CN111549120A - 无核酸扩增的aldh2基因g1510a位点分型方法及所用探针和反应体系 - Google Patents

无核酸扩增的aldh2基因g1510a位点分型方法及所用探针和反应体系 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无核酸扩增的ALDH2基因G1510A位点分型方法所用的反应探针，由野生型探针和突变型探针组成；野生型探针为WT1、uni，突变型探针为MT1、uni。本发明还同时提供了包含上述反应探针的检测体系，以及利用该体系进行的无核酸扩增的ALDH2基因G1510A位点分型方法。本发明可以在无扩增的条件下对ALDH2基因位点进行G1510A分型。

Description

无核酸扩增的ALDH2基因G1510A位点分型方法及所用探针和 反应体系
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种基于无核酸扩增的基因SNP分型检测方法。
背景技术
同一种药物对一些人非常有效或者吸收效果好，对另一些人效果却不明显，是因为他们基因组中存在的差异。这种差异很多表现为人类基因组上单个碱基上的变异，也就是单核苷酸的多态性(SNP)。单核苷酸的多态性，全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。因此，SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。
人类乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)是一种催化乙醛以及其他脂肪族醛氧化的四联体蛋白酶。目前，已发现有19种ALDH同工酶，研究较为深入的主要有胞质同工酶ALDHl和线粒体同工酶ALDH2，其中ALDH2在肝脏和胃中具有很高的表达量，是人体乙醇代谢途径中关键酶之一。人类ALDH2基因位于人类第12号染色体的12q24.2,总长约44kb，含有13个外显子，编码有517个氨基酸残基的多肽，目前发现存在His47Arg、Glu479Lys、Glu504Lys等多种突变体，其中主要突变体是Glu504Lys(rs671)，即位于12号外显子的单碱基突变G1510A。正常的等位基因记为ALDH2*1(*1510G)，突变的等位基因记为ALDH2*2(*1510A)。ALDH2*2在人类各族群中的分布是不同的，研究显示中国人ALDH2*2的频率为16％，日本人24％，泰国人5％，韩国人15％，印度人2％，但在白种人与黑人人群中频率很低，甚至完全缺乏。研究显示，突变型等位基因ALDH2*2的乙醛脱氢酶活性及硝酸酯酶活性基本丧失。硝酸甘油(NTG)是硝酸酯类扩张血管药物，是心绞痛急性发作的经典治疗药物之一。研究表明，硝酸甘油松弛血管平滑肌的作用，是通过释放一氧化氮(NO)来介导的。ALDH2基因编码的乙醛脱氢酶可以催化硝酸甘油转化成NO。乙醛脱氢酶的失活，导致硝酸甘油转化成NO过程受阻，引起NO水平降低，进而导致硝酸甘油治疗心绞痛效果降低。研究表明，ALDH2*1基因型的患者硝酸甘油治疗心绞痛的疗效明显优于ALDH2*2患者，野生型ALDH2对硝酸甘油的催化活性(Vmax/Km)大约是突变型的10倍，且前者迅速起效率也明显高于后者。ALDH2*2/*2纯合突变型硝酸酯酶活性约为ALDH2*1野生型的6-7％，ALDH2*l/*2杂合突变型硝酸酯酶活性约为ALDH2*1野生型的8-15％。同时，ALDH2突变基因携带者服用硝酸甘油无效风险也在大幅增加，ALDH2纯合及杂合突变型使用无效率达到42.4％，大约为ALDH2野生型的3倍。因此关于ALDH2基因G1510A位点的检测可用于硝酸甘油用药指导
目前检测SNP的方法有很多，sanger测序法、焦磷酸测序、taqman探针、arms-PCR、HRM高分辨融解曲线等等，但几乎所有方法都需要用到核酸扩增技术，包括DNA双链的变性、退火、延伸，PCR扩增容易导致形成气融胶，弥散在空气中，这些产物可以作为第二次PCR的模板进行扩增，极易引起污染，对检测结果造成假阳性；因此在国内，PCR技术要应用于临床，规定必须建设专门的核酸扩增室，至少包括试剂准备间、扩增间、检测间，并对每个房间设置气压差以避免交叉污染。这对于项目的开展是一笔巨大的投入，极大限制了分子生物学在临床上的应用。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种利用无核酸扩增的技术检测SNP位点，对其进行分型。
本发明的方法克服了现有技术的限制；以ALDH2基因的位点G1510A为例，利用本发明的基因检测技术，将该位点区分为纯合野生GG型、杂合GA型、纯合AA突变型；可用于硝酸甘油的用药指导。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
对ALDH2基因的G1510A位点，在dbSNP数据库记录号为rs671,通过NCBI数据库获得该位点两侧的序列(作为参考序列)，括号内带下划线的为野生型与突变型的不同碱基，如下：
AGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACT[G/A]AAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGG
分别针对该位点的野生型或突变型，设计两对探针，使两条野生型探针的序列正好与野生型GG序列匹配；另两条突变型探针的序列与突变型AA序列匹配；两对探针的差别为上游探针3’端的一个碱基不同，两对探针的下游探针是相同的，记为Uni探针。
野生型探针(WT1、uni)为：
WT1:5’GGTCCCACACTCACAGTTTTCACTTC 3’，在探针5’端标记荧光基团(例如为FAM荧光基团)；
uni:5’AGTGTATGCCTGCAGCCCGTACTCGC 3’，在探针5’端磷酸化修饰，在探针3’端标记淬灭基团(例如为BHQ1淬灭基团)。
与参考序列野生时可形成如下双链结构：
3‘CGCTCATGCCCGACGTCCGTATGTGA5’3’[C]TTCACTTTTGACACTCACACCCTGG5’
5‘GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACT[G]AAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACC 3’
设计突变型探针(MT1、uni)为：
MT1:5’GGTCCCACACTCACAGTTTTCACTTT 3’，在5’端标记荧光基团(例如为FAM荧光基团)；
uni:5’AGTGTATGCCTGCAGCCCGTACTCGC 3’，与野生型的一致，在探针5’端磷酸化修饰，在探针3’端标记淬灭基团(例如为BHQ1淬灭基团)。
与参考序列的突变型可形成如下双链结构：
3‘CGCTCATGCCCGACGTCCGTATGTGA5’3’[T]TTCACTTTTGACACTCACACCCTGG5’
5‘GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACT[A]AAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACC 3’
具体序列如表1所示：
表1、序列表
Figure BDA0002520261660000031
探针设计原则：CG含量40-60％，碱基长度20-40nt，与其他非特异区域保证3个以上碱基的错配。
本发明中所述发光基团为FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、R0X中的任意一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ-1、BHQ-2中的任意一种。
所有序列，由中国takara公司(中国地区称为大连宝生物有限公司)负责合成，返回后探针稀释成10pmole/ul深度，分装后避光保存。
本发明还同时提供了包含上述反应探针的检测体系：包括作为模板的待测DNA、
Figure BDA0002520261660000032
10X反应缓冲液、WT1探针、MT1探针、Uni探针、耐高温的DNA连接酶、纯水。
作为本发明检测体系的改进：耐高温的DNA连接酶为
Figure BDA0002520261660000033
耐热DNA连接酶。
本发明的方法是通过对模板DNA进行高温变性后再退火的过程中，所设的特异型探针与目的片段特异型结合，并通过耐高温的T4 DNA连接酶连接后，发生探针荧光基团淬灭，从而通过检测荧光量的变化情况，判定SNP位点的具体基因型。其中Taq DNA连接酶，能够催化磷酸二酯键的形成，使杂交到同一靶DNA链上的两条寡核苷酸链的5’-磷酸末端和3’-羟基末端通过磷酸二酯键连接，因此这个连接反应只有当两条寡核苷酸链与靶DNA完全配对并且二者之间没有空隙的条件下才可发生，而当探针3’末端碱基与靶DNA不能完全匹配，则连接酶不能起作用，不能发生连接反应。
本发明的具体使用方法如下：
在本发明中涉及的DNA连接酶是指具有可以通过在两个DNA分子的之间形成磷酸二酯键将DNA在3’端的尾端与5’端的前端连在一起。所述DNA连接酶是T4 DNA连接酶，其可以催化具有粘端或平端的双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单一链上面具有的缺口。
本发明中所述DNA连接酶为耐高温的DNA连接酶(例如但不限于
Figure BDA0002520261660000041
DNALigase,Epicentre科技公司，以及Taq DNA连接酶)。
Figure BDA0002520261660000042
DNA连接酶是一种热稳定的连接酶，其能够催化NAD-依赖的双链DNA的5’-磷酸和3’-羟基基团的连接反应，在65℃半衰期为48小时，在95℃时半衰期达1小时以上。Taq DNA连接酶也是NAD-依赖的热稳定的连接酶，其能够催化磷酸二酯键的形成，使杂交到同一靶DNA链上的两条寡核苷酸链的5’-磷酸末端和3’-羟基末端通过磷酸二酯键连接，这个连接反应只有当两条寡核苷酸链与靶DNA完全配对并且二者之间没有空隙的条件下才可发生，因此，可以用它来检测单碱基替换。在45℃-65℃范围内，Taq DNA连接酶均有活性。
其中本发明实施例中为耐热DNA连接酶
Figure BDA0002520261660000043
耐热DNA连接酶，购买自美国lucigen公司(货号A0110K)。
本发明中的反应缓冲液为
Figure BDA0002520261660000044
10X反应缓冲液，购自美国lucigen公司(货号为A1905B)。
血液DNA提取试剂盒：Qiagen DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒(德国凯杰公司，货号69506)。
具体操作步骤如下：
1、外周血2ml，利用血液DNA提取试剂盒提取基因组DNA，作为模板，放冰上或者4℃冰箱暂存备用；
2、在冰上制备以下反应体系：
2.1野生型反应体系
Figure BDA0002520261660000045
Figure BDA0002520261660000051
2.2突变型反应体系
Figure BDA0002520261660000052
说明：野生型反应体系、突变型反应体系中，DNA连接酶必须使用同一种酶。
将配置完成的PCR反应管放于荧光定量PCR仪(博日，FQD-48A)上，进行如下程序：
Figure BDA0002520261660000053
说明：表中的55℃为退火。
于起始时收集荧光值，且于所需个数的循环结束时收集荧光值；
依次进行以下步骤：
步骤1、首先判定反应结果，任选以下一种方法：
方法一、
当10个循环后的荧光相对值＜95％，反应结果属于阳性；
当10个循环后的荧光相对值≥95％，不做判断，需要等到40个循环后按照方法二再进行判断；
方法二、
当40个循环后的荧光相对值＜80％，反应结果属于阳性；
当40个循环后的荧光相对值＞90％，反应结果属于阴性；
80％≤当40个循环后的荧光相对值≤90％，反应结果属于临界区间；
方法一、方法二中，荧光相对值＝循环后对应的荧光值/起始荧光值(首次检测得到的荧光值)；
步骤2、最终结果判读：
当野生型检测体系的反应结果为阳性、且突变型检测体系的反应结果为阴性时，判定该该待测DNA属于纯合野生型；
当野生型检测体系的反应结果为阳性、且突变型检测体系的反应结果为阳性时，判定该该待测DNA属于杂合型；
当野生型检测体系的反应结果为阴性、且突变型检测体系的反应结果为阳性时，判定该该待测DNA属于纯合突变型；
当野生型检测体系、突变型检测体系中只要有一个的反应结果属于临界区间时，或者当野生型检测体系和突变型检测体系的反应结果均为阴性时，判定需要对该待测DNA重新进行检测。
说明：野生型检测体系和突变型检测体系的反应结果均为阴性，相当于没有发生反应，如果反应正常进行，不可能出现这种请款，因此重新进行检测。
本发明中，以事先采用具有cFDA批文的ALDH2基因突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(国械注准20163400754)，检测结果为纯合野生型的作为本实验的阴性样本质控品，检测结果为杂合型、纯合突变型作为本实验的阳性样本质控品。
判读方式如下：将反应液初始放入之后荧光PCR仪收集的荧光信号值为初始荧光信号值设置为1，进行归一化处理；然后按照表2进行判定。
表2
Figure BDA0002520261660000061
Figure BDA0002520261660000071
当检测循环数为40个循环时，荧光相对值＞90％为阴性，荧光相对值＜80％为阳性，80％≤荧光相对值≤90％，为临界值；同一样本的两管反应(野生型和突变型)，如果一管的结果是临界值，另一管无论结果是阴性，或是阳性，或是临界值，此实验都需要加大模板重复实验。
当检测时间为10个循环时，荧光相对值＜95％判断为阳性，当大于或等于95％时，均不做判断，需要等到40个循环后再做判断。
以野生型反应体系为例，其结果如图2。
本发明的技术原理如图1所示：
1.DNA模板通过95℃高温变性，双链DNA形成单链DNA；
2.加入两条探针和耐高温的DNA连接酶，在DNA连接酶作用下两条探针连接成为一条，使荧光基团淬灭：当带有FAM荧光的探针和带有BHQ1淬灭基团的探针分开时，能够发出荧光，并通过qPCR仪检测到。而当退火到55℃时，若带FAM荧光的探针、BHQ1淬灭基团的探针与模板能够匹配，则可以通过DNA连接酶的作用，催化3’OH和5’磷酸基团形成磷酸二酯键，从而使两条探针连接成为一条，使荧光淬灭，并与模板形成一个互补的双链。若两条探针与模板不能匹配，则两条探针就不会连接成一条探针，荧光也不会淬灭。
3.经过多轮循环后，其中大部分FAM荧光探针与BHQ1淬灭基团的探针连接为一条探针，从而使得荧光淬灭。
在循环过程中，为保证加入的带有荧光基团和淬灭基团的荧光探针连接效率，将带有淬灭基团探针的量，设置为带有荧光基团探针的量的3-5倍(摩尔比)，即uni探针是WT1探针的3～5倍，且，uni探针是MT1探针的3～5倍，保证此类连接探针优选结合在模板上，发生连接反应。在反复发生的连接过程中通过qPCR仪检测不同时间的荧光信号值，经过不断的循环，荧光不断的衰减，荧光信号将呈线性下降。
本发明具有如下性能优势：
1、本发明采用了独创的闭管检测，以及无扩增反应体系，几乎可以避免所有因核酸扩增带来的气溶胶污染。从而使实验条件的要求也大大降低，不再需要临床核酸扩增实验室，使得该检测能在普通的理化实验室完成。这大大增加了该技术的应用范围。
2、本发明的结果检测，可以采用实时荧光检测，也可以采用终点荧光检测法，这使得对检测设备的要求可以进一步降低。
综上所述，本发明可以在无扩增的条件下对ALDH2基因位点进行G1510A分型。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明的原理图。
图2是阴性对照/杂合阳性对照/阳性对照样本检测荧光值随检测循环数的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、对10例经有CFDA批文试剂验证过的ALDH2基因G1510A位点分别为纯合野生型(GG)的4例，杂合型(GA)的4例，纯合突变型(AA)的2例血样，利用本发明进行基因分型。
一、实验方法与步骤
1.样本DNA提取：
上述已知分型结果的10例样本的EDTA抗凝取血由合作医院负责提供，每个样本的EDTA抗凝取血2ml。用Qiagen DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒(德国凯杰公司，货号69506)进行血液中的基因组DNA提取，Nanodrop测浓度后，统一稀释为50ng/ul。
2.在冰上制备以下反应体系：
2.1野生型反应体系1
Figure BDA0002520261660000081
2.2突变型反应体系2
Figure BDA0002520261660000082
Figure BDA0002520261660000091
野生型探针为WT1、uni，突变型探针为MT1、uni；
野生型探针(WT1、uni)为：
WT1:5’GGTCCCACACTCACAGTTTTCACTTC 3’，在探针5’端标记FAM荧光基团；
uni:5’AGTGTATGCCTGCAGCCCGTACTCGC 3’，在探针5’端磷酸化修饰，在探针3’端标记BHQ1淬灭基团。
突变型探针(MT1、uni)为：
MT1:5’GGTCCCACACTCACAGTTTTCACTTT 3’，在5’端标记FAM荧光基团；
uni:5’AGTGTATGCCTGCAGCCCGTACTCGC 3’，与野生型的一致，在探针5’端磷酸化修饰，在探针3’端标记BHQ1淬灭基团。
3.将配置完成的PCR反应管放于荧光定量PCR仪(博日，FQD-48A)上，进行如下程序：
Figure BDA0002520261660000092
4.以各反应孔40个循环后检测的终点荧光信号值比上此反应孔初始第一次检测的初始
荧光信号值，做为终点比值法(即，作为荧光相对值)，进行判断：
步骤1、首先判定反应结果，
当40个循环后的荧光相对值＜80％，反应结果属于阳性；
当40个循环后的荧光相对值＞90％，反应结果属于阴性；
80％≤当40个循环后的荧光相对值≤90％，反应结果属于临界区间；
步骤2、最终结果判读：
当野生型检测体系的反应结果为阳性、且突变型检测体系的反应结果为阴性时，判定该该待测DNA属于纯合野生型；
当野生型检测体系的反应结果为阳性、且突变型检测体系的反应结果为阳性时，判定该该待测DNA属于杂合型；
当野生型检测体系的反应结果为阴性、且突变型检测体系的反应结果为阳性时，判定该该待测DNA属于纯合突变型；
当野生型检测体系、突变型检测体系中只要有一个的反应结果属于临界区间时，或者当野生型检测体系和突变型检测体系的反应结果均为阴性时，判定需要对该待测DNA重新进行检测。
5、结果如表3所示。
表3. 10个样本的检测结果与判读情况
Figure BDA0002520261660000101
Figure BDA0002520261660000111
结果显示，在500ng人全血DNA做为模板的前提下，用该方法检测结果，与有CFDA批文的试剂检测结果完全一致。
本发明的创新之处在无扩增、闭管检测、可以终点检测法。降低了对仪器的需求，以及避免扩增环境，无须临床扩增实验室，也不会引起气溶胶污染。在临床基因分型检测中具有非常重要的意义，特别是对药物基因组学，微生物耐药等场景，具有重要的价值。
实施例2、为了验证本发明方法的通用性，发明人进行了如下的验证实验：
将未知样本40个循环后的荧光信号值比初始信号值进行比较，实验方法和判定条件均同实施例1。
所得结果如下：
未知样本的份数为30份，经本发明的方法所得结果为：16份为杂合型、9份为纯合野生型、5份为纯合突变型；这30份样本按照金标准法进行检测；所得结果完全同本发明的检测结果。
对比例1-1、按照上文中告知的探针设计原则还设定了如下的探针对：
野生型探针(WT2、uni1)为：，
WT2:5’CACACTCACAGTTTTCACTTC 3’，在探针5’端标记FAM荧光基团；
Uni1:5’TATGCCTGCAGCCCGTACTCGC3’，在探针5’端磷酸化修饰，在探针3’端标记BHQ1淬灭基团。
突变型探针(MT2、uni1)为：
MT2:5’CACACTCACAGTTTTCACTTT 3’，在5’端标记FAM荧光基团；
Uni1:5’TATGCCTGCAGCCCGTACTCGC 3’，与野生型的一致，在探针5’端磷酸化修饰，在探针3’端标记BHQ1淬灭基团。
即，其他修饰与实施例1相同，只是将探针长度缩短至与实施例1不同的长度。
上述探针也满足以下条件：两条野生型探针的序列正好与野生型GG序列匹配；另两条突变型探针的序列与突变型AA序列匹配。
利用此探针按照实施例1所述方法对10个已知样本进行检测，所得结果如下表4：
表4
Figure BDA0002520261660000121
采用上述探针对时，出现了一定比例的与“金标准法检测结果”不一致的情况，因此，说明该对比例所述探针不能用于无核酸扩增的ALDH2基因G1510A位点分型。
对比例1-2、按照上文中告知的探针设计原则还设定了如下的探针对：
野生型探针(WT3、uni2)为：，
WT3:5’CAGCAGGTCCCACACTCACAGTTTTCACTTC 3’，在探针5’端标记FAM荧光基团；
Uni2:5’AGTGTATGCCTGCAGCCCGTACTCGCCCAA 3’，在探针5’端磷酸化修饰，在探针3’端标记BHQ1淬灭基团。
突变型探针(MT2、uni)为：
MT3:5’CAGCAGGTCCCACACTCACAGTTTTCACTTC 3’，在探针5’端标记FAM荧光基团；
Uni2:5’AGTGTATGCCTGCAGCCCGTACTCGCCCAA 3’，在探针5’端磷酸化修饰，在探针3’端标记BHQ1淬灭基团。
即，其他修饰与实施例1相同，只是将所有探针长度设置与实施例1不同的长度。
上述探针也满足以下条件：两条野生型探针的序列正好与野生型GG序列匹配；另两条突变型探针的序列与突变型AA序列匹配。
利用此探针按照实施例1所述方法对10个已知样本进行检测，所得结果如下表5：
表5
Figure BDA0002520261660000131
采用上述探针对时，出现了一定比例的与“金标准法检测结果”不一致的情况，因此，说明该对比例所述探针不能用于无核酸扩增的ALDH2基因G1510A位点分型。
对比例2、将实施例1中的连接反应体系中使用的DNA连接酶换成Hi-T4TM耐热DNA连接酶及其对应反应缓冲液，具体如下：
野生型反应体系：
模板DNA(50ng/μL) 10μL
10XT4 DNA连接酶反应缓冲液 2.5μL
WT1探针(1pM) 1μL
Uni探针(1pM) 5μL
Hi-T4<sup>TM</sup>耐热DNA连接酶 1U
总体积，用无核酶的纯水补足到 25μL
突变型反应体系：
模板DNA(50ng/μL) 10μL
10XT4 DNA连接酶反应缓冲液 2.5μL
MT1探针(1pM) 1μL
Uni探针(1pM) 5μL
Hi-T4<sup>TM</sup>耐热DNA连接酶 1U
总体积，用无核酶的纯水补足到 25μL
所用探针同实施例1；对10个已知样本进行检测，所得结果无论是阴性样本，或是阳性样本，荧光信号在40个循环后仍然保持在初始值的95％以上(即，荧光相对值＞95％)，均判断为阴性结果；因此，证明Hi-T4TM耐热DNA连接酶不能用于无核酸扩增的ALDH2基因G1510A位点分型。
说明：DNA连接酶也是T4 DNA连接酶，也可以催化具有粘端或平端的双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子，但其最佳反应温度在约37℃左右，高于65℃则逐渐失去酶活性。因此在95℃的高温进行变性时，会导致Hi-T4TM耐热DNA连接酶失去活性，进而使连接反应不能进行。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，如其他基于SNP位点的检测应用，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州盾恩医学检验实验室有限公司
<120> 无核酸扩增的ALDH2基因G1510A位点分型方法及所用探针和反应体系
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtcccacac tcacagtttt cacttc 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtgtatgcc tgcagcccgt actcgc 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtcccacac tcacagtttt cacttt 26

Claims (5)

1.无核酸扩增的ALDH2基因G1510A位点分型方法所用的反应探针，其特征是：由野生型探针和突变型探针组成；
野生型探针为WT1、uni，突变型探针为MT1、uni，
WT1:5’GGTCCCACACTCACAGTTTTCACTTC 3’，在探针5’端标记荧光基团；
uni:5’AGTGTATGCCTGCAGCCCGTACTCGC 3’，在探针5’端磷酸化修饰，在探针3’端标记淬灭基团；
MT1:5’GGTCCCACACTCACAGTTTTCACTTT 3’，在探针5’端标记荧光基团。
2.根据权利要求1所述的反应探针，其特征是：
所述荧光基团为以下任一：FAM、TET、J0E、HEX、Cy3、TAMRA、R0X；
所述淬灭基团为以下任一：Dabcyl、BHQ-1、BHQ-2。
3.包含如权利要求1或2所述反应探针的检测体系，其特征是：包括作为模板的待测DNA、
Figure FDA0002520261650000012
10X反应缓冲液、WT1探针、MT1探针、Uni探针、耐高温的DNA连接酶。
4.根据权利要求3所述的检测体系，其特征是：耐高温的DNA连接酶为
Figure FDA0002520261650000013
耐热DNA连接酶。
5.利用如权利要求3或4所述体系进行的无核酸扩增的ALDH2基因G1510A位点分型方法，其特征是：
每个待测DNA作为模板分别设定使用野生型探针的野生型检测体系、以及使用突变型探针的突变型检测体系；
野生型检测体系/突变型检测体系分别于荧光定量PCR仪上，进行如下程序：
Figure FDA0002520261650000011
Figure FDA0002520261650000021
于起始时收集荧光值，且于所需个数的循环结束时收集荧光值；
依次进行以下步骤：
步骤1、首先判定反应结果，任选以下一种方法：
方法一、
当10个循环后的荧光相对值＜95％，反应结果属于阳性；
当10个循环后的荧光相对值≥95％，不做判断，需要等到40个循环后按照方法二再进行判断；
方法二、
当40个循环后的荧光相对值＜80％，反应结果属于阳性；
当40个循环后的荧光相对值＞90％，反应结果属于阴性；
80％≤当40个循环后的荧光相对值≤90％，反应结果属于临界区间；
方法一、方法二中，荧光相对值＝循环后对应的荧光值/起始荧光值；
步骤2、最终结果判读：
当野生型检测体系的反应结果为阳性、且突变型检测体系的反应结果为阴性时，判定该该待测DNA属于纯合野生型；
当野生型检测体系的反应结果为阳性、且突变型检测体系的反应结果为阳性时，判定该该待测DNA属于杂合型；
当野生型检测体系的反应结果为阴性、且突变型检测体系的反应结果为阳性时，判定该该待测DNA属于纯合突变型；
当野生型检测体系、突变型检测体系中只要有一个的反应结果属于临界区间时，或者当野生型检测体系和突变型检测体系的反应结果均为阴性时，判定需要对该待测DNA重新进行检测。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112538528A (zh) * 2020-12-25 2021-03-23 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 一种检测aldh2基因多态性的引物组及试剂盒

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