CN116555404A - 利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用 - Google Patents
利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116555404A CN116555404A CN202310646865.4A CN202310646865A CN116555404A CN 116555404 A CN116555404 A CN 116555404A CN 202310646865 A CN202310646865 A CN 202310646865A CN 116555404 A CN116555404 A CN 116555404A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bismuth
- taq
- based compound
- chain reaction
- polymerase chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title claims abstract description 95
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 89
- 229910052797 bismuth Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 88
- JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N bismuth atom Chemical compound [Bi] JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 61
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 32
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 100
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 93
- VZZHAYFWMLLWGG-UHFFFAOYSA-K triazanium;bismuth;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[Bi+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O VZZHAYFWMLLWGG-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 51
- MGLUJXPJRXTKJM-UHFFFAOYSA-L bismuth subcarbonate Chemical compound O=[Bi]OC(=O)O[Bi]=O MGLUJXPJRXTKJM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 48
- 229910000014 Bismuth subcarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 47
- 229940036358 bismuth subcarbonate Drugs 0.000 claims description 47
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 43
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 43
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 12
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 18
- 101001014590 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoforms XLas Proteins 0.000 description 16
- 101001014594 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoforms short Proteins 0.000 description 16
- 101001014610 Homo sapiens Neuroendocrine secretory protein 55 Proteins 0.000 description 16
- 101000797903 Homo sapiens Protein ALEX Proteins 0.000 description 16
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 10
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 102100032610 Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoforms XLas Human genes 0.000 description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- -1 small molecule compound Chemical class 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012443 analytical study Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- XNDSNRGHJVSBHA-UHFFFAOYSA-L azanium;bismuth(2+);2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [NH4+].[Bi+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XNDSNRGHJVSBHA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 150000001622 bismuth compounds Chemical class 0.000 description 1
- QSBNOZODKXUXSP-UHFFFAOYSA-K bismuth;azane;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound N.[Bi+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O QSBNOZODKXUXSP-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007848 endpoint PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了利用铋基化合物增强聚合酶链式反应(PCR)的方法及应用。所述铋基化合物通过对Taq DNA聚合酶的吸附，调节聚合酶在反应液中的活性，增强反应效率；其也能通过促进产物解离，加速反应进程，增加目标产物产量。所述铋基化合物材料简单易得、廉价无毒、具有良好的生物相容性，并且热稳定性好。所述铋基化合物兼容于不同的DNA聚合酶反应体系，适用范围宽。
Description
技术领域
本发明属于基因扩增技术领域，更具体地，本发明涉及一种利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，用于放大特定的DNA片段，其可作为生物体外的特殊DNA复制。PCR技术是生物技术领域中最重要的生物技术(包括细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术)之一。
PCR由变性、退火、延伸三个基本的反应步骤构成。在一般的PCR技术中，利用DNA在体外约95℃高温时变性会变成单链，低温(例如约在60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(约72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’-3’)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。短时间内就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
具有高GC含量(例如>65％)的DNA模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富含GC的序列同时也涉及二级结构。因此，富含GC的序列可导致DNA聚合酶沿模板扩增时发生停滞或滞后，干扰DNA合成。为了扩增高GC含量的片段，双链模板必须解离，以便引物与模板结合，并使DNA聚合酶能够读取到序列。为了减少强GC相互作用，本领域使用DMSO等PCR添加剂或辅助溶剂来帮助DNA变性。DMSO减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性。然而，DMSO此类试剂带有一定的毒性，使用时应尽量控制其用量。
综上，尽管PCR已经是一种成熟的技术，但进一步进行PCR反应条件的优化仍是本领域的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用。
在本发明的第一方面，提供一种增强聚合酶链式反应的方法，所述方法包括：在聚合酶链式反应体系中，添加铋基化合物。
在一种或多种优选实施方式中，所述聚合酶链式反应体系为含有以下组分的缓冲液：DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、甘油、DMSO。
在一种或多种优选实施方式中，所述DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、甘油、DMSO为有效量的、适于所述聚合酶链式反应的进行。
在一种或多种优选实施方式中，所述DNA模板为待测核酸样品或来自于待测核酸样品。
在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物在反应体系中的浓度为0.001nM～5mM，如0.005nM，0.01nM，0.05nM，0.1nM，0.5nM，1nM，5nM，10nM，50nM，100nM，500nM，1uM，5uM，10uM，50uM，100uM，500uM，1mM，2mM。
在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物包括：柠檬酸铋铵或次碳酸铋。
在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物为柠檬酸铋铵，其在反应体系中的浓度为0.001nM～500uM，如0.005nM，0.01nM，0.05nM，0.1nM，0.5nM，1nM，5nM，10nM，50nM，100nM，500nM，1uM，5uM，10uM，50uM，100uM，200uM。
在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物为次碳酸铋，其在反应体系中的浓度为0.1nM～5mM，如0.2nM，0.5nM，1nM，5nM，10nM，50nM，100nM，500nM，1uM，5uM，10uM，50uM，100uM，500uM，1mM，2mM。
在一种或多种优选实施方式中，按照体积比，所述甘油在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～20％；较佳地2～15％，如3％、4％、5％、6％、8％、10％、12％、14％。
在一种或多种优选实施方式中，所述甘油为低量的，按照体积比为2～7％，如3％、4％、5％、6％。
在一种或多种优选实施方式中，按照体积比，所述DMSO在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～15％；较佳地1.5～12％，如2％、3％、4％、5％、6％、8％、10％。
按照体积比，所述DMSO为低量的，按照体积比为1.5～5％，如2％、3％、4％、5％。
在一种或多种优选实施方式中，所述聚合酶链式反应中，DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
在一种或多种优选实施方式中，所述Taq DNA聚合酶包括(但不限于)：Ex Taq，Vazyme Taq，BBI Taq，NEB Taq，Takara rTaq，Genstar Taq，Toyobo rTaq。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法的应用，用于进行聚合酶链式反应，或用于分析待测样品(核酸样品)中目标DNA的存在情况。
在一种或多种优选实施方式中，所述分析待测样品(核酸样品)中目标DNA的存在情况为非诊断性的。
在本发明的另一方面，提供铋基化合物(如柠檬酸铋铵或次碳酸铋)的应用，用于增强聚合酶链式反应。
在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物(如柠檬酸铋铵或次碳酸铋)通过对Taq DNA聚合酶的吸附，调节聚合酶在反应液中的活性，增强反应效率。
在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物(如柠檬酸铋铵或次碳酸铋)通过促进产物解离，加速反应进程，增加目标产物产量。
在一种或多种优选实施方式中，所述聚合酶链式反应用于扩增的DNA为高GC含量的DNA；较佳地其GC含量高于55％(如GC含量为55～95％)；更佳地其GC含量高于60％(例如GC含量为或高于65％，70％，75％，80％，85％，90％)。
在本发明的另一方面，提供一种聚合酶链式反应的试剂盒，所述试剂盒中包括：铋基化合物，dNTPs，DNA聚合酶，甘油，DMSO。
在一种或多种优选实施方式中，所述DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、甘油、DMSO为有效量的、适于所述聚合酶链式反应的进行。
在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物为柠檬酸铋铵，其在反应体系中的浓度为0.001nM～500uM。
在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物为次碳酸铋，其在反应体系中的浓度为0.1nM～5mM。
在一种或多种优选实施方式中，按照体积比，所述甘油在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～20％；或，所述DMSO在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～15％。
更佳地，在一种或多种优选实施方式中，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
在一种或多种优选实施方式中，所述Taq DNA聚合酶包括(但不限于)：Ex Taq，Vazyme Taq，BBI Taq，NEB Taq，Takara rTaq，Genstar Taq，Toyobo rTaq。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1为根据本发明的DMSO和甘油辅助的PCR体系优化效果图，(a)为扩增产物电泳结果，(b)为电泳条带的扩增产物量化统计；Lane1-8分别对应试验1-8；NTC为(No TemplateControl)不含有模板的对照；NC为阴性缓冲液对照；M为Marker。
图2为根据本发明的柠檬酸铋铵增强GNAS1基因启动子扩增的增强效果图，(a)为扩增产物电泳结果，(b)为电泳条带的扩增产物量化统计；Lane1-3分别为添加柠檬酸铋铵2.2mM，0.22mM，0.022mM的组；Lane4-5分别为添加柠檬酸铋铵2.2μM，0.22μM的组；Lane6-9为添加柠檬酸铋铵22nM，2.2nM，0.22nM，0.022nM的组；Lane10为添加柠檬酸铋铵2.2pM的组；PC：阳性对照。
图3为根据本发明的次碳酸铋增强GNAS1基因启动子扩增的增强效果图；(a)为扩增产物电泳结果，Lane1-10分别为2.0mM，0.20mM，0.020mM，2.0μM，0.20μM，0.020μM，2.0nM，0.20nM，0.020nM，2.0pM；(b)为0.02mM-2mM次碳酸铋添加量时的电泳结果；(c)为(a)中电泳条带的扩增产物量化统计；(d)为(b)中电泳条带的扩增产物量化统计。
图4为根据本发明的柠檬酸铋铵增强APOE基因扩增的增强效果图；(a)为扩增产物电泳结果，Lane1-10分别为2.2mM，0.22mM，0.022mM，2.2μM，0.22μM，0.022μM，2.2nM，0.22nM，0.022nM，2.2pM；(b)为0.02mM-0.22mM柠檬酸铋铵添加量时的电泳结果；(c)为(a)中电泳条带的扩增产物量化统计；(d)为(b)中电泳条带的扩增产物量化统计。
图5为根据本发明的次碳酸铋增强APOE基因扩增的增强效果图；(a)为扩增产物电泳结果，Lane1-10分别为2.0mM，0.20mM，0.020mM，2.0μM，0.20μM，0.020μM，2.0nM，0.20nM，0.020nM，2.0pM；(b)为电泳条带的扩增产物量化统计。
图6为根据本发明的铋基化合物对以不同聚合酶扩增GNAS1基因启动子的PCR适用性图；(a)为扩增产物电泳结果，Lane1-3分别代表加入0nM铋基化合物(3％ DMSO和5％甘油)，0.22nM柠檬酸铋铵和0.1mM次碳酸铋扩增产物的结果；(b)为电泳条带的扩增产物量化统计。
图7为根据本发明的铋基化合物对以不同聚合酶扩增APOE基因的PCR适用性图；(a)为扩增产物电泳结果，Lane1-3分别代表0μM铋基化合物(3％ DMSO和5％甘油)，0.022mM柠檬酸铋铵和0.02mM次碳酸铋扩增产物的结果；(b)为电泳条带的扩增产物量化统计。
图8(a-d)为根据本发明的铋基化合物在扩增GNAS1基因的PCR中影响引物熔解温度(Tm)的熔解曲线图。
图9(a-d)为根据本发明的铋基化合物在扩增APOE基因的PCR中影响引物熔解温度(Tm)的熔解曲线图。
图10(a-c)为根据本发明的铋基化合物对扩增GNAS1基因产物解离程度影响的熔解曲线和凝胶电泳图。
图11(a-c)为根据本发明的铋基化合物对扩增APOE基因产物解离程度影响的熔解曲线和凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示铋基化合物在增强聚合酶链式反应(PCR)中的新应用。所述铋基化合物通过对Taq DNA聚合酶的吸附，调节聚合酶在反应液中的活性，增强反应效率；其也能通过促进产物解离，加速反应进程，增加目标产物产量。
铋基化合物
本领域现有技术中，铋基材料已经有所研究，例如在生物医学方面。首先，中国铋的储存量占世界首位，是一种廉价金属；其次，铋的复合物表现出较好的光电信号转换性能且稳定性好；此外，铋基材料较好的光热转换效率使其在肿瘤治疗方面得到应用；最后，铋剂具有很好的抗菌作用已被广泛用于治疗幽门螺旋杆菌，并且还被用治疗胃溃疡、预防及治疗腹泻方面有很好的疗效。
但是，本领域至今没有将铋基材料与PCR技术相关联，在增强PCR效应及其机制方面更是没有研究。本发明中，首次将铋基化合物作为PCR效应的增强子，为PCR技术提供了新的解决方案，也为探索铋基材料的应用领域提供了新途径。
如本发明所用，所述的“铋基化合物”为无毒无害、生物相容性良好的添加剂。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
作为本发明的优选方式，所述的铋基化合物为柠檬酸铋铵(AMMONIUM BISMUTHCITRATE)，CAS号:25530-63-6。以往的技术中，柠檬酸铋铵多用于微生物学配制培养基，医用收敛剂。
作为本发明的优选方式，所述的铋基化合物为次碳酸铋(BISMUTHSUBCARBONATE)，CAS号:5892-10-4。次碳酸铋本身是一种胃药，主要用于医药工业，也具收敛，保护作用。它们的这种生物特性，使其应用范围得以拓宽。
在本发明中，所述的铋基化合物可以是纯净形式存在的化合物，或纯度大于90％(较佳地大于95％，98％或99％)的化合物。在得知其化学结构的情况下，所述的小分子化合物可通过化学合成的方式获得。本发明还包括化合物的前体，所述的“前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在加入到反应体系后可以转变成具有活性的该化合物。
本发明还包括上述铋基化合物的异构体、溶剂合物(如水合物)，或它们的盐，只要它们与铋基化合物具有相同或基本相同的功能。所述的“盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
本领域人员应理解，在得知了铋基化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料来获得，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法及获得的产物均可应用于本发明中。合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。
应用
在本发明的实施例中，进行了铋基化合物参与PCR反应的效果分析及机制研究，包括：
S1、优化PCR体系，通过PCR实验和凝胶电泳图确定DMSO和甘油的适合配比；
S2、将不同浓度的两种铋基化合物(柠檬酸铋铵和次碳酸铋)均分别用于两种不同高GC含量的基因扩增反应中，然后通过凝胶电泳图确定两种铋基材料的最佳浓度范围；
S3、通过常规PCR和凝胶电泳实验研究不同酶用于PCR增强的普适性；
S4、通过对两条互补的寡核苷酸链分别标记荧光基团和淬灭基团得到融解曲线，研究材料对引物的影响
S5、通过qPCR，反应产物的融解曲线以及凝胶电泳实验，研究柠檬酸铋铵和次碳酸铋对产物解离程度的影响。
上述的分析研究充分论证了铋基化合物在增强PCR的效果的显著性，尤其是针对高GC含量的目标扩增基因。
基于本发明人的新发现，发明公开了铋基化合物用于增强聚合酶链式(PCR)反应的新应用。所述的铋基化合物与DMSO和甘油可共存于PCR体系中。与单用DMSO和甘油的PCR扩增反应相比，铋基化合物的添加起到了非常显著的增效作用。
本发明中，针对多于一种的高GC含量的目标扩增基因进行了分析，均可实现PCR效果的增强。具体实施例中，所述的目标扩增基因包括了GNAS1(约84％ GC)和APOE(75.5％GC)。可以理解的是，经过所述论证，本领域技术人员能够相信本发明的技术方案适用于多种/多样的目标扩增基因，具有较宽的适用性(普适性)。
本发明所述的铋基化合物(如柠檬酸铋铵和次碳酸铋)增强PCR扩增反应的方法，兼容不同聚合酶反应体系，包括Vazyme,BBI,NEB,TaKaRa,Genstar,Toyobo Taq酶等。
本发明所述的铋基化合物(如柠檬酸铋铵和次碳酸铋)能通过吸附引物使Tm值降低，从而降低反应的退火温度，提高反应特异性。
本发明所述的铋基化合物(如柠檬酸铋铵和次碳酸铋)能通过对酶的吸附，调节聚合酶在反应液中的活性，以增强反应效率。
本发明所述的铋基化合物(如柠檬酸铋铵和次碳酸铋)对产物解离也有一定的促进作用，加速反应进程，增加目标产物产量。
本发明的技术方案可应用于多种多样的方案中，例如包括但不限于如下的方面：
(a)检测不同细胞类型、组织和生物体在特定时间点的基因表达差异。首先，从目标样品中分离出RNA并将mRNA逆转录成cDNA。随后，通过由PCR扩增的cDNA数量，确定mRNA的初始水平。终点PCR可通过凝胶里的扩增产物条带强度对RNA的表达进行定量(一种半定量方法)。通过凝胶电泳使不同起始量的终点PCR得率可视化，然后对条带强度进行定量，预估扩增靶点的相对表达水平。也可以实时PCR或qPCR取代，以获得更可靠和更准确的基因表达定量结果。
(b)基因分型。可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列差异。例如，基因敲除和敲入小鼠等转基因生物的基因分型。引物对经设计位于目标区域侧翼，可根据是否存在扩增子及扩增子长度来检测遗传变异。通过PCR进行基因分型也是对癌症和遗传病中的突变进行遗传分析的一个基本方式。
(c)分子克隆。应用于目标DNA片段的克隆，例如将DNA(如，gDNA、cDNA、质粒DNA)的目标区域被扩增并插入特定的载体中。除了制备插入片段，PCR也是一种在克隆后筛选克隆是否携带目标插入片段的有效方法。引物经过设计，可以用于确定载体中插入片段是否存在和插入方向。
(d)突变。通过克隆将所需突变引入目的基因中，以便进行突变研究。在定点突变中，经过设计的PCR引物可将碱基置换、删除或插入整合到特定序列中。引物定位到已克隆至质粒中的序列上。随后，含有引入突变的PCR产物通过自我连接，重新生成环状质粒，并用于转化感受态细胞。
(e)测序。PCR是为测序富集模板DNA的一种相对简单的方法。在Sanger测序中，PCR扩增片段经纯化并用于测序反应。二代测序(NGS)中，PCR被广泛用于构建DNA测序文库。
(f)甲基化研究。用于研究位点特异性甲基化，以区分目标位点的甲基化状态。
本发明与现有技术相比，其有益效果包括：
本发明的技术方案中，通过在PCR反应体系中添加铋基化合物，使得PCR反应得以非常显著地增强，尤其适用于高GC含量的目标基因的PCR扩增，缩短反应时间，大大提高反应效率。
本发明所应用的铋基化合物材料简单易得、廉价无毒、具有良好的生物相容性，并且热稳定性好(能在高温条件下稳定存在)，是应用于PCR新领域的有利研究。
本发明所应用的铋基化合物(如柠檬酸铋铵和次碳酸铋)具有良好的生物安全性，能有效增强PCR反应，且兼容于不同的DNA聚合酶反应体系，适用范围宽。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、PCR体系的分析
通过三因素两水平(表1)正交实验优化体系确定适合的条件。利用不同浓度DMSO，不同浓度甘油，在50μL PCR体系中，以Ex Taq DNA聚合酶(Takara)(1.25U、2.5U)，DMSO(3％、6％)，甘油(5％，10％)(v/v)，变换用量、进行富含GC碱基对的基因扩增反应。
以人源基因组DNA为模板，扩增GNAS1基因启动子(GenBank登录号NG_016194)；引物序列如下(扩增靶片段283bp)：
ASPro4se-FP序列：GAGCGTTGGCGTCGTGC(SEQ ID NO:1)；
ASPro4as-RP序列：GAGGAGGAGGGCCGAGGA(SEQ ID NO:2)。
PCR体系中聚合酶、DMSO及甘油如表1，其它材料/试剂如下：
模板：100ng人源基因组DNA(来自RD细胞的提取)。
引物(ASPro4se-FP、ASPro4as-RP)0.2μM；
每种dNTP各0.2mM；
10×Ex Taq缓冲液。
PCR反应方法如下：
扩增循环包括两个程序：首先进行降落PCR程序，在94℃下预变性5min，其中包括25个扩增循环：94℃下1min，退火温度下30s，72℃下40s。退火温度从72℃降至60℃，每个循环降低0.5℃。然后进行标准PCR程序20个循环：94℃下1min，60℃下30s，72℃下40s。
表1
| 试验组数 | 聚合酶 | DMSO | 甘油 |
| 试验1 | 1.25U | 3％ | 5％ |
| 试验2 | 1.25U | 3％ | 10％ |
| 试验3 | 1.25U | 6％ | 5％ |
| 试验4 | 1.25U | 6％ | 10％ |
| 试验5 | 2.50U | 3％ | 5％ |
| 试验6 | 2.50U | 3％ | 10％ |
| 试验7 | 2.50U | 6％ | 5％ |
| 试验8 | 2.50U | 6％ | 10％ |
结果如图1，除了试验5，其它组均能够获得扩增产物。尽管试验1获得的条带较弱，但为了使仅添加DMSO和甘油的对照组与添加铋基化合物的实验组形成更明显的对比，并最大限度地通过材料增强反应扩增，发明人倾向于选择在节省试剂的同时高效扩增高GC含量基因的优化组。
因此，考虑到酶的成本、增强子组合的实用性以及高GC含量基因的扩增效果，以1.25U酶量、3％DMSO和5％甘油(试验1)条件下进行后续扩增实验。
当酶量增加、DMSO或甘油用量有所增加时，铋基化合物对于增强PCR的作用也是显著的。
实施例2、铋基化合物增强PCR实验
1、扩增GNAS1基因启动子(添加柠檬酸铋铵)
本实施例中，以人源基因组DNA为模板，扩增GNAS1基因启动子，分析铋基化合物对于PCR实验的影响作用。铋基化合物具体采用柠檬酸铋铵，浓度依次为：0.022nM，0.22nM，2.2nM，22nM。引物序列同实施例1。
PCR反应体系以及反应方法如表2。
表2
如图2所示，通过添加柠檬酸铋铵扩增GNAS1启动子的实验发现，在添加0.022nM～22nM(Lane 6-9)柠檬酸铋铵的情况下，Ex Taq DNA聚合酶可以有效地增强扩增富含GC的GNAS1启动子。此外，可以看到在柠檬酸铋铵浓度为0.22nM(Lane 8)时，其在PCR中的增强效果最好，相比阳性对照组(PC，即实施例1中加入3％ DMSO和5％甘油的组)，它的目标产物量多达约2倍。
2、扩增GNAS1基因启动子(添加次碳酸铋)
其它情形同表2，但以次碳酸铋(2.0pM-2.0mM)替换柠檬酸铋铵，进行扩增反应。
如图3所示，通过次碳酸铋扩增GNAS1启动子的实验发现，在添加0.2mM(Lane 2)次碳酸铋的情况下，Ex Taq DNA聚合酶可以有效地增强扩增富含GC的GNAS1启动子。
细化次碳酸铋浓度后发现，其在0.06mM～0.5mM之间对扩增反应有很强的增强效果，浓度为0.1mM时，其在PCR中的增强效果最佳。相比阳性对照组(0mM，即实施例1中加入3％ DMSO和5％甘油的组)，添加次碳酸铋后的目标产物量多达约4倍。
3、扩增APOE基因(添加柠檬酸铋铵)
反应体系同表2，但以50ng人源基因组DNA为模板、进行APOE基因(GenBank登录号NM_001302691)的扩增，分析添加柠檬酸铋铵后的扩增情况。引物序列如下(扩增靶片段322bp)：
APse-FP序列：CCCGGTGGCGGAGGAGACG(SEQ ID NO:3)；
APas-RP序列：GTCGCGGCCCTGTTCCACCAG(SEQ ID NO:4)；
反应方法如下：
在96℃下预变性5min，然后进行30个循环：96℃下45s，60℃下30s，72℃下20s。最后总体延伸阶段在72℃下反应5min。
如图4所示，通过柠檬酸铋铵扩增APOE基因的实验发现，在添加0.22μM～22μM(Lane 3-5)柠檬酸铋铵的情况下，Ex Taq DNA聚合酶也可以有效地增强扩增富含GC的APOE基因。以2倍梯度稀释细化其浓度后，可以看到柠檬酸铋铵浓度在0.022mM时，其增强效果依然是很佳的，相比阳性对照组，它的目标产物量多约1.2倍。
本发明人的分析也发现，对于APOE基因，铋基化合物浓度在较宽的用量范围内都会有效增强聚合酶链式反应。
4、扩增APOE基因(添加次碳酸铋)
其它情形同上述“3”，以人源基因组DNA为模板、进行APOE基因的扩增，但添加次碳酸铋。分析添加次碳酸铋后的扩增情况。
如图5所示，通过次碳酸铋扩增APOE基因的实验发现，在添加20nM～20μM(Lane 3-6)次碳酸铋的情况下，Ex Taq DNA聚合酶也可以有效地增强扩增富含GC的APOE基因。此外，可以看到在柠檬酸铋铵浓度为0.02mM(Lane 3)时，其在PCR中的增强效果最好，相比阳性对照组，它的目标产物量多约1.4倍。
5、铋基化合物对不同酶扩增的适用性
分析的铋基化合物对不同酶扩增的适用性：将不同品牌的Taq聚合酶和对应缓冲溶液，包括诺唯赞Vazyme、生工BBI、NEB、Takara、Genstar、Toyobo分别应用到上述优化好的体系中。表3列出了六种不同的Taq DNA聚合酶的储存液成分，同时列出了在PCR体系中缓冲溶液的成分及pH值。除了聚合酶进行替换，其它PCR体系同表2，扩增GNAS1启动子或APOE基因。
表3、不同种类聚合酶的作用环境对比
扩增GNAS1启动子的反应体系的扩增产物的电泳结果如图6所示，使用多种Taq聚合酶如Vazyme Taq、BBI Taq、Takara rTaq、Toyobo rTaq DNA聚合酶均能在仅加入添加剂3％ DMSO和5％甘油时出现目标条带，实现有效扩增。其中使用Vazyme Taq和Takara rTaqDNA聚合酶并在次碳酸铋的作用下比仅加入添加剂出现了更多的目标条带，说明次碳酸铋增强PCR能很好的适用于这两种酶所处的体系，可能是因为它们所在的作用环境相似且pH值相同。
扩增APOE基因的反应体系的扩增产物的电泳结果如图7所示，使用多种Taq聚合酶如Vazyme Taq、NEB Taq、Takara rTaq、Genstar Taq DNA聚合酶均能在仅加入添加剂3％DMSO和5％甘油时有微弱的目标条带。当在体系中使用多种Taq聚合酶如Vazyme Taq、Takara rTaq、Genstar Taq和Toyobo rTaq DNA聚合酶扩增时，在柠檬酸铋铵和次碳酸铋的作用下均能增强PCR扩增反应，使用NEB Taq DNA聚合酶，在次碳酸铋的作用下能增强PCR反应。柠檬酸铋铵和次碳酸铋增强PCR扩增反应均能适用于相似环境条件及pH的不同聚合酶反应体系中。
实施例3、铋基化合物降低引物的熔解温度(Tm)
DNA中GC含量越高，Tm值越高，成正比关系。对于GC含量高的模板而言，Tm值的有效降低有利于提高反应的特异性。本实施例中研究铋基化合物对于引物Tm值的影响作用。
在利用ASPro4se-FP、ASPro4se-RP进行Tm值测定时，本发明人分析了铋基化合物(柠檬酸铋铵(0.22nM)和次碳酸铋(0.1mM))对引物寡核苷酸链的影响：通过分别在正向引物(或反向引物)以及其互补链的5’端(或3’端)标记报告荧光基团Cy5和淬灭基团BHQ3观察荧光信号随温度的变化情况。如图8所示，添加剂和铋基化合物的存在导致正向引物和反向引物及其完全互补链的Tm值分别降低3℃和4℃，从而保持高特异性。
在利用APOE-FP、APOE-RP进行Tm值测定时，铋基化合物(柠檬酸铋铵(0.022mM)和次碳酸铋(0.02mM))对寡核苷酸链的影响。如图9所示，添加剂和铋基化合物的存在导致正向引物和反向引物及其完全互补链的Tm值均降低3℃。
上述结果表明，铋基化合物的加入可以提高反应的特异性。
实施例4、铋基化合物促进产物的解离
首先通过RT-qPCR扩增目标产物，然后通过测量dsDNA产物的量作为加热温度的函数，即产物的熔解曲线，分别研究柠檬酸铋铵(0.22nM)和次碳酸铋(0.1mM)对产物解离程度的影响。其中DMSO和甘油在体系中的浓度分别扩大两倍，其它PCR扩增方法同前述表2中。
对于GNAS1基因的扩增曲线，如图10所示，本发明人发现，在93℃时，不含和含0.22nM柠檬酸铋铵、0.1mM次碳酸铋的PCR产物的解离百分比分别为91.8％和92.8％、92.7％。另外，本发明人也通过凝胶电泳实验再次证实了柠檬酸铋铵(泳道2)和次碳酸铋(泳道3)可以促进产物解离，扩增产物量增多。数据清楚地表明，表面相互作用确实增强了产物的解离，加速反应进程。
对于APOE基因的扩增曲线，如图11所示，在95℃时，不含和含0.022mM柠檬酸铋铵、0.02mM次碳酸铋的PCR产物的解离百分比分别为94.6％和95.0％、95.1％。另外，本发明人也通过凝胶电泳实验再次证实了柠檬酸铋铵(泳道2)和次碳酸铋(泳道3)可以促进产物解离，扩增产物量增多，与扩增GNAS1基因作用效果相似。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
Claims (10)
1.一种增强聚合酶链式反应的方法，其特征在于，所述方法包括：在聚合酶链式反应体系中，添加铋基化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应体系为含有以下组分的缓冲液：DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、甘油、DMSO。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铋基化合物在反应体系中的浓度为0.001nM～5mM。
4.权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述铋基化合物包括：柠檬酸铋铵或次碳酸铋；
较佳地，所述铋基化合物为柠檬酸铋铵，其在反应体系中的浓度为0.001nM～500uM；或
较佳地，所述铋基化合物为次碳酸铋，其在反应体系中的浓度为0.1nM～5mM。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，按照体积比，所述甘油在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～20％；较佳地2～15％；更佳地所述甘油为低量的2～7％；或
按照体积比，所述DMSO在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～15％；较佳地1.5～12％；更佳地所述DMSO为低量的1.5～5％。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应中，DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶；较佳地，所述Taq DNA聚合酶包括：Ex Taq，Vazyme Taq，BBITaq，NEB Taq，Takara rTaq，Genstar Taq，Toyobo rTaq。
7.权利要求1～6任一所述的方法的应用，用于进行聚合酶链式反应，或用于分析待测样品中目标DNA的存在情况。
8.铋基化合物的应用，用于增强聚合酶链式反应；
较佳地，所述铋基化合物通过对Taq DNA聚合酶的吸附，调节聚合酶在反应液中的活性，增强反应效率；
较佳地，所述铋基化合物通过促进产物解离，加速反应进程，增加目标产物产量。
9.如权利要求1所述的方法或权利要求7所述的应用，其特征在于，所述聚合酶链式反应用于扩增的DNA为高GC含量的DNA；较佳地其GC含量高于55％；更佳地其GC含量高于60％。
10.一种聚合酶链式反应的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：铋基化合物，dNTPs，DNA聚合酶，甘油，DMSO；
较佳地，所述DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、甘油、DMSO为有效量的、适于所述聚合酶链式反应的进行；
更佳地，所述铋基化合物为柠檬酸铋铵，其在反应体系中的浓度为0.001nM～500uM；或，所述铋基化合物为次碳酸铋，其在反应体系中的浓度为0.1nM～5mM；
更佳地，按照体积比，所述甘油在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～20％；或，所述DMSO在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～15％；
更佳地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶；较佳地，所述Taq DNA聚合酶包括：Ex Taq，Vazyme Taq，BBITaq，NEB Taq，Takara rTaq，Genstar Taq，Toyobo rTaq。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310646865.4A CN116555404A (zh) | 2023-06-01 | 2023-06-01 | 利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310646865.4A CN116555404A (zh) | 2023-06-01 | 2023-06-01 | 利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116555404A true CN116555404A (zh) | 2023-08-08 |
Family
ID=87491615
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310646865.4A Pending CN116555404A (zh) | 2023-06-01 | 2023-06-01 | 利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116555404A (zh) |
-
2023
- 2023-06-01 CN CN202310646865.4A patent/CN116555404A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5786235B2 (ja) | リガーゼ検出反応による核酸相違の適合性の高い検出 | |
| JP3421664B2 (ja) | ヌクレオチド塩基の同定方法 | |
| JP2022008577A (ja) | 限られたヌクレオチド組成を有するプライマーを用いた増幅 | |
| JP4718493B2 (ja) | 核酸増幅中のプライマー凝集体形成を減少させるためのｄＵＴＰに基づく組成物 | |
| US20120028310A1 (en) | Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions | |
| JP6382189B2 (ja) | Ｒｎａテンプレートから開始する等温ｄｎａ増幅用のキット | |
| KR102213886B1 (ko) | 내열성 미스매치 엔도뉴클레아제의 이용방법 | |
| CN107109401A (zh) | 使用crispr‑cas系统的多核苷酸富集 | |
| KR102313470B1 (ko) | Dna의 에러-프리 염기서열 분석 | |
| CA3120713A1 (en) | Methods for targeted nucleic acid library formation | |
| Jia et al. | New applications of CRISPR/Cas9 system on mutant DNA detection | |
| JP4177118B2 (ja) | 増幅方法 | |
| JP2005512572A (ja) | Ｐｃｒにおける非特異的増幅を減少する方法 | |
| US20170253920A1 (en) | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids | |
| JP2005518216A (ja) | 融解温度依存ｄｎａ増幅 | |
| US10087482B2 (en) | Amplification of bisulfite-reacted nucleic acids | |
| JP2997043B2 (ja) | 改良されたプライマー伸長反応 | |
| JP2007111048A (ja) | プルーフリーディング特性を有するｄｎａポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応のための方法 | |
| CN110241175B (zh) | 一种Tet2序列偏好性的研究方法 | |
| US20180051330A1 (en) | Methods of amplifying nucleic acids and compositions and kits for practicing the same | |
| EP3601611B1 (en) | Polynucleotide adapters and methods of use thereof | |
| CN116555404A (zh) | 利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用 | |
| CN112831547B (zh) | 一种用于高GC片段扩增的qPCR添加剂及扩增方法 | |
| JP4601830B2 (ja) | カップル性ポリメラーゼ連鎖反応−制限エンドヌクレアーゼ消化−リガーゼ検出反応法 | |
| JP4300321B2 (ja) | Ｄｎａ合成反応を促進する方法、およびそのための組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |