CN108004314A - 用于检测与有机磷农药相关的ⅱ型糖尿病的易感基因芯片 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，公开了一种用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病的易感基因芯片，以醛基玻璃为材质的固定相载体，用于检测与有机磷农药残留相关的Ⅱ型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针；所述特异性寡核苷酸探针的核苷酸序列SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8，探针被固定在固相载体上。本发明利用互补碱基特异性杂交方法，实现了高通量的检测；操作简单，荧光染料标记后，洗片、荧光扫描仪检测结果，无需显色，检测快速，成本低，反应体系微量。检测结果假阳性率为3.25％，假阴性率为1.05％，具有很好的应用市场和经济效益，易规模化应用。

Description

用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病的易感基因芯片

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种用于检测与有机磷农药相关 的Ⅱ型糖尿病的易感基因芯片。

背景技术

糖尿病是一种常见的以慢性高血糖为主要特征的内分泌代谢疾病，最常见 的一类是Ⅱ型糖尿病，大约占糖尿病总数的90％左右。Ⅱ型糖尿病病因及发病 机理复杂，具有明显的遗传易感性，目前认为它是由遗传、环境、行为等多种 危险因素共同参与和相互作用引起的多因子疾病。近年来，随着人类基因组计 划的完成，高通量单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测基因 芯片的建立，一系列Ⅱ型糖尿病相关易感基因被发现。目前已经筛选出至少40 个和Ⅱ型糖尿病相关的易感基因。

农药，尤其是化学农药的使用，仍然是目前世界各国防治粮食和其它农作 物病虫害的主要和有效手段。有机磷类杀虫剂成为目前使用量最大的农药之一， 多属于高效农药。但是大量或长期接触有机磷农药或超标农产品，超过一定限 度后会导致一些慢性疾病，会直接危及人体的神经系统和肝、肾等重要器官， 干扰人体化学信息的传递，破坏身体的酶，阻碍器官发挥正常的生理功能，导 致功能失调。虽然少量的残留不会对人体造成立即的、直接的毒害，但是其分 子结构比较稳定，绝大多数在生物体内很难被代谢分解、排泄。有机磷农药会 干扰哺乳动物大脑、肝脏、骨骼肌及胰岛正常糖代谢功能，诱发实验动物高血 糖症，导致血糖代谢紊乱，增加糖尿病的患病率和死亡率，长期暴露可导致胰 岛素抵抗的发生。

国内外已有的有机磷农药与Ⅱ型糖尿病相关性研究表明，有机磷农药会干 扰哺乳动物大脑、肝脏、骨骼肌及胰岛正常糖代谢功能，诱发实验动物高血糖 症，而且有机磷农药中毒与人体应激性高血糖之间也存在相关性。人体若长期 微量接触有机磷农药可能会增加患Ⅱ型糖尿病的危险。因此综合遗传和环境因 素，采用生物芯片和基因测序技术，研究Ⅱ型糖尿病基因易感性和有机磷农药 之间的相关性已成为当务之急，以此研究成果作为靶向治疗药物选择的依据， 应用于Ⅱ型糖尿病精准治疗和防控工作，为有机磷农药残留所致的Ⅱ型糖尿病 患者在易感基因筛查、早期诊断和精准治疗方面提供科学依据。

糖尿病易感基因检测方法以往一般采用PCR-RFLP和DNA测序方法等，但 存在一定不足，如操作时间长、步骤繁琐、易漏检、不适用于批量、多位点、 特殊结构序列检测等，给糖尿病的临床诊断带来困难。目前尚缺少与有机磷农 药相关的Ⅱ型糖尿病易感基因检测芯片，已有的Ⅱ型糖尿病易感基因检测基因 芯片与长期接触有机磷农药所导致的Ⅱ型糖尿病之间缺少关联性，不能作为靶 向治疗药物选择的依据。如何快速、准确地检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿 病易感基因突变是糖尿病临床诊断需要解决的问题。基因芯片是近些年来兴起 的一项重要检测技术，应用于基因多态性分析、诊断、易感基因检测、致病菌快速筛查等。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测与有机磷农药相关 的Ⅱ型糖尿病的易感基因芯片。

本发明是这样实现的，一种用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病4个 易感基因的芯片，所述基因芯片包括以醛基玻璃为材质的固定相载体，用于检 测有机磷农药残留导致的Ⅱ型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针；

所述特异性寡核苷酸探针的核苷酸序列见表1，探针被固定在固相载体上。

进一步，所述用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病4个易感基因的芯 片为：

(1)芯片共分4块相同部分，每个部分是由56个样品点组成的4行×14 列矩阵，分为检测区和对照区；其中，检测区为：

①芯片阳性对照，序号SEQ ID NO：9，布控于左上、右上、中下三个位 置，共12个，也起定位作用；

②芯片平行对照，采用SEQ ID NO：1～8探针等量混合的25uM溶液点样， 一个基因位点检测区由上面3个点和下面3个点共6个点组成；

(2)对照区为：序号SEQ ID NO：10，芯片阴性对照，为TE溶液，共4 个阴性对照样点，位于每个基因位点检测区之间。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于检测有机磷农药导致Ⅱ型糖尿病 4个易感基因的芯片的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)玻璃经醛基化修饰后预处理为固相载体；

(2)探针制备方法为，探针5’端含有15个氨基修饰的多聚dT，并经氨基 基团修饰，而后用TE溶液按1:1比例稀释至终浓度为25μM；

(3)PBS溶液清洗点样仪点样针，校正；用于扩增4个易感基因突变位点 的引物序列为表2SEQ ID NO：11～18所示，将特异性寡核苷酸探针的核苷酸 序列作为寡核苷酸探针，序列为SEQ ID NO：1～8，表1所示。采用芯片点样 仪将稀释好的寡核苷酸探针印点到固相载体上，避光放置过夜，湿度65-75％， 干燥芯片；

(4)干燥后，于紫外交联仪中固定芯片30min，强度600MJ，取出后将芯 片置于含有饱和NaCl溶液的湿盒中，42℃水化过夜；

(5)水化后芯片在室温下2×SSC-0.1％SDS溶液中洗涤2-3次，每次各 5min，0.5×SSC-0.1％SDS溶液中洗涤2次，每次各5min，双蒸水中洗涤2-3 次，风干，获得基因芯片，4℃保存避光保存备用。

进一步，所述4个有机磷农药残留导致的Ⅱ型糖尿病易感基因为MTHFR、 CAPN10、LEP、IL1A。

本发明的优点及积极效果为：基因芯片以探针SEQ ID NO：1～SEQ ID NO： 10作为检测集合，并包括阳性对照、阴性对照以及检测所对应的引物，将有机 磷农药残留导致的Ⅱ型糖尿病易感基因位点探针集成到一张芯片上，利用互补 碱基特异性杂交方法，实现了高通量的检测。操作简单，荧光染料标记后，洗 片、荧光扫描仪检测结果，无需显色，检测快速，成本低，反应体系微量。各 位点片内平行对照点间荧光强度一致性好，结果准确，检测结果假阳性率为 3.25％，假阴性率为1.05％，具有很好的应用市场和经济效益，易规模化应用。 本发明通过样本分析研究确立的与长期接触有机磷农药所导致的Ⅱ型糖尿病相 关4个位点突变的易感基因芯片MTHFR、CAPN10、LEP、IL1A。

附图说明

图1是本发明提供的Ⅱ型糖尿病易感基因4个位点突变的基因芯片点样布 阵示意图；

图中：探针排布具体为：①和②：C677T，③和④：rs3792267，⑤和⑥： G19A，⑦和⑧：rs1800587，⑨：阳性对照，⑩：阴性对照。

图2是本发明实施例提供的用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病的易 感基因芯片的制备方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病的易感基因 芯片包括以醛基玻璃为材质的固定相载体、用于检测有机磷农药残留导致的2 型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针，探针被固定在固相载体上。

本发明通过对有机磷农药残留导致的2型糖尿病易感基因位点进行筛选， 设计相关探针，经过反复试验和验证，得到了一组杂交特异性高准确度好的探 针，探针序列如下。

表1特异性寡核苷酸探针序列

表2 4个易感基因突变位点的引物序列

如图2所示，本发明实施例提供的用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿 病的易感基因芯片的制备方法包括以下步骤：

S101：玻璃经醛基化修饰后预处理为固相载体；

S102：探针制备方法为，探针5’端含有15个氨基修饰的多聚dT，并经氨 基基团修饰，而后用TE溶液按1:1比例稀释至终浓度为25μM；

S103：PBS溶液清洗点样仪点样针，校正；用于扩增4个易感基因突变位 点的引物序列为SEQ ID NO：1～8，扩增区域为SEQ ID NO：11～18所示，将 特异性寡核苷酸探针的核苷酸序列作为寡核苷酸探针，采用芯片点样仪将稀释 好的寡核苷酸探针印点到固相载体上，避光放置过夜，湿度65-75％，干燥芯片；

S104：干燥后，于紫外交联仪中固定芯片30min，强度600MJ，取出后将芯 片置于含有饱和NaCl溶液的湿盒中，42℃水化过夜；

S105：水化后芯片在室温下2×SSC-0.1％SDS溶液中洗涤2-3次，每次各 5min，0.5×SSC-0.1％SDS溶液中洗涤2次，每次各5min，双蒸水中洗涤2-3 次，风干，获得基因芯片，4℃保存避光保存备用。

如图1所示，用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病的易感基因芯片为：

(1)芯片共分4块相同部分，每个部分是由56个样品点组成的4×14阵， 分为检测区和对照区；其中，检测区为：

①芯片阳性对照，序号SEQ ID NO：9，布控于左上、右上、中下三个位 置，作为阳性对照样点，共12个，也起定位作用；

②芯片平行对照，采用SEQ ID NO：1～8探针等量混合的25uM溶液点样， 一个基因位点检测区由上面2个点和下面2个点共4个点组成；

(2)对照区为：序号SEQ ID NO：10，芯片阴性对照，为TE溶液，共12个 阴性对照样点，布控于左下、右下、中上三个位置。

基因芯片检测未知样品：42℃预热杂交液，加入芯片反应室预杂交3h，弃 去预杂交液；将变性的Cy3标记的纯化PCR产物与预热的杂交液按比例混匀，避 光加入反应室，42℃杂交过夜。分别以2×SSC/0.1％SDS，0.5×SSC/0.1％SDS， 双蒸水洗片，离心甩干。扫描仪扫描读片。DNA经测序、BLAST软件比对分析 后验证芯片检测结果。实施中会使用到以下试剂中一种或多种：杂交液、封闭 液、dNTPs、PCR缓冲液、Cy3-dCTP、Taq DNA聚合酶以及MgCl₂。

主要试剂与仪器：超纯水系统，杂交仪，凝胶成像系统，芯片点样仪，芯 片扫描仪。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例1

本发明的实施例筛选与有机磷农药长期接触人群，根据Ⅱ型糖尿病易感基 因，采用meta分析方法，对每个易感基因进行分类统计，计算OR值，统计出 与有机磷农药长期接触相关的易感基因位点。以MTHFR的C677T基因位点为 例，统计有机磷农药长期接触易感人群组与对照组、未有接触史易感人群与对 照组的数据，经reviewmanager 5软件分析，结果显示，该位点OR值为2.03， 大于1，因此该位点为有机磷农药长期接触易感人群的危险因素。

本发明实施例中的基因芯片包括固相载体及固定在固相载体上的用于检测 2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针，该探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～8所示，阳性对照探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：9，委托上海某公 司合成。固相载体为醛基玻璃。

探针和引物设计如下：通过对有机磷农药长期接触人群2型糖尿病易感基 因位点进行筛选，确定了4个易感基因位点设计探针，经过反复试验验证，得 到了一组杂交特异性高、准确度好的探针，探针序列如表1所示。探针在合成 时3’端合成15个多聚T，并经氨基基团修饰。所用引物扩增获得的片段长度适 中，可在同一反应条件下完成PCR扩增反应，所得到的混合产物能很好地满足 杂交的需要，为芯片杂交节省了时间并降低了成本。

本发明实施例中基因芯片采用如下方法制备：

将用20×SSC-Buffer稀释的终浓度为15μM的探针溶液按图1所示点样矩阵 点样，用芯片点样仪点印，避光放置过夜，紫外线照射交联固定，42℃饱和NaCl 溶液中水化过夜，0.5×SSC-0.1％SDS洗涤剂5min×2次，双蒸水洗涤，室温 晾干，封闭液封闭，双蒸水洗涤，室温晾干。

实施例2

本发明实施例提供的易感基因位点的检测方法，具体包括如下步骤：

1.样品DNA提取

按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血后， 采用血液基因组DNA提取试剂盒(QIAamp DNAMini Blood Kit，Qiagen)提取 基因组DNA，双蒸水稀释样品至10ng/mL。

2.样品检测

用引物序列扩增易感基因位点的序列并引入Cy3标记。PCR反应液是由 10×buffer、10μmol/L的正向引物、10μmol/L反向引物、25mmol/L MgCl₂、 10mmol/LdNTPs(含0.5nM Cy3-dCTP，Fermentas)和双蒸水组成。扩增条件为： 95℃预变性3min，35个循环(94℃变性60s，54℃退火45s，72℃延伸60s)， 72℃延伸10min。PCR产物100℃变性，-20℃冷却。42℃预杂交30min封闭非 特异性结合。将变性的Cy3标记探针与预热的杂交液1∶10混匀，加入反应体 系60℃杂交3h。在相同的杂交反应条件下同时与所有探针反应。室温2× SSC-0.1％SDS洗涤5min×2次，42℃0.5×SSC-0.1％SDS洗涤15min×2次， 室温下双蒸水洗涤10min，离心甩干。将芯片放置于微阵列扫描仪中按既定程序 扫描。阳性对照有绿色荧光信号，阴性对照无荧光信号说明本次杂交有效，可 以进行结果判读。每个基因位点有两个探针，读取每个探针的信号强度，用公 式Pb1/(Pb1+Pb2)计算，当K<0.25时，基因型为纯和突变型，当0.25<K<0.75 时，为杂合型，当K>0.75时，纯和野生型。

3、检测结果的测序验证

对于检测结果，同时做一份普通PCR，用于测序验证。比较测序和膜芯片 检测结果，两者结果相符。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

<110> 徐州工程学院

<120>用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病的易感基因芯片

<160> 4

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ATGAAATCGGCTCCCGC

ATGAAATCGACTCCCGC

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

AAGTAAGGCGTTTGAAG

AAGTAAGGCATTTGAAG

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

CAGCGCCAGCGGTTGCAA

CAGCGCCAACGGTTGCAA

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

CCAGGCAACACCATTGAAGGCTC

CCAGGCAACATCATTGAAGGCTCA

Claims (4)

1.一种用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病的易感基因芯片，其特征在于，所述用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病的易感基因芯片包括以醛基玻璃为材质的固定相载体，用于检测与有机磷农药相关的导致的Ⅱ型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针；

所述特异性寡核苷酸探针的核苷酸序列SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8，探针被固定在固相载体上。

2.如权利要求1所述的用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病的易感基因芯片，其特征在于，所述用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病的易感基因芯片为：

(1)芯片共分4块相同部分，每个部分是由56个样品点组成的4行×14列矩阵，分为检测区和对照区；其中，检测区为：

①芯片阳性对照，序号SEQ ID NO：9，布控于左上、右上、中下三个位置，作为阳性对照样点，共12个，也起定位作用；

②芯片平行对照，采用SEQ ID NO：1～8探针等量混合的25uM溶液点样，一个基因位点检测区由上面2个点和下面2个点共4个点组成；

(2)对照区为：序号SEQ ID NO：10，芯片阴性对照，为TE溶液，共12个阴性对照样点，布控于左下、右下、中上三个位置。

3.一种如权利要求1所述用于检测与有机磷农药相关的Ⅱ型糖尿病的易感基因芯片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)玻璃经醛基化修饰后预处理为固相载体；

(2)探针制备方法为，探针5’端含有15个氨基修饰的多聚dT，并经氨基基团修饰，而后用TE溶液按1:1比例稀释至终浓度为25μM；

(3)PBS溶液清洗点样仪点样针，校正；用于扩增4个易感基因突变位点的引物序列为SEQ ID NO：11～18，将特异性寡核苷酸探针的核苷酸序列作为寡核苷酸探针，采用芯片点样仪将稀释好的寡核苷酸探针印点到固相载体上，避光放置过夜，湿度65-75％，干燥芯片；

(4)干燥后，于紫外交联仪中固定芯片30min，强度600MJ，取出后将芯片置于含有饱和NaCl溶液的湿盒中，42℃水化过夜；

(5)水化后芯片在室温下2×SSC-0.1％SDS溶液中洗涤2-3次，每次各5min，0.5×SSC-0.1％SDS溶液中洗涤2次，每次各5min，双蒸水中洗涤2-3次，风干，获得基因芯片，4℃保存避光保存备用。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述4个易感基因为MTHFR、CAPN10、LEP、IL1A。