BR112021007527A2

BR112021007527A2 - inibidor de ligação não específica para ácido nucleico, reagente de hibridização para ácido nucleico, métodos de hibridização de ácido nucleico e de detecção de um ácido nucleico e uso de um ácido nucleico

Info

Publication number: BR112021007527A2
Application number: BR112021007527-5A
Authority: BR
Inventors: Takashi Serizawa
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 2018-10-30
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2021-08-03
Also published as: JP7415284B2; CA3117823A1; US20210395802A1; EP3875586A1; JPWO2020090822A1; KR20210084352A; EP3875586A4; CN112955552A; WO2020090822A1

Abstract

INIBIDOR DE LIGAÇÃO NÃO ESPECÍFICA PARA ÁCIDO NUCLEICO, REAGENTE DE HIBRIDIZAÇÃO PARA ÁCIDO NUCLEICO, MÉTODOS DE HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO E DE DETECÇÃO DE UM ÁCIDO NUCLEICO E USO DE UM ÁCIDO NUCLEICO. A presente invenção divulga um inibidor de ligação não específica que permite, na detecção de um ácido nucleico alvo por hibridização, a inibição eficaz da hibridização cruzada entre o ácido nucleico alvo e fitas complementares de sequências semelhantes a ele, cujo inibidor de ligação não específica tem uma qualidade estável entre os lotes de produção; e um método de hibridização para ácido nucleico usando o referido inibidor. O inibidor de ligação não específica para ácido nucleico inclui um ácido nucleico que tem um comprimento de bases de 2 a 11 bases e o seu teor de base(s) de guanina e/ou base(s) de guanina metilada em toda a sequência de bases não é inferior a 70%.

Description

“INIBIDOR DE LIGAÇÃO NÃO ESPECÍFICA PARA ÁCIDO NUCLEICO, REAGENTE DE HIBRIDIZAÇÃO PARA ÁCIDO NUCLEICO, MÉTODOS DE HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO E DE DETECÇÃO DE UM ÁCIDO NUCLEICO E USO DE UM ÁCIDO NUCLEICO” CAMPO DA INVENÇÃO

[01] A presente invenção diz respeito a um inibidor de ligação não específica na hibridização de ácido nucleico, um reagente de hibridização compreendendo o inibidor, um método de hibridização para ácido nucleico, método esse que utiliza o inibidor, e um método de detecção de um ácido nucleico alvo, cujo método compreende a etapa de hibridização.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[02] O ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA) são ácidos nucleicos que transportam informação biológica. O DNA contém adenina (dA), timina (dT), citosina (dC) e guanina (dG), e o RNA contém adenina (A), uracila (U), citosina (C) e guanina (G), como bases. O DNA e o RNA, devido às suas propriedades, ligam-se especificamente às suas fitas complementares, que possuem as sequências complementares. A afinidade e especificidade de ligação são realizadas pela combinação de dois tipos de modos de ligação específicos: A–T (ou U) e C–G. A afinidade de ligação e a especificidade para a fita complementar são dependentes da ordem de arranjo e das razões de componentes dos tipos de base contidos na sequência, do comprimento da cadeia de ligação, da estrutura de ordem superior dependendo da sequência de base, e semelhantes. Eles também são controlados por fatores externos, como a temperatura do líquido de reação, a força iônica no líquido de reação e a presença ou ausência de um agente desnaturante de ácido nucleico, tal como a formamida. A ligação do ácido nucleico com a fita complementar é chamada de hibridização.

[03] Nos últimos anos, estudos para a predição ou diagnóstico do desenvolvimento de doença foram realizados com base na medição dos níveis de expressão de determinados ácidos nucleicos alvo em várias amostras biológicas. O número total de genes presentes em um ser humano foi relatado como sendo, por exemplo, não inferior a 26.000. Além disso, nos últimos anos, os microRNAs, que são ácidos nucleicos de cadeia curta, estão atraindo a atenção como RNAs não traduzidos, e foi relatado que não menos que 2.600 tipos de microRNAs estão presentes em um ser humano. Em particular, os microRNAs são cada vez mais considerados como intervenientes importantes, responsáveis pelo ajuste fino da regulação da expressão gênica em organismos superiores, incluindo humanos, uma vez que, por exemplo, um tipo de sequência de microRNA regula os níveis de expressão de mais de 100 tipos de genes. Assim, a associação de microRNAs com doenças tem sido intensamente estudada. Não é fácil encontrar genes associados a doenças de um número tão grande de genes candidatos. Exemplos de técnicas frequentemente usadas para tal propósito incluem a busca exaustiva de expressão gênica usando matrizes de ácidos nucleicos (também chamadas de microarranjos de DNA ou chips de DNA).

[04] Uma matriz de ácido nucleico compreende, em um substrato de suporte, sondas de ácido nucleico com sequências de bases complementares para um grande número de ácidos nucleicos alvo. Os ácidos nucleicos alvo em uma amostra extraída de uma amostra biológica são preliminarmente marcados com uma molécula de marcação, tal como uma substância fluorescente, e os ácidos nucleicos alvo marcados são aplicados à matriz de ácido nucleico. Ao permitir a hibridização entre os ácidos nucleicos alvo e as sondas de ácido nucleico, os níveis de expressão dos ácidos nucleicos alvo podem ser detectados como sinais fluorescentes dos complexos de ácido nucleico formados. Exemplos de um método para controlar a afinidade de ligação e a especificidade entre os ácidos nucleicos alvo e suas fitas complementares em uma matriz de ácido nucleico incluem, como descrito acima, a mudança de temperatura da reação na hibridização e a mudança da composição da solução de hibridização. Em particular, a composição da solução de hibridização é otimizada por cada um dos versados na técnica, e essa otimização é uma técnica essencial para a detecção específica de ácidos nucleicos com uma matriz de ácido nucleico.

[05] Entretanto, em matrizes de ácidos nucleicos comuns, as sondas de fita complementar são imobilizadas sobre um substrato de vidro, e o vidro tem uma propriedade que permite absorver a ligação de ácidos nucleicos nele de uma forma não específica em relação às sequências. Assim, como resultado, a adsorção dos ácidos nucleicos alvo ao substrato de vidro causa um aumento no sinal de fundo. Nos casos em que os valores de sinal dos ácidos nucleicos alvo são baixos, sua detecção é difícil devido ao alto sinal de fundo.

[06] Além disso, nos casos em que ácidos nucleicos alvo devem ser detectados utilizando uma matriz de ácido nucleico ou outra abordagem semelhante, pode ocorrer uma hibridização cruzada entre os ácidos nucleicos alvo e os ácidos nucleicos cujas fitas complementares têm sequências similares. Em tais casos, os ácidos nucleicos alvo que hibridizam de forma cruzada podem exibir valores de sinal mais elevados em relação aos valores de sinal dos ácidos nucleicos alvo, levando a dificuldade na detecção dos níveis de expressão dos ácidos nucleicos alvo.

[07] Em particular, uma vez que o genoma contém sequências repetitivas nas quais as sequências particulares são altamente repetidas, a detecção de um ácido nucleico alvo na sequência genômica de análise é difícil nos casos em que as sequências repetitivas do ácido nucleico alvo hibridizam de forma cruzada com a sonda de ácido nucleico que possui fita complementar ao ácido nucleico alvo, devido a um elevado valor basal do valor mensurado.

[08] Com o intuito de suprimir a adsorção não específica para um substrato de matriz de ácido nucleico, e para suprimir a hibridização cruzada com ácidos nucleicos cujas fitas complementares possuem sequências semelhantes ao ácido nucleico alvo, um tampão, sal, agente de hidratação, agente desnaturante de ácido nucleico e/ou semelhante, e/ou adicionalmente, um inibidor (agente de bloqueio) da ligação não específica de ácidos nucleicos é(são) adicionado(s) à solução de hibridização. Por exemplo, o DNA de esperma de salmão é um dos inibidores de ligação não específica mais comumente usados. Outros exemplos de inibidores de ligação não específica para ácido nucleico incluem DNA Cot-1 humano, tRNA de E. coli, produtos de amplificação da PCR (documento patentário 1), poli-dA (documento não patentário 1, documento não patentário 2), oligonucleotídeos aleatórios e suas misturas (documento patentário 2), que são usados por adição às soluções de hibridização.

DOCUMENTOS DOS ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[09] Documentos Patentários: - Documento Patentário 1: Pedido de patente PCT Traduzido do Japonês Aberto à Inspeção Pública Nº 2009-518004; e - Documento Patentário 2: JP 2010-29.174 A.

[10] Documentos Não Patentários: - Documento não patentário 1: Nota Técnica, “Implementation of DNA Microarray Hybridization Protocols, Translation of Manual Methods to Tecan Hybridization Station” [online] Tecan Japan Co., Ltd.

[pesquisado em 22 de outubro de 2018], internet <URL: http://www.tecan.co.jp/pdf/technote_hs.pdf>; e - Documento não patentário 2: Pan SJ. et al., BMC

Genomics, 2002, vol. 3, nº 35, págs. 1-12.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

[11] Como um dos inibidores de ligação não específica convencionalmente utilizado dentre os inibidores descritos acima para ácido nucleico, o DNA de esperma de salmão é preparado pela fragmentação de DNA derivado de testículos de salmão, por tratamento com ultrassons ou cisalhamento físico. O DNA do esperma de salmão geralmente tem uma distribuição de peso molecular de várias centenas de pares de bases a vários milhares de pares de bases, embora a distribuição do peso molecular varie dependendo do fornecedor. O DNA de esperma de salmão é conhecido por ter propriedades diferentes na distribuição do peso molecular e semelhantes, dependendo do lote de produção. O DNA Cot-1 humano é preparado por tratamento de cisalhamento do DNA derivado da placenta humana. Uma vez que é similarmente derivado de uma amostra biológica, suas propriedades, como a distribuição do peso molecular, variam dependendo do lote de produção. O tRNA de E. coli é o tRNA extraído de um homogenato de E. coli.

Por ser derivado de uma amostra biológica, suas propriedades podem variar entre os lotes de produção.

[12] Assim, na detecção de um ácido nucleico alvo usando um inibidor de ligação não específica derivado de uma amostra biológica, o resultado da medição pode ser diferentemente afetado quando um lote de produção diferente é utilizado. Por esse motivo, por exemplo, o inibidor de ligação não específica deve ser obtido a partir de uma pluralidade de lotes de produção, e devem ser realizadas comparações e avaliações entre os lotes de produção, para identificar determinado(s) lote(s) de produção com o(s) qual(is) resultados de medição equivalentes podem ser obtidos, para fornecer o(s) lote(s) de produção em grande quantidade. Assim, muito trabalho tem sido necessário.

[13] Em contraste, os produtos de amplificação por PCR e oligonucleotídeos aleatórios fornecem diferenças de qualidade relativamente pequenas entre lotes de produção uma vez que os produtos de amplificação por PCR são produzidos por amplificação por PCR, e os oligonucleotídeos aleatórios são produzidos por síntese química. No entanto, no sentido estrito, os produtos da amplificação por PCR exibem diferentes taxas de contaminação com sequências não intencionais causadas por erros da PCR entre os lotes de produção. Os oligonucleotídeos aleatórios (randômicos), nos quais comprimentos de cadeia de não mais de 10 bases são comumente usados, também podem exibir diferentes componentes de base entre os lotes de produção. Assim, estes inibidores de ligação não específica continuam a ser afetados por as diferenças no lote.

[14] Em contra partida, o poli-dA é um DNA composto de um único tipo de base (adenina), e pode ser quimicamente sintetizado. Portanto, espera-se que haja menos diferenças entre os lotes de produção. poli-dA é usado para o bloqueio de poli-dT no cDNA, que é produzido quando o mRNA é transcrito reversamente. Foi relatado que, quando uma amostra de cDNA é avaliada usando uma matriz de ácido nucleico, poli-dA inibe sinais falso- positivos gerados entre poli-dT no cDNA e sequências ricas em adenina (A) nas sondas de fita complementar (Documento não patentário 2). Entretanto, as matrizes de ácido nucleico também permitem a hibridização cruzada entre várias sequências semelhantes e não se pode esperar que o poli-dA, quando usado sozinho, tenha um efeito inibidor na hibridização cruzada entre essas várias sequências semelhantes. Assim, no documento não patenteado 2, uma vez que o DNA de Cot-1 humano é adicionado ao mesmo tempo, pode-se dizer que o efeito inibitório na hibridização cruzada entre várias sequências semelhantes é obtido substancialmente a partir de DNA Cot-1 humano.

[15] Conforme descrito acima, convencionalmente, na detecção de um ácido nucleico alvo por hibridização, não havia inibidor de ligação não específica capaz de inibir eficazmente a hibridização cruzada entre o ácido nucleico alvo e as fitas complementares das suas sequências semelhantes, e que possuísse uma qualidade estável entre os lotes de produção. A presente invenção visa fornecer um inibidor de ligação não específica que satisfaça essas propriedades.

MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS

[16] Como resultado de estudos intensivos, os presentes inventores descobriram que um ácido nucleico contendo a guanina (G), altamente eficaz inibe a ligação não específica, e que o ácido nucleico possui uma qualidade estável entre os lotes de produção, concluindo assim a presente invenção. Mais especificamente, a presente invenção provê os seguintes (1) a (12): (1) Um inibidor de ligação não específica para ácido nucleico, cujo inibidor compreende um ácido nucleico que tem um comprimento de bases de 2 a 11 bases, e em que o teor bases de guanina e/ou bases de guanina metilada em toda a sequência de bases não é inferior a 70%; (2) O inibidor, de acordo com (1), em que o ácido nucleico tem um comprimento de bases de 5 a 7 bases; (3) O inibidor de ligação não específica, de acordo com (1) ou (2), em que as bases de guanina e/ou bases de guanina metilada são bases de guanina; (4) O inibidor, de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que o ácido nucleico tem uma sequência de cinco bases de guanina consecutivas; (5) O inibidor, de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que todas as bases no ácido nucleico são guanina; (6) O inibidor, de acordo com qualquer um de (1) a (5), em que o ácido nucleico é DNA;

(7) Um reagente de hibridização para ácido nucleico, em que o reagente compreendendo o inibidor conforme definido em qualquer um de (1) a

(6);

(8) Um método de hibridização para ácido nucleico, em que o método compreende a hibridização de um ácido nucleico alvo com um ácido nucleico capaz de se ligar especificamente ao ácido nucleico alvo, em que o método compreende a coexistência do inibidor conforme definido em qualquer um de (1) a (6) na hibridização;

(9) Um método de detecção para um ácido nucleico alvo,

caracterizado por compreender:

- uma etapa de hibridização para a hibridização do ácido nucleico alvo com um ácido nucleico capaz de ligar especificamente ao ácido nucleico alvo; e

- uma etapa de detecção para detectar um complexo de ácido nucleico formado pela etapa de hibridização;

em que o método compreende a coexistência do inibidor conforme definido em qualquer um de (1) a (6) na etapa de hibridização;

(10) O método de detecção, de acordo com (9), caracterizado por usar uma matriz de ácido nucleico;

(11) Uso de um ácido nucleico que tem um comprimento de bases de 2 a 11 bases e no qual o teor de bases de guanina e/ou bases de guanina metilada em toda a sequência de bases não é inferior a 70%,

caracterizado por ser para uso como um inibidor de ligação não específica para ácido nucleico; e

(12) Uso de um ácido nucleico que tem um comprimento de bases de 2 a 11 bases e no qual o teor de bases de guanina e/ou bases de guanina metilada em toda a sequência de bases não é inferior a 70%,

caracterizado pelo uso ser para a produção de um inibidor de ligação não específica para ácido nucleico.

EFEITOS DA INVENÇÃO

[17] O inibidor de ligação não específica para ácido nucleico da presente invenção tem um efeito inibitório sobre a ligação não específica, cujo efeito é equivalente ou melhor do que o de inibidores convencionais, como o DNA de esperma de salmão. Além disso, como o inibidor tem qualidade estável entre os lotes de produção, não requer mão de obra para seleção e preparação dos lotes de produção. Em particular, na detecção de um ácido nucleico alvo por hibridização, o inibidor permite a realização estável de um efeito de inibição de hibridização cruzada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[18] A Fig. 1 mostra os efeitos de inibição da hibridização cruzada de DNA de esperma de salmão, primers aleatórios e poli-dG5 (Exemplos 1 e 2, Exemplos Comparativos 1 e 2).

[19] A Fig. 2 mostra os efeitos de inibição de hibridização cruzada de poli-dG5, poli-dG7 e poli-dG10 (Exemplos 3 a 8).

[20] A Fig. 3 mostra os efeitos de inibição de hibridização cruzada de poli-dG5, GGAGG, GGGAG e TGGGG (Exemplos 9 a 12).

[21] A Fig. 4 mostra a estabilidade do efeito de inibição da hibridização cruzada de poli-dG5 entre os lotes (Exemplo 13).

[22] A Fig. 5 mostra a instabilidade do efeito de inibição da hibridização cruzada do DNA de esperma de salmão entre os lotes (Exemplo Comparativo 3).

MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[23] Um primeiro aspecto da presente invenção é um inibidor para inibir a ligação não específica que ocorre na hibridização de um ácido nucleico, o inibidor compreendendo um ácido nucleico que tem um comprimento de bases de 2 a 11 bases e no qual o teor de bases de guanina e/ou bases de guanina metilada em toda a sequência de bases não é inferior a 70%. Nos casos em que o ácido nucleico contém bases de guanina e bases de guanina metilada, o teor total não é inferior a 70%. Ao longo da seguinte descrição, o termo “guanina” pretende incluir “guanina metilada”, a menos que o contexto indique claramente o contrário. No entanto, nos Exemplos (exemplos de trabalho reais), “guanina” significa guanina normal não metilada.

Ao longo da seguinte descrição, a guanina normal não metilada é preferida à guanina metilada. Exemplos da guanina metilada incluem 7–metilguanina (m7G) e O6–metilguanina (O6–MeG).

[24] Na presente invenção “ligação não específica” de ácido nucleico significa qualquer reação de ligação que ocorra durante a hibridização entre um ácido nucleico alvo e um ácido nucleico (tal como uma sonda) possuindo uma sequência complementar à sequência do ácido nucleico alvo, e inclui qualquer ligação exceto a hibridização (ligação específica) envolvendo o ácido nucleico alvo.

[25] O modo da ligação não específica de ácido nucleico é a hibridização cruzada que ocorre no uso de um suporte (tal como um substrato), no qual um ácido nucleico (sonda de ácido nucleico) utilizado para a detecção de um ácido nucleico alvo é imobilizada, tal como uma matriz de ácido nucleico (também referida como microarranjo de DNA (DNA microarray) ou chip de DNA), em que o ácido nucleico usado para a detecção tem uma sequência de bases complementar ao ácido nucleico alvo e em que a hibridização cruzada ocorre entre o ácido nucleico alvo e um ácido nucleico cuja fita complementar tem uma sequência semelhante ao ácido nucleico alvo. Em outro modo de ligação não específica, um ácido nucleico alvo adsorve ao próprio material de um suporte no qual um ácido nucleico possuindo uma sequência complementar ao ácido nucleico alvo é imobilizado (em que a adsorção inclui adsorção física pela força de Van der Waals e adsorção química por interação hidrofóbica). A “ligação não específica” de ácido nucleico na presente invenção inclui ambos os modos.

[26] O ácido nucleico contido no inibidor de ligação não específica da presente invenção (doravante também referido na presente descrição com “ácido nucleico da presente invenção”) tem um comprimento de bases de 2 a 11 bases, mais preferencialmente 5 a 7 bases, ainda mais preferencialmente 5 bases. O teor de bases de guanina em toda a sequência de bases do ácido nucleico não é inferior a 70%.

[27] Em um modo preferido do ácido nucleico da presente invenção, uma pluralidade de bases de guanina está disposta consecutivamente. Mais preferencialmente, cinco bases de guanina são arranjadas consecutivamente.

[28] O ácido nucleico da presente invenção pode conter uma base diferente de uma base de guanina, de acordo com as condições descritas acima. No entanto, uma vez que, nos casos em que um ácido nucleico com uma sequência de interesse é sintetizado pela mistura de uma pluralidade de bases, a contaminação com uma sequência diferente da sequência de interesse pode ocorrer com certa probabilidade. Assim, preferencialmente, o ácido nucleico é composto apenas por bases de guanina.

[29] O ácido nucleico contido no inibidor de ligação não específica da presente invenção pode ser sintetizado por um método de síntese de ácido nucleico comumente utilizado. Tanto um método de síntese em fase sólida quanto um método de síntese em fase líquida pode ser usado para a síntese do ácido nucleico. Por exemplo, em um método de síntese em fase sólida, monômeros de nucleotídeos modificados chamados amidita são imobilizados em esferas. A síntese prossegue pela adição de monômeros de nucleotídeo do lado da extremidade 3' em direção ao lado da extremidade 5' de uma sequência de oligonucleotídeos. Após a conclusão da extensão ao longo de todo o comprimento da cadeia, o ácido nucleico de interesse pode ser obtido por separação das esferas em fase sólida. Em um método de síntese em fase líquida, os monômeros de nucleotídeo são adicionados de forma semelhante a um suporte de fase líquida altamente dispersível ou semelhante, para obter um ácido nucleico de interesse.

[30] O ácido nucleico sintetizado pode ser utilizado após purificação por um método de purificação como a purificação de dessalinização, purificação em coluna de fase reversa, purificação por HPLC ou purificação por PAGE. O ácido nucleico utilizado é preferencialmente um ácido nucleico purificado por purificação em coluna de fase reversa, purificação por HPLC, ou purificação por PAGE, mais preferencialmente purificação por HPLC ou purificação por PAGE.

[31] O ácido nucleico contido no inibidor de ligação não específica da presente invenção pode ser DNA, RNA ou um ácido nucleico artificial. Exemplos de ácidos nucleicos artificiais incluem LNA (Ácido Nucleico Bloqueado), PNA (ácido nucleico peptídico), e ENA (ácido nucleico com ligações de etileno). Outros ácidos nucleicos sintetizados com uma combinação de uma pluralidade de tipos de ácidos nucleicos também podem ser usados.

Embora os ácidos nucleicos artificiais como LNA, PNA e ENA tenham alta estabilidade enzimática, seus custos de produção são elevados. Portanto, o ácido nucleico da presente invenção é preferencialmente DNA ou RNA, mais preferencialmente DNA, que tem estabilidade enzimática relativamente alta.

Além disso, o ácido nucleico contido no inibidor de ligação não específica da presente invenção pode conter inosina (I), além de adenina (A), timina (T), citosina (C), guanina (G) e uracila (U) como bases.

[32] O ácido nucleico da presente invenção pode conter uma base modificada. Por exemplo, C também pode estar contido como 5-

metilcitosina (5mC), 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formilcitosina (5fC), 5- carboxilcitosina (5caC) ou semelhantes. Além disso, G também pode estar contido como 7-metilguanina (m7G), O6–metilguanina (O6–MeG) ou semelhantes, conforme descrito acima, ou como 2'–O–metilribonucleosídeo.

[33] O ácido nucleico da presente invenção pode ser modificado em uma ou ambas as extremidades, 5' e 3', com um grupo fosfato, um grupo alquila, um grupo alcoxi, um grupo amino, um grupo adenila, biotina, tiol, halogênio, corante fluorescente e/ou semelhantes. O(s) grupo(s) de modificação não está(estão) limitado(s) a estes, e um grupo modificador arbitrário pode ser usado, dependendo do uso pretendido.

[34] Nos casos em que o ácido nucleico contido no inibidor de ligação não específica da presente invenção tem um comprimento de bases de 2 bases ou 3 bases, o ácido nucleico é composto apenas por bases de guanina.

[35] Nos casos em que o ácido nucleico da presente invenção tem um comprimento de bases de quatro bases, o ácido nucleico é constituído por três bases de guanina e uma base arbitrária (que também pode ser uma base de guanina), e essa base é arranjada em uma posição arbitrária na sequência. Nos casos em que uma base é uma base de guanina, a sequência é composta apenas de bases de guanina (ou seja, a sequência de bases é “GGGG”), que é mais preferida.

[36] Nos casos em que o ácido nucleico da presente invenção tem um comprimento de bases de cinco bases, o ácido nucleico é constituído por quatro bases de guanina e uma base arbitrária (que também pode ser uma base de guanina), e esta base é arranjada em uma posição arbitrária na sequência. Exemplos de tal ácido nucleico incluem um ácido nucleico no qual aquela base é uma base de adenina disposta na terceira posição a partir da extremidade 5' (nome do ácido nucleico (DNA): “GGAGG"), um ácido nucleico no qual aquela base é uma base de adenina disposta na quarta posição a partir da extremidade 5' (nome do ácido nucleico (DNA): “GGGAG”), e um ácido nucleico no qual aquela base é uma base de timina disposta na primeira posição a partir da extremidade 5' (nome do ácido nucleico (DNA): “TGGGG”).

Nos casos em que uma base é uma base de guanina, o ácido nucleico é composto por cinco bases consecutivas, todas as quais sendo bases de guanina (ou seja, a sequência de bases é “GGGGG”), que é especialmente preferida (nome do ácido nucleico (DNA): “Poli-dG5”).

[37] Nos casos em que o ácido nucleico da presente invenção tem um comprimento de bases de seis bases, o ácido nucleico é constituído por cinco bases de guanina e uma base arbitrária (que também pode ser uma base de guanina), e essa base é arranjada em uma posição arbitrária na sequência. Em particular, o ácido nucleico tem preferencialmente uma constituição contendo uma sequência de cinco bases de guanina consecutivas, e contendo uma base arbitrária em qualquer uma das extremidades. Nos casos em que uma base arbitrária é uma base de guanina, a sequência é composta por seis bases consecutivas, sendo todas elas bases de guanina (ou seja, a sequência de bases é “GGGGGG”), que é mais preferida.

[38] Nos casos em que o ácido nucleico da presente invenção tem um comprimento de bases de sete bases, o ácido nucleico é constituído por cinco bases de guanina e duas bases arbitrárias (que também podem ser bases de guanina), e as duas bases são arranjadas em posições arbitrárias na sequência. De preferência, o ácido nucleico contém uma sequência de cinco bases de guanina consecutivas e contém uma base arbitrária em cada uma das duas extremidades, ou contém as duas bases arbitrárias em qualquer uma das extremidades. Nos casos em que ambas as bases são bases de guanina, a sequência é composta por sete bases consecutivas, todas elas sendo bases de guanina (ou seja, a sequência de bases é “GGGGGGG”), que é mais preferida.

[39] Nos casos em que o ácido nucleico da presente invenção tem um comprimento de bases de oito bases, o ácido nucleico é constituído por seis bases de guanina e duas bases arbitrárias (que também podem ser bases de guanina), e as duas bases são arranjadas em posições arbitrárias na sequência. De preferência, o ácido nucleico contém uma sequência de seis bases de guanina consecutivas e contém uma base arbitrária em cada uma das duas extremidades, ou contém as duas bases arbitrárias em qualquer uma das extremidades. Nos casos em que ambas as bases são bases de guanina, a sequência é composta por oito bases consecutivas, todas elas sendo bases de guanina (ou seja, a sequência de bases é “GGGGGGGG”), que é mais preferencial (nome do ácido nucleico (DNA): “Poli-dG8”).

[40] Nos casos em que o ácido nucleico da presente invenção tem um comprimento de bases de nove bases, o ácido nucleico é constituído por sete bases de guanina e duas bases arbitrárias (incluindo bases de guanina), e as duas bases são arranjadas em posições arbitrárias na sequência. De preferência, o ácido nucleico contém uma sequência de sete bases de guanina consecutivas e contém uma base arbitrária em cada uma das duas extremidades, ou contém as duas bases arbitrárias em qualquer uma das extremidades. Nos casos em que ambas as bases são bases de guanina, a sequência é composta por nove bases consecutivas, todas elas sendo bases de guanina (ou seja, a sequência de bases é “GGGGGGGGG”), que é mais preferida.

[41] Nos casos em que o ácido nucleico da presente invenção tem um comprimento de bases de 10 bases, o ácido nucleico é constituído por sete bases de guanina e três bases arbitrárias (incluindo bases de guanina), e as três bases são arranjadas em posições arbitrárias na sequência. De preferência, o ácido nucleico contém uma sequência de sete bases de guanina consecutivas e contém uma ou duas bases arbitrárias em cada uma das duas extremidades, ou contém as três bases arbitrárias em qualquer uma das extremidades. Nos casos em que todas as três bases são bases de guanina, a sequência é composta por 10 bases consecutivas, todas as quais são bases de guanina, o que é mais preferido (nome do ácido nucleico (DNA): “poli-dG10”; SEQ ID NO: 1).

[42] Nos casos em que o ácido nucleico da presente invenção tem um comprimento de bases de 11 bases, o ácido nucleico é constituído por oito bases de guanina e três bases arbitrárias (incluindo bases de guanina), e as três bases são arranjadas em posições arbitrárias na sequência. De preferência, o ácido nucleico contém uma sequência de oito bases de guanina consecutivas e contém uma ou duas bases arbitrárias em cada uma das duas extremidades, ou contém as três bases arbitrárias em qualquer uma das extremidades. Nos casos em que todas as três bases são bases de guanina, a sequência é composta por 11 bases consecutivas, todas as quais são bases de guanina, o que é mais preferido (SEQ ID NO: 2).

[43] Um segundo aspecto da presente invenção é um reagente de hibridização para ser usado na hibridização de ácido nucleico, reagente esse que compreende o ácido nucleico da presente invenção.

[44] O reagente de hibridização da presente invenção pode ser preparado como uma solução contendo o ácido nucleico da presente invenção.

A concentração do ácido nucleico da presente invenção contido no reagente de hibridização da presente invenção é preferencialmente de 0,3 μM a 100 μM.

Uma vez que uma solução de ácido nucleico com uma alta concentração tem viscosidade, a solução é mais preferencialmente usada em 0,3 μM a 30 μM do ponto de vista da operação experimental e gerenciamento de fabricação. A concentração do ácido nucleico da presente invenção pode ser apropriadamente selecionada dependendo do uso pretendido e do método de uso.

[45] O reagente de hibridização da presente invenção pode conter um polissacarídeo, de preferência dextrano sulfato de sódio. Pode-se esperar que o dextrano sulfato de sódio tenha um efeito que aumente a taxa de reação da hibridização, uma vez que, devido à sua ação de hidratação, o dextrano sulfato de sódio é capaz de simular um estado em que a concentração do ácido nucleico alvo é aumentada. A concentração de dextrano sulfato de sódio é preferencialmente de 1 a 30% em peso, mais preferencialmente de 1 a 20% em peso. E é mais preferencialmente usado em 3 a 10% em peso. O dextrano sulfato de sódio pode ser usado com um peso molecular na faixa de 3.000 a 100.000 Da. De modo mais preferido, o dextrano sulfato de sódio usado tem um peso molecular de 5.000 a 30.000 Da.

[46] O reagente de hibridização da presente invenção pode conter um agente desnaturante. O reagente de hibridização pode conter, por exemplo, formamida ou dimetilssulfóxido. A formamida ou dimetilssulfóxido tem uma ação que enfraquece as ligações de hidrogênio entre as bases de ácido nucleico. A–T e G–C têm números diferentes de ligações de hidrogênio e, ao controlar suas afinidades de ligação, um efeito que melhora a especificidade de ligação na hibridização pode ser esperado. A concentração de formamida é preferencialmente de 1 a 50% em volume, mais preferencialmente de 1 a 30% em volume. Ela é preferencialmente utilizada a 3 a 25% por volume. A concentração de dimetilssulfóxido é preferencialmente de 1 a 40% em volume, mais preferencialmente de 1 a 20% em volume. Ele é preferencialmente utilizado a 3 a 10% em volume.

[47] O reagente de hibridização da presente invenção pode conter um inibidor de adsorção não específica para proteína. Os exemplos preferidos de inibidores incluem albumina de soro bovino (BSA). Pode-se esperar que a BSA tenha um efeito que melhore a relação sinal-ruído ao inibir a adsorção não específica, que gera um ruído de fundo. A concentração do inibidor de adsorção não específica, tal como BSA, é preferencialmente de 1 a 100 mg/mL, mais preferencialmente de 5 a 50 mg/mL. O inibidor é preferencialmente usado a 10 mg/mL.

[48] O reagente de hibridização da presente invenção pode conter uma substância útil para aumentar a sensibilidade da reação de hibridização. Por exemplo, uma vez que as bolhas de ar geradas durante a reação de hibridização podem inibir fisicamente a reação de hibridização, o reagente pode conter um agente antiespumante ou similar que suprime a geração de bolhas de ar. Exemplos do agente antiespumante incluem tensoativos como Tween 20 (nome comercial), Tween 60 (nome comercial) e Triton X-100 (nome comercial); e óleos de silicone. A concentração do agente antiespuma para uso não é limitada e é normalmente de cerca de 0,001 a 10% em peso, de preferência cerca de 0,01 a 1% em peso.

[49] A composição do reagente de hibridização da presente invenção pode ser a mesma que uma composição bem conhecida exceto que o reagente contém o ácido nucleico da presente invenção. Um exemplo de preparação específica do reagente podem ser “6 × SSPE, 0,1% SDS, 25% de formamida, 10 mg/mL de BSA, 10% de dextrano sulfato de sódio, e 15 μM de poli-dG5”, para o qual pode referir-se a um composição descrita em “Ku WC. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, vol. 315, edição 1, págs. 30-37 “.

[50] Um terceiro aspecto da presente invenção é um método de hibridização para ácido nucleico, cujo método compreende a realização da hibridização na presença do inibidor de ligação não específica para ácido nucleico da presente invenção, ou o uso do reagente de hibridização da presente invenção.

[51] O próprio método de hibridização do ácido nucleico pode ser realizado de forma bem conhecida, exceto no que diz respeito à presença do ácido nucleico da presente invenção. Por exemplo, pode-se utilizar um método descrito em “Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque”. Mais especificamente, um ácido nucleico alvo e o inibidor de ligação não específica da presente invenção ou o reagente de hibridização da presente invenção podem ser adicionados a um suporte no qual uma sonda de ácido nucleico de fita complementar é preliminarmente imobilizada. A hibridização pode, então, ser realizada pela incubação em uma determinada temperatura.

Antes da adição do inibidor de ligação não específica da presente invenção ou do reagente de hibridização da presente invenção, o ácido nucleico alvo pode ser desnaturado por calor por um determinado período de tempo em alta temperatura. Com isso, a especificidade da ligação ao ácido nucleico pode ser melhorada ainda mais. Alternativamente, um ácido nucleico alvo, uma sonda de ácido nucleico de fita complementar e o inibidor de ligação não específica da presente invenção ou o reagente de hibridização da presente invenção podem ser misturados e podem então ser incubados a uma determinada temperatura para realizar a hibridização, seguida da imobilização da sonda de ácido nucleico de fita complementar no suporte.

[52] Um quarto aspecto da presente invenção é um método de detecção de ácido nucleico, cujo método compreende as etapas de: hibridizar um ácido nucleico alvo com um ácido nucleico capaz de ligação específica ao ácido nucleico alvo, na presença/coexistência do inibidor de ligação não específica para ácido nucleico da presente invenção, ou usando o reagente de hibridização da presente invenção; e detectar um complexo de ácido nucleico formado pela hibridização.

[53] As etapas de hibridização de um ácido nucleico alvo com um ácido nucleico capaz de se ligar especificamente a ele pode ser realizada pela aplicação do método de hibridização de ácido nucleico descrito no terceiro aspecto da presente invenção.

[54] A etapa de detecção de um ácido nucleico complexo formado pela etapa de hibridização pode ser realizada por aplicação de um método de detecção para ácido nucleico bem conhecido. Por exemplo, na etapa de hibridização, o ácido nucleico alvo pode ser preliminarmente marcado com uma molécula de marcação, para permitir a detecção da quantidade do complexo de ácido nucleico como a quantidade da molécula de marcação.

Exemplos de moléculas de marcação que podem ser utilizadas para esse fim incluem substâncias fluorescentes, como corantes orgânicos fluorescentes, corantes fosforescentes, quantum dots, e proteínas fluorescentes; proteínas quimioluminescentes; radioisótopos; espécies redox capazes de dar e receber elétrons; as próprias enzimas, como a fosfatase alcalina e peroxidase de rábano; e monômeros de ácido nucleico contendo essas moléculas de marcação. Nos casos de um monômero de ácido nucleico contendo uma molécula de marcação, a marcação do ácido nucleico alvo é possível introduzindo enzimaticamente o monômero em uma extremidade do ácido nucleico alvo.

[55] Para a detecção do complexo de ácido nucleico, uma substância fluorescente é preferencialmente utilizada como uma molécula de marcação a partir do ponto de vista de sensibilidade e simplicidade. Neste caso, a quantidade do complexo de ácido nucleico pode ser medida como um valor de sinal de fluorescência emitida a partir da substância fluorescente, usando um microscópio de fluorescência, leitor de placa ou semelhante.

[56] Na detecção do complexo de ácido nucleico, a ligação entre o ácido nucleico alvo e uma sonda de ácido nucleico capaz de se ligar especificamente ao mesmo também pode ser detectada como uma mudança no comprimento de onda de fluorescência de um intercalante de ácido nucleico.

Exemplos do intercalante de ácido nucleico incluem brometo de etídio, “SYBR (marca registrada) Verde” e seus substitutos. Por exemplo, após uma etapa de hibridização usando uma matriz de ácido nucleico, a matriz de ácido nucleico na qual um complexo entre o ácido nucleico alvo e a sonda de ácido nucleico é formado pode ser imersa em uma solução de intercalante de ácido nucleico e, em seguida, a matriz pode ser lavada com um tampão ou semelhante. Depois disso, a quantidade do complexo de ácido nucleico pode ser medida como um valor de sinal de uma fluorescência emitida a partir do intercalante de ácido nucleico, usando um microscópio de fluorescência ou um leitor de placas.

[57] A detecção e do complexo de ácido nucleico pode ser realizada por um método conhecido, tal como hibridização in situ, hibridização de colônias, dot blotting, Southern blotting ou Northern blotting, ou utilizando uma matriz de ácido nucleico (microarranjo de DNA, chip de DNA, ou semelhantes) em que um ácido nucleico (sonda de ácido nucleico) que se liga especificamente ao ácido nucleico alvo, e que tem uma sequência de base complementar ao ácido nucleico alvo, é imobilizado em um suporte.

[58] Como matriz de ácido nucleico, pode-se utilizar um produto disponível comercialmente. Exemplos de tal produto incluem “GeneChip (marca registrada) Arrays”, fabricado pela Affymetrix Inc.; chips de oligo DNA fabricados pela Agilent Technologies, Inc.; e “3D-Gene (marca registada)”, fabricado pela Toray Industries, Inc. É preferível o uso do “3D-Gene (marca registrada)”, fabricado pela Toray Industries, uma vez que ele utiliza um suporte de resina, com o qual a adsorção física de ácido nucleico pode ser reduzida, e uma vez que alcança eficiência de agitação para a solução de hibridização melhorada pelo uso de microesferas para a agitação.

EXEMPLOS

[59] A presente invenção é descrita concretamente por meio dos Exemplos a seguir. No entanto, a presente invenção não está limitada ao escopo dos exemplos, e os exemplos apenas descrevem alguns dentre os diversos exemplos de realização que podem ser idealizados para a invenção reivindicada.

EXEMPLOS 1 E 2, EXEMPLOS COMPARATIVOS 1 E 2

[60] Como matriz de ácido nucleico, foi usado um microarranjo de DNA (DNA microarray) fabricado pela Toray Industries, Inc. “3D-Gene (marca registrada) com chip oligo miRNA humano (compatível com miRBase versão 21)”. Como ácido nucleico alvo, foi selecionado o HSA-miR-6858-5p (nº de acesso no miRBase: MIMAT0027616, SEQ ID NO: 3), que é um miRNA que potencialmente provoca hibridização cruzada. Estes foram usados para avaliar o efeito de inibição de hibridização cruzada do inibidor de ligação não específica para ácido nucleico da presente invenção na reação de hibridização.

[61] O ácido nucleico alvo HSA-miR-6858-5p foi quimicamente sintetizado como um produto com o grupo fosfato na extremidade 5' modificado (síntese personalizada pela Fasmac Co., Ltd.; grau de purificação HPLC). O ácido nucleico alvo foi dissolvido em água destilada a 2,5 fmol/μL e uma porção de 5 fmol do mesmo foi submetida a marcação por fluorescência usando um kit de marcação “miRNA 3D-Gene (marca registrada)” (Toray Industries, Inc.).

Posteriormente, de acordo com o protocolo padrão do kit, a hibridização foi realizada usando a matriz de ácido nucleico.

[62] Como inibidor da ligação não específica para ácido nucleico, foi utilizado o “poli-dG5” (síntese personalizada pela Fasmac Co., Ltd.; grau de purificação em coluna de fase reversa). O inibidor foi dissolvido em “tampão de hibridização de miRNA V3” para uma concentração final de 1 μM (Exemplo 1) ou 10 μM (Exemplo 2), para preparar soluções de hibridização a serem usadas na hibridização.

[63] Além disso, DNA de esperma de salmão (Invitrogen, número de catálogo, 15632011) foi dissolvido a uma concentração final de 92 μg/mL (Exemplo Comparativo 1), ou o iniciador aleatório “Random Primer (N) 9” (Takara Bio Inc., número de catálogo, 3802) foi dissolvido para uma concentração final de 6,5 μg/mL (correspondendo a 2,2 μM) (Exemplo Comparativo 2), para preparar soluções de hibridização como controles para a comparação a ser utilizada na hibridização.

[64] O microarranjo de DNA após a hibridização foi submetido a um scanner de microarranjos (Microarray Scanner) (fabricado pela Toray Industries, Inc.) para medir a intensidade de fluorescência. O scanner foi utilizado com as seguintes configurações: saída do laser, 100%; tensão fotomultiplicadora, AUTO. Usando o software de digitalização “3D-Gene Extraction” (Toray Industries, Inc.), a intensidade de fluorescência de cada ponto na imagem digitalizada obtida foi digitalizada como um valor de sinal. A relação entre o valor do sinal do ácido nucleico alvo e o valor de sinal do conjugado de HSA-miR-4498 (nº de acesso no miRBase: MIMAT0019033, SEQ ID NO: 4), que exibiu o sinal mais elevado entre os sinais detectados como um resultado de hibridização cruzada (valor do sinal de hsa-miR-6858- 5p/valor do sinal de hsa-miR-4498), foi calculada como a relação S/N.

[65] Os resultados são mostrados na Figura 1. Em comparação com a relação S/N (1,58) no caso em que o inibidor de ligação não específica para ácido nucleico não foi adicionado, a relação S/N no caso em que o DNA de esperma de salmão foi adicionado foi melhorada para 2,78, indicando a produção de um efeito de inibição de hibridização cruzada. A relação S/N no caso em que o iniciador aleatório N(9) (Random Primer N (9)) foi adicionado foi de 1,33, indicando que não houve produção de um efeito de inibição de hibridização cruzada. Em contrapartida, nos casos em que o inibidor de ligação não específica da presente invenção, poli-dG5, foi usado na concentração de 1 μM ou 10 μM, uma relação S/N de 1,95 ou 2,47, respectivamente, foi obtida, indicando que o efeito de inibição da hibridização cruzada aumentou conforme a concentração do inibidor adicionado aumentou. Assim, verificou-se que o poli-dG5 exibe um efeito de inibição da hibridização cruzada, pelo menos em uma concentração não inferior a 1 μM.

EXEMPLOS 3 A 8

[66] A hibridização do ácido nucleico alvo HSA-miR-6858-5p foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto que na preparação da solução de hibridização para ser utilizada na hibridização, “Poli-dG5” (síntese personalizada pela Fasmac Co., Ltd.; grau de purificação por HPLC) foi adicionado a uma concentração final de 10 μM (Exemplo 3) ou 15 μM (Exemplo 4); “Poli-dG7” (síntese personalizada pela Fasmac Co., Ltd.; grau de purificação por HPLC) foi adicionado a uma concentração final de 10 μM (Exemplo 5) ou 15 μM (Exemplo 6); ou “Poli-dG10” (síntese personalizada pela Fasmac Co., Ltd.; grau de purificação por HPLC; SEQ ID NO: 1) foi adicionado a uma concentração final de 10 μM (Exemplo 7) ou 15 μM (Exemplo 8); e como um inibidor de ligação não específica para ácido nucleico, para avaliar o efeito de inibição de hibridização cruzada.

[67] Os resultados são mostrados na Figura 2. Nos casos em que poli-dG5 foi adicionado a 10 μM ou 15 μM, a relação S/N foi melhorada para 3,11 ou 3,92, respectivamente, indicando a produção de um efeito de inibição da hibridização cruzada superior em relação ao DNA de esperma de salmão (Exemplo Comparativo 1). Nos casos em que poli-dG7 foi adicionado a 10 μM ou 15 μM e nos casos em que poli-dG10 foi adicionado a 10 μM ou 15 μM, a relação S/N foi melhorada em comparação com o caso em que nenhum inibidor foi adicionado. A partir desses resultados, verificou-se que os ácidos nucleicos com uma sequência de bases de guanina consecutivas com um comprimento de bases de 5 a 10 bases têm um efeito de inibição de hibridização cruzada e que o poli-dG5 (15 μM) exibe um efeito inibidor da hibridização cruzada notavelmente alto.

EXEMPLOS 9 A 12

[68] A hibridização do ácido nucleico alvo, HSA-miR-6858-5p, foi realizada da mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que, na preparação da solução de hibridização a ser utilizada para a hibridização, “poli- dG5” (síntese personalizada pela Fasmac Co., Ltd.; grau de purificação por coluna de fase reversa) (Exemplo 9), “GGAGG” (síntese personalizada pela Fasmac Co., Ltd.; grau de purificação por HPLC) (Exemplo 10), “GGGAG” (síntese personalizada pela Fasmac Co., Ltd.; grau de purificação por HPLC) (Exemplo 11), ou “TGGGG” (síntese personalizada pela Fasmac Co., Ltd.; grau de purificação por HPLC) (Exemplo 12) foi adicionado a uma concentração final de 15 μM como um inibidor de ligação não específica para ácido nucleico, para avaliar o efeito de inibição da hibridização cruzada.

[69] Os resultados são mostrados na Figura 3. Qualquer um dos inibidores de ligação não específica para ácido nucleico da presente invenção melhora a relação S/N em comparação com o caso em que não se adicionou qualquer inibidor. A partir desses resultados, foi descoberto que os ácidos nucleicos contendo bases de guanina em altas proporções geralmente têm um efeito de inibição de hibridização cruzada de forma semelhante aos ácidos nucleicos compostos apenas de bases guanina, como o poli-dG5, que mostrou um alto efeito inibidor da hibridização cruzada.

EXEMPLO 13

[70] Foi avaliada a influência de uma diferença no lote de produção do inibidor de ligação não específica para ácido nucleico da presente invenção sobre o efeito da inibição da hibridização cruzada.

[71] Como inibidor da ligação não específica para ácido nucleico, o “poli-dG5” (síntese personalizada pela Fasmac Co., Ltd.; grau de purificação em coluna de fase reversa) foi fornecido a partir de quatro lotes de produção diferentes. As soluções de hibridização foram preparadas da mesma maneira que no Exemplo 4 (ou Exemplo 9), de modo que cada solução continha em cada lote uma concentração final de 15 μM. Cada lote foi submetido à hibridização por quatro vezes (N = 4; N = 16 no total na medição para os quatro lotes).

[72] Os resultados são mostrados na Figura 4. A média e o valor CV (coeficiente de variação) da relação S/N de cada lote (N = 4) de poli- dG5 foram os seguintes. No lote 1, a média foi 3,75 e o valor CV foi 4,25%. No lote 2, a média foi 3,79 e o valor CV foi 3,82%. No lote 3, a média foi 3,69 e o valor CV foi 4,22%. No lote 4, a média foi 3,60 e o valor CV foi 5,33%. Como um todo, os quatro lotes apresentaram uma média de 3,71 e um valor CV de 4,47%. O inibidor de ligação não específica para ácido nucleico da presente invenção não exibiu grande diferença no desempenho entre os lotes de produção, indicando a produção estável de um efeito de inibição da hibridização cruzada.

EXEMPLO COMPARATIVO 3

[73] Como inibidor de ligação não específica para o ácido nucleico que tem sido utilizado convencionalmente, o DNA de esperma de salmão (Invitrogen, número de catálogo, 15632011) foi fornecido a partir de quatro lotes de produção diferentes. As soluções de hibridização foram preparadas da mesma maneira que no Exemplo 13, de modo que cada solução continha em cada lote uma concentração final de 92 μg/mL. Cada lote foi submetido à hibridização por quatro vezes (N = 4; N = 16 no total na medição para os quatro lotes).

[74] Os resultados são mostrados na Figura 5. A média e o valor CV da relação S/N de cada lote (N = 4) de DNA de esperma de salmão foram os seguintes. No lote 1, a média foi 2,43 e o valor CV foi 3,24%. No lote

2, a média foi 2,72 e o valor CV foi 5,26%. No lote 3, a média foi 2,90 e o valor CV foi 3,20%. No lote 4, a média foi 2,63 e o valor CV foi 5,51%. Como um todo, os quatro lotes apresentaram uma média de 2,67 e um valor CV de 7,75%. Demonstrou-se que o DNA de esperma de salmão, que tem sido utilizado convencionalmente, exibe grandes diferenças entre os lotes com relação ao efeito de inibição da hibridização cruzada, quando comparado com o inibidor de ligação não específica para ácido nucleico da presente invenção.

TEXTO LIVRE DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[75] SEQ ID NO:1: Sequência projetada, poli-dG10.

[76] SEQ ID NO:2: Sequência projetada.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. INIBIDOR DE LIGAÇÃO NÃO ESPECÍFICA PARA ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por compreender um ácido nucleico que possui um comprimento de bases de 2 a 11 bases; e no qual o teor de base(s) de guanina e/ou base(s) de guanina metilada em toda a sequência de bases não é inferior a 70%.

2. INIBIDOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ácido nucleico ter um comprimento de bases de 5 a 7 bases.

3. INIBIDOR de ligação não específica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelas bases de guanina e/ou bases de guanina metilada serem bases de guanina.

4. INIBIDOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo ácido nucleico ter uma sequência de cinco bases guanina consecutivas.

5. INIBIDOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por todas as bases no ácido nucleico serem guanina.

6. INIBIDOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo ácido nucleico ser DNA.

7. REAGENTE DE HIBRIDIZAÇÃO PARA ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por compreender o inibidor conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. MÉTODO DE HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, que compreende a hibridização de um ácido nucleico alvo com um ácido nucleico capaz de se ligar especificamente ao ácido nucleico alvo, caracterizado pelo inibidor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, coexistir na hibridização.

9. MÉTODO DE DETECÇÃO DE UM ÁCIDO NUCLEICO alvo, caracterizado por compreender:

- uma etapa de hibridização da hibridização do ácido nucleico alvo com um ácido nucleico capaz de se ligar especificamente ao ácido nucleico alvo; e - uma etapa de detecção da detecção de um complexo de ácido nucleico formado na etapa de hibridização; em que o inibidor conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 coexiste na referida etapa de hibridização.

10. MÉTODO DE DETECÇÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por utilizar uma matriz de ácido nucleico.

11. USO DE UM ÁCIDO NUCLEICO que tem um comprimento de bases de 2 a 11 bases e no qual o teor de base(s) de guanina e/ou base(s) de guanina metilada em toda a sequência de bases não é inferior a 70%, caracterizado por ser para uso como um inibidor de ligação não específica para ácido nucleico.

12. USO DE UM ÁCIDO NUCLEICO que tem um comprimento de bases de 2 a 11 bases e no qual o teor de base(s) de guanina e/ou base(s) de guanina metilada em toda a sequência de bases não é inferior a 70%, caracterizado por ser para a produção de um inibidor de ligação não específica para ácido nucleico.