CN101956017B - 一种检测2型糖尿病易感基因18个位点突变的基因芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测2型糖尿病易感基因18个位点突变的基因芯片。该芯片以固定在固相载体上的SEQIDNo.1~36所示的探针作为检测系统,并进一步包括阳性对照、阴性对照和平行对照组成质控系统包。本发明还同开了该基因芯片检测的配套引物,这些引物可在同一退火温度进行PCR反应,扩增同时完成Cy3标记,经过1次杂交反应,即可检测18个基因位点。检测结果准确、快速、效率高,能够系统地筛选目前国内外报导的2型糖尿病易感基因18个位点突变,适用于大样本低成本2型糖尿病易感基因关联分析。
Description
技术领域
本发明涉及基因芯片检测领域,具体涉及一种快速检测2型糖尿病易感基因多个位点突变的基因芯片,位点涵盖目前明确与2型糖尿病相关易感基因。
背景技术
糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍所致的复杂代谢性疾病,发病率逐年上升,我国的糖尿病发病人数位居世界第二,其中90%为2型糖尿病,且发病年龄趋向年轻化。持续高血糖所引发的慢性并发症已成为肾功能衰竭、失明和心脑血管疾病的主要原因,给个人、社会和国家医疗保健带来了沉重的负担,成为全球性的社会卫生和经济问题。由于T2DM具有家族性特征,且不同种族间发病率存在明显差异,另外同卵双生和异卵双生个体发病率和病情也不同,因此遗传成分在该病的发病中起重要作用。因此,通过连锁或关联分析确定糖尿病的易感或致病基因,对于从基因角度阐释糖尿病发病机制有重要意义。
基因芯片是近年来兴起的一项重要生物技术,越来越多地应用于基因多态性分析和诊断[1][2]。随着基因芯片技术的发展,到2007年[3]用全基因组SNP基因芯片进行糖尿病易感基因筛查的研究迅速增多,Diabetes Gene DiscoveryGroup[4],Finland-US Investigation of NIDDM Genetics(FUSION)[5],deCODEGenetics[6],DiaGen[7]等研究使用Illumina 100K或Illumina 300KSNP基因芯片,Diabetes Genetics Initiative[8],Wellcome Trust Case Control Consortium[9],Pima[10],Starr County,Texas[11],Old Order Amish[12],Framingham Health Study[13]等研究使用Affymetrix 100K或Affymetrix 500K芯片,Japanese multi-disease collaborativegenome scan[14]使用JSNP Genome Scan 100K SNP芯片,BioBank Japan[15]使用定制的268K SNP芯片。
这些研究中发现了许多新的易感基因位点与2型糖尿病有关,总结目前已发现的与2型糖尿病有关的易感基因位点(risk variants)主要有以下几类:
(1)通过候选基因关联分析(candidate-gene associations)确定的易感基因位点:Pro12Ala位于过氧化物酶体增殖活化受体gamma基因(PPARG,peroxisome proliferator-activated receptor gamma),该基因编码thiazolidinedione类胰岛素增敏剂的靶点。Glu23Lys位于内向整流型钾离子通道亚家族J基因(KCNJ11,the potassium inwardly rectifying channel,subfamily J,member 11)该基因编码磺脲类降糖药的靶点。
(2)通过基于微卫星多态性关联分析确定的易感基因位点:rs7903146位于TCF7L2基因内含子区,该基因编码Wnt信号通路中一种重要的转录因子。该位点在目前所有已知2型糖尿病相关的易感基因中效应最强。
(3)通过大规模候选通路研究确立的易感基因位点:rs10010131位于WFS1(Wolfram syndrome 1)基因内含子外显子交界,该基因可能参与调解beta细胞功能。rs757210位于HNF1B(肝细胞核因子1B)基因内含子区,该基因与胰岛发育和功能有关。
(4)通过全基因关联分析确定的易感基因位点:rs8050136位于FTO基因内含子区;rs111875位于HHEX/IDE(hematopoietically expressed homeobox[HHEX]/insulin degrading enzyme)基因下游7.7kb处;rs7754840位于CDKAL1(CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1)基因内含子区;rs4402960位于IGF2BP2(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2)基因内含子区;rs10811661位于CDKN2A/B(cyclin-dependent kinase inhibitors 2a and 2b)基因上游125kb处;rs13266634编码SLC30A8(solute carrier family 30,member 8)基因R325W突变。
(5)通过对全基因组关联分析进行meta分析确定的易感基因位点:rs10923931位于NOTCH2(Notch homologue 2,Drosophila)基因内含子区,该基因参与胰腺发育;rs4607103位于ADAMTS9(ADAM metallopeptidase withthrombospondin type 1 motif 9)基因上游38kb处;rs12779790临近CAMK1D(calcium/calmodulin-dependent protein kinase 1D)基因;rs864745位于JAZF1(juxtaposed with another zinc finger gene 1)基因内含子区;rs7961581位于TSPAN8/LGR5(tetraspanin 8(TSPAN8)/leucine-rich repeat-containing G-proteincoupled(LGR5))基因内含子区;rs7578597编码THADA(thyroid adenomaassociated)基因T1187A突变。
如何高通量简便快速的对这些已知易感基因位点进行分型,对于验证不同人群这些位点相关性差异,或重复关联分析结果,即(replication studies)有重要意义。并且对大样本人群进行这些位点分型,可判断通过这些位点从基因角度预测2型糖尿病的效能(Meigs,J.B.,Prediction of type 2 diabetes:the dawn ofpolygenetic testing for complex disease.Diabetologia,2009.52(42):p.568-570.)。例如Valeriya Lyssenko等(Narayan,K.M.V.and M.B.Weber,Clinical Risk Factors,DNA Variants,and the Development of Type 2 Diabetes.New England Journal ofMedicine,2009.360(13):p.1360-1360.)对16,061名瑞典人和2770芬兰人分析16种SNP(TCF7L2(rs7903146),KCNJ11(rs5219),PPARG(rs1801282),CDKAL1(rs7754840),IGF2BP2(rs4402960),CDKN2A/CDKN2B(rs10811661),FTO(rs9939609),HHEX(rs1111875),SLC30A8(rs13266634),WFS1(rs10010131),JAZF1(rs864745),CDC123/CAMK1D(rs12779790),TSPAN8/LGR5(rs7961581),THADA(rs7578597),ADAMTS9(rs4607103),and NOTCH2(rs10923931).)基因型,以检测这些易感基因位点预测2型糖尿病的效能,发现在常规易感因素上,加入易感基因信息,可提高预测效能(加入易感基因信息后,ROC曲线下面积AUC由0.74升为0.75,P=1.0×10-4)。Lango等(Lango,H.,et al.,Assessing thecombined impact of 18 common genetic variants of modest effect sizes on type 2diabetes risk.Diabetes,2008.57(11):p.3129-35.)对2,598名对照和2,309名2型糖尿病患者分析18种SNP分型发现,以携带10-12个易感等位基因组为基准,携带≥25个等位基因组OR为4.2(95%CI 2.11-8.56)。提示携带大量易感等位基因个体患病可能性更大。
对传统的糖尿病易感基因检测方法主要包括:PCR-RFLP、AS-PCR和DNA测序方法等,这些方法在基因突变检测中起了重要作用,但普遍存在着明显的不足,传统的糖尿病易感基因检测方法主要包括:PCR-RFLP、AS-PCR和DNA测序方法等,这些方法在基因突变检测中起了重要作用,但普遍存在着明显的不足,诸如检测基因位点有限、耗时长、操作繁琐等,不适用于大批量、系统检测,给糖尿病的临床诊断带来困难。
PCR-RFLP方法是经典的生物学方法,但由于限制性内切酶识别位点有限,难以实现同时检测多个位点,且耗时较长;AS-PCR方法虽能准确检测突变,但要求扩增条件非常优化,且引物要有高度的特异性,否则易出现假限性或假阳性结果;DNA测序虽是目前公认的检测新突变的金标准,但由于其对特殊结构DNA序列无法测序,而且只有异质性水平>25%时才能检出,而临床常用标本外周血白细胞中异质性水平通常都达不到这个标准,因此很易漏检。
目前常用的SNaPshot和Sequenom技术,应用成本高,则需要购买昂贵的专门设备。本课题组采用定制基因芯片技术,通过自动化基因芯片点样仪将预先合成的探针点样于醛基修饰的玻璃载片上,构成专门针对2型糖尿病大样本关联分析用的基因芯片,为检测该芯片检测的准确性和重复性,本发明对外周血样本应用该芯片进行检测,并测序验证芯片检测结果,芯片检测结果与测序结果相符。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测2型糖尿病易感基因18个位点突变的基因芯片。
本发明的另一个目的在于提供一种包括上述基因芯片的试剂盒。
为实现上述目的,本发明首先提供一种检测2型糖尿病18基因位点突变的基因芯片,其包括固定在固相载体上的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针,其核苷酸序列如SEQ ID No.1~36所示。所述固相载体优选为醛基玻片。所述探针5’端有15个多聚T,5’端经修饰氨基基团后固定在醛基玻片上。
上述基因芯片点阵布控为:玻璃芯片为117个样点组成的10行×12列的矩阵见附图1,包括质控系统和检测系统,质控系统为:(1)芯片阳性对照,为SEQID No.1~14探针的等量混合的溶液,设计布控于左下角,作为阳性对照点,共3个阳性对照样点;(2)芯片平行对照,采用25uM的探针溶液点样,每种探针平行点3个点(3个重复),即每3个点检测一个等位基因型;左右共6个点,共同构成一个基因位点检测区;(3)芯片阴性对照,为点样溶液以及双蒸水,各三个点,共6个阴性对照样点,位于右下角。
本发明还进一步提供所述基因芯片的制备方法,其包括如下步骤:合成SEQID No.1~36所示的探针,探针在合成时5’端多合成15个多聚T,并经氨基基团修饰,将修饰后的探针用TE Buffer制成50uM的溶液,点样前按1∶1比例与点样溶液混合,终浓度为25μM;将玻片醛基化修饰;将终浓度为25μM的探针溶液按点样矩阵排列在96孔板;PBS溶液清洗点样仪点样针,校正,按图1矩阵点样;预点20次,点间间距200um,室温水合固定24h。在固定后按下述步骤进行洗涤:室温下2×SSC-0.1%SDS洗涤液中上下提放2-3次,1×SSC-0.1%SDS洗涤液中上下提放2min,0.2×SSC洗涤液中上下提放2min,双蒸水中抽提2-3次,离心甩干。
进一步,本发明还提供一种含有上述基因芯片的检测试剂盒,其还包括用于扩增易感基因位点所在区域的引物,引物序列为SEQ ID No.37~72所示的寡核苷酸,所扩增区域为SEQ ID No.73~90所示。
此外其还可以包括以下试剂中的一种或多种:杂交液、封闭液、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶以及MgCl2。
具体地,为实现上述目的,本发明采用以下技术步骤:
(1)通过对2型糖尿病易感基因位点突变进行筛选,应用Primer3.0(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)和NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)辅助设计相关探针和引物,使目的片段扩增、杂交反应能在同一条件下进行。其核苷酸序列如SEQ ID No.1~72所示。这些探针分为易感位点检测探针和非易感位点检测探针,对下述SNP位点:rs1801282、rs5219、rs7903146、rs10010131、rs757210、rs4430796、rs8050136、rs1111875、rs7754840、rs4402960、rs10811661、rs13266634、rs10923931、rs4607103、rs7578597、rs864745、rs12779790、rs7961581(具体如表1所示)。
(2)芯片点阵布控:玻璃芯片为117个样点组成的10行×12列的矩阵,包括质控系统和检测系统,质控系统为:(1)芯片阳性对照,为所选的各寡核苷酸探针的等量混合的溶液(SEQ ID No.1~36),设计布控于左下角,共3个阳性对照样点;(2)芯片平行对照,采用25uM的探针溶液,各位探针平行点3个点,即每3个点检测一个等位基因型;左右共6个点,共同构成一个基因位点检测区;(3)芯片阴性对照,为点样溶液(Micro Spotting Solution Plus 2X,Telechem)以及双蒸水,各三个点,共6个阴性对照样点,位于右下角,探针具体排布见图1。
(3)包括玻片醛基修饰,点样,固定,DNA模板提取,PCR扩增和标记,杂交,洗涤,荧光检测在内的多种复杂反应。
(4)荧光信号检测,通过ScanAlyze软件分析各点荧光强度,通过易感位点和非易感位点荧光信号强度步骤,确定基因型。
一种检测2型糖尿病18个易感基因位点的微阵列芯片制备步骤是:
(1)以醛基玻片为载体:
玻片经铬酸洗液浸泡过夜,去除表面有机物等杂质,然后蒸馏水清洗,再用25%氨水浸泡过夜,水洗。pH为4.5氨丙基三甲氧基硅烷的95%乙醇浸泡20min,再用95%乙醇超声清洗,纯水超声清洗,115℃烘烤45min,最后在5%的戊二醛溶液中50min,超声10min,水洗两次,置于室温干燥备用。
(2)探针和引物设计
本发明研制的微阵列芯片可检测目前国内外报道的与2型糖尿病相关的18个易感基因位点。应用Primer3.0(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)和NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)辅助设计相关探针和引物,设计探针36条,退火温度为58±2℃;以及扩增相应片段的18对引物。位点涵盖了目前明确的与2型糖尿病相关的易感位点。
(3)芯片点阵布控
玻璃芯片为117个样点组成的10行×12列的矩阵,包括质控系统和检测系统,质控系统为:(1)芯片阳性对照,为所选的各寡核苷酸探针的等量混合的溶液(SEQ ID No.1~36),设计布控于左下角,共3个阳性对照样点;(2)芯片平行对照,采用25uM的探针溶液,各位探针平行点3个点,即每3个点检测一个等位基因型;左右共6个点,共同构成一个基因位点检测区;(3)芯片阴性对照,为点样溶液(Micro Spotting Solution Plus 2X,Telechem)以及双蒸水,各三个点,共6个阴性对照样点,位于右下角,探针具体排布见图1。
(4)芯片的点样,固定和洗涤
将终浓度为25μM的探针溶液按点样矩阵(点样矩阵排布见图1)排列在96孔板;PBS溶液清洗点样仪(SpotBot3,Telechem)点样针,校正,按图1矩阵点样;预点20次,点间间距200um,室温水合固定24h。所述芯片洗涤过程为:室温下2×SSC-0.1%SDS洗涤液中上下提放2-3次,1×SSC-0.1%SDS洗涤液中上下提放2min,0.2×SSC洗涤液中上下提放2min,双蒸水中抽提2-3次,离心甩
一种检测2型糖尿病18个易感基因位点的微阵列芯片检测步骤是:
(1)收取病人标本,提取DNA模板。
(2)采用SEQ ID No.37~72所示引物,扩增目的片段。PCR反应液是由10×buffer,10μmol/L的正向引物,10μmol/L反向引物,25mmol/L MgCl2,10mmol/LdNTPs(含0.5nM Cy3-dCTP,由Amersham公司提供)和无菌双蒸水组成。扩增条件为95℃预变性3min,35个循环(94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s),72℃延伸7min。
(3)PCR产物100℃变性,骤冷。
(4)42℃预杂交30min封闭非特异性结合;预加热变性的Cy3-DNA与杂交液(DIG Easy Hyb,Roche)按1∶10混匀,42℃杂交4h,每个样本同时用两个相同矩阵重复检测。
(5)室温下2×SSC-0.1%SDS洗涤液中上下提放2-3次,1×SSC-0.1%SDS洗涤液中上下提放2min,0.2×SSC洗涤液中上下提放2min,双蒸水中抽提2-3次,离心甩干。
(6)LuxScan 10K-A(CapitalBio,Beijing)芯片扫描仪在570nm波长采集芯片图像(分辨率10um,激光器功率95%,PMT增益650)。所得结果通过ScanAlyze软件分析,获得芯片分析数据。根据荧光信号强度比值(易感等位基因各点荧光强度均值/非易感等位基因各点荧光强度均值,具体分析方法同ScanAlyze软件手册介绍),若比值大于3则判为易感等位基因纯合型,在0.3以下非易感等位基因纯合型,介于0.3-3之间,判为杂合型。(比值衡量标准参考Du W,Marsac C,Kruschina M,Ortigao F,Florentz C.Functionalized self-assembled monolayer ongold for detection of human mitochondrial tRNA gene mutations.Anal Biochem.2003 Nov 1;322(1):14-25.)
(7)该芯片具有下优点:①一张芯片可同时检测1-5份不同标本的18个易感基因位点;②操作简单,标记扩增同步完成,在保证目的片段丰度同时,完成标记反应,无需显色;③可检测目前已明确的18个易感基因位点,无漏检和误诊。④根据野生型和突变型荧光强度比值,以及背景信号强度,判断被检位点基因型,结果科学客观。各位点片内平行对照点间荧光强度一致性好,变异系数小于6.4%,片间同位点间变异系数小于8.63%,检测结果假阳性率为2.65%,假阴性率为0.76%;⑤成本低,反应体系微量,一次杂交反应体系为100微升。
发明的优点和效果:
本发明研制了一种快速检测18个2型糖尿病相关位点的微阵列芯片。该芯片可:①18对引物扩增和Cy3荧光染料标记可在同一条件下进行,在保证后续反应所需DNA量的同时完成标记,省时并降低了实验成本。②Cy3荧光染料标记,洗片后可直接荧光扫描仪观察结果,无需显色,根据两种探针杂交信号强弱,可判定被测位点基因型,省时。③探针退火温度为58±2℃,在42℃杂交可获得满意的杂交效果;④芯片包含检测系统和质控系统两个体系,可系统检测2型糖尿病相关18个易感基因位点,并有质量控制;位点涵盖了目前已确定的与2型糖尿病易感基因明确相关的基因位点。相对于目前常用的SNaPshot和Sequenom技术,该芯片方法不需要特殊的昂贵仪器,实验室常规的荧光显微镜即可进行检测。该芯片适用于大样本低成本2型糖尿病易感基因关联分析。
附图说明
图1为2型糖尿病易感基因18个位点突变位点检测微阵列芯片点样矩阵图,其中:●为阳性对照;○为阴性对照(双蒸水);为点样液对照(点样溶液Micro Spotting Solution Plus 2X,Telechem);◎为非易感等位基因检测探针;⊙为易感等位基因检测探针;
图2为Cy3标记18个突变位点检测微阵列玻璃芯片检测结果,同一标本平行做两矩阵重复对照。
图3为微阵列芯片检测的18个易感基因位点测得基因型测序验证结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
探针和引物设计
本发明通过对2型糖尿病易感基因位点突变进行筛选,设计相关探针,经过反复试验筛选和验证,得到了一组杂交特异性高准确度好的探针,探针序列如表1所示。
表1 18个位点野生型和突变型探针序列
探针在合成时5’端多合成15个多聚T,并经氨基基团修饰(采用标准亚磷酰氨化学方法,5′或3′氨基修饰用5′-Amino-Modifier C6,TFA-protected在合成后的最后一步引入)。芯片所需的多聚T修饰探针(探针由InvitrogenG公司合成)用TE Buffer(100mM Tris-Cl pH 8.0,10mM EDTA pH 8.0)重悬为浓度为50μM的溶液,点样前按1∶1比例与点样缓冲液(Micro Spotting Solution Plus 2X,Telechem)混合,终浓度为25μM;。
同时根据相关SNP位点设计引物,进过反复筛选和验证,得到一组用于扩增包含突变位点目的片段的特异引物(表2)。这些引物扩增获得片段长度集中在150~250bp左右,长度适中。并且这些引物可在同一反应条件下完成PCR扩增反应,所得到的混合产物能很好的满足杂交的需要,为芯片杂交节省了时间并降低了成本。
表2涵盖18个2型糖尿病易感基因位点突变目的片段特异性扩增引物
实施例2
玻璃介质基因芯片制备
玻片醛基化修饰;将预先合成的探针(探针由InvitrogenG公司合成)用TEBuffer(100mM Tris-Cl pH 8.0,10mM EDTA pH 8.0)重悬为浓度为50uM的溶液,点样前按1∶1比例与点样缓冲液(Micro Spotting Solution Plus 2X,Telechem)混合,终浓度为25μM;将终浓度为25μM的探针溶液按点样矩阵(点样矩阵排布见图1)排列在96孔板;PBS溶液清洗点样仪(SpotBot3,Telechem)点样针,校正,按图1矩阵点样;室温水合固定。
实施例3
易感基因位点检测方法
(1)样品DNA提取
获取外周血DNA,利用血液基因组DNA提取试剂盒(血液基因组提取试剂盒DP318-02,TIANGEN),按厂商说明书操作,提取基因组DNA。
(2).目的DNA扩增,杂交,检测:
PCR反应液是由10×buffer,10μmol/L的正向引物,10μmol/L反向引物,25mmol/LMgCl2,10mmol/L dNTPs(含0.5nM Cy3-dCTP,由Amersham公司提供)和无菌双蒸水组成。扩增条件为95℃预变性3min,35个循环(94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s),72℃延伸7min;100℃变性,骤冷;42℃预杂交30min封闭非特异性结合;预加热变性的Cy3-DNA与杂交液(DIG Easy Hyb,Roche)按1∶10混匀,42℃杂交4h,每个样本同时用两个相同矩阵重复检测;室温下2×SSC-0.1%SDS洗涤液中上下提放2-3次,1×SSC-0.1%SDS洗涤液中上下提放2min,0.2×SSC洗涤液中上下提放2min,双蒸水中抽提2-3次,离心甩干;LuxScan 10K-A(CapitalBio,Beijing)芯片扫描仪在570nm波长采集芯片图像(分辨率10um,激光器功率95%,PMT增益650)。所得结果通过ScanAlyze软件分析,获得芯片分析数据。根据荧光信号强度比值(易感等位基因各点荧光强度均值/非易感等位基因各点荧光强度均值,具体分析方法同ScanAlyze软件手册介绍),若比值大于3则判为易感等位基因纯合型,在0.3以下非易感等位基因纯合型,介于0.3-3之间,判为杂合型。(比值衡量标准参考Du W,Marsac C,Kruschina M,Ortigao F,Florentz C.Functionalized self-assembled monolayer ongold for detection of human mitochondrial tRNA gene mutations.Anal Biochem.2003 Nov 1;322(1):14-25.)对于检测结果,同时做一份普通PCR,用于测序验证。比较测序和玻璃芯片检测结果,两者结果相符。
表3ScanAlyze软件对芯片分析结果
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<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tctcctattg acccagaaag cgatt 25
<210> 2
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<212> DNA
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<400> 2
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gaggaccctg ccaagcccag gtacc 25
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gaggaccctg ccgagcccag gtacc 25
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acgttgcagt tgcctttctt 20
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gactctgcag tgaggcccta 20
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<221> mutation
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<400> 73
tctgctctga taattctaaa tacagtacag ttcacgcccc tcacaagaca ctgaacatgt 60
gggtcaccgg cgagacagtg tggcaatatt ttccctgtaa tgtaccaagt cttgccaaag 120
cagtgaacat tatgacacaa ctttttgtca cagctggctc ctaataggac agtgccagcc 180
aattcaagcc cagtcctttc tgtgtttatt cccatctctc ccaaatattt ggaaactgat 240
gtcttgactc atgggtgtat tcacaaattc tgttacttca agtctttttc ttttaacgga 300
ttgatctttt gctagataga gacaaaatat cagtgtgaat tacagcaaac ccctattcca 360
tgctgttatg ggtgaaactc tgggagattc tcctattgac scagaaagcg attccttcac 420
tgatacactg tctgcaaaca tatcacaagg taaagttcct tccagatacg gctattgggg 480
acgtgggggc atttatgtaa gggtaaaatt gctcttgtag tttgtcttcc aggttgtgtt 540
tgttttaata ctatcatgtg tacactccag tattttaatg cttagctcgt tgctatcgcg 600
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ctgtgcatgg ctcccatttc ctgaatttta agcattaaag gtatagttat atccaaaaac 720
aatcctgttc atttttattt cctgagtttg catagatttc ccaagaatac ataagggctt 780
tttagacttg aagggtcact t 801
<210> 74
<211> 1380
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs5219
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<221> mutation
<222> (1222)..(1222)
<400> 74
gcagcagggg gaggctgagc tgaggctggc ccagcctcac accaggccct ggccgggcta 60
cataccacat ggtccgtgtg tacacacgcg tgtggggggc ccgagagacc atggctcagg 120
acagggaatc tggagagatg ctgaacttgg gcttggcctt ggccatgggc acgctgcgct 180
tgcgcagggg cccgcgggct gaggcgaggg tcagagcttc cagtaggctg tggtcctcat 240
caagctggcg ggccgtgcag agtggtgtgg gcactttgac ggtgttgcca aacttggagt 300
agtccacaga gtaacgtccg tcctcctcag ctacaatggg cacaaagcgc tggccccaca 360
ggatctcatc ggccaggtag gaggtgcggg cctgggtggt gatgcccgtg gtttccacca 420
cgccttccag gatgacgatg atctcgaggt cctggtggtg gtgcaggtcg ctgggtgcca 480
ggtcgtagag tgggctgttg gcatcaatga catggtagat gatcagcggg gccaccagga 540
agatgctgtt gccacccacg ccgttctcca tggggatgtc cacctggtgg aggggcacca 600
cctcgccctc ggggctggtg gtcttgcgta ccacctgcat gtggatggtg gcgctgatga 660
tcatgctctt gcggaggtca cccacacgta gcatgaagca gaggcggccg tggcgcaggg 720
cgatcaccgc atgcttgctg aagatgaggg tctcagccct gcggtgggct tgggcagtct 780
tcatgaagat gcagccaagc atgatggcgt tgatcatgag ccccacgatg ttctgcacga 840
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tcacttggac ctcaatggag aaaaggaagg cagacgagaa ggagtggatg ctggtgacac 960
agggctcagc agtgccctcg ctgggggcca ggtcaccgtg ggcgaaggcg atgagccacc 1020
aggccatggc gaagagcagc cagctgcaca ggaaggacat ggtgaagatg agcaatgtgt 1080
gtggccactt gaggtccacc agcgtggtga acacgtcctg caggaagcgg ccctgctccc 1140
ggatgttctt gtgggccacg ttgcagttgc ctttcttgga cacaaagcgg gccctccgct 1200
ggcgggcacg gtacctgggc tnggcagggt cctctgccag gcgtgtcagc acgtattcct 1260
cggggatgat gcccttgcgg gacagcatgg ctccggtgac ccccagggag gggcttcccc 1320
catcggaggc acccctcgga cgtggcctag ggcctcactg cagagtcctc tcggtgggca 1380
<210> 75
<211> 720
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs7903146
<220>
<221> mutation
<222> (346)..(346)
<400> 75
ctgtttcttg cttagtcact ttctgtttga acaaaattgg aatttccttt ttggatctgt 60
ttctttaatt gtaaattgaa tcggactaaa acctttccaa ttttttcaca tgtgaagaca 120
tacacaaaag ttttattgga gggttgcaca tgtgaaagaa aaagggagaa agcaggattg 180
agcaggggga gccgtcagat ggtaatgcag atgtgatgag atctctgccg gaccaaagag 240
aagattcctt tttaaatggt gacaaattca tgggctttct ctgcctcaaa acctagcaca 300
gctgttattt actgaacaat tagagagcta agcacttttt agataytata taatttaatt 360
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<210> 76
<211> 801
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs10010131
<220>
<221> mutation
<222> (401)..(401)
<400> 76
cctgccagtg cacccaggct ggtgactgca gtgagtccac cctgggttca agacagctct 60
gcctctttct gactgtgtga ccttgagtga gccagaacac aggcctgtgc ctccgggtct 120
gcacctctga gagaggggag gaacaggaag aggctgcctt cttcccgcca gcatgtaggg 180
ggcacttggg ggcgtctggt gggagaccag tctggcctcc cagctggaga gtgggcgtgg 240
cgcgatgtcc tcttgagtca gatgtccatg catccttccc tggtaaccaa gtcctgacac 300
cttctatgag tctcgctcga aagccttcca ggcagagttg gcagggtcag agtggcaccg 360
aaagcctagg cagggcacac aaggcctttg accacatcct rtccctcagg catcacgtcc 420
gagaacgaac gggaggtgag gcagctctcc tccgagaccg acctggagag ggccgtgcgc 480
aaggcagccc tggtcatgta ctggaagctc aaccccaaga agaagaagca ggtggccgtg 540
gcggagctgc tggagaatgt cggccaggtc aacgagcacg gtgcgaggat tcaccctggg 600
caccagcctt ccctgggcgc cagccttccc acaggagcca ggaccttccc ataggggctg 660
ggaccttccc tcaggggctg ggtcttccca caggagccgg gaccttccct gtgaggacag 720
ggcccttcct tgtggggacc aggggaccag aaccttcctg tagagaccgt gccctagtgg 780
tgaggtgtgt gggtggcatt t 801
<210> 77
<211> 646
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs757210
<220>
<221> mutation
<222> (246)..(246)
<400> 77
ctgaacactg ttcagcctgc tacctcctca aagggcaggt gagagactga ggcagccctc 60
acactgggga gcagctgcga gagtgtctca cacccaccag acacaaagct tcaggaatcg 120
gttttgtcac ctccacacaa gtcagatatg aagcgtttgc ggggtacgtg gcttgggttt 180
tgtttttagt gagaggtgat gcacaggctg gtagttagga gcctgcaagc ctgcaggctg 240
ggctcrtgtc caggctcctg ccccaagtcc acatgacttt gggcaagtca cttcaccagt 300
ctgaacctca gtttcttcat ctgtaaaatg gaggtggcta tacttctcac atggagcggt 360
cgtaagaatt agatgaagga atatatttag aggatttggc acaatacctc accacagaaa 420
aggttcaata aatgtgaacc gttattgtgt ctgttcacat taaatgaaaa aatctcacat 480
tgctcccagg cccttgggat gatccacact ggctttcgcc attggtgact ctactggtgc 540
cacacagggc ccacggggag gagggaagac actgtgacag acctcactga gcaggggaca 600
tctccttctc ccccttggat ttcccctcaa gtaactgcat ttagag 646
<210> 78
<211> 801
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs4430796
<220>
<221> mutation
<222> (401)..(401)
<400> 78
accccgtctc tactaaaaat accaaaaaaa aaaaaaatta gccaggtgtg gtggcgggca 60
cctgcagtcc cagctacttg ggaggctgaa gcaggagaat ggcgtgaacc cgggaggcgg 120
agcttgcagt gagccaagat cgcgccactg cactccagtc tgggtggcag agcgagaccc 180
cgtctcaaaa agttaaataa ataaataaat aaataaaaca aaaataacaa taacaacaat 240
ctcttgaaga ggctgttgta tttgtaaaac gtcccttcct cagcatcttg agaaactttc 300
tggacctctg tcttttgaga agtttccagt ctgcctttcc tgcctccttc tcctttctga 360
agaaattctc attgaataca gagaggcagc acagactgga ratgctgcat aaagcttaaa 420
ttgggcaggg cccaagcgtt gttgggtctt tggagacaat ggctcctgag aattttttta 480
ggctttccag gaactacaga gagttgcttc atgtcaggaa cacaaattct taaagagcta 540
gtcaccaagt atggggggcc aacccattct tggaaaggtc tctcgctcta agcagcaaac 600
agctctcatg ttgcttcttc caatctattc atgtaatgct cccaacaaaa gcacaaacac 660
cacaatatga aatgaacacc taaaaccatt cctttcacca gcccagggac attgagacaa 720
taaatactga aacaatcact tcagagcagt gtgtaacaga agacaagagt cattttaaaa 780
agcaacaggg aaaaaaccca a 801
<210> 79
<211> 801
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs8050136
<220>
<221> mutation
<222> (401)..(401)
<400> 79
ttcatatgac aattaaagag agagcttgtc taaagtgtct tatgtagtag tatccccagt 60
ttgacccttt tgagaatctg atgacagtta tggaaccctc tccccagaca agtgcccgta 120
tacccagaac tttgtattta atttcatggg gttcatgaag cctctgaaac tcagcttaag 180
agtccatacc aaccaaggtc cttataggaa gagcttgtgt ttttgttttg ttttggcttt 240
ctgcagtctc ttaataatgt ttattgaatg agagaattta actaatttcc ggtttccata 300
atcactttaa actcggtatt tgatttcctt ttccctggga cctgtgacag tgccagcttc 360
atagcctagt ctaggcatgc cagttgccca ctgtggcaat maatatctga gcctgtggtt 420
tttgccttag gtaaactgta gagatggact catggaatgc ttggaaaatt tttcagttta 480
tgataatgtg taaatgtcga gagccaatta ttgaggaatg gcacctcaaa gtatttgggt 540
actctagatc agacatgacc atcttggtgt gtgaaatttt gctaatgcat ctttcctaat 600
agaatataca atctcagggc tagaaagtct tagagatcat ttaatttaat tcctccagat 660
tgattaagtg gtttgtccaa ggtcattcaa ctggtatagt ggcagagctc aggctgtaca 720
aatcaggtga gtattcttca gctcctcaga agccagtaac ttccactcac ttgtgtgtgt 780
ctgaaattca ttaaaccttc g 801
<210> 80
<211> 801
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs1111875
<220>
<221> mutation
<222> (401)..(401)
<400> 80
tatcttgtaa acatgatgct ttaaaataca tttgaaaagt aaaacaaata tgaaatgtaa 60
atatatacaa aatgtaaata tattttagtg ccccatgttt atacaaggtg gataatactg 120
aataatggct aagattcaga ataatatata ctagaaactg catgcataaa ttccctggtc 180
accattaaca ttgtgttttt cttaatgcct gaaataacat ctaaacaagg ggcagctgcc 240
tcaggcaaat ggtacttagg tgattttaaa gaccttaatg agatcaggta attgcttggt 300
gaagctaaaa attttacctt caattaactg atcaacagca ccatacatca tcataacttc 360
tcactccctt ccacctccgt accatcaagt catttcctct rgacgtctga acctgcactc 420
agggtccatt ttttaaacat ttattgaatt agtctggtct aatctacaat taatggaaag 480
tctgtagtaa tgcagtttcc ataagcagct aaggaaagtt gaaactttga aagagcatgt 540
aaagtaaaca ctttctcttc cttctacact tctttgcaat tcataaaata ctttcagaaa 600
tcatttaaaa aatttggatt tcctgcttcc attttctgaa tagatgatgc tgataaaaat 660
agtagtgatc acagcccatc ccaaatagtg tcattttttt tttcagtaaa ctggatatat 720
tttaaataaa actcttgatt gaaattgaga agtgtgaact ggaaattgaa tgaaattgcc 780
aagtctgaaa gggaaaaatg g 801
<210> 81
<211> 501
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs7754840
<220>
<221> mutation
<222> (251)..(251)
<400> 81
tttcctcttt ttgggaaaag ggtttagtat cgttatgctg tcattgcatc aagtcatcgt 60
taatatattt atgttaagta cattgtaagt tgtataagta atataattgc attaatatca 120
gaacacttgt cttacatttg agtttcaaat tgtccagatt tgagagtgag caaaatacac 180
cagatatacc accaaaattg aaaaaaaaat caactgcttg ctgttgggga agaagtagta 240
atgttggaaa sgttgacttg atagaggatt ttgtaagatg agtgaaaaag atctaaaagg 300
acagtgatgt ctctgttatt gactgaggta tccttggtct ctagaatagt gcctgatgaa 360
cagcattgag ttacttattc actgaattga attgaaagat ttgatgaagg ccaaatttct 420
ctaaatacat tcttgtttat ggattaggtc ttattatcta tcatatgtga atgaattcat 480
tttattcatc ttatgtcaca g 501
<210> 82
<211> 887
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs4402960
<220>
<221> mutation
<222> (201)..(201)
<400> 82
ctgaggcagt aagaaactga tttcttctga taacacaact gctcagtcta aagcactgag 60
agaaacagcc ctgtctctgg gcctggtgtc aaagcaggtt tggaaccctg gaattccaag 120
attcccagtc ttggaatcta acagctctat ggagttttgg ccctgcctgg ggagcagtaa 180
ggtaggatgg acagtagatt kaagatactg attgtgtttg caaacatgcc ccagataagg 240
aatggtcaaa gcagattcct tttttttttt ttttttttga gacggagtct tgctctgtcg 300
cccaggctag agtgcagtgg tacaaacaaa ctcactgcag tctcaacctc ctgggctcaa 360
gcaatcctcc cgcctcagcc tctcaagcag ctgagactac aggtgcatgc caccacacct 420
ggctaatttt ttttatatgt atattttggg agaggtagag tctcactaca ttgccaaggc 480
tggtctcaaa ctcctgagct caagcaatcc tcccagcttg gcctcccaaa gtgctaggat 540
tacaggtgtg agccaccaca cctggcccag agcagatcct agagacccgg gctgccctca 600
tatcacaggt gtgtctggct ccttatcctc acacaggcag ttgttcctaa atatttcttt 660
gctaaggact taatcataga ctcacagaat tctagaacag acaggaaggt tgagtatcaa 720
ctaacttaca tcctcgcatt actgatgaga aaactaacag cccaatgggg gatcacagag 780
ctggttaatg acagaaccag atgagatagg actcaggcca gtattcctta ccctagactt 840
taccatctca ttcaagtgtc catgcacatc cagagttccc ttcccaa 887
<210> 83
<211> 801
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs10811661
<220>
<221> mutation
<222> (401)..(401)
<400> 83
gaatgtattg tacttacatt tgtctagagg tgtgtctatt ctggctattc tctttaaagg 60
agccattcta tcgtgaacag atcctgttgg agctgttttc ttgttctacc aaccttcagc 120
cacctctctg tctttcatat tacttattgg cagggtttca aaaggtttta gtccttactt 180
aatataaaca aaaatgtaca atattgacaa agtttcagtt aagcagatga aattctaaga 240
gttaagctgg gattttccaa aataatcctg ttaacagact tgaaagcact tatcagttct 300
gtctaatgaa gacattagaa caccataacc tttccggccc attttctttg tcaataagcg 360
ttcttgccct gtcagcagct cacctccagc tttagttttc ycatgacagt aagtctatta 420
ccctcctgat ctgtcttctg gctcctccta cccaggatgg ggaaggtttt tgactttact 480
gatattctca gaacaaattt tgggaagtaa atataaggtt ttccagtcgg gtgcagtggc 540
tcacgcctat gatcccagcg ctttgggaaa ccaaggtggg tggatcacct gaggtcagga 600
gtttgagacc agcttggcca ataaggtgaa accccatctc tacaaaaatt agttgggcgt 660
ggtggcggca cctgtaaatc cagctactca ggaggctgag gcaagaggat tgcttgaatc 720
tgggagccgg aggttgaagt gaactgagat tgggccactg cattctagcc tgggcgacaa 780
gagtgaagct ccatctcaaa a 801
<210> 84
<211> 601
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs13266634
<220>
<221> mutation
<222> (301)..(301)
<400> 84
ttttccaggg cttgtctccc cttccatagt aagctcctag gaatgccaga ctccagagat 60
aacagtggac agaaagagtt cccatagcga cagggcactt tgctgcacta gagtttcccc 120
tgccttgtct gtgtgaatgt agctgattat cagagcaaac gtggcttcct ctgagtgccc 180
tgcctctgcc ccaccccagc aggtcaaaga caaagtactt gaagttggag tcagagcagt 240
cgcccatgcg tgtgcaatca gtgctaatct ccctgtgctt ctttatcaac agcagccagc 300
ygggacagcc aagtggttcg gagagaaatt gctaaagccc ttagcaaaag ctttacgatg 360
cactcactca ccattcagat ggaatctcca gttgaccagg accccgactg ccttttctgt 420
gaagacccct gtgactagct cagtcacacc gtcagtttcc caaatttgac aggccacctt 480
caaacatgct gctatgcagt ttctgcatca tagaaaataa ggaaccaaag gaagaaattc 540
atatcatggt gcaatgcata ttttatctat ttatttagtt gcattcacca tgaaggaaga 600
g 601
<210> 85
<211> 701
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs10923931
<220>
<221> mutation
<222> (201)..(201)
<400> 85
tagttttcaa aataaagaag gccaatctga gctgactgtt gagggatgta gggaaagagg 60
aagaaactca gagtgctaca agtgaagatg acatggcatt accaagccac cattagcaaa 120
ggaagtatac tgttttggtt ttgcaggagt agggtcacct ccatgctgat cttttcttgt 180
tgctccatcc tctggcttca kgctgaacaa gtaagattat gggcacagtc agccaggcgt 240
ggtggctcac gcctataatt ccagcacttt ggaaggctga ggcaggtgga tcacgaggtc 300
aagggattga gaccatcctg gccaacatgg tgaaaccccg tctttactaa aaatacaaaa 360
attaactggg catgatggtg catgcctgta gtcccagcta cttgggaggc tgaggcagga 420
gaatcgcttg aatccaggag gcggaggtgg cagtgatctg agatcgtgcc actgcactcc 480
agcctggcga cagagcaaga ctccatctca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttatggacac 540
agcctgtggc agtaaatata acagggtgaa cctaagaggt ctgtgctgaa atagaaacca 600
tggcctgggc ctcattagca ccacgcttca gccaagtgag ccaaagacca tgaaacagtc 660
agcatttatg agctgtaaca cgcagggaca caaacagctc a 701
<210> 86
<211> 801
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs4607103
<220>
<221> mutation
<222> (401)..(401)
<400> 86
tacctaagct ctccttagta tggccgaaag ggctcttggc tgtgtcttac ctcctctcca 60
tgcataccca cccctggcta gtgactaaat gcagcaggct ttacacagct cagttccttt 120
gctgtatggc ttttgccccc ttggtcagta tcttgaaaag gattggccta acacacaaga 180
tctccttcct ggctccctgt ttctgcctcc actttacctc ctcctcctat tgatcctaca 240
aattccaaaa ccatctgtgc tagtaggcag agtaattggt gttgaacaga tgtctatttg 300
ggtaacaatg ttatttttta aagtgggcat tttaaaaaca ttgctgctag atgattttgg 360
aatgtatttt acatcataat tcctcaggcc cagcaggttt ytcaacttga cttttcttag 420
gttattagtg atgttgtttg gatgtccttg gtacacacca agagagtggc agaaagagct 480
gctcagcaat gtgcaagaaa cccagtgact tctttgagat gaagtgtttc ttctggctaa 540
ctttccacaa tgtgttgcag acatacaact aatgggcaat ccaggtcctt taaaatcatt 600
tcttcttaaa aaatagacta cagtaagtgt agctgtgcta ttcggtaaat caacatgtgt 660
ttatcacatt tgcaaagccc tgggttgaat agtcattcat atgtaacttc tgcatattag 720
agtttctaag ctgttttctt ccttgccagt tcttcttgtg tctccagtgg ttttatgttc 780
attttttaag ggatcagtga g 801
<210> 87
<211> 684
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs7578597
<220>
<221> mutation
<222> (343)..(343)
<400> 87
aaaactattc aaacaagctt caaatgtctg tccaatgttc aagagttctt tatctccagc 60
agaaactttt tgttaaaaaa taaagcaaag atttaaaaca actgcaggcg gctgaggcag 120
aagaattgct tgaacctggg aggcgaaggt tgcagtgagc tgagatcgcg ccactgtact 180
ccagcctggg taacaagacg gtaacagccg tcttgaaaaa agtgaaaaac aaaacaaaac 240
aaaaaacaac actggagggt ttgtgtattt ccatgattac ctgggggact gtactctgta 300
tgtcatctgt aggcccagcc aaagagatta actctttcat tgytattttc aacaaatcca 360
ttctgccttt ctttggttca gatgccaaca gtgcctatgg aaaaagaatg caaaaattaa 420
cagggttctt agtttacata tacttgtttg ctgcttccct ggatcaatcc caaaatgcaa 480
aatcccctta ataaaaacat gtggttatca aagaaagtta attaagccat gtggccgtgg 540
gcaagtggtt taacctcaca gttgaaccta cagattcttc atcgctaaat ttaggtgaag 600
gtgaaatcat gtcatctcta aggtcacttc cactttgctc attaaatttt ataattctaa 660
aaggccaaaa aatggctctt attg 684
<210> 88
<211> 501
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs864745
<220>
<221> mutation
<222> (251)..(251)
<400> 88
tctgtctcga ttttctattt cacatttggc ttgggatttc actgtaacag gatacagggc 60
tgtggctgca tcttttgagt ctgtgaaatt ttgttctact ccaaattaaa agctgggata 120
gcataacata accaagagct tactaaacta tatgctgtga atgagtttca cattgccacc 180
agatattcac agctgtaaag ttctttctgc gttaaaacat tgaacatttc ctacaaccat 240
tcaaaacatt rtaacagttc aaattatatt tgagcatcac ttatatggct cttacggaac 300
ttatgtaaag ttcttgaagt cagtgatttt aagaaattgt gcttggaata tttataaaaa 360
ttcttgctaa gatctttcct agtattttat ttctcttacc ataacaatgt gatataaaga 420
ataaaaatag attcttctca ccggttgctg cataaatgtt gtgaggttat ctctacttta 480
attcaatgtg ttgtacacat a 501
<210> 89
<211> 1229
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs7961581
<220>
<221> mutation
<222> (201)..(201)
<400> 89
ccaagggcaa atgtggtttc agcccatccc tgtggatcat ttcacacaaa caatgttgaa 60
tcacggtctt gatttaaatg aataattaaa ccaaatgaag tacagaccca cccaaatgaa 120
ggggatcttt actttccttg cctcattttc acccaccacc ttcctcaata acaagctgga 180
tgccaaagct caggagtaaa ygaggatgaa aagtagttat caactcagtg aaaatagatt 240
tgatcttctg gtttaatttt ctggttcgat cttattttgc ttactgcagc attcttcttt 300
ttttaagaat gcagttaaac tgaggtagtt caatttacca attatgtgaa aaattagtat 360
gtgaaggaag caatagaaaa aaacattgag agcactgtgt gtgtcactta accataggaa 420
tacatcctga gaaatgtatt gttaagtgag ctcctcatca tgtgaacatg gtagagtcac 480
ttccacaaac ctagatggca taacttacca cacacctaag ctatatgtca tagcctattt 540
ctcctaggat acaagcctgt acagcatgtt attatagcga atacggttaa gttaccataa 600
cacataagta tttgtgtatc tgaacataga aaaaggtaaa aatacagtat taatgatttt 660
tttaaatggc acacctgtat aggacaccta ccatgaatgg agcctgcagg attgaaagtt 720
gctctgggtg agtcagtgag tgagtggagt gaatgtgaag gcctaggaca ctactgcaca 780
ctactataga ctttataaac actgtacact gaggctatgc taaatctatt tttttagttg 840
tatttcttca ataataaatt aacctagtct tgctataacg tctttacttt aaaagctttt 900
taatttttaa aaactttttg gctctttagt agtaacactt agcttaaaac acacacattg 960
tatagctgta caaaaatagt ttctttacat ccatatttta taagttgttc tatttttact 1020
tttttgcttt ttaaactttc gtgttaaaaa ctaagatgca aatgcataca ttagcctagg 1080
cctgaactat cttctccctc cacatcttat ctcactggaa ggtctgcagt ggcaataaca 1140
tgcatggagc tgctgtcttc tatgataaaa atgccttctg gaatacctcc ggacatgact 1200
gatgctgttt tacagttttt tattttatt 1229
<210> 90
<211> 1001
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> rs12779790
<220>
<221> mutation
<222> (501)..(501)
<400> 90
agattttggg ctgaggcgat ggggttttct agatatataa tcatgtcatc tgcaaacagg 60
gacaacttga ctttctcttt tcctaattga atacccttta tttccttctc ctgcctgatt 120
gccctggcca gaacttccaa cactacgttg actaggggtg gtgagatact tctttttttt 180
cttttttttt gagatggagt ctcgctctgt cgcccaggct ggagtgcagt ggcgtgatct 240
tggctcactg caagctccac ctccggggtt cacaacattc tcctgcctga gccttccgag 300
taggtgggac tgcaggcacc cgccaccacg cgcagctaat ttttttgtat ttttagtaga 360
gatggggttt cactgtgtta gccaggatgg tctcgatctc ctgacctcgt gatccgcctg 420
cctcggcctc ccaaagtctc ccaaagtgct gggattacag gtgtgagcca ccgcacccgg 480
acaatgttgg gaattttttc rtatttcttg gccatttata tatcttcttt tgagaattat 540
ctattcatgt ccttagccca ttttttgatg ggattttttt ttcttgctag tttgtttgtg 600
ttcattgtag attctggata ttagtccttt gtcagatgta tactatttgt atcttttttt 660
tttggacaga gtctcactct gctgcccagg ctggagtgca gtggtgtgat cttggctcac 720
tgcaacctcc gcctcctggg ttcaagcaat tctcctacct cagcctcctg agtagctggg 780
actacaggtg cataccacca cacctggcta attttctgta tttttttttt tttttttgat 840
agagacgggg tttcaccatg ttagccaggg tgggcttgat ctcctgacct cgtgatccac 900
ccacctcggc ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgag ccactgcact cagccctctt 960
ttttattatt aaaatttttt ttggctaggc atggtggctc a 1001
Claims (9)
1.一种检测2型糖尿病18基因位点突变的基因芯片,其包括固定在固相载体上的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针,其核苷酸序列如SEQ ID No.1~36所示。
2.根据权利要求1所述的基因芯片,其特征在于,所述固相载体为醛基玻片。
3.根据权利要求2所述的基因芯片,其特征在于,所述探针5’端有15个多聚T,5’端经修饰氨基基团后固定在醛基玻片上。
4.根据权利要求1-3任一项所述基因芯片,其特征在于,该基因芯片点阵布控:玻璃芯片为117个样点组成的10行×12列的矩阵,包括质控系统和检测系统,质控系统为:(1)芯片阳性对照,为SEQ ID No.1~36所示核苷酸序列的各寡核苷酸探针的等量混合的溶液,作为阳性对照点,设计布控于左下角,共3个阳性对照样点;(2)芯片平行对照,采用25uM的探针溶液点样,每种探针设置平行点3个点,即每3个点检测一个等位基因型;左右共6个点,共同构成一个基因位点检测区;(3)芯片阴性对照,为点样溶液以及双蒸水,各三个点,共6个阴性对照样点,位于右下角。
5.权利要求4所述基因芯片的制备方法,其包括如下步骤:合成SEQ IDNo.1~36所示的探针,探针在合成时5’端多合成15个多聚T,并经氨基基团修饰,将修饰后的探针用TE Buffer制成50uM的溶液,点样前按1:1比例与点样溶液混合,终浓度为25μM;将玻片醛基化修饰;将终浓度为25μM的探针溶液按点样矩阵排列在96孔板;PBS溶液清洗点样仪点样针,校正,按图1矩阵点样;预点20次,点间间距200um,室温水合固定24h。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,其还包括在固定后按下述步骤进行洗涤:室温下2×SSC-0.1%SDS洗涤液中上下提放2-3次,1×SSC-0.1%SDS洗涤液中上下提放2min,0.2×SSC洗涤液中上下提放2min,双蒸水中抽提2-3次,离心甩干。
7.含有权利要求1~4任一项所述基因芯片的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其还包括用于扩增易感基因位点所在区域的引物,引物序列为SEQ ID No.37~72所示的寡核苷酸,所扩增区域为SEQ IDNo.73~90所示。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒,其包括以下试剂中的一种或多种:杂交液、封闭液、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶以及MgCl2。
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