 염기 길이가 2~11염기이며, 전체 염기 서열 중의 구아닌 염기 또는 메틸화구아닌 염기의 함유율이 70% 이상인 핵산을 포함한다.

Description

핵산의 비특이 결합 억제제, 하이브리디제이션용 시약, 및 핵산의 하이브리디제이션 방법

본 발명은 핵산 하이브리디제이션에 있어서의 비특이 결합을 억제하기 위한 억제제, 상기 억제제를 포함하는 하이브리디제이션용 시약, 상기 억제제를 사용하는 핵산의 하이브리디제이션 방법, 상기 하이브리디제이션 공정을 포함하는 표적 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.

데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)은 생체 정보를 담당하는 핵산이며, DNA는 아데닌(dA), 티민(dT), 시토신(dC), 및 구아닌(dG)을, RNA는 아데닌(A), 우라실(U), 시토신(C), 및 구아닌(G)을 염기로서 포함한다. DNA 및 RNA는 각각 상보 서열인 상보쇄와 특이적으로 결합하는 성질을 갖고, 그 결합 친화성 및 특이성은 A-T(또는 U) 및 C-G의 2종류의 특이적 결합 양식의 조합에 의해 실현된다. 상보쇄와의 결합 친화성 및 특이성은 서열에 포함되는 각 염기종의 서열 순서, 구성 비율, 및 결합쇄 길이 또는 염기 서열에 의존한 고차 구조 등에 의해 규정되지만, 또한 외부 요인으로서 반응액의 온도 및 반응액 중의 이온 강도, 또한 포름아미드 등의 핵산 변성제의 존재 유무에 의해도 조절된다. 이 상보쇄와의 핵산 결합은 하이브리디제이션이라고 불린다.

최근, 각종 생체 시료에 있어서 특정 핵산을 표적 핵산으로 해서 그 발현량을 측정함으로써 질환의 발증 예측이나 진단을 행하는 연구가 이루어져 있다. 예를 들면, 인간에게는 총 유전자가 26000 이상이나 존재한다고 보고되어 있다. 또한, 최근에는 비번역 RNA로서 단쇄 핵산인 마이크로 RNA도 주목받고 있으며, 인간에게는 2600종 이상의 마이크로 RNA가 존재한다고 보고되어 있다. 특히, 마이크로 RNA는 1종류의 서열이 최대 100 종류 초과의 유전자 발현량을 조절하는 등 인간 등의 고등 생물의 유전자 발현 조절에 있어서 Fine-Tuning을 담당하는 중요한 플레이어이다, 라는 인식이 높아져 있으며, 질환과의 관련이 정력적으로 연구되고 있다. 이들 방대한 후보 유전자 중으로부터 질환에 관련되는 유전자를 탐색하는 것은 용이하지는 않다. 그 목적을 위해서 다용되어 있는 기술로서 핵산 어레이(DNA 마이크로어레이 또는 DNA칩이라고도 불린다)를 사용한 망라적 유전자 발현 탐색을 들 수 있다.

핵산 어레이는 지지체가 되는 기판 상에 다수의 표적 핵산에 대한 상보적 염기 서열을 갖는 핵산 프로브가 고정화되어 있으며, 생체 시료로부터 추출된 시료 중의 표적 핵산을 미리 형광 물질 등의 표식 분자로 표식해 두고, 핵산 어레이에 어플라이하여 표적 핵산과 핵산 프로브 사이에서 하이브리디제이션시킴으로써 표적 핵산의 발현량을 형성된 핵산 복합체의 형광 시그널로서 검출할 수 있다. 핵산 어레이에 있어서 표적 핵산과 상보쇄 간의 결합 친화성 및 특이성을 조절하는 방법으로서 상술한 바와 같이 하이브리디제이션의 반응 온도의 변경이나 하이브리디제이션 용액의 조성 변경이 행해진다. 특히, 하이브리디제이션 용액의 조성은 당업자마다 최적화되어 있으며, 핵산 어레이에 있어서 특이적인 핵산 검출을 행하기 위해서는 필수적인 기술이다.

그러나 일반적인 핵산 어레이는 유리 기판 상에 상보쇄 프로브가 고정화되어 있지만 유리는 핵산을 그 서열 비특이적으로 흡착 결합하는 성질을 갖는다. 그 때문에 유리 기판 상에 표적 핵산이 흡착되어 버리고, 그 결과 백그라운드 시그널의 증가를 초래한다. 표적 핵산의 시그널값이 낮을 경우에는 고백그라운드 때문에 검출이 곤란해진다.

또한, 핵산 어레이 등을 사용해서 표적 핵산을 검출하고자 할 경우 표적 핵산과 이것과 유사한 서열의 상보쇄를 갖는 핵산 사이에서 크로스 하이브리디제이션이 발생하는 경우가 있다. 그 경우 표적 핵산의 시그널값에 비해서 크로스 하이브리다이즈한 표적 핵산의 시그널값이 상대적으로 높아져 표적 핵산의 발현량의 검출이 곤란해질 우려가 있다.

또한, 특히 게놈 서열의 해석에 있어서 게놈 중에는 특정 서열이 고도로 반복된 리피트 서열이 많이 포함되기 때문에 표적 핵산의 검출에 있어서 상기 표적 핵산의 리피트 서열이 표적 핵산에 대한 상보쇄를 갖는 핵산 프로브와 크로스 하이브리다이즈할 경우에는 측정값의 베이스 라인이 상승해서 표적 핵산을 검출하는 것이 곤란해진다.

이상과 같은 핵산 어레이 기판에 대한 비특이적인 흡착이나 표적 핵산과 유사한 서열의 상보쇄를 갖는 핵산의 크로스 하이브리디제이션을 억제하기 위해서 하이브리디제이션 용액에는 완충제, 염, 수화제, 핵산 변성제 등 외에 이들 핵산의 비특이 결합의 억제제(블로킹제)가 첨가된다. 예를 들면, 연어 정자 DNA는 가장 범용되는 비특이 결합 억제제 중 1개이다. 또한, 이 외에 Human Cot-1 DNA, 대장균 tRNA, PCR 증폭물(특허문헌 1), poly-dA(비특허문헌 1, 비특허문헌 2), 랜덤 올리고 등, 이들의 혼합물(특허문헌 2) 등이 핵산의 비특이 결합 억제제로서 하이브리디제이션 용액에 첨가하여 사용되어 있다.

일본 특허공표 2009-518004호 공보 일본 특허공개 2010-29174호 공보

Technical Note, "Implementation of DNA Microarray Hybridization Protocols, Translation of Manual Methods to Tecan Hybridization Station", [online], Tecan Japan Co., Ltd., [2018년 10월 22일 검색], 인터넷 <URL: http://www.tecan.co.jp/pdf/technote_hs.pdf> Pan SJ. 등, BMC Genomics, 2002년, 제3권, 35호, p.1-12

상기와 같은 종래 사용되어 있는 핵산의 비특이 결합 억제제 중 연어 정자 DNA는 연어 정소 유래의 DNA를 초음파 파쇄 또는 물리 전단 처리함으로써 단편화한 것이다. 제공자에 따라 상이하지만 통상 수 백bp~수 천bp의 분자량 분포를 갖고 있으며, 제조 로트에 의해 그 분자량 분포 등의 성상이 상이한 것이 알려져 있다. 또한, Human Cot-1 DNA는 인간 태반 유래의 DNA를 전단 처리함으로써 단편화한 것이며, 동일하게 생물 시료 유래인 점에서 제조 로트마다 분자량 분포 등의 성상은 상이하다. 또한, 대장균 tRNA는 대장균 파쇄물로부터 추출된 tRNA이지만 생물 시료 유래인 점에서 제조 로트 간에서 성상이 상이할 우려가 있다.

이상과 같이 생물 시료 유래의 비특이 결합 억제제를 사용해서 표적 핵산의 검출을 할 경우에는 제조 로트가 스위칭될 때마다 측정 결과도 영향을 받을 가능성이 있다. 그 때문에 복수의 제조 로트의 비특이 결합 억제제를 입수하여 비교 평가하고, 동등한 측정 결과가 얻어지는 특이적인 제조 로트를 특정하고, 또한 상기 제조 로트를 대량으로 확보할 필요가 있는 등 다대한 노력이 필요했다.

그것에 대해서 PCR 증폭물은 PCR 증폭에 의해, 랜덤 올리고는 화학 합성에 의해 각각 제조되기 때문에 제조 로트마다의 품질 차는 비교적 작다. 그러나 PCR 증폭물은 엄밀하게는 PCR 에러에 의한 목적 외 서열의 혼입률이 제조 로트마다 상이하다. 또한, 랜덤 올리고는 일반적으로 10염기 이하의 쇄 길이가 사용되지만 역시 제조 로트마다 포함되는 염기 구성이 동일하게는 이루어지지 않을 우려가 있다. 따라서, 이들 비특이 결합 억제제에 있어서도 로트 스위칭의 영향은 잔존하고 있다.

한편, poly-dA는 단일 염기(아데닌)에 의해 구성되는 DNA이며, 화학 합성 가능하기 때문에 제조 로트 간 차는 적다고 기대된다. poly-dA는 mRNA를 역전사했을 때에 발생하는 cDNA 상의 poly-dT를 블로킹하는 용도로 사용되어 있으며, cDNA 샘플을 핵산 어레이로 평가할 때에는 cDNA 상의 poly-dT와 상보쇄 프로브 상의 아데닌(A) 리치인 서열 간에서의 의양성 시그널을 억제하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2). 그러나 핵산 어레이에서는 다양한 유사 서열 간에서의 크로스 하이브리디제이션도 발생하고 있으며, poly-dA 단독으로는 이들 다양한 유사 서열 간에서의 크로스 하이브리디제이션에 대한 억제 효과는 기대할 수 없다. 그 때문에 비특허문헌 2에 있어서도 Human Cot-1 DNA가 동시에 첨가되어 있으며, 다양한 유사 서열 간에서의 크로스 하이브리디제이션에 대한 억제 효과는 실질적으로는 Human Cot-1 DNA에 의해 얻어져 있다고 말할 수 있다.

이상과 같이 종래 하이브리디제이션에 의해 표적 핵산을 검출할 때에 표적 핵산과 그 유사 서열 상보쇄를 갖는 핵산 사이의 크로스 하이브리디제이션을 효과적으로 억제하고, 또한 제조 로트 간에서의 품질이 안정된 비특이 결합 억제제는 존재하고 있지 않다. 본 발명은 이들 특성을 양립하는 비특이 결합 억제제를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명자는 예의 연구한 결과, 구아닌(G)을 포함하는 핵산이 비특이 결합을 억제하는 효과가 높고, 또한 상기 핵산의 제조 로트 간에서의 품질이 안정적인 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키는 것에 도달했다. 즉, 본 발명은 이하의 (1)~(12)를 제공한다.

(1) 염기 길이가 2~11염기이며, 전체 염기 서열 중의 구아닌 염기 또는 메틸화구아닌 염기의 함유율이 70% 이상인 핵산을 포함하는 핵산의 비특이 결합 억제제.

(2) (1)에 있어서, 상기 핵산의 염기 길이가 5~7염기인 억제제.

(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 구아닌 염기 또는 메틸화구아닌 염기가 구아닌 염기인 비특이 결합 억제제.

(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 연속되는 5염기의 구아닌 염기 서열을 갖는 억제제.

(5) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산의 전체 염기가 구아닌인 억제제.

(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 DNA인 억제제.

(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 억제제를 포함하는 핵산의 하이브리디제이션용 시약.

(8) 표적 핵산과, 상기 표적 핵산과 특이적으로 결합 가능한 핵산을 하이브리다이즈시키는 핵산의 하이브리디제이션 방법으로서, 상기 하이브리디제이션에 있어서 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 억제제를 공존시키는 것을 포함하는 방법.

(9) 표적 핵산과, 상기 표적 핵산과 특이적으로 결합 가능한 핵산을 하이브리다이즈시키는 하이브리디제이션 공정 및 상기 하이브리디제이션 공정에서 형성된 핵산 복합체를 검출하는 검출 공정을 포함하는 표적 핵산의 검출 방법으로서, 상기 하이브리디제이션 공정에 있어서 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 억제제를 공존시키는 것을 포함하는 검출 방법.

(10) (9)에 있어서, 핵산 어레이를 사용하는 검출 방법.

(11) 염기 길이가 2~11염기이며, 전체 염기 서열 중의 구아닌 염기 또는 메틸화구아닌 염기의 함유율이 70% 이상인 핵산의 비특이 결합 억제제로서의 사용.

(12) 염기 길이가 2~11염기이며, 전체 염기 서열 중의 구아닌 염기 또는 메틸화구아닌 염기의 함유율이 70% 이상인 핵산의 비특이 결합 억제제의 제조를 위한 사용.

(발명의 효과)

본 발명의 핵산의 비특이 결합 억제제는 연어 정자 DNA 등의 종래의 억제제와 동등 또는 그 이상의 비특이 결합의 억제 효과를 갖고, 또한 제조 로트 간에서의 품질이 안정적이기 때문에 그 선정이나 조제의 노력을 불필요로 하는 것이다. 특히, 하이브리디제이션에 의한 표적 핵산의 검출에 있어서 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과를 안정적으로 실현하는 것이 가능하다.

도 1은 연어 정자 DNA, 랜덤 프라이머와 poly-dG5의 크로스 하이브리디제이션 억제 효과를 나타내는 도면이다(실시예 1, 실시예 2, 비교예 1, 비교예 2).
도 2는 poly-dG5, poly-dG7, 및 poly-dG10의 크로스 하이브리디제이션 억제 효과를 나타내는 도면이다(실시예 3~실시예 8).
도 3은 poly-dG5, GGAGG, GGGAG, 및 TGGGG의 크로스 하이브리디제이션 억제 효과를 나타내는 도면이다(실시예 9~실시예 12).
도 4는 poly-dG5의 로트 간에서의 크로스 하이브리디제이션 억제 효과의 안정성을 나타내는 도면이다(실시예 13).
도 5는 연어 정자 DNA의 로트 간에서의 크로스 하이브리디제이션 억제 효과의 불안정성을 나타내는 도면이다(비교예 3).

본 발명의 제 1 실시형태(aspect)는 핵산의 하이브리디제이션 시에 발생하는 비특이 결합을 억제하기 위한 억제제이며, 염기 길이가 2~11염기이며, 상기 전체 염기 서열 중의 구아닌 염기 또는 메틸화구아닌 염기의 함유율이 70% 이상인 핵산을 포함하는 것이다. 구아닌 염기와 메틸화구아닌 염기의 양쪽이 포함될 경우에는 그 합계의 함유율이 70% 이상이다. 이하의 모든 설명에 있어서 문맥으로부터 그렇지 않은 것이 명백한 경우를 제외하고, 「구아닌」이라는 단어는 「메틸화구아닌」도 포함하는 의미로 사용하고 있다. 단, 실시예(actual working examples)에서는 「구아닌」은 메틸화되어 있지 않은 통상의 구아닌을 의미한다. 또한, 이하의 모든 설명에 있어서 메틸화되어 있지 않은 통상의 구아닌의 편이 메틸화구아닌보다 바람직하다. 또한, 메틸화구아닌의 예로서는 7-메틸구아닌(m7G), O6-메틸구아닌(O6-MeG) 등을 들 수 있다.

여기에서 핵산의 「비특이 결합」이란 표적으로 하는 핵산과 상기 표적 핵산의 서열에 상보적인 서열을 갖는 핵산(프로브 등) 사이에서의 하이브리디제이션 시에 발생하는 표적 핵산의 관여하는 상기 하이브리디제이션(특이적 결합) 이외의 모든 결합형 반응을 말한다.

이 핵산의 비특이 결합의 일실시형태는 핵산 어레이(DNA 마이크로어레이, DNA칩이라고도 한다) 등 표적 핵산을 검출하기 위해서 사용하는 핵산이며, 상기 표적 핵산에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산(핵산 프로브)이 고정화된 지지체(기판 등)를 사용할 경우에 표적 핵산과, 표적 핵산과 유사한 서열의 상보쇄를 갖는 핵산 사이에서 발생하는 크로스 하이브리디제이션이다. 또한, 비특이 결합의 다른 실시형태는 상기 표적 핵산에 상보적인 서열을 갖는 핵산이 고정화된 지지체의 재료 자체에 표적 핵산이 흡착(반데르발스 힘에 의한 물리 흡착, 소수성 상호 작용에 의한 화학 흡착 중 어느 것이나 포함된다)하는 것이다. 본 발명에 있어서의 핵산의 「비특이 결합」에는 이들 어느 실시형태도 포함된다.

본 발명의 비특이 결합 억제제에 포함되는 핵산(이하, 본 명세서에 있어서 「본 발명의 핵산」이라고도 한다)은 그 염기 길이가 2~11염기이며, 보다 바람직하게는 5~7염기이며, 더 바람직하게는 5염기이다. 또한, 상기 핵산의 전체 염기 서열 중의 구아닌 염기의 함유율은 70% 이상이다.

본 발명의 핵산의 바람직한 실시형태는 복수의 구아닌 염기가 연속해서 배열되어 있는 것이며, 그 중에서도 5염기의 구아닌 염기가 연속해서 병렬되어 있는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 핵산은 구아닌 염기 이외의 염기를 상기 조건에 따라 포함하는 것이 가능하지만 복수종의 염기를 혼합해서 목적의 서열을 갖는 핵산을 합성할 경우에는 목적 외의 서열이 일정 확률로 혼입될 가능성이 있으므로 상기 핵산은 구아닌 염기 1종만으로 구성되는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 비특이 결합 억제제에 포함되는 핵산은 일반적으로 사용되는 핵산 합성법에 의해 합성할 수 있고, 고상 합성법 및 액상 합성법 중 어느 것이나 상기 핵산의 합성에 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 고상 합성법에서는 아미다이트라고 불리는 수식 뉴클레오티드 모노머를 비즈 상에 고상화해 두고, 올리고뉴클레오티드의 서열의 3' 말단측으로부터 5' 말단을 향해서 뉴클레오티드 모노머를 부가해 감으로써 합성이 진행된다. 모든 쇄 길이 신장이 완료된 후에 고상 비즈로부터 분리를 행함으로써 목적의 핵산이 얻어진다. 액상 합성법에서는 고분산성 액상 지지체 등에 동일하게 뉴클레오티드 모노머를 부가함으로써 목적의 핵산이 얻어진다.

합성한 핵산은 일반적으로 사용되는 탈염 정제, 역상 칼럼 정제, HPLC 정제, PAGE 정제 등의 정제 방법에 의해 정제해서 사용해도 좋다. 바람직하게는 역상 칼럼 정제, HPLC 정제 또는 PAGE 정제, 보다 바람직하게는 HPLC 정제 또는 PAGE 정제에 의해 정제된 핵산을 사용한다.

본 발명의 비특이 결합 억제제에 포함되는 핵산은 DNA, RNA이어도 인공 핵산이어도 좋다. 인공 핵산으로서는 LNA(Locked Nucleic Acid), PNA(Peptide Nucleic Acid), ENA(Ethylene-Bridged Nucleic Acid) 등을 들 수 있다. 또한, 복수의 핵산종을 조합해서 합성한 핵산을 사용하는 것도 가능하다. LNA, PNA, ENA 등의 인공 핵산은 효소 안정성이 높은 한편 제조 비용도 비싸다. 따라서, 본 발명의 핵산은 DNA 또는 RNA가 바람직하고, 효소 안정성이 비교적 높은 DNA가 보다 바람직하다. 또한, 본 발명의 비특이 결합 억제제에 포함되는 핵산으로는 염기로서 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G), 우라실(U) 이외에 이노신(I)을 함유하는 것도 가능하다.

본 발명의 핵산은 수식 염기를 포함하고 있어도 좋다. 예를 들면, C는 5-메틸시토신(5mC), 5-히드록시메틸시토신(5hmC), 5-포르밀시토신(5fC), 5-카르복실시토신(5caC) 등으로서도 포함할 수도 있다. 또한, 상기와 같이 G는 7-메틸구아닌(m7G), O6-메틸구아닌(O6-MeG) 등으로서 또는 2'-O-메틸리보뉴클레오시드로서 포함하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명의 핵산은 그 5' 말단, 3' 말단 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 인산기, 알킬기, 알콕시기, 아미노기, 아데닐기, 비오틴, 티올, 할로겐, 형광 색소 등에 의해 수식되어 있어도 좋고, 이것에 한정되지 않고 그 사용 목적에 따라 임의의 수식기를 사용할 수 있다.

본 발명의 비특이 결합 억제제에 포함되는 핵산은 그 염기 길이가 2염기 또는 3염기일 경우에는 전체가 구아닌 염기에 의해 구성된다.

본 발명의 핵산은 그 염기 길이가 4염기일 경우에는 구아닌 염기 3염기 및 임의의 1염기(구아닌 염기이어도 좋다)로 구성되고, 상기 1염기의 배치되는 위치는 상기 서열 중에서 임의이다. 상기 1염기가 구아닌 염기일 경우에는 전체가 구아닌 염기에 의해서만 구성되어(즉, 염기 서열이 「GGGG」) 보다 바람직한 서열이다.

본 발명의 핵산은 그 염기 길이가 5염기일 경우에는 구아닌 염기 4염기 및 임의의 1염기(구아닌 염기이어도 좋다)로 구성되고, 상기 1염기의 배치되는 위치는 상기 서열 중에서 임의이다. 예를 들면, 상기 1염기가 아데닌 염기이며, 또한 5' 말단으로부터 3번째에 위치하는 핵산(핵산명(DNA): 「GGAGG」), 및 상기 1염기가 아데닌 염기이며, 또한 5' 말단으로부터 4번째에 위치하는 핵산(핵산명(DNA): 「GGGAG」), 및 상기 1염기가 티민 염기이며, 또한 5' 말단으로부터 1번째에 위치하는 핵산(핵산명(DNA): 「TGGGG」) 등이 이들에 포함된다. 또한, 상기 1염기가 구아닌 염기일 경우에는 전체가 구아닌 염기뿐인 연속하는 5염기에 의해 구성되어(즉, 염기 서열이 「GGGGG」) 특히 바람직한 핵산이다(핵산명(DNA): 「poly-dG5」).

본 발명의 핵산은 그 염기 길이가 6염기일 경우에는 구아닌 염기 5염기 및 임의의 1염기(구아닌 염기이어도 좋다)로 구성되고, 상기 1염기의 배치되는 위치는 상기 서열 중에서 임의이다. 이 중 연속하는 구아닌 5염기의 서열을 갖고, 그 어느 말단에 임의의 1염기를 포함하는 구성이 바람직하다. 또한, 상기 임의의 1염기가 구아닌 염기일 경우에는 전체가 구아닌 염기뿐인 연속하는 6염기에 의해 구성되어(즉, 염기 서열이 「GGGGGG」) 보다 바람직한 서열이다.

본 발명의 핵산은 그 염기 길이가 7염기일 경우에는 구아닌 염기 5염기 및 임의의 2염기(구아닌 염기이어도 좋다)로 구성되고, 상기 2염기의 배치되는 위치는 상기 서열 중에서 임의이다. 이 중 연속하는 구아닌 5염기의 서열을 갖고, 그 양 말단에 임의의 1염기씩을 포함하는 것 또는 어느 말단에 임의의 2염기를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 2염기가 어느 쪽도 구아닌 염기일 경우에는 전체가 구아닌 염기뿐인 연속하는 7염기에 의해 구성되어(즉, 염기 서열이 「GGGGGGG」) 보다 바람직한 서열이다.

본 발명의 핵산은 그 염기 길이가 8염기일 경우에는 구아닌 염기 6염기 및 임의의 2염기(구아닌 염기이어도 좋다)로 구성되고, 상기 2염기의 배치되는 위치는 상기 서열 중에서 임의이다. 이 중 연속하는 구아닌 6염기의 서열을 갖고, 그 양 말단에 임의의 1염기씩을 포함하는 것 또는 그 어느 말단에 임의의 2염기를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 2염기가 어느 쪽도 구아닌 염기일 경우에는 전체가 구아닌 염기뿐인 연속하는 8염기에 의해 구성되어(즉, 염기 서열이 「GGGGGGGG」) 보다 바람직한 서열이다(핵산명(DNA): 「poly-dG8」).

본 발명의 핵산은 그 염기 길이가 9염기일 경우에는 구아닌 염기 7염기 및 임의의 2염기(구아닌 염기를 포함한다)로 구성되고, 상기 2염기의 배치되는 위치는 상기 서열 중에서 임의이다. 이 중 연속하는 구아닌 7염기의 서열을 갖고, 그 양 말단에 임의의 1염기씩을 포함하는 것 또는 그 어느 말단에 임의의 2염기를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 2염기가 어느 쪽도 구아닌 염기일 경우에는 전체가 구아닌 염기뿐인 연속하는 9염기에 의해 구성되어(즉, 염기 서열이 「GGGGGGGGG」) 보다 바람직한 서열이다.

본 발명의 핵산은 그 염기 길이가 10염기일 경우에는 구아닌 염기 7염기 및 임의의 3염기(구아닌 염기를 포함한다)로 구성되고, 상기 3염기의 배치되는 위치는 상기 서열 중에서 임의이다. 이 중 연속하는 구아닌 7염기의 서열을 갖고, 그 양 말단에 임의의 1염기 또는 2염기를 포함하는 것 또는 그 어느 말단에 임의의 3염기를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 3염기의 전체가 구아닌 염기일 경우에는 전체가 구아닌 염기뿐인 연속하는 10염기에 의해 구성되어 보다 바람직한 서열이다(핵산명(DNA): 「poly-dG10」, 서열번호 1).

본 발명의 핵산은 그 염기 길이가 11염기일 경우에는 구아닌 염기 8염기 및 임의의 3염기(구아닌 염기를 포함한다)로 구성되고, 상기 3염기의 배치되는 위치는 상기 서열 중에서 임의이다. 이 중 연속하는 구아닌 8염기의 서열을 갖고, 그 양 말단에 임의의 1염기 또는 2염기를 포함하는 것 또는 그 어느 말단에 임의의 3염기를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 3염기의 전체가 구아닌 염기일 경우에는 전체가 구아닌 염기뿐인 연속하는 11염기에 의해 구성되어 보다 바람직한 서열이다(서열번호 2).

본 발명의 제 2 실시형태는 핵산의 하이브리디제이션에 있어서 사용하는 하이브리디제이션용 시약으로서, 본 발명의 핵산을 포함하는 시약이다.

본 발명의 하이브리디제이션용 시약은 본 발명의 핵산을 포함하는 용액으로서 조제할 수 있다. 본 발명의 하이브리디제이션용 시약에 포함되는 본 발명의 핵산의 농도는 0.3μM~100μM가 바람직하다. 고농도의 핵산 용액은 점성을 갖기 때문에 실험 조작 및 제조 관리의 관점으로부터 0.3μM~30μM로 사용하는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 핵산의 농도는 사용 목적이나 사용 방법에 따라 적당히 선택할 수 있다.

본 발명의 하이브리디제이션용 시약은 다당을 포함할 수 있고, 바람직하게는 덱스트란황산 나트륨을 포함할 수 있다. 덱스트란황산 나트륨은 그 수화 작용에 의해 표적 핵산의 농도를 높인 상태를 모방할 수 있는 점에서 하이브리디제이션의 반응 속도를 높이는 효과를 기대할 수 있다. 덱스트란황산 나트륨의 농도는 1~30중량%가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1~20중량%이며, 또한 3-10중량%로 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 덱스트란황산 나트륨의 분자량은 3,000~100,000Da의 범위에서 이용하는 것이 가능하다. 보다 바람직하게는 분자량 5,000~30,000Da의 덱스트란황산 나트륨을 사용한다.

본 발명의 하이브리디제이션용 시약에는 변성제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 포름아미드 또는 디메틸술폭시드를 포함할 수 있다. 포름아미드 또는 디메틸술폭시드는 핵산 염기 간의 수소 결합을 약하게 하는 작용이 있으며, 수소 결합수의 상이한 A~T 간, G~C 간의 결합 친화성을 조절함으로써 하이브리디제이션의 결합 특이성을 향상시키는 효과를 기대할 수 있다. 포름아미드의 농도는 1~50용량%가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1~30용량%이며, 또한 3~25용량%로 사용하는 것이 가장 바람직하다. 디메틸술폭시드의 농도는 1~40용량%가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1~20용량%이며, 3~10용량%로 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 하이브리디제이션용 시약에는 단백질에 대한 비특이적 흡착의 억제제를 포함할 수도 있다. 상기 억제제로서는 소혈청알부민(BSA)을 사용하는 것이 바람직하다. BSA는 백그라운드 노이즈로 이루어지는 비특이적 흡착을 억제함으로써 시그널/노이즈비가 향상되는 효과를 기대할 수 있다. BSA 등의 비특이적 흡착 억제제의 농도는 1~100mg/mL가 바람직하고, 보다 바람직하게는 5~50mg/mL이며, 10mg/mL로 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 하이브리디제이션용 시약에는 하이브리디제이션 반응의 감도를 높이기 위해서 유용한 물질을 포함해도 좋다. 예를 들면, 하이브리디제이션 반응 중에 발생하는 기포는 하이브리디제이션 반응을 물리적으로 저해할 우려가 있기 때문에 기포의 발생을 억제하는 소포제 등을 포함하고 있어도 좋다. 소포제의 예로서는 계면활성제인 Tween20(상품명), Tween60(상품명), Triton X-100(상품명) 또는 실리콘 오일 등을 들 수 있다. 또한, 소포제의 사용 농도는 특별히 한정되지 않고, 통상 0.001~10중량% 정도, 바람직하게는 0.01~1중량% 정도이다.

본 발명의 하이브리디제이션용 시약은 상술한 본 발명의 핵산을 포함하는 것 이외에는 주지의 조성을 채용할 수 있고, 구체적인 조제예로서는, 예를 들면 「Ku WC. 등, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004년, 제315권, 1호, p.30-37」에 기재된 조성을 참고로 해서 「6×SSPE, 0.1% SDS, 25% 포름아미드, 10mg/mL BSA, 10% 덱스트란황산 나트륨, 15μM poly-dG5」로 할 수 있다.

본 발명의 제 3 실시형태는 핵산의 하이브리디제이션 방법으로서, 본 발명의 핵산의 비특이 결합 억제제를 공존시켜서 또는 본 발명의 하이브리디제이션용 시약을 사용해서 하이브리디제이션을 행하는 방법이다.

핵산의 하이브리디제이션 방법 자체는 상술한 본 발명의 핵산을 공존시키는 것 이외에는 주지의 방법으로 행할 수 있고, 예를 들면 「Sambrook, J. 등, (1998） Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York」에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로는 미리 상보쇄 핵산 프로브가 고정화된 지지체에 표적 핵산과 본 발명의 비특이적 결합 억제제 또는 본 발명의 하이브리디제이션용 시약을 첨가하고, 일정 온도에서 인큐베이트함으로써 하이브리디제이션을 행할 수 있다. 본 발명의 비특이적 결합 억제제 또는 본 발명의 하이브리디제이션용 시약의 첨가 전에 표적 핵산을 고온에서 일정 시간 열변성시킴으로써 보다 핵산 결합의 특이성을 향상시키는 것도 가능하다. 또한, 표적 핵산과 상보쇄 핵산 프로브 및 본 발명의 비특이적 결합 억제제 또는 하이브리디제이션용 시약을 혼합하고, 일정 온도에서 인큐베이트함으로써 하이브리디제이션을 행한 후에 상보쇄 핵산 프로브를 지지체에 고정화하는 것도 가능하다.

본 발명의 제 4 실시형태는 핵산의 검출 방법으로서, 본 발명의 핵산의 비특이 결합 억제제를 공존시켜서 또는 본 발명의 하이브리디제이션용 시약을 사용해서 표적 핵산과, 이것에 특이적으로 결합 가능한 핵산을 하이브리디제이션시키는 공정과 상기 하이브리디제이션으로 형성된 핵산 복합체를 검출하는 공정을 포함하는 방법이다.

표적 핵산과, 이것에 특이적으로 결합 가능한 핵산을 하이브리디제이션시키는 공정은 상기 본 발명의 제 3 실시형태에 기재된 핵산의 하이브리디제이션 방법을 그대로 적용해서 실시할 수 있다.

하이브리디제이션 공정으로 형성된 핵산 복합체를 검출하는 공정 자체는 주지의 핵산의 검출 방법을 적용해서 행할 수 있다. 예를 들면, 하이브리디제이션 공정에 있어서 미리 표적 핵산을 표식 분자에 의해 표식함으로써 핵산 복합체의 양을 표식 분자의 양으로서 검출할 수 있다. 표식 분자로서는 유기 형광 색소, 인광 색소, 양자 도트, 형광 단백질 등의 형광체, 화학 발광 단백질, 방사성 동위체, 전자의 수수가 가능한 산화 환원종, 알칼리포스파타제나 호스래디시페록시다아제 등의 효소 자체 또는 이들 표식 분자를 포함하는 핵산 모노머 등을 사용할 수 있다. 표식 분자를 포함하는 핵산 모노머의 경우에는 표적 핵산의 말단에 효소 반응적으로 도입함으로써 표식 가능하다.

핵산 복합체의 검출은 감도면이나 간편성으로부터 표식 분자로서 형광체를 사용하는 것이 바람직하고, 그 경우에는 핵산 복합체의 양을 형광체가 발하는 형광 시그널값으로서 형광 현미경이나 플레이트 리더 등에 의해 측정하는 것이 가능하다.

핵산 복합체의 검출은 표적 핵산과 이것에 특이적으로 결합 가능한 핵산 프로브의 결합을 핵산 인터칼레이터의 형광 파장 변화로서 검출하는 것도 가능하다. 핵산 인터칼레이터로서는 에티디움브로마이드, 「SYBR(등록상표) Green」 또는 이들 대체 제품을 사용할 수 있다. 예를 들면, 핵산 어레이를 사용한 하이브리디제이션 공정 후 표적 핵산과 핵산 프로브의 복합체가 형성된 핵산 어레이를 핵산 인터칼레이터액에 침지하고, 완충액 등으로 세정한 후 핵산 복합체의 양을 핵산 인터칼레이터가 발하는 형광 시그널값으로서 형광 현미경이나 플레이트 리더에 의해 측정하는 것이 가능하다.

복합체 핵산의 검출은 in situ 하이브리디제이션, 콜로니 하이브리디제이션, 도트 블로팅, 서던 블로팅, 노던 블로팅 등의 공지의 방법, 또한 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산이며, 표적 핵산에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산(핵산 프로브)이 지지체에 고정화된 핵산 어레이(DNA 마이크로어레이, DNA칩 등)를 사용해서 실시될 수 있다.

핵산 어레이로서는 일반적으로 판매되어 있는 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, Affymetrix, Inc.의 「GeneChip(등록상표) Arrays」, Agilent Technologies Japan, Ltd.의 올리고 DNA칩, TORAY INDUSTRIES, INC.의 「3D-Gene(등록상표)」 등을 들 수 있지만 지지체가 수지제이기 때문에 핵산의 물리적 흡착이 적어 하이브리디제이션 용액을 마이크로비즈에서 교반함으로써 교반 효율이 향상된 TORAY INDUSTRIES, INC.의 「3D-Gene(등록상표)」을 사용하는 것이 바람직하다.

(실시예)

이하의 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만 본 발명은 실시예의 범위에 한정되는 것이 아니고, 간단히 특허청구하는 발명에 대해서 생각되는 많은 실시형태 중 몇 가지를 기재한 것에 지나지 않는다.

(실시예 1, 실시예 2, 비교예 1, 비교예 2)

핵산 어레이로서 TORAY INDUSTRIES, INC.제의 DNA 마이크로어레이 「3D-Gene(등록상표） human miRNA oligo chip(miRBase release 21 대응)」을 사용하고, 크로스 하이브리디제이션을 발생할 수 있는 miRNA인 hsa-miR-6858-5p(miRBase Accession No. MIMAT 0027616, 서열번호 3)를 표적 핵산으로서 선택하고, 하이브리디제이션 반응에 있어서의 본 발명의 핵산의 비특이 결합 억제제의 크로스 하이브리디제이션 억제 효과를 평가했다.

표적 핵산 hsa-miR-6858-5p는 5' 말단 인산기 수식체로서 화학 합성했다 (Fasmac Co., Ltd. 위탁 합성, HPLC 정제 그레이드). 이 표적 핵산을 증류수에 용해해서 2.5f㏖/μL로 조제하고, 그 5f㏖분을 「3D-Gene(등록상표) miRNA labeling kit」(TORAY INDUSTRIES, INC.)를 사용해서 형광 표식하고, 그 표준 프로토콜에 따라 상기 핵산 어레이를 사용해서 하이브리디제이션을 행했다.

핵산의 비특이 결합 억제제로서 「poly-dG5」(Fasmac Co., Ltd. 위탁 합성, 역상 칼럼 정제 그레이드)를 사용하고, 「miRNA Hybridization buffer V3」에 대해서 각각 최종 농도 1μM(실시예 1), 10μM(실시예 2)가 되도록 하이브리디제이션 용액을 조제하여 하이브리디제이션에 사용했다.

또한, 비교 대조로서 연어 정자 DNA(Invitrogen Corporation, 형번: 15632011)를 최종 농도 92μg/mL(비교예 1), 「Random Primer (N)9」(Takara Bio Inc., 형번: 3802)를 최종 농도 6.5μg/mL(2.2μM 상당)(비교예 2)로 해서 각각 하이브리디제이션 용액을 조제하여 하이브리디제이션을 행했다.

하이브리디제이션 후의 DNA 마이크로어레이를 「Microarray scanner」(TORAY INDUSTRIES, INC.)에 제공하여 형광 강도를 측정했다. 스캐너의 설정은 레이저 출력 100%, 포토 멀티플라이어의 전압 설정을 AUTO 설정으로 했다. 수치화 소프트웨어 「"3D-Gene” Extraction」(TORAY INDUSTRIES, INC.)을 사용해서 얻어진 스캔 화상의 각 스폿의 형광 강도를 시그널값으로서 수치화했다. 표적 핵산의 시그널값과 크로스 하이브리디제이션으로서 검출된 시그널 중 가장 높았던 hsa-miR-4498(miRBase Accession No. MIMAT 0019033, 서열번호 4)의 시그널값의 비(hsa-miR-6858-5p의 시그널값/hsa-miR-4498의 시그널값)를 S/N비로서 산출했다.

그 결과를 도 1에 나타낸다. 핵산의 비특이 결합 억제제를 비첨가한 경우의 S/N비(1.58)에 비해서 연어 정자 DNA를 첨가한 경우의 S/N비는 2.78로 향상되어 있으며, 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과가 확인되었다. Random Primer (N)9를 첨가한 경우의 S/N비는 1.33이며, 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과가 확인되지 않았다. 한편, 본 발명의 비특이 결합 억제제인 poly-dG5를 1μM, 10μM의 농도로 사용한 경우에는 각각 S/N비는 1.95, 2.47이 되며, 첨가 농도에 따라 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과가 향상되었다. 즉, poly-dG5는 적어도 1μM 이상의 농도로 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

(실시예 3~실시예 8)

핵산의 비특이 결합 억제제로서 「poly-dG5」(Fasmac Co., Ltd. 위탁 합성, HPLC 정제 그레이드)를 최종 농도 10μM(실시예 3), 15μM(실시예 4)가 되도록, 또한 「poly-dG7」(Fasmac Co., Ltd. 위탁 합성, HPLC 정제 그레이드)을 최종 농도 10μM(실시예 5), 15μM(실시예 6)가 되도록, 또한 「poly-dG10」(Fasmac Co., Ltd. 위탁 합성, HPLC 정제 그레이드, 서열번호 1)을 최종 농도 10μM(실시예 7), 15μM(실시예 8)가 되도록 각각 하이브리디제이션 용액을 조제하고, 하이브리디제이션에 사용한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 해서 표적 핵산 hsa-miR-6858-5p의 하이브리디제이션을 행하여 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과를 평가했다.

그 결과를 도 2에 나타낸다. poly-dG5를 10μM, 15μM로 첨가한 경우 S/N비는 각각 3.11, 3.92로 향상되고, 연어 정자 DNA(비교예 1) 이상의 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과를 발휘했다. 또한, poly-dG7을 10μM, 15μM로 첨가한 경우, poly-dG10을 10μM, 15μM로 첨가한 경우, 비첨가의 경우에 비해서 각각 S/N비가 향상되었다. 이 결과로부터 염기 길이가 5~10인 구아닌 염기 연속 서열을 갖는 핵산은 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과를 갖고 있으며, 그 중에서도 poly-dG5(15μM)는 돌출되어 높은 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

(실시예 9~실시예 12)

핵산의 비특이 결합 억제제로서 「poly-dG5」(Fasmac Co., Ltd. 위탁 합성, 역상 칼럼 정제 그레이드)(실시예 9), 「GGAGG」(Fasmac Co., Ltd. 위탁 합성, HPLC 정제 그레이드)(실시예 10), 「GGGAG」(Fasmac Co., Ltd. 위탁 합성, HPLC 정제 그레이드)(실시예 11), 「TGGGG」(Fasmac Co., Ltd. 위탁 합성, HPLC 정제 그레이드)(실시예 12)를 최종 농도 15μM가 되도록 각각 하이브리디제이션 용액을 조제하고, 하이브리디제이션에 사용한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 해서 표적 핵산 hsa-miR-6858-5p의 하이브리디제이션을 행하여 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과를 평가했다.

그 결과를 도 3에 나타낸다. 본 발명의 어느 핵산의 비특이 결합 억제제를 첨가한 경우에도 비첨가의 경우에 비해서 S/N비가 향상되었다. 이 결과로부터 높은 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과를 나타낸 poly-dG5와 같은 구아닌 염기만으로 구성되는 핵산은 아니어도 구아닌 염기를 고율로 포함하는 핵산은 대체로 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과를 갖는 것을 알 수 있었다.

(실시예 13)

본 발명의 핵산의 비특이 결합 억제제의 제조 로트 차에 의한 크로스 하이브리디제이션 억제 효과로의 영향을 평가했다.

핵산의 비특이 결합 억제제로서 「poly-dG5」(Fasmac Co., Ltd. 위탁 합성, 역상 칼럼 정제 그레이드)의 상이한 제조 로트를 4로트 준비하고, 실시예 4(또는 실시예 9)와 마찬가지로 해서 각각 최종 농도 15μM가 되도록 하이브리디제이션 용액을 조제하여 각 로트에 대해서 4회씩(N=4; 4로트 합계에 의해 측정 N=16) 하이브리디제이션을 행했다.

그 결과를 도 4에 나타낸다. poly-dG5의 각 로트(N=4)의 S/N비의 평균값 및 CV값은 로트 1: 평균값 3.75 및 CV값 4.25%, 로트 2: 평균값 3.79 및 CV값 3.82%, 로트 3: 평균값 3.69 및 CV값 4.22%, 로트 4: 평균값 3.60 및 CV값 5.33%이며, 4로트 전체에서는 평균값 3.71 및 CV값 4.47%이었다. 본 발명의 핵산의 비특이 결합 억제제는 제조 로트 간에서의 큰 성능 차는 없어 안정된 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과를 발휘했다.

(비교예 3)

종래 사용되어 온 핵산의 비특이 결합 억제제로서 연어 정자 DNA(Invitrogen Corporation, 형번: 15632011)의 상이한 제조 로트를 4로트 준비하고, 실시예 13과 마찬가지로 해서 각각 최종 농도 92μg/mL가 되도록 하이브리디제이션 용액을 조제하여 각 로트에 대해서 4회씩(N=4; 4로트 합계에 의해 측정 N=16) 하이브리디제이션을 행했다.

그 결과를 도 5에 나타낸다. 연어 정자 DNA의 각 로트(N=4)의 S/N비의 평균값 및 CV값은 로트 1: 평균값 2.43 및 CV값 3.24%, 로트 2: 평균값 2.72 및 CV값 5.26%, 로트 3: 평균값 2.90 및 CV값 3.20%, 로트 4: 평균값 2.63 및 CV값 5.51%이며, 4로트 전체에서는 평균값 2.67 및 CV값 7.75%이었다. 본 발명의 핵산의 비특이 결합 억제제와 비교해서 종래 사용되어 온 연어 정자 DNA는 크로스 하이브리디제이션의 억제 효과에 큰 로트 간 차가 존재하는 것이 나타내어졌다.

(서열번호 1) Designed Sequence, poly-dG10
(서열번호 2) Designed Sequence

SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> Suppressing agent for non-specific binding of nucleic acid, agent for hybridization of nucleic acid, and method for hybridization of nucleic acid <130> PF000651-PCT <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed Sequence, poly-dG10 <400> 1 gggggggggg 10 <210> 2 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed Sequence <400> 2 gggggggggg g 11 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 gugaggaggg gcuggcaggg ac 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 ugggcuggca gggcaagugc ug 22

Claims

염기 길이가 2~11염기이며, 전체 염기 서열 중의 구아닌 염기 또는 메틸화구아닌 염기의 함유율이 70% 이상인 핵산을 포함하는 핵산의 비특이 결합 억제제.
제 1 항에 있어서,
상기 핵산의 염기 길이가 5~7염기인 억제제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 구아닌 염기 또는 메틸화구아닌 염기가 구아닌 염기인 비특이 결합 억제제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산이 연속되는 5염기의 구아닌 염기 서열을 갖는 억제제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산의 전체 염기가 구아닌인 억제제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산이 DNA인 억제제.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 억제제를 포함하는 핵산의 하이브리디제이션용 시약.
표적 핵산과, 상기 표적 핵산과 특이적으로 결합 가능한 핵산을 하이브리다이즈시키는 핵산의 하이브리디제이션 방법으로서,
상기 하이브리디제이션에 있어서 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 억제제를 공존시키는 것을 포함하는 방법.
표적 핵산과, 상기 표적 핵산과 특이적으로 결합 가능한 핵산을 하이브리다이즈시키는 하이브리디제이션 공정 및 상기 하이브리디제이션 공정에서 형성된 핵산 복합체를 검출하는 검출 공정을 포함하는 표적 핵산의 검출 방법으로서,
상기 하이브리디제이션 공정에 있어서 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 억제제를 공존시키는 것을 포함하는 검출 방법.
제 9 항에 있어서,
핵산 어레이를 사용하는 검출 방법.
염기 길이가 2~11염기이며, 전체 염기 서열 중의 구아닌 염기 또는 메틸화구아닌 염기의 함유율이 70% 이상인 핵산의 비특이 결합 억제제로서의 사용.
염기 길이가 2~11염기이며, 전체 염기 서열 중의 구아닌 염기 또는 메틸화구아닌 염기의 함유율이 70% 이상인 핵산의 비특이 결합 억제제의 제조를 위한 사용.