JPWO2015136999A1 - Dna中のグアニン・脱塩基部位の検出方法 - Google Patents
Dna中のグアニン・脱塩基部位の検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2015136999A1 JPWO2015136999A1 JP2016507391A JP2016507391A JPWO2015136999A1 JP WO2015136999 A1 JPWO2015136999 A1 JP WO2015136999A1 JP 2016507391 A JP2016507391 A JP 2016507391A JP 2016507391 A JP2016507391 A JP 2016507391A JP WO2015136999 A1 JPWO2015136999 A1 JP WO2015136999A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- guanine
- double
- stranded dna
- abasic
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/21—Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/21—Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
- C12Y301/21005—Type III site-specific deoxyribonuclease (3.1.21.5)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
項1. 2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、(1)2本鎖DNA中の脱塩基部位を酵素により位置選択的に切断する第1ステップ、(2)脱塩基部位の反対側にあるグアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾する第2ステップ、
(3)第1ステップ及び第2ステップを行って得られた修飾後の2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べる第3ステップを含む(但し、第1ステップと第2ステップの順序は問わない)、グアニン・脱塩基部位の有無を検出する方法。
項2. 2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、(1)2本鎖DNA中の脱塩基部位を酵素により位置選択的に切断する第1ステップ、(2)脱塩基部位の反対側にあるグアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾する第2ステップ、
(3)第1ステップ及び第2ステップを行って得られた修飾後の2本鎖DNAを鋳型とするリアルタイムPCR反応を行い、増幅産物を定量する第3ステップを含む(但し、第1ステップと第2ステップの順序は問わない)、グアニン・脱塩基部位の定量法。
項3. 2本鎖DNA中の脱塩基部位を位置選択的に切断するエンドヌクレアーゼ、グアニンの2位アミノ基を修飾するグリオキサール又はその誘導体を含む、2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べることにより、そのグアニン・脱塩基サイトの有無を検出するためのキット。
項4. 前記エンドヌクレアーゼが大腸菌由来のエンドヌクレアーゼIIIである、項3に記載のキット。
項5. グリオキサールの誘導体は一個以上の芳香環あるいはアルキル基を有する、項3に記載のキット。
項6. グリオキサールまたはその誘導体の極性溶媒をさらに含む、項3〜5のいずれかに記載のキット。
項7. 2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、(1)脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基をビオチン化するステップ、(2)ビオチン化された2本鎖DNAをアビジンカラムにて精製するステップ、(3)精製されたビオチン化2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い増幅産物において塩基配列の変異の有無を調べるステップを含む、グアニン・脱塩基部位の位置を検出する方法。
項8. 脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基をビオチン化する試薬、アビジンカラムを含むグアニン・脱塩基部位の位置を検出するためのキット。
第1ステップでは、2本鎖DNA中の脱塩基部位を位置選択的に切断する。この位置選択的な切断には、酵素を使用する。使用可能な酵素としては、エンドヌクレアーゼが挙げられ、好ましくはエンドヌクレアーゼIIIが挙げられ、より好ましくは大腸菌由来のエンドヌクレアーゼIIIが挙げられる。
グアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾して、PCR反応により塩基の伸長が行われないようにする。このような修飾剤としてはグリオキサール又はその誘導体が挙げられる。グリオキサールの誘導体は、一個以上の芳香環あるいはアルキル基を有する化合物が挙げられる。本発明で使用される、修飾剤としては、例えば下記式(I)の化合物が挙げられる。
アルキル基としては、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロヘキシルなどの炭素数1〜6、好ましくは炭素数1〜4の直鎖、環状又は分岐を有するアルキル基が挙げられる。
アリール基、アラルキルオキシ基の置換基としては、OH、メトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシ、n−ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどのアルコキシ、SH、メチルチオ、エチルチオなどのアルキルチオ、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノなどのモノアルキルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどのジアルキルアミノ、アセチルアミノなどのアルカノイルアミノ、COOH、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ブトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル、フェノキシカルボニルなどのアリールカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどのアラルキルカルボニル、カルバモイル(CONH2)、メチルカルバモイル、エチルカルバモイルなどのモノアルキルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイルなどのジアルキルカルバモイル、CN,ハロゲン原子(F,Cl,Br,I)、NO2、アセチルなどのアルカノイルなどが挙げられる。これらの置換基は、アリール基に対し、1〜5個、好ましくは1〜3個有し得る。
第3ステップでは、修飾剤で修飾した2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べる。塩基対を形成していない脱塩基部位のグアニン残基がグリオキサール又はその誘導体などの修飾剤で修飾されると、修飾グアニン残基のところでPCR反応が止まり、長いPCR生成物が得られなくなる。PCRのプライマーは、修飾グアニン残基の5‘側と3’側のものを使用する。PCRは、リアルタイムPCRが好ましい。リアルタイムPCRを行うことで、グアニン・脱塩基部位を定量することができる。PCRは20〜35サイクル程度、好ましくは20〜30サイクル程度行う。
脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基(AP部位のグアニン残基)のビオチン化は、2本鎖DNAとビオチン化試薬を反応させることにより行うことができる。
ビオチン化された2本鎖DNAの精製は、アビジンカラムを使用して常法に従い行うことができる。この精製ステップにより、ビオチン化された2本鎖DNAのみが得られ、これについてPCR反応を行うことで、AP部位の位置の検出が可能である。この精製工程なしにPCR反応を行った場合、非ビオチン化2本鎖DNAも増幅し、それにより位置の検出ができなくなる。
精製されたビオチン化2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応は、常法に従い行うことができる。得られた増幅産物についてシーケンスを行い、G→Aの変異を調べることによりAP部位の位置を検出することができる。脱塩基側鎖を鋳型として増幅する場合、一旦脱塩基側のところに2本鎖の平滑末端ができ、Taqポリメラーゼによってアデニンがその平滑末端に挿入されるために、AP部位はGからAに変わる。
グアニン・脱塩基部位の有無を検出もしくは定量するための本発明のキットは、以下の成分を含む
(i)2本鎖DNAの脱塩基部位を位置選択的に切断する酵素、好ましくはエンドヌクレアーゼ、より好ましくは大腸菌由来のエンドヌクレアーゼIII
(ii) 脱塩基部位の反対側にある塩基対を形成していないグアニン残基を選択的に修飾する修飾剤、好ましくはグリオキサール又はその誘導体、より好ましくは式(I)で示されるグリオキサール又はその誘導体。
(ii’)修飾反応の溶媒(例えばDMSO、DMFなど)
(iii)PCR反応に必要な成分、例えばTaq DNA PolymeraseなどのDNAポリメラーゼ、PCRバッファー、dNTPミックス、プライマーミックス、溶媒(水)
などが挙げられる。
(i)AP部位の孤立グアニン残基のビオチン化試薬、例えば2-Oxohex-5-ynalのようなアセチレン基(−C≡C)の導入試薬とAzide-PEO3-BiotinのようなClick反応でビオチン基を導入する試薬の組み合わせ。
(ii) アビジンカラム
(iii) PCR反応に必要な成分、例えばTaq DNA PolymeraseなどのDNAポリメラーゼ、PCRバッファー、dNTPミックス、プライマーミックス、溶媒(水)
などが挙げられる。
本発明で使用するグアニン・脱塩基部位を含む2本鎖オリゴDNAは以下の方法で作製した。人工合成したdUを含む100merオリゴDNA(20131226U)がウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)によって処理されたのち、人工合成した100merのオリゴDNA(20131226G)とハイブリダイゼーションさせることで作製した。100merオリゴDNA(20131226U)は、5'TGA CTT GCC ACC TAT AGA CAG CCC TTG CTC TCC TGC AGA GTT TGG CAA TGA CTC UGG TCA CTG CAT CTG TGG GAC CTG GCT CAG TCT GCC AAC TTC ACT G3'を表し、DNA(20131226G)は5'CAG TGA AGT TGG CAG ACT GAG CCA GGT CCC ACA GAT GCA GTG ACC GGA GTC ATT GCC AAA CTC TGC AGG AGA GCA AGG GCT GTC TAT AGG TGG CAA GTC A 3'を表す。100merオリゴDNA(20131226U)100 pmolを1×UDGバッファー(600μl)で溶かし、90℃で1分加熱し氷冷した後、UDG(30unit,6μl)を加え、37℃、1時間反応を行った。反応後、その相補鎖である100merのオリゴDNA(20131226G)を同じモル数を加え、90℃で10分間加熱して、室温になるまで放置した。反応液の2本鎖DNAをNucleospin Gel and PCR Clean upキットに含まれるシリカゲルにて吸着させ、0.5 M溶液リン酸緩衝液 pH 7.4または5 mM Tris-HClの緩衝液pH 8.5でグアニン・脱塩基部位を含む2本鎖オリゴDNA溶出させた。
実施例1の0.5 M溶液リン酸緩衝液 pH 7.4で溶出2本鎖オリゴDNA (10μl、6pmol)と10μlの0.3 M GlyoxalのDMSO液と混合し37℃で12時間インキュベーションした。反応後、NAP-5カラムに載せ、10 mM TE緩衝液で溶出した。LA Taq DNAポリメラーゼ、Vent( Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、Pyrococcus furiosus Taqを用いたPCRにて、オリゴDNA断片の増幅を行った。PCR反応は95℃,1分間の前反応の後、95℃,30秒―55℃,30秒−72℃,30秒を30サイクル繰り返した。プライマーは、FW: 5'CAG TGA AGT TGG CAG ACT GAG C3'、Rev:5'CTG ACT TGC CAC CTA TAG ACA GC3'、MidRev:5'CTG CAG AGT TTG GCA ATG ACT CC3'を使用した(図4)。結果、脱塩基部位の反対側にあるグアニンを含む2本鎖のオリゴDNAはGlyoxalで反応させても、DNAポリメラーゼ連鎖反応の増幅に全く影響を与えないことがわかった。
実施例1で5 mM Tris-HClの緩衝液pH 8.5で溶出させた2本鎖オリゴDNA液20pmolを60 unit APE1またはEndonuclease IVと37℃、1時間反応を行った。反応液中の2本鎖オリゴDNAをNucleospin Gel and PCR Clean upキットのシリカゲルにて吸着させ、0.5 M溶液リン酸緩衝液 pH 7.4で溶出させた。一方、endonuclease IIIの場合、実施例1の100 pmol オリゴDNAのUDG反応液に直接300 unitを加え37℃、1時間反応を行った。反応液をNucleospin Gel and PCR Clean upキットにて精製し、0.5 M溶液リン酸緩衝液 pH 7.4で溶出させた。それぞれ2本鎖オリゴDNA を(10μl、6pmol)と10μlの0.3 M GlyoxalのDMSO液と混合し37℃で12時間インキュベーションした。反応後、NAP-5カラムに載せ、10 mM TE緩衝液で溶出した。LA TaqDNAポリメラーゼを用いたPCRにて、オリゴDNA断片の増幅を行った。その結果、EndoIIIとGlyoxalで処理した場合のみ、DNAポリメラーゼによる増幅が止まった(図5)。
実施例3のエンドヌクレアーゼIIIで切断した2本鎖オリゴDNA (10μl、6pmol)と10μlの0.3 M GlyoxalのDMSO液またはリン酸緩衝液と混合し37℃で12時間インキュベーションした。反応後、NAP-5カラムに載せ、10 mM TE緩衝液で溶出した。LA TaqDNAポリメラーゼを用いたPCRにて、オリゴDNA断片の増幅の確認を行った。図6のように、DMSO溶液が良い結果を与えた。
実施例3のエンドヌクレアーゼIIIで切断した2本鎖オリゴDNA (10μl、6pmol)と10μlの0.3 M Glyoxal、Phenylglyoxal、TrimethoxyphenylglyoxalのDMSO液と混合し、37℃で12時間インキュベーションした。反応後、NAP-5カラムに載せ、10 mM TE緩衝液で溶出した。LA TaqDNAポリメラーゼを用いたPCR反応20サイクルまたは30サイクルを行い、オリゴDNA断片の増幅の確認を行った。
図7のように、Glyoxalの反応性が最も高いことがわかった。
実施例1で述べた作製法で調製したグアニン・脱塩基サイトを含む2本鎖オリゴDNA 500 ngをリン酸緩衝液と非特許文献5で開示された2-Oxohex-5-ynalのDMSO溶液(0.3M)と混合し、37℃で12時間インキュベーションした。反応後、G-50 microカラムに載せ、0.05mlの10 mM TE緩衝液で溶出した。回収した溶液に0.1 M CuBr溶液 0.01 ml、0.1 M TBTA溶液0.02mlとAzido-PEO3-Biotin 0.002 M 0.02 ml(すべてJena bioscience社)を混合し、37℃で2時間インキュベーションした。反応物を遠心した後、NAP-5カラムに載せ、0.5mlの10 mM TE緩衝液で溶出した。次に、0.5 mlアビジンカラム(Pierce社)にて精製したのち、TaqDNAポリメラーゼによるPCR反応で増幅した。さらに、PCR産物をpGEM T-vector(Promega社)にクローニングした後、DNAの塩基配列を決定した。その結果、脱塩基に向いているグアニンからアデニンに変異したことが明らかになった(図8)。
また、制限酵素によるPCR産物の配列の確認実験も行った。実施例6のように2-Oxohex-5-ynalによる修飾したのち、NEB buffer 4の溶液中でCCGGの配列を認識する制限酵素MspIを用いて反応させ、2%agaroseゲル中での電気泳動を行った。その結果からPCR産物(100 bp)を切断できないことがわかった(電気泳動3)。この結果からも、グアニンからアデニンへ変異したことが支持された。一方、グアニン・脱塩基サイトを含む2本鎖オリゴDNA 500 ngと市販のヒドロキシアミノビオチン化合物と混合し、リン酸緩衝液中に37℃で2時間インキュベーションした。反応物は、NAP−5カラムに載せ、0.5mlの10 mM TE緩衝液で溶出した後に、アビジンカラムにて精製した。精製したビオチン化された2本鎖オリゴDNAを鋳型とし、前記の条件でTaqDNAポリメラーゼを用いたPCRにて、DNA断片の増幅を行った。増幅した断片をNucleospin Gel and PCR Clean upキットで精製したのち、NEB buffer 4緩衝液で希釈してCCGGの配列を認識する制限酵素MspIを用いて反応させた。2%agaroseゲル中での電気泳動の結果から、2本鎖のDNAが完全に切断されることがわかった(電気泳動2)。さらに、ビオチン化処理なしのグアニン・脱塩基サイトを含む2本鎖オリゴDNA 1ngを鋳型とし、前記の条件でDNAポリメラーゼを用いたPCRにて、DNA断片の増幅を行った。反応物をNucleospin Gel and PCR Clean upキットで精製したのち、CCGGの配列を認識する制限酵素MspIを用いて反応させ、2%agaroseゲル中での電気泳動を行った。その結果、2本鎖のバンドであることがわかった(電気泳動1)。脱塩基側鎖と孤立したグアニン側鎖のそれぞれがPCR反応の鋳型になっているからである(図9)。
Claims (8)
- 2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、(1)2本鎖DNA中の脱塩基部位を酵素により位置選択的に切断する第1ステップ、(2)脱塩基部位の反対側にあるグアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾する第2ステップ、
(3)第1ステップ及び第2ステップを行って得られた修飾後の2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べる第3ステップを含む(但し、第1ステップと第2ステップの順序は問わない)、グアニン・脱塩基部位の有無を検出する方法。 - 2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、(1)2本鎖DNA中の脱塩基部位を酵素により位置選択的に切断する第1ステップ、(2)脱塩基部位の反対側にあるグアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾する第2ステップ、
(3)第1ステップ及び第2ステップを行って得られた修飾後の2本鎖DNAを鋳型とするリアルタイムPCR反応を行い、増幅産物を定量する第3ステップを含む(但し、第1ステップと第2ステップの順序は問わない)、グアニン・脱塩基部位の定量法。 - 2本鎖DNA中の脱塩基部位を位置選択的に切断するエンドヌクレアーゼ、グアニンの2位アミノ基を修飾するグリオキサール又はその誘導体を含む、2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べることにより、そのグアニン・脱塩基サイトの有無を検出するためのキット。
- 前記エンドヌクレアーゼが大腸菌由来のエンドヌクレアーゼIIIである、請求項3に記載のキット。
- グリオキサールの誘導体は一個以上の芳香環あるいはアルキル基を有する、請求項3に記載のキット。
- グリオキサールまたはその誘導体の極性溶媒をさらに含む、請求項3〜5のいずれかに記載のキット。
- 2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、(1)脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基をビオチン化するステップ、(2)ビオチン化された2本鎖DNAをアビジンカラムにて精製するステップ、(3)精製されたビオチン化2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い増幅産物において塩基配列の変異の有無を調べるステップを含む、グアニン・脱塩基部位の位置を検出する方法。
- 脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基をビオチン化する試薬、アビジンカラムを含むグアニン・脱塩基部位の位置を検出するためのキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014052221 | 2014-03-14 | ||
JP2014052221 | 2014-03-14 | ||
PCT/JP2015/052475 WO2015136999A1 (ja) | 2014-03-14 | 2015-01-29 | Dna中のグアニン・脱塩基部位の検出方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2015136999A1 true JPWO2015136999A1 (ja) | 2017-04-06 |
JP6176694B2 JP6176694B2 (ja) | 2017-08-09 |
Family
ID=54071453
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016507391A Active JP6176694B2 (ja) | 2014-03-14 | 2015-01-29 | Dna中のグアニン・脱塩基部位の検出方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10370703B2 (ja) |
JP (1) | JP6176694B2 (ja) |
WO (1) | WO2015136999A1 (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004049182A (ja) * | 2002-07-24 | 2004-02-19 | Bio Oriented Technol Res Advancement Inst | Dna脱塩基部位の検出方法 |
JP2006172025A (ja) * | 2004-12-15 | 2006-06-29 | Nissan Motor Co Ltd | 積層塗膜構造 |
JP2012223203A (ja) * | 2005-06-06 | 2012-11-15 | 454 ライフ サイエンシーズ コーポレイション | 両末端配列決定(pairedendsequencing) |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007145612A1 (en) | 2005-06-06 | 2007-12-21 | 454 Life Sciences Corporation | Paired end sequencing |
WO2009082020A1 (ja) | 2007-12-21 | 2009-07-02 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | アミノオキシ基を含有する反応性化合物 |
WO2010028388A1 (en) * | 2008-09-05 | 2010-03-11 | Solulink Biosciences, Inc. | Methods and compositions for direct detection of dna damage |
-
2015
- 2015-01-29 JP JP2016507391A patent/JP6176694B2/ja active Active
- 2015-01-29 WO PCT/JP2015/052475 patent/WO2015136999A1/ja active Application Filing
- 2015-01-29 US US15/126,178 patent/US10370703B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004049182A (ja) * | 2002-07-24 | 2004-02-19 | Bio Oriented Technol Res Advancement Inst | Dna脱塩基部位の検出方法 |
JP2006172025A (ja) * | 2004-12-15 | 2006-06-29 | Nissan Motor Co Ltd | 積層塗膜構造 |
JP2012223203A (ja) * | 2005-06-06 | 2012-11-15 | 454 ライフ サイエンシーズ コーポレイション | 両末端配列決定(pairedendsequencing) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6176694B2 (ja) | 2017-08-09 |
US20170088884A1 (en) | 2017-03-30 |
WO2015136999A1 (ja) | 2015-09-17 |
US10370703B2 (en) | 2019-08-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2021282536B2 (en) | Polynucleotide enrichment using CRISPR-Cas systems | |
KR102503884B1 (ko) | 시토신 변형의 중아황산염-유리 염기-해상도 식별 | |
US20210355485A1 (en) | Methods for targeted nucleic acid library formation | |
EP2310401B1 (en) | Universal methylation profiling methods | |
JP2020513801A (ja) | メチル化状態が維持されるdna増幅方法 | |
WO2015043493A1 (zh) | 5-醛基胞嘧啶特异性化学标记方法及相关应用 | |
EP2698437B1 (en) | Method for detecting 5-hydroxymethylcytosine in nucleic acids | |
JP2023519782A (ja) | 標的化された配列決定の方法 | |
TW202126817A (zh) | 標的核酸的檢測方法與其檢測用套組、核酸結合分子的檢測方法與其檢測用套組、以及核酸結合能力的評價方法與其評價用套組 | |
Bilichak et al. | The combined bisulfite restriction analysis (COBRA) assay for the analysis of locus-specific changes in methylation patterns | |
KR20140119602A (ko) | 염기 특이 반응성 프라이머를 이용한 핵산 증폭방법 | |
JP5239853B2 (ja) | 変異遺伝子の検出方法 | |
JP6176694B2 (ja) | Dna中のグアニン・脱塩基部位の検出方法 | |
US20230220475A1 (en) | Compositions and methods for dna methylation analysis | |
US11254982B2 (en) | Osmiumtetroxide-based conversion of RNA and DNA containing thiolated nucleotides | |
WO2021072435A2 (en) | Methods and systems for detection of nucleic acid modifications | |
CN110573627A (zh) | 用于产生目标核酸分子的方法和组合物 | |
RU2662664C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для проведения метилчувствительной амплификации ДНК | |
WO2022209428A1 (ja) | Rnaの高次構造解析方法 | |
WO2004094447A1 (ja) | チオヌクレオシド-s-ニトロシル誘導体 | |
US6855500B2 (en) | Fluorescence-based genotyping | |
WO2023137292A1 (en) | Methods and compositions for transcriptome analysis | |
CN116555404A (zh) | 利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用 | |
JP2009215171A (ja) | ヌクレオシドトリホスフェート誘導体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170704 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170705 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6176694 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |