JP2004049182A - Ｄｎａ脱塩基部位の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、ＤＮＡ上に発生した脱塩基部位を、それぞれの脱塩基部位ごとに検出することにより、ＤＮＡ上のどの部分に、どの程度存在するかを検出することを課題とする。
【解決手段】本発明は、（ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化する工程；（ｉｉ）前記標識化ＤＮＡを基板上に線状に固定化する工程；および（ｉｉｉ）前記固定化された標識化ＤＮＡのそれぞれの脱塩基部位を検出する工程；を含む、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出方法を提供することにより、上記課題を解決した。本発明はまた、（ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化した標識化ＤＮＡサンプルを、基板上に線状に固定化する固定化手段；（ｉｉ）標識化されたそれぞれの脱塩基部位を検出する検出手段；を含む、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出用装置を提供することにより、上述した課題を解決した。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明は、（ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化する工程；（ｉｉ）前記標識化ＤＮＡを基板上に線状に固定化する工程；および（ｉｉｉ）前記固定化された標識化ＤＮＡのそれぞれの脱塩基部位を検出する工程；を含む、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出方法を提供することにより、上記課題を解決した。本発明はまた、（ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化した標識化ＤＮＡサンプルを、基板上に線状に固定化する固定化手段；（ｉｉ）標識化されたそれぞれの脱塩基部位を検出する検出手段；を含む、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出用装置を提供することにより、上述した課題を解決した。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡの損傷や変異によって生じる脱塩基部位を標識することによって、定性的かつ定量的に脱塩基部位を検出することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ損傷は、ある種の化学物質への曝露、Ｘ線や紫外線などの照射、酸化ストレスへの曝露などにより生じ、変異やガン化の主要な原因となる。脱塩基部位は、ＤＮＡ分子中に発生する損傷の一般的なタイプであり、二本鎖ＤＮＡのうちの一方の鎖上の塩基が脱落することにより発生する。そして植物および動物の両方ともにおいて、自発的脱プリン化、放射線または修復により脱塩基部位が形成されることが知られている（Ａｔａｍｎａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９７， ６８５−６９１； Ｄａｎｄｏｙ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ．， １８１， ５７−６０； Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ， Ｅ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９５） ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）。
【０００３】
脱塩基部位は、ＤＮＡの損傷の中でも最も主要なものであり、ＤＮＡの損傷が原因となるガンや免疫不全のための診断等にも必須の技術であることから、その検出を行うために、これまでにも多くの技術が開発されてきた。これらの従来技術として、たとえば、（１）１４Ｃ−メトキシアミンを用いて脱塩基部位をＲＩ標識するメトキシアミン法、（２）脱塩基部位に特異的に結合するアルデヒド反応性プローブ（ＡＲＰ）に、さらに酵素複合体を結合させて行う酵素アッセイ法、（３）ＡＲＰに蛍光色素を含有するリポソームを用いたリポソーム法、（４）ＡＲＰに結合したアビジンを原子間力顕微鏡を用いて画像化した原子間力顕微鏡法、などが開発されている。
【０００４】
メトキシアミン法は、メトキシアミンと脱塩基部位の反応がほぼ１：１で定量的に生じ、両者の結合が安定的であることを利用し、脱塩基部位に対して１４Ｃ−メトキシアミンを結合させた後、その１４Ｃ−メトキシアミンを検出する方法である（Ｔａｌｐａｅｒｔ−Ｂｏｒｌｅ， Ｍ． ＆ Ｌｉｕｚｚｉ， Ｍ．， （１９８３） Ｂｉｏｃｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ７４０， ４１０−４１６）。しかしながら、１４Ｃ−メトキシアミンの比活性が著しく低いために脱塩基部位の定量感度が低いという点、また、１４Ｃ−標識であることから、脱塩基部位を可視的に観察することができないという点、が欠点として存在する。
【０００５】
酵素アッセイ法は、ビオチン−含有アルデヒド−反応性−プローブ（ＡＲＰ）をＤＮＡ中の脱塩基損傷部位に特異的に結合させ、そのビオチンとアビジン−酵素複合体との特異的結合を利用して、アビジン−酵素複合体の酵素により溶液中の発色基質を発色させる方法である（Ｋｕｂｏ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１， ３７０３−３７０８）。この方法は、現在、一般に広く用いられている方法で、感度も高く、定量性にも優れている。しかし、ＤＮＡ上の平均的な脱塩基部位の量を測定しているため、個々のＤＮＡにおける脱塩基部位の数や場所の特定は不可能であり、可視的に観察することはできない。
【０００６】
リポソーム法は、蛍光色素を含有するリポソームの表面にＡＲＰを結合させることによって、酵素アッセイ法の約１／１０００という微量なＤＮＡ量で脱塩基部位を検出できる方法である（日本分析化学会第５０年会発表、菅原正雄他、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｓｏｃ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｊｓａｃ／ＴＴ５０／３Ｆ２１．ｈｔｍｌ）。しかし、リポソーム法も総ＤＮＡにおける脱塩基部位の定量方法であって、個々のＤＮＡにおける脱塩基部位の数や場所の特定は不可能であり、可視的に観察することはできない。
【０００７】
原子間力顕微鏡法は、物体の表面とそれをなぞる細かい針先との間に作用する原子間力（引力、斥力）を検知し、コンピュータで画像化するものである（Ｓｕｎ，Ｈ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７３， ２２２９−２２３２）。この方法は、使用する装置が高価であり、汎用性が低い手法であるという欠点が存在する。また、乾燥させたＤＮＡ試料でのみ観察可能である点も欠点である。さらに、原子間力顕微鏡法では、数塩基〜数百塩基程度の非常に狭い領域のＤＮＡしか検出できないため、染色体など、大型のＤＮＡに存在する脱塩基部位の定量や同定は不可能である。
【０００８】
このように、従来の技術では、ＤＮＡの一部または全体のどの部分にどの程度脱塩基部位が存在するかを見出す方法は全くなく、変異やガン、また老化などの原因となる脱塩基部位を分子レベルで診断することができなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＤＮＡ上に発生した脱塩基部位を、それぞれの脱塩基部位ごとに可視的に検出することにより、ＤＮＡ上のどの部分に、どの程度存在するかを検出することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者らは、鋭意研究を進めた結果、以下の構成を採用することにより上述した課題を解決することができることを明らかにした。
【００１１】
本発明は、その一態様において、（ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化する工程；および
（ｉｉ）前記標識化ＤＮＡを基板上に線状に固定化する工程；を行った後、
（ｉｉｉ）前記固定化された標識化ＤＮＡのそれぞれの脱塩基部位を検出する工程；を含む、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出方法を提供することにより、上記課題を解決できることを明らかにした。本発明のこの方法において、工程（ｉ）および工程（ｉｉ）は、いずれを先に行ってもよい。
【００１２】
本発明において、上述したＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出を、脱塩基部位の標識化を蛍光標識により行うことにより、行うことができる。
本発明においては、たとえば、前記脱塩基部位の標識化を、ＤＮＡの前記脱塩基部位のアルデヒド基を標識化することにより行うことができる。この場合のアルデヒド基は、たとえば、メトキシアミンやＡＲＰなどのヒドロキシルアミン誘導体を用いて認識することができる。
【００１３】
本発明の別の一態様において、（ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化した標識化ＤＮＡサンプルを、基板上に線状に固定化する固定化手段；
（ｉｉ）標識化されたそれぞれの脱塩基部位を検出する検出手段；
を含む、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出用装置を提供することにより、上述した課題を解決できることを明らかにした。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明を詳細に説明する。本発明のＤＮＡ脱塩基部位の検出方法は、ＤＮＡの損傷やその後の修復過程によって生じた脱塩基部位を蛍光標識し、その標識化ＤＮＡをガラスプレートなどの基板上に、個々のＤＮＡが重複することなく直線状に並べることによって展開・固定させたのち、これを光学的顕微鏡などの検出手段を用いて可視的に観察するとともに、その蛍光強度を測定することによってＤＮＡ上に生じた脱塩基部位の位置と数とを計測することを特徴とするものである。
【００１５】
本発明においてＤＮＡの脱塩基部位という場合、ＤＮＡがある種の化学物質への曝露、紫外線やＸ線の照射、酸化ストレスへの曝露などに曝されたときに、ＤＮＡから塩基が脱落する損傷が起こった部分を指すものである。脱塩基部位から脱落する塩基は、プリン塩基であってもピリミジン塩基であってもよく、すなわち脱塩基部位という概念は、脱プリン部位および脱ピリミジン部位の両方を含む概念である。この様な脱塩基部位は、上述したような外的条件に曝された場合のみならず、生理条件下でも自発的に生成する場合がある他、塩基のアルキル化などの他のＤＮＡ損傷の修復過程でも生成される場合があり、ＤＮＡ損傷のなかで最も多く見られる損傷である。このようなＤＮＡ損傷が適切に修復されない場合は、突然変異を誘発しやすくなり、癌や老化の原因となる場合もある。本発明においては、このような個々の脱塩基部位を、個別のものとして認識し、可視的に検出するための方法および装置を提供する。
【００１６】
本発明においては、ＤＮＡ上に存在するＤＮＡ損傷のそれぞれを、可視的に検出することを目的とするため、まず、ＤＮＡを検出可能な標識により標識化することが必要である。ここで可視的という場合、可視光を介して肉眼により検出可能である状態を意味するが、肉眼だけでなく、可視光によりシグナルを検出可能な装置を用いて検出することも含まれる。
【００１７】
本発明において標識化するという場合、ＤＮＡ上に存在する脱塩基部位を特異的に認識する工程と、脱塩基部位を検出可能なように標識する工程とを、同時にまたは逐次的に行うことを意味する。この脱塩基部位の認識および標識は、一分子により直接的に行っても、複数分子の組み合わせにより間接的に行ってもよい。
【００１８】
ＤＮＡ上の脱塩基部位を認識するためには、塩基が脱落した際に生じるアルデヒド基を、特異的に認識する試薬、たとえばＡＲＰなどのヒドロキシルアミン誘導体、メトキシアミンなどを使用できることが知られている。その特異性、反応性などの観点から、本発明においては、ＤＮＡ上の脱塩基部位を特異的に認識するため、ヒドロキシルアミン誘導体を使用することが好ましい。
【００１９】
脱塩基部位は、いずれかの検出可能な標識分子により標識化する。本発明においては、可視的に検出することができる標識分子を使用することが好ましく、たとえば検出可能な標識分子として、蛍光色素を使用する。蛍光色素としては、当該技術分野において既知のいずれかの蛍光色素を使用することができ、例えばフルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５などを使用することができる。本発明においては、最も好ましい蛍光色素としては、Ｃｙ５、Ｃｙ３を使用する。
【００２０】
このような標識は、上述したように、ＤＮＡ上の脱塩基部位の認識部分、たとえばヒドロキシルアミン誘導体、に直接的に結合させて直接的に標識しても、分子間の特異的結合特性を有する複数分子を用いて間接的に結合させて標識してもよい。間接的に標識させる場合には、たとえば、認識部分にビオチンを結合させ、一方標識分子にはこのビオチンに特異的に結合可能なアビジンを結合させ、認識部分と標識分子とを、アビジン−ビオチン結合特性を用いて間接的に結合させることにより行うことができるが、アビジン−ビオチン以外の他の分子も、間接的な標識に用いることができる。
【００２１】
本発明においては、ＤＮＡ上に存在するＤＮＡ損傷のそれぞれを、個別に検出することを目的とするため、ＤＮＡを基板上に線状に固定化することが必要である。
ＤＮＡが線状である、という場合、単一のＤＮＡ分子上の全ての部位が、同一のＤＮＡ分子上の他の部位または他のＤＮＡ分子と完全に区別された状態で検出できるようになっている状態をいい、固定化された際に、同一ＤＮＡ分子内および他のＤＮＡ分子との間で、物理的に重なり合った場所を有さない状態であることをいう。本発明において、好ましくは、ＤＮＡ分子同士が離れた状態で、それぞれの単一のＤＮＡ分子がほぼ直線状になっている状態をいう。
【００２２】
ＤＮＡを固定化するための基板は、可視的な検出が可能な透明の材質のものであればその材質には特に制限されず、たとえばガラス、透明プラスチック、マイカなどを使用することができる。これらの基板は、ＤＮＡを固定化しやすいように、シラン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリスチレンなどによりその表面をコーティングすることが好ましい。
【００２３】
ＤＮＡを基板上で線状に固定化するためには、個々のＤＮＡが伸展された状態で、何らかの基板上に固定される方法であればよく、たとえば、ＤＮＡ溶液の液面を基板上でゆっくり一定速度で移動させてＤＮＡを伸展させる、界面移動法（Ｍｉｃｈａｌｅｔ ｅｔａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１５１８−１５２３）；基板上に滴下したＤＮＡ溶液にカバーグラスをかけることで水流を発生させてＤＮＡを伸展させる、水流法；高速で回転する基板の上にＤＮＡ溶液を滴下してＤＮＡを伸展させる、スピン法；基板上に滴下したＤＮＡ溶液の液滴を吸い上げることで、液滴内に生じる水流でＤＮＡを伸展させる、液滴吸い上げ法；ＤＮＡ溶液の乗せた基板を傾けることによって生じる水流でＤＮＡを伸展させる、ティルティング法（Ｆｒａｎｓｚ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ９：４２１−４３０）；などの方法を使用することができる。本発明においては、その簡便性、効率などの観点から、水流法を使用することが好ましい。
【００２４】
水流法は、基板上に滴下したＤＮＡ溶液にカバーグラスをかけることで水流を発生させてＤＮＡを伸展させ、固定化する方法である。具体的には、ＤＮＡ試料、例えば細胞核から単離精製したＤＮＡを含む水溶液をスライドガラス上に滴下し、乾燥させ、次いでマウント液をＤＮＡを滴下した位置からやや離れた位置に滴下させ、カバーグラスをかけて水流を作り出しＤＮＡを伸展させる方法である。
【００２５】
ＤＮＡ上の脱塩基部位を可視的に検出するためには、標識した脱塩基部位を識別でき、かつ、調べるＤＮＡ分子の長さを検出可能な分解能を有する検出手段を使用し、たとえば光学顕微鏡、ＣＣＤカメラ、フォトマルなどの検出手段を、単独でまたは組み合わせて、使用することができる。本発明においては、１００倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡との組み合わせで、１００〜５０ ｎｍの解像度が得られる冷却ＣＣＤカメラを使用することが好ましい。
【００２６】
本発明においてはまた、上述したＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出方法を行うための、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出用装置もまた、提供する。この装置は、（ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化した標識化ＤＮＡサンプルを、基板上に線状に固定化する固定化手段；（ｉｉ）標識化されたそれぞれの脱塩基部位を検出する検出手段；を含むことを特徴とする。
【００２７】
【実施例】
実施例 １ ：蛍光色素の検出
Ｃｙ５結合ストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を５０００倍に希釈調整して、スライドグラス上に滴下、乾燥させ、水流法によって分散、固定化した。この試料を１００ Ｗ水銀ランプおよび１００×、１．４ ＮＡ Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｒｔ対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ， Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， ＤＥ）を装着した蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ， Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， ＤＥ）で観察するとともに、画像を６７ ｎｍ×６７ ｎｍのピクセルサイズを有する、熱電気的に冷却された（−２０℃）ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｔｒｅｎｔｏｎ， ＮＪ）で取り込み、蛍光強度を測定した。取り込んだ画像をＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（バージョン４．５、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．， Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ， ＰＡを使用して解析した。これにより、放射蛍光を、個々の蛍光プローブから定量化した。
【００２８】
１個の蛍光プローブから放射された光を、ＣＣＤチップ上に合焦し、そこで１個の輝点を作製した（約７ピクセル×７ピクセル）。Ｃｙ５結合ストレプトアビジン１個あたりの蛍光は、輝点の数にして１３０個以上測定し、ＣＣＤピクセル値と面積の積分値を求め、同面積のバックグラウンドノイズを差し引いて計測した。
【００２９】
この結果を図１に示す。蛍光の露光時間に伴い、蛍光強度は増加したが、１００秒以上では幾分消光が観察された。したがって、Ｃｙ５結合ストレプトアビジンでは８０秒以内での発光観測が好ましいことがわかった。
【００３０】
実施例 ２ ：蛍光色素 Ｃｙ５ を結合した ｄＵＴＰ およびストレプトアビジンの蛍光強度のヒストグラム
分子内に１個のＣｙ５色素を結合したｄＵＴＰ、Ｃｙ５−標識ｄＵＴＰ（５０万倍に希釈）（ｄＵＴＰ−Ｃｙ５， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）および分子内に複数個のＣｙ５色素を結合させたストレプトアビジン、Ｓａ−Ｃｙ５（５０００倍希釈）を使用して、蛍光シグナル定量の正確さを、デジタル画像解析により試験した。
【００３１】
１個のＣｙ５蛍光色素を有するｄＵＴＰ（ｄＵＴＰ−Ｃｙ５）および複数のＣｙ５蛍光色素を有するＳａ分子（Ｓａ−Ｃｙ５， 蛍光色素／タンパク質比＝４：１）を、スライドグラス上に滴下・乾燥させることにより、ｄＵＴＰ−Ｃｙ５およびＳａ−Ｃｙ５をガラス表面に吸着させ、そしてスライド上にマウントした。ｄＵＴＰ−Ｃｙ５およびＳａ−Ｃｙ５を定量試験用の蛍光標準として使用して、そしてＳａ−Ｃｙ５をビオチン化ＤＮＡを検出するためのプローブとして使用した。
【００３２】
蛍光の検出、画像の取り込み、および解析は、実施例１に記載する方法および装置を使用して、行った。画像を一定時間（２０秒）で撮影後、各輝点の蛍光強度を算出し、ｄＵＴＰとストレプトアビジンそれぞれを比較した（図２）。
【００３３】
Ｃｙ５が１個であるｄＵＴＰ、ｄＵＴＰ−Ｃｙ５の蛍光強度は２２６．６±６０．１、Ｃｙ５が複数個のストレプトアビジン、Ｓａ−Ｃｙ５では３８７．１±１５１．６の平均蛍光強度をそれぞれ示し、実施例において一蛍光分子を識別するのに充分な蛍光強度の解像力が示された。また、Ｃｙ５結合ストレプトアビジンの一個平均の蛍光強度はＣｙ５結合ｄＵＴＰの約１．７倍であることが示された。さらに、１個のシグナルであるかあるいは隣接する複数のシグナルであるかは、蛍光強度により区別することができる。
【００３４】
実施例 ３ ：規定損傷個数を持つ標準 ＡＲＰ−ＤＮＡ による脱塩基損傷の検出
本実施例においては、ＤＮＡ分子上の脱塩基部位をｉｎ ｓｉｔｕにて可視化できるかどうかを試験するため、ヒドロキシルアミン誘導体としてＡＲＰを使用することとし、まず、標準ＡＲＰ−ＤＮＡを使用して実験を行った。予め規定された損傷個数を持つ標準ＡＲＰ−ＤＮＡ（各１０万塩基につき０個、２０個、４０個の脱塩基部位、Ｄｏｊｉｎｄｏ， Ｋｕｍａｍｏｔｏ， Ｊａｐａｎ）を原液のままスライドグラス上に滴下し、カバーした後、５分間インキュベーションした。カバースリップを取り除き、ガラスを風乾した。次に１：１０，０００倍に希釈したＣｙ５−結合ストレプトアビジン（Ｓａ−Ｃｙ５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ）の１０μｌの水滴を、ＤＮＡスポット上に滴下し、カバーグラスをかけ３７℃で１時間、加湿チャンバー中で反応させた後、トリス塩化ナトリウムバッファー（ＴＢＳＴバッファー；５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、ＮａＣｌ ３００ ｍＭ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で３回洗浄後、乾燥させた。これらのＤＮＡ試料を、ＹＯＹＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）によりカウンター染色した後、光学顕微鏡で観察した。蛍光の検出、画像の取り込み、および解析は、実施例１に記載する方法および装置を使用して、行った。
【００３５】
この結果、ＤＮＡは断片化していたが、損傷個数に応じた密度でＣｙ５の蛍光シグナルが検出された（図３）。標準ＡＲＰ−ＤＮＡ中には、ランダムに断片化したＤＮＡ分子が可視的に観察された。Ｃｙ５の明確な蛍光シグナルが、２０および４０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドを有する標準ＤＮＡにおいて見いだされた。そして、Ｃｙ５シグナルの強度は、２０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドを有する標準ＤＮＡと比較して、４０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドを有する標準ＤＮＡにおいて、より高かった。０部位／１００，０００ヌクレオチドである標準ＤＮＡ中では、有意なシグナルは全く検出されなかった。ほぼ全てのＣｙ５シグナルは、２０および４０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドを有する標準ＤＮＡ上にともに局在していた。
【００３６】
実施例 ４ ：脱塩基部位の生成およびその検出
本実施例においては、脱塩基部位を、単一のＤＮＡ分子上に局在化し、そして計測することができるかどうかを調べるため、ラムダファージＤＮＡ上に脱塩基部位を生成し、それを、ヒドロキシルアミン誘導体としてＡＲＰを使用して可視的に検出した。
【００３７】
ラムダＤＮＡ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）を１００ ｍＭ塩化ナトリウム含有の１０ ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、７０℃にて各０、３０、６０そして９０分間反応させることにより、脱塩基部位を含有する標的ＤＮＡを生成した。次に、１０μｌの１０ ｍＭビオチン化ＡＲＰ（Ｄｏｊｉｎｄｏ， Ｋｕｍａｍｏｔｏ， Ｊａｐａｎ）溶液と１０μｌの標的ＤＮＡ溶液（５０−１００ ｎｇ／μｌ）とを混合し、３７℃で１時間インキュベートした。反応液は、ゲル濾過スピンカラムで精製したのち、さらに１０μｌの１：５，０００希釈Ｃｙ５結合ストレプトアビジン（Ｓａ−Ｃｙ５）溶液と混合して、３７℃で１時間インキュベートした。さらにＤＮＡ−ストレプトアビジン複合体を、反応液をゲル濾過スピンカラムにかけることにより精製したのち、スライドグラス基板上に滴下、乾燥させ、水流法でＤＮＡを伸展させてＤＮＡ試料とした。そして０．１μＭのＹＯＹＯ−１とともにマウントした。蛍光の検出、画像の取り込み、および解析は、実施例１に記載する方法および装置を使用して、行った。
【００３８】
ＣＣＤカメラで撮影した代表的な画像を図４に示す。ラムダＤＮＡ分子は一本一本それぞれに直線状に伸展されて観察され、Ｃｙ５で標識された脱塩基損傷部位がそのＤＮＡ分子上に分散して分布していることが示された。
【００３９】
より高倍率に拡大して示したＤＮＡ分子（図５下）では、その全長の４カ所に脱塩基部位があることが明瞭に検出でき、単一のラムダＤＮＡ分子上の脱塩基部位の数および位置が、明確に可視化された（図５）。また、特異的部位の分布を解析する本発明の方法の能力は、サブ−マイクロメーターレベルであることが明らかに示された。
【００４０】
実施例 ５ ：脱塩基損傷部位の検出感度
実施例４により脱塩基部位を生成したラムダＤＮＡによる可視的検出法を予め損傷数の規定された標準ＡＲＰ−ＤＮＡと酵素アッセイ法よって検出感度を比較したものを図５に示した。その結果、従来のアッセイにおいては、９０分間のクエン酸バッファー処理により、１００，０００ヌクレオチドあたり４１．７±０．６５の脱塩基部位が誘導された（図５）。本発明の可視的検出方法においては、９０分間の処理で、４０．６±１６．８の脱塩基部位が検出された（図５）。また、ストレプトアビジンとＤＮＡとの非特異的反応は、見いだされなかった。
【００４１】
実線で示した可視的検出方法と破線で示した酵素アッセイ法とはその検出感度において極めて良い一致を示し、この方法の感度は、従来の方法とほぼ同等のものであることが確認された。このことは、可視的に検出された脱塩基部位が１：１でその実体に対応していることを示している。
【００４２】
【発明の効果】
本発明は、１個のＳａ−Ｃｙ５分子によりＤＮＡの脱塩基部位を初めて直接的に可視化し、定量化するための新規な方法を提供する。この方法は、植物および動物を含むあらゆる生物のＤＮＡに適応可能であり、かつ正確で簡易に脱塩基部位を同定することが可能である。
【００４３】
最近、原子間力顕微鏡に基づく脱塩基部位の検出方法が開発された（Ｓｕｎ， Ｈ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７３， ２２２９−２２３２）が、その方法では２５０−ｂｐ ＤＮＡテンプレート上で２つの脱塩基部位を検出したにすぎない。これに対して、本発明の視覚化システムは、光学顕微鏡に基づく方法であり、標準的な研究室での試料調製のみを必要とし、そして液体条件下でサンプルを調べることができる、という利点を有する。
【００４４】
本発明の方法においては、脱塩基損傷を、１個のＳａ−Ｃｙ５複合体により検出することができるので、近接する塩基でのいくつかの損傷を、蛍光強度により計測することができる。また、図５にも示されたように、特異的部位の分布を解析する本発明の方法の能力は、サブ−マイクロメーターレベルであることが明らかに示された。単一−分子標的の検出は、標的に対するプローブ分子の感度およびプローブと標的との間の反応の効率性により未だに制限されているが、本発明の方法により、ＤＮＡ損傷およびＤＮＡ修飾を、マルチカラーのＦＩＳＨにより検出することが可能になる。
【００４５】
本発明の方法はまた、脱塩基損傷が細胞のガン化や老化の原因であることから、ガン組織の診断、ＤＮＡ修復能力についての免疫体質の個人診断、また抗ガン剤の安全性検定の際に、高感度の検定技術となりうる。本発明はさらに、遺伝子治療などで脱塩基部位を有するＤＮＡを治療対照とする際に、所望の効果を達成したかどうかをモニターするための簡便な手段として使用することもできる。すなわち、治療前には存在していた脱塩基部位が、治療後に消失していることを確認することにより、治療効果を確認できる。
【００４６】
本発明の方法において、当該技術分野において公知の遺伝的マーカーを併用することにより、どの遺伝子あるいはどの染色体上に脱塩基部位の数およびＤＮＡ上の位置だけでなく、ゲノム上のどこに脱塩基部位が存在するかを同時に判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で使用される蛍光色素Ｃｙ５結合ストレプトアビジンの露光時間による蛍光強度を示したものである（任意単位）。エラーバーは、標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【図２】本発明で使用される蛍光色素Ｃｙ５結合ストレプトアビジンの蛍光強度を標準蛍光物質Ｃｙ５結合ｄＵＴＰの蛍光強度と比較した図である（任意単位）。
【図３】既知の脱塩基個数を持つ標準ＡＲＰ−ＤＮＡを用いて、脱塩基部位の可視的観察を行った図である。緑色のシグナルは、ＹＯＹＯ−１染色ＤＮＡを示す。赤色のシグナルは、Ｃｙ５−複合体化ストレプトアビジンにより標識された脱塩基部位を示す。黄色は、ＤＮＡの脱塩基部位の局在を示す。０の列：標準ＤＮＡ（０個の脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチド）の陰性対照；２０の列：２０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドのＡＲＰ−ＤＮＡ標準ＤＮＡ；４０の列：４０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドのＡＲＰ−ＤＮＡ標準ＤＮＡ。Ｂａｒ＝２０μｍ。
【図４】本発明により、個々のＤＮＡにおける脱塩基部位を直接的に可視的検出した際の、一視野の画像である。Ｂａｒ＝２０μｍ。
【図５】本発明により、単一のＤＮＡ分子上の脱塩基部位を、直接的に可視的検出し、特徴付けした図である。４つの脱塩基部位が、単一のラムダＤＮＡ上に局在していた（任意方向）。
【図６】本発明による脱塩基部位の定量がほぼ１００％検出可能であることを示す図である。エラーバーは、標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。黒三角および実線は、可視的アッセイの結果を、白丸および破線は、従来のアッセイによる結果を、それぞれ示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡの損傷や変異によって生じる脱塩基部位を標識することによって、定性的かつ定量的に脱塩基部位を検出することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ損傷は、ある種の化学物質への曝露、Ｘ線や紫外線などの照射、酸化ストレスへの曝露などにより生じ、変異やガン化の主要な原因となる。脱塩基部位は、ＤＮＡ分子中に発生する損傷の一般的なタイプであり、二本鎖ＤＮＡのうちの一方の鎖上の塩基が脱落することにより発生する。そして植物および動物の両方ともにおいて、自発的脱プリン化、放射線または修復により脱塩基部位が形成されることが知られている（Ａｔａｍｎａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９７， ６８５−６９１； Ｄａｎｄｏｙ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ．， １８１， ５７−６０； Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ， Ｅ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９５） ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）。
【０００３】
脱塩基部位は、ＤＮＡの損傷の中でも最も主要なものであり、ＤＮＡの損傷が原因となるガンや免疫不全のための診断等にも必須の技術であることから、その検出を行うために、これまでにも多くの技術が開発されてきた。これらの従来技術として、たとえば、（１）１４Ｃ−メトキシアミンを用いて脱塩基部位をＲＩ標識するメトキシアミン法、（２）脱塩基部位に特異的に結合するアルデヒド反応性プローブ（ＡＲＰ）に、さらに酵素複合体を結合させて行う酵素アッセイ法、（３）ＡＲＰに蛍光色素を含有するリポソームを用いたリポソーム法、（４）ＡＲＰに結合したアビジンを原子間力顕微鏡を用いて画像化した原子間力顕微鏡法、などが開発されている。
【０００４】
メトキシアミン法は、メトキシアミンと脱塩基部位の反応がほぼ１：１で定量的に生じ、両者の結合が安定的であることを利用し、脱塩基部位に対して１４Ｃ−メトキシアミンを結合させた後、その１４Ｃ−メトキシアミンを検出する方法である（Ｔａｌｐａｅｒｔ−Ｂｏｒｌｅ， Ｍ． ＆ Ｌｉｕｚｚｉ， Ｍ．， （１９８３） Ｂｉｏｃｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ７４０， ４１０−４１６）。しかしながら、１４Ｃ−メトキシアミンの比活性が著しく低いために脱塩基部位の定量感度が低いという点、また、１４Ｃ−標識であることから、脱塩基部位を可視的に観察することができないという点、が欠点として存在する。
【０００５】
酵素アッセイ法は、ビオチン−含有アルデヒド−反応性−プローブ（ＡＲＰ）をＤＮＡ中の脱塩基損傷部位に特異的に結合させ、そのビオチンとアビジン−酵素複合体との特異的結合を利用して、アビジン−酵素複合体の酵素により溶液中の発色基質を発色させる方法である（Ｋｕｂｏ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１， ３７０３−３７０８）。この方法は、現在、一般に広く用いられている方法で、感度も高く、定量性にも優れている。しかし、ＤＮＡ上の平均的な脱塩基部位の量を測定しているため、個々のＤＮＡにおける脱塩基部位の数や場所の特定は不可能であり、可視的に観察することはできない。
【０００６】
リポソーム法は、蛍光色素を含有するリポソームの表面にＡＲＰを結合させることによって、酵素アッセイ法の約１／１０００という微量なＤＮＡ量で脱塩基部位を検出できる方法である（日本分析化学会第５０年会発表、菅原正雄他、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｓｏｃ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｊｓａｃ／ＴＴ５０／３Ｆ２１．ｈｔｍｌ）。しかし、リポソーム法も総ＤＮＡにおける脱塩基部位の定量方法であって、個々のＤＮＡにおける脱塩基部位の数や場所の特定は不可能であり、可視的に観察することはできない。
【０００７】
原子間力顕微鏡法は、物体の表面とそれをなぞる細かい針先との間に作用する原子間力（引力、斥力）を検知し、コンピュータで画像化するものである（Ｓｕｎ，Ｈ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７３， ２２２９−２２３２）。この方法は、使用する装置が高価であり、汎用性が低い手法であるという欠点が存在する。また、乾燥させたＤＮＡ試料でのみ観察可能である点も欠点である。さらに、原子間力顕微鏡法では、数塩基〜数百塩基程度の非常に狭い領域のＤＮＡしか検出できないため、染色体など、大型のＤＮＡに存在する脱塩基部位の定量や同定は不可能である。
【０００８】
このように、従来の技術では、ＤＮＡの一部または全体のどの部分にどの程度脱塩基部位が存在するかを見出す方法は全くなく、変異やガン、また老化などの原因となる脱塩基部位を分子レベルで診断することができなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＤＮＡ上に発生した脱塩基部位を、それぞれの脱塩基部位ごとに可視的に検出することにより、ＤＮＡ上のどの部分に、どの程度存在するかを検出することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者らは、鋭意研究を進めた結果、以下の構成を採用することにより上述した課題を解決することができることを明らかにした。
【００１１】
本発明は、その一態様において、（ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化する工程；および
（ｉｉ）前記標識化ＤＮＡを基板上に線状に固定化する工程；を行った後、
（ｉｉｉ）前記固定化された標識化ＤＮＡのそれぞれの脱塩基部位を検出する工程；を含む、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出方法を提供することにより、上記課題を解決できることを明らかにした。本発明のこの方法において、工程（ｉ）および工程（ｉｉ）は、いずれを先に行ってもよい。
【００１２】
本発明において、上述したＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出を、脱塩基部位の標識化を蛍光標識により行うことにより、行うことができる。
本発明においては、たとえば、前記脱塩基部位の標識化を、ＤＮＡの前記脱塩基部位のアルデヒド基を標識化することにより行うことができる。この場合のアルデヒド基は、たとえば、メトキシアミンやＡＲＰなどのヒドロキシルアミン誘導体を用いて認識することができる。
【００１３】
本発明の別の一態様において、（ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化した標識化ＤＮＡサンプルを、基板上に線状に固定化する固定化手段；
（ｉｉ）標識化されたそれぞれの脱塩基部位を検出する検出手段；
を含む、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出用装置を提供することにより、上述した課題を解決できることを明らかにした。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明を詳細に説明する。本発明のＤＮＡ脱塩基部位の検出方法は、ＤＮＡの損傷やその後の修復過程によって生じた脱塩基部位を蛍光標識し、その標識化ＤＮＡをガラスプレートなどの基板上に、個々のＤＮＡが重複することなく直線状に並べることによって展開・固定させたのち、これを光学的顕微鏡などの検出手段を用いて可視的に観察するとともに、その蛍光強度を測定することによってＤＮＡ上に生じた脱塩基部位の位置と数とを計測することを特徴とするものである。
【００１５】
本発明においてＤＮＡの脱塩基部位という場合、ＤＮＡがある種の化学物質への曝露、紫外線やＸ線の照射、酸化ストレスへの曝露などに曝されたときに、ＤＮＡから塩基が脱落する損傷が起こった部分を指すものである。脱塩基部位から脱落する塩基は、プリン塩基であってもピリミジン塩基であってもよく、すなわち脱塩基部位という概念は、脱プリン部位および脱ピリミジン部位の両方を含む概念である。この様な脱塩基部位は、上述したような外的条件に曝された場合のみならず、生理条件下でも自発的に生成する場合がある他、塩基のアルキル化などの他のＤＮＡ損傷の修復過程でも生成される場合があり、ＤＮＡ損傷のなかで最も多く見られる損傷である。このようなＤＮＡ損傷が適切に修復されない場合は、突然変異を誘発しやすくなり、癌や老化の原因となる場合もある。本発明においては、このような個々の脱塩基部位を、個別のものとして認識し、可視的に検出するための方法および装置を提供する。
【００１６】
本発明においては、ＤＮＡ上に存在するＤＮＡ損傷のそれぞれを、可視的に検出することを目的とするため、まず、ＤＮＡを検出可能な標識により標識化することが必要である。ここで可視的という場合、可視光を介して肉眼により検出可能である状態を意味するが、肉眼だけでなく、可視光によりシグナルを検出可能な装置を用いて検出することも含まれる。
【００１７】
本発明において標識化するという場合、ＤＮＡ上に存在する脱塩基部位を特異的に認識する工程と、脱塩基部位を検出可能なように標識する工程とを、同時にまたは逐次的に行うことを意味する。この脱塩基部位の認識および標識は、一分子により直接的に行っても、複数分子の組み合わせにより間接的に行ってもよい。
【００１８】
ＤＮＡ上の脱塩基部位を認識するためには、塩基が脱落した際に生じるアルデヒド基を、特異的に認識する試薬、たとえばＡＲＰなどのヒドロキシルアミン誘導体、メトキシアミンなどを使用できることが知られている。その特異性、反応性などの観点から、本発明においては、ＤＮＡ上の脱塩基部位を特異的に認識するため、ヒドロキシルアミン誘導体を使用することが好ましい。
【００１９】
脱塩基部位は、いずれかの検出可能な標識分子により標識化する。本発明においては、可視的に検出することができる標識分子を使用することが好ましく、たとえば検出可能な標識分子として、蛍光色素を使用する。蛍光色素としては、当該技術分野において既知のいずれかの蛍光色素を使用することができ、例えばフルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５などを使用することができる。本発明においては、最も好ましい蛍光色素としては、Ｃｙ５、Ｃｙ３を使用する。
【００２０】
このような標識は、上述したように、ＤＮＡ上の脱塩基部位の認識部分、たとえばヒドロキシルアミン誘導体、に直接的に結合させて直接的に標識しても、分子間の特異的結合特性を有する複数分子を用いて間接的に結合させて標識してもよい。間接的に標識させる場合には、たとえば、認識部分にビオチンを結合させ、一方標識分子にはこのビオチンに特異的に結合可能なアビジンを結合させ、認識部分と標識分子とを、アビジン−ビオチン結合特性を用いて間接的に結合させることにより行うことができるが、アビジン−ビオチン以外の他の分子も、間接的な標識に用いることができる。
【００２１】
本発明においては、ＤＮＡ上に存在するＤＮＡ損傷のそれぞれを、個別に検出することを目的とするため、ＤＮＡを基板上に線状に固定化することが必要である。
ＤＮＡが線状である、という場合、単一のＤＮＡ分子上の全ての部位が、同一のＤＮＡ分子上の他の部位または他のＤＮＡ分子と完全に区別された状態で検出できるようになっている状態をいい、固定化された際に、同一ＤＮＡ分子内および他のＤＮＡ分子との間で、物理的に重なり合った場所を有さない状態であることをいう。本発明において、好ましくは、ＤＮＡ分子同士が離れた状態で、それぞれの単一のＤＮＡ分子がほぼ直線状になっている状態をいう。
【００２２】
ＤＮＡを固定化するための基板は、可視的な検出が可能な透明の材質のものであればその材質には特に制限されず、たとえばガラス、透明プラスチック、マイカなどを使用することができる。これらの基板は、ＤＮＡを固定化しやすいように、シラン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリスチレンなどによりその表面をコーティングすることが好ましい。
【００２３】
ＤＮＡを基板上で線状に固定化するためには、個々のＤＮＡが伸展された状態で、何らかの基板上に固定される方法であればよく、たとえば、ＤＮＡ溶液の液面を基板上でゆっくり一定速度で移動させてＤＮＡを伸展させる、界面移動法（Ｍｉｃｈａｌｅｔ ｅｔａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１５１８−１５２３）；基板上に滴下したＤＮＡ溶液にカバーグラスをかけることで水流を発生させてＤＮＡを伸展させる、水流法；高速で回転する基板の上にＤＮＡ溶液を滴下してＤＮＡを伸展させる、スピン法；基板上に滴下したＤＮＡ溶液の液滴を吸い上げることで、液滴内に生じる水流でＤＮＡを伸展させる、液滴吸い上げ法；ＤＮＡ溶液の乗せた基板を傾けることによって生じる水流でＤＮＡを伸展させる、ティルティング法（Ｆｒａｎｓｚ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ９：４２１−４３０）；などの方法を使用することができる。本発明においては、その簡便性、効率などの観点から、水流法を使用することが好ましい。
【００２４】
水流法は、基板上に滴下したＤＮＡ溶液にカバーグラスをかけることで水流を発生させてＤＮＡを伸展させ、固定化する方法である。具体的には、ＤＮＡ試料、例えば細胞核から単離精製したＤＮＡを含む水溶液をスライドガラス上に滴下し、乾燥させ、次いでマウント液をＤＮＡを滴下した位置からやや離れた位置に滴下させ、カバーグラスをかけて水流を作り出しＤＮＡを伸展させる方法である。
【００２５】
ＤＮＡ上の脱塩基部位を可視的に検出するためには、標識した脱塩基部位を識別でき、かつ、調べるＤＮＡ分子の長さを検出可能な分解能を有する検出手段を使用し、たとえば光学顕微鏡、ＣＣＤカメラ、フォトマルなどの検出手段を、単独でまたは組み合わせて、使用することができる。本発明においては、１００倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡との組み合わせで、１００〜５０ ｎｍの解像度が得られる冷却ＣＣＤカメラを使用することが好ましい。
【００２６】
本発明においてはまた、上述したＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出方法を行うための、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出用装置もまた、提供する。この装置は、（ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化した標識化ＤＮＡサンプルを、基板上に線状に固定化する固定化手段；（ｉｉ）標識化されたそれぞれの脱塩基部位を検出する検出手段；を含むことを特徴とする。
【００２７】
【実施例】
実施例 １ ：蛍光色素の検出
Ｃｙ５結合ストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を５０００倍に希釈調整して、スライドグラス上に滴下、乾燥させ、水流法によって分散、固定化した。この試料を１００ Ｗ水銀ランプおよび１００×、１．４ ＮＡ Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｒｔ対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ， Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， ＤＥ）を装着した蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ， Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， ＤＥ）で観察するとともに、画像を６７ ｎｍ×６７ ｎｍのピクセルサイズを有する、熱電気的に冷却された（−２０℃）ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｔｒｅｎｔｏｎ， ＮＪ）で取り込み、蛍光強度を測定した。取り込んだ画像をＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（バージョン４．５、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．， Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ， ＰＡを使用して解析した。これにより、放射蛍光を、個々の蛍光プローブから定量化した。
【００２８】
１個の蛍光プローブから放射された光を、ＣＣＤチップ上に合焦し、そこで１個の輝点を作製した（約７ピクセル×７ピクセル）。Ｃｙ５結合ストレプトアビジン１個あたりの蛍光は、輝点の数にして１３０個以上測定し、ＣＣＤピクセル値と面積の積分値を求め、同面積のバックグラウンドノイズを差し引いて計測した。
【００２９】
この結果を図１に示す。蛍光の露光時間に伴い、蛍光強度は増加したが、１００秒以上では幾分消光が観察された。したがって、Ｃｙ５結合ストレプトアビジンでは８０秒以内での発光観測が好ましいことがわかった。
【００３０】
実施例 ２ ：蛍光色素 Ｃｙ５ を結合した ｄＵＴＰ およびストレプトアビジンの蛍光強度のヒストグラム
分子内に１個のＣｙ５色素を結合したｄＵＴＰ、Ｃｙ５−標識ｄＵＴＰ（５０万倍に希釈）（ｄＵＴＰ−Ｃｙ５， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）および分子内に複数個のＣｙ５色素を結合させたストレプトアビジン、Ｓａ−Ｃｙ５（５０００倍希釈）を使用して、蛍光シグナル定量の正確さを、デジタル画像解析により試験した。
【００３１】
１個のＣｙ５蛍光色素を有するｄＵＴＰ（ｄＵＴＰ−Ｃｙ５）および複数のＣｙ５蛍光色素を有するＳａ分子（Ｓａ−Ｃｙ５， 蛍光色素／タンパク質比＝４：１）を、スライドグラス上に滴下・乾燥させることにより、ｄＵＴＰ−Ｃｙ５およびＳａ−Ｃｙ５をガラス表面に吸着させ、そしてスライド上にマウントした。ｄＵＴＰ−Ｃｙ５およびＳａ−Ｃｙ５を定量試験用の蛍光標準として使用して、そしてＳａ−Ｃｙ５をビオチン化ＤＮＡを検出するためのプローブとして使用した。
【００３２】
蛍光の検出、画像の取り込み、および解析は、実施例１に記載する方法および装置を使用して、行った。画像を一定時間（２０秒）で撮影後、各輝点の蛍光強度を算出し、ｄＵＴＰとストレプトアビジンそれぞれを比較した（図２）。
【００３３】
Ｃｙ５が１個であるｄＵＴＰ、ｄＵＴＰ−Ｃｙ５の蛍光強度は２２６．６±６０．１、Ｃｙ５が複数個のストレプトアビジン、Ｓａ−Ｃｙ５では３８７．１±１５１．６の平均蛍光強度をそれぞれ示し、実施例において一蛍光分子を識別するのに充分な蛍光強度の解像力が示された。また、Ｃｙ５結合ストレプトアビジンの一個平均の蛍光強度はＣｙ５結合ｄＵＴＰの約１．７倍であることが示された。さらに、１個のシグナルであるかあるいは隣接する複数のシグナルであるかは、蛍光強度により区別することができる。
【００３４】
実施例 ３ ：規定損傷個数を持つ標準 ＡＲＰ−ＤＮＡ による脱塩基損傷の検出
本実施例においては、ＤＮＡ分子上の脱塩基部位をｉｎ ｓｉｔｕにて可視化できるかどうかを試験するため、ヒドロキシルアミン誘導体としてＡＲＰを使用することとし、まず、標準ＡＲＰ−ＤＮＡを使用して実験を行った。予め規定された損傷個数を持つ標準ＡＲＰ−ＤＮＡ（各１０万塩基につき０個、２０個、４０個の脱塩基部位、Ｄｏｊｉｎｄｏ， Ｋｕｍａｍｏｔｏ， Ｊａｐａｎ）を原液のままスライドグラス上に滴下し、カバーした後、５分間インキュベーションした。カバースリップを取り除き、ガラスを風乾した。次に１：１０，０００倍に希釈したＣｙ５−結合ストレプトアビジン（Ｓａ−Ｃｙ５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ）の１０μｌの水滴を、ＤＮＡスポット上に滴下し、カバーグラスをかけ３７℃で１時間、加湿チャンバー中で反応させた後、トリス塩化ナトリウムバッファー（ＴＢＳＴバッファー；５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、ＮａＣｌ ３００ ｍＭ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で３回洗浄後、乾燥させた。これらのＤＮＡ試料を、ＹＯＹＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）によりカウンター染色した後、光学顕微鏡で観察した。蛍光の検出、画像の取り込み、および解析は、実施例１に記載する方法および装置を使用して、行った。
【００３５】
この結果、ＤＮＡは断片化していたが、損傷個数に応じた密度でＣｙ５の蛍光シグナルが検出された（図３）。標準ＡＲＰ−ＤＮＡ中には、ランダムに断片化したＤＮＡ分子が可視的に観察された。Ｃｙ５の明確な蛍光シグナルが、２０および４０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドを有する標準ＤＮＡにおいて見いだされた。そして、Ｃｙ５シグナルの強度は、２０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドを有する標準ＤＮＡと比較して、４０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドを有する標準ＤＮＡにおいて、より高かった。０部位／１００，０００ヌクレオチドである標準ＤＮＡ中では、有意なシグナルは全く検出されなかった。ほぼ全てのＣｙ５シグナルは、２０および４０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドを有する標準ＤＮＡ上にともに局在していた。
【００３６】
実施例 ４ ：脱塩基部位の生成およびその検出
本実施例においては、脱塩基部位を、単一のＤＮＡ分子上に局在化し、そして計測することができるかどうかを調べるため、ラムダファージＤＮＡ上に脱塩基部位を生成し、それを、ヒドロキシルアミン誘導体としてＡＲＰを使用して可視的に検出した。
【００３７】
ラムダＤＮＡ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）を１００ ｍＭ塩化ナトリウム含有の１０ ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、７０℃にて各０、３０、６０そして９０分間反応させることにより、脱塩基部位を含有する標的ＤＮＡを生成した。次に、１０μｌの１０ ｍＭビオチン化ＡＲＰ（Ｄｏｊｉｎｄｏ， Ｋｕｍａｍｏｔｏ， Ｊａｐａｎ）溶液と１０μｌの標的ＤＮＡ溶液（５０−１００ ｎｇ／μｌ）とを混合し、３７℃で１時間インキュベートした。反応液は、ゲル濾過スピンカラムで精製したのち、さらに１０μｌの１：５，０００希釈Ｃｙ５結合ストレプトアビジン（Ｓａ−Ｃｙ５）溶液と混合して、３７℃で１時間インキュベートした。さらにＤＮＡ−ストレプトアビジン複合体を、反応液をゲル濾過スピンカラムにかけることにより精製したのち、スライドグラス基板上に滴下、乾燥させ、水流法でＤＮＡを伸展させてＤＮＡ試料とした。そして０．１μＭのＹＯＹＯ−１とともにマウントした。蛍光の検出、画像の取り込み、および解析は、実施例１に記載する方法および装置を使用して、行った。
【００３８】
ＣＣＤカメラで撮影した代表的な画像を図４に示す。ラムダＤＮＡ分子は一本一本それぞれに直線状に伸展されて観察され、Ｃｙ５で標識された脱塩基損傷部位がそのＤＮＡ分子上に分散して分布していることが示された。
【００３９】
より高倍率に拡大して示したＤＮＡ分子（図５下）では、その全長の４カ所に脱塩基部位があることが明瞭に検出でき、単一のラムダＤＮＡ分子上の脱塩基部位の数および位置が、明確に可視化された（図５）。また、特異的部位の分布を解析する本発明の方法の能力は、サブ−マイクロメーターレベルであることが明らかに示された。
【００４０】
実施例 ５ ：脱塩基損傷部位の検出感度
実施例４により脱塩基部位を生成したラムダＤＮＡによる可視的検出法を予め損傷数の規定された標準ＡＲＰ−ＤＮＡと酵素アッセイ法よって検出感度を比較したものを図５に示した。その結果、従来のアッセイにおいては、９０分間のクエン酸バッファー処理により、１００，０００ヌクレオチドあたり４１．７±０．６５の脱塩基部位が誘導された（図５）。本発明の可視的検出方法においては、９０分間の処理で、４０．６±１６．８の脱塩基部位が検出された（図５）。また、ストレプトアビジンとＤＮＡとの非特異的反応は、見いだされなかった。
【００４１】
実線で示した可視的検出方法と破線で示した酵素アッセイ法とはその検出感度において極めて良い一致を示し、この方法の感度は、従来の方法とほぼ同等のものであることが確認された。このことは、可視的に検出された脱塩基部位が１：１でその実体に対応していることを示している。
【００４２】
【発明の効果】
本発明は、１個のＳａ−Ｃｙ５分子によりＤＮＡの脱塩基部位を初めて直接的に可視化し、定量化するための新規な方法を提供する。この方法は、植物および動物を含むあらゆる生物のＤＮＡに適応可能であり、かつ正確で簡易に脱塩基部位を同定することが可能である。
【００４３】
最近、原子間力顕微鏡に基づく脱塩基部位の検出方法が開発された（Ｓｕｎ， Ｈ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７３， ２２２９−２２３２）が、その方法では２５０−ｂｐ ＤＮＡテンプレート上で２つの脱塩基部位を検出したにすぎない。これに対して、本発明の視覚化システムは、光学顕微鏡に基づく方法であり、標準的な研究室での試料調製のみを必要とし、そして液体条件下でサンプルを調べることができる、という利点を有する。
【００４４】
本発明の方法においては、脱塩基損傷を、１個のＳａ−Ｃｙ５複合体により検出することができるので、近接する塩基でのいくつかの損傷を、蛍光強度により計測することができる。また、図５にも示されたように、特異的部位の分布を解析する本発明の方法の能力は、サブ−マイクロメーターレベルであることが明らかに示された。単一−分子標的の検出は、標的に対するプローブ分子の感度およびプローブと標的との間の反応の効率性により未だに制限されているが、本発明の方法により、ＤＮＡ損傷およびＤＮＡ修飾を、マルチカラーのＦＩＳＨにより検出することが可能になる。
【００４５】
本発明の方法はまた、脱塩基損傷が細胞のガン化や老化の原因であることから、ガン組織の診断、ＤＮＡ修復能力についての免疫体質の個人診断、また抗ガン剤の安全性検定の際に、高感度の検定技術となりうる。本発明はさらに、遺伝子治療などで脱塩基部位を有するＤＮＡを治療対照とする際に、所望の効果を達成したかどうかをモニターするための簡便な手段として使用することもできる。すなわち、治療前には存在していた脱塩基部位が、治療後に消失していることを確認することにより、治療効果を確認できる。
【００４６】
本発明の方法において、当該技術分野において公知の遺伝的マーカーを併用することにより、どの遺伝子あるいはどの染色体上に脱塩基部位の数およびＤＮＡ上の位置だけでなく、ゲノム上のどこに脱塩基部位が存在するかを同時に判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で使用される蛍光色素Ｃｙ５結合ストレプトアビジンの露光時間による蛍光強度を示したものである（任意単位）。エラーバーは、標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【図２】本発明で使用される蛍光色素Ｃｙ５結合ストレプトアビジンの蛍光強度を標準蛍光物質Ｃｙ５結合ｄＵＴＰの蛍光強度と比較した図である（任意単位）。
【図３】既知の脱塩基個数を持つ標準ＡＲＰ−ＤＮＡを用いて、脱塩基部位の可視的観察を行った図である。緑色のシグナルは、ＹＯＹＯ−１染色ＤＮＡを示す。赤色のシグナルは、Ｃｙ５−複合体化ストレプトアビジンにより標識された脱塩基部位を示す。黄色は、ＤＮＡの脱塩基部位の局在を示す。０の列：標準ＤＮＡ（０個の脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチド）の陰性対照；２０の列：２０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドのＡＲＰ−ＤＮＡ標準ＤＮＡ；４０の列：４０脱塩基部位／１００，０００ヌクレオチドのＡＲＰ−ＤＮＡ標準ＤＮＡ。Ｂａｒ＝２０μｍ。
【図４】本発明により、個々のＤＮＡにおける脱塩基部位を直接的に可視的検出した際の、一視野の画像である。Ｂａｒ＝２０μｍ。
【図５】本発明により、単一のＤＮＡ分子上の脱塩基部位を、直接的に可視的検出し、特徴付けした図である。４つの脱塩基部位が、単一のラムダＤＮＡ上に局在していた（任意方向）。
【図６】本発明による脱塩基部位の定量がほぼ１００％検出可能であることを示す図である。エラーバーは、標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。黒三角および実線は、可視的アッセイの結果を、白丸および破線は、従来のアッセイによる結果を、それぞれ示す。
Claims (5)
- （ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化する工程；および
（ｉｉ）前記標識化ＤＮＡを基板上に線状に固定化する工程；を行った後、
（ｉｉｉ）前記固定化された標識化ＤＮＡのそれぞれの脱塩基部位を検出する工程；を含む、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出方法。 - 標識化を蛍光標識により行う、請求項１のＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出方法。
- 前記脱塩基部位の標識化を、ＤＮＡの前記脱塩基部位のアルデヒド基を標識することにより行う、請求項１または２のＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出方法。
- 前記アルデヒド基を、アルデヒド基反応性のヒドロキシルアミン誘導体を用いて標識する、請求項３のＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出方法。
- （ｉ）ＤＮＡ上の脱塩基部位を標識化した標識化ＤＮＡサンプルを、基板上に線状に固定化する固定化手段；
（ｉｉ）標識化されたそれぞれの脱塩基部位を検出する検出手段；
を含む、ＤＮＡの脱塩基部位の可視的検出用装置。
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