CN103184203A - 木聚糖酶AnxB及其编码基因 - Google Patents
木聚糖酶AnxB及其编码基因 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103184203A CN103184203A CN2011104500614A CN201110450061A CN103184203A CN 103184203 A CN103184203 A CN 103184203A CN 2011104500614 A CN2011104500614 A CN 2011104500614A CN 201110450061 A CN201110450061 A CN 201110450061A CN 103184203 A CN103184203 A CN 103184203A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- anxb
- sequence
- zytase
- xylanase
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了木聚糖酶AnxB及其编码基因。该木聚糖酶SoxB为氨基酸序列如序列表中序列4所示的蛋白质。实验证明,本发明木聚糖酶,在保持原有木聚糖酶特性的基础上,其半衰期显著延长,Tm值显著增高,最适温度也显著提高。因此,本发明的木聚糖酶在木聚糖应用领域将有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及木聚糖酶AnxB及其编码基因。
背景技术
木聚糖(xylan)是一类分子结构变化范围很大的多糖,从仅由β-1,4糖苷键连接的多聚木糖线性分子到高度分支的异聚多糖。木聚糖是植物半纤维素的重要组分,约占植物总糖的三分之一,是自然界中除纤维素以外含量最丰富的再生生物资源。木聚糖酶(E.C 3.2.1.8)是一类以内切方式降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶系。近年来,木聚糖酶在食品、纺织、饲料、能源工业中都显示了广阔的应用前景。特别是在制浆造纸工业中该酶用于纸浆漂白,能够增加纸张白度,改善纸张性能,降低漂白用化学物质的用量,从而有效减轻造纸业对环境的污染。根据木聚糖酶催化区域的氨基酸组成和疏水簇序列分析,可将其归为F/10和G/11两大家族。相比于F/10家族木聚糖酶,G/11家族木聚糖酶具有分子量较小,易于穿透纤维素网状结构以及不含纤维素酶活性的特点,从而更适合应用于纸浆漂白工艺中。
热稳定性是木聚糖酶工业生产、储藏、运输以及应用过程中追求的又一重要特性。因此,获得热稳定性的木聚糖酶对于木聚糖酶的应用具有重要的实践价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种热稳定性高的木聚糖酶(蛋白质)及其编码基因与应用。
本发明所提供的蛋白质,其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
本发明所提供的蛋白质的编码基因,为任何编码上述蛋白的DNA,具体为核苷酸序列如序列表中序列3所示的DNA。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明的保护范围。
上述任一所述蛋白质在作为木聚糖酶中的应用也属于本发明的保护范围。
实验证明,本发明的木聚糖酶,在保持原有木聚糖酶特性的基础上,其半衰期显著延长,Tm值显著增高,最适温度也显著提高。因此,本发明的木聚糖酶在木聚糖应用领域将有广阔的应用前景。
附图说明
图1为AnxB与其突变体AnxB-M2热稳定性比较。(A)AnxB与AnxB-M2在65℃热稳定性比较;(B)AnxB与AnxB-M2Tm值比较。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
黑曲霉Aspergillus niger UV-11 CGMCC No.4.4309购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
pET-28a(+)购自Novagen,产品目录号为69865-3;
实施例1、木聚糖酶AnxB及其热稳定性的提高
将黑曲霉Aspergillus niger UV-11 CGMCC No.4.4309产生的木聚糖酶AnxB中五个氨基酸相应地突变为Y11,H12,D13,Y15和F16,产生突变体AnxB-M2,并将其热稳定性与其相应的野生型木聚糖酶进行比较。
一、木聚糖酶AnxB的制备及稳定性检测
实验组:
1、PCR扩增木聚糖酶SlxB的编码基因
以黑曲霉Aspergillus niger UV-11 CGMCC No.4.4309的基因组DNA为模板,用引物AnxB-P1、AnxB-P2(表1)进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
2、酶切、连接
用NdeI和EcoRI双酶切PCR扩增产物,与预先使用NdeI和EcoRI双酶切的pET-28a(+)进行连接,得到重组载体;
3、转化、筛选以及测序验证
用氯化钙化学转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用含有卡拉霉素(50μg/ml)的LB培养基进行筛选培养,挑取单菌落,并进行扩大培养和提取质粒,进行测序验证.结果获得的序列(即AnxB编码基因)如序列表中序列1所示;该序列编码序列2所示蛋白(即AnxB蛋白)。证明构建的质粒及重组菌正确。将阳性克隆记作BL21-pET-AnxB,阳性质粒记作pET-AnxB。
4、酶的表达:
挑取BL21-pET-AnxB单菌落接入含有卡拉霉素(50μg/ml)的LB培养基中,于37℃过夜培养。将过夜培养物接种于1L含有卡拉霉素(50μg/ml)的LB培养基,37℃剧烈振荡(200rpm)培养,至发酵液的OD600值达到0.6-0.8左右,再向发酵体系中加入IPTG(终浓度0.5mM),30℃条件下再培养6-8小时。
发酵完毕后,5000rpm离心15分钟,收集菌体;用pH6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液重悬菌体,超声波破碎后12,000rpm离心15min。收集上清液,即为含有目的蛋白的粗酶液。
5、酶的纯化:
采用镍柱亲和层析进行纯化,在Amersham公司的AKTA FPLC系统中用1ml装量的HiTrap chelating HP column(镍柱)纯化上清。非变性镍柱结合缓冲液I用于平衡纯化柱体和上样。蛋白上样量为10ml,流速设为1ml/min。用20%非变性镍柱洗脱缓冲液(即非变性镍柱结合缓冲液I和非变性镍柱洗脱缓冲液II的混合溶液,非变性镍柱结合缓冲液I和非变性镍柱洗脱缓冲液II的体积比为80∶20)进行洗涤,去除非特异性结合的杂蛋白。用80%非变性镍柱洗脱缓冲液(即非变性镍柱结合缓冲液I和非变性镍柱洗脱缓冲液II的混合溶液,非变性镍柱结合缓冲液I和非变性镍柱洗脱缓冲液II的体积比为20∶80)进行洗脱,收集含洗脱峰的洗脱液,SDS-PAGE检测洗脱液中样品纯度。
非变性镍柱结合缓冲液I:0.02M磷酸盐缓冲液,0.5M氯化钠,pH7.4;
非变性镍柱洗脱缓冲液II:0.02M磷酸盐缓冲液,0.5M氯化钠,0.5M咪唑,pH7.4。
6、目的酶液的酶活检测:
木聚糖酶酶活的测定:木聚糖酶酶活的测定采用DNS法。取40μl适当稀释的酶液,加入360μl 1%木聚糖(Sigma birchwood xylan)溶液,50℃温育10min,加入600μl DNS溶液后,99℃温育15min,冷却到室温后540nm处测定吸光值。
酶活定义:每分钟水解木聚糖产生1μmol木糖的酶量定义为一个酶活单位。
1%木聚糖(Sigma birchwood xylan)溶液的组成:1g木聚糖溶于100mL 20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中。
DNS溶液的组成:50g 3,5-二硝基水杨酸溶于4L水中,不断搅拌,缓缓加入80gNaOH,使之完全溶解,继续搅拌,将1500g酒石酸钾钠分数次加入,并小心加热,溶液最高温度不超高45℃。冷却至室温后定容至5L。如果溶液不澄清,用Whatman 1号滤纸过滤,然后棕色瓶室温贮藏。
制作DNS标准曲线,将酶液测定结果与DNS标准曲线比对,得到酶液中酶活量。
对照组:同时将空载体pET-28a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3),筛选验证,得到含有空载体pET-28a(+)的阳性克隆,记作BL21-pET-28a(+),作为对照菌。按照上述步骤将对照菌进行酶的表达和纯化,对纯化得到的液体进行酶活检测。
实验设3次重复,实验组检测均具有木聚糖酶活性,而对照组均未检测到木聚糖酶酶活。
(二)酶热稳定性的检测:
取在特定温度下处理不同时间的木聚糖酶酶液进行剩余酶活的测定。根据剩余酶活曲线计算其半衰期(t1/2)。剩余酶活(%)=P/Pmax*100%。其中P为木聚糖酶在70℃或80℃条件下分别处理不同时间,取样后迅速置于冰上,在50℃,pH 6.0条件下测定的酶活。Pmax为木聚糖酶未进行热处理在50℃,pH 6.0条件下测定的酶活。半衰期(t1/2)的定义:酶失活至原来活性一半时所需时间。
实验设3次重复。
差示扫描量热仪[Nano DSC(TA instruments)]测定木聚糖酶Tm值。
酶蛋白的变性温度(Tm值)定义:是在连续升温的过程中,50%蛋白发生变性时所对应的温度。
DSC测定的升降温速率为1℃/min,木聚糖酶蛋白浓度为1.0mg/mL。为防止在升温过程中样品的蒸发,所有的DSC实验均维持3atm的压力。实验数据用Nano DSC自带的DSCRun软件进行分析处理。蛋白质DSC曲线的吸热峰所指征的温度即为该蛋白的Tm值。
实验设3次重复。
(四)最适温度
比较木聚糖酶在不同温度下的酶活,测定其最适温度。最适温度的测定是在20mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)中于不同温度下(30-90℃)进行酶促反应,测定木聚糖酶酶活。
实验设3次重复。
二、木聚糖酶AnxB的突变体(AnxB-M2)的制备及稳定性检测
(一)木聚糖酶突变体(AnxB-M2)的制备
实验组:
1、重叠延伸PCR扩增AnxB-M2基因
(1)以pET-AnxB质粒为模板,以P1和AnxB-P2为引物扩增AnxB-M2基因上游片段,以P2和AnxB-P1为引物扩增AnxB-M2基因下游片段。
(2)胶回收步骤(1)中扩增的上下游片段,并以回收的上下游片段为模板,以P1和P2为引物,PCR扩增得到AnxB-M2全长基因片段。
2、酶切、连接
用NdeI和EcoRI双酶切重叠延伸PCR扩增产物,与预先使用NdeI和EcoRI双酶切的pET-28a(+)进行连接,得到重组载体;
3、转化、筛选以及测序验证
用氯化钙化学转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用含有卡拉霉素(50μg/ml)的LB培养基进行筛选培养,挑取单菌落,并进行扩大培养和提取质粒,进行测序验证,结果获得序列表中序列3所示基因(编码序列4所示蛋白),表明得到插入基因序列正确的阳性克隆;将阳性克隆记作BL21-pET-AnxB-M2,将阳性质粒记作pET-AnxB-M2。
也可按照常规的其它方法制备得到序列3所示基因,如人工合成。
序列4所示蛋白(即AnxB木聚糖酶5个氨基酸共同突变体)与序列2所示蛋白(即AnxB木聚糖酶)相比,存在以下差别:序列4自N端起第8位氨基酸突变成Y、自N端起第9位氨基酸突变成H,自N端起第10位氨基酸突变成D,自N端起第12位氨基酸突变成Y,自N端起第13位氨基酸突变成F。
4、酶的表达:方法与实验一中所述相同。
5、酶的纯化:方法与实验一中所述相同。
6、目的酶液的酶活检测:方法与实验一中所述相同。
对照组:同时将空载体pET-28a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3),筛选验证,得到含有空载体pET-28a(+)的阳性克隆,记作BL21-pET-28a(+),作为对照菌。按照上述步骤将对照菌进行酶的表达和纯化,对纯化得到的液体进行酶活检测。
实验设3次重复,实验组检测均具有木聚糖酶活性,而对照组均未检测到木聚糖酶酶活。
(二)酶热稳定性的检测
方法与实验一中所述相同。实验设3次重复。
(三)Tm值测定
方法与实验一中所述相同。实验设3次重复。
(四)最适温度:方法与实验一中所述相同。实验设3次重复。
结果表明AnxB-M2的热稳定性得到的明显的提高。木聚糖酶AnxB在引入这五个氨基酸残基的突变后,在55℃的半衰期由原来的12.2min提高到75.6min(图1A和表2)。Tm值也由原来的54.1℃提高到63.2℃(图1B和表2)。
表1用于克隆木聚糖酶及其突变基因的引物
表2、AnxB与AnxB-M2热稳定性比较
Claims (5)
1.一种蛋白质,其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因,其特征在于:所述编码基因为核苷酸序列如序列表中序列3所示的DNA。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒。
5.权利要求1所述蛋白质在作为木聚糖酶中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011104500614A CN103184203A (zh) | 2011-12-29 | 2011-12-29 | 木聚糖酶AnxB及其编码基因 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011104500614A CN103184203A (zh) | 2011-12-29 | 2011-12-29 | 木聚糖酶AnxB及其编码基因 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103184203A true CN103184203A (zh) | 2013-07-03 |
Family
ID=48675652
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2011104500614A Pending CN103184203A (zh) | 2011-12-29 | 2011-12-29 | 木聚糖酶AnxB及其编码基因 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103184203A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110607292A (zh) * | 2018-06-14 | 2019-12-24 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种高比活木聚糖酶突变体 |
CN113528491A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-10-22 | 江南大学 | 一种n-糖基化修饰提高黑曲霉木聚糖酶热稳定性的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101392266A (zh) * | 2008-09-18 | 2009-03-25 | 复旦大学 | 一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株及其制备方法 |
-
2011
- 2011-12-29 CN CN2011104500614A patent/CN103184203A/zh active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101392266A (zh) * | 2008-09-18 | 2009-03-25 | 复旦大学 | 一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
SHAN ZHANG 等: ""Biochemical and Biophysical Research Communications"", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
付正 等: ""嗜热真菌木聚糖酶1YNA 的表达和定点突变"", 《湖北农业科学》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110607292A (zh) * | 2018-06-14 | 2019-12-24 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种高比活木聚糖酶突变体 |
CN110607292B (zh) * | 2018-06-14 | 2022-05-31 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种高比活木聚糖酶突变体 |
CN113528491A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-10-22 | 江南大学 | 一种n-糖基化修饰提高黑曲霉木聚糖酶热稳定性的方法 |
CN113528491B (zh) * | 2021-08-19 | 2023-08-25 | 江南大学 | 一种n-糖基化修饰提高黑曲霉木聚糖酶热稳定性的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mao et al. | Purification, characterization, and heterologous expression of a thermostable β-1, 3-1, 4-glucanase from Bacillus altitudinis YC-9 | |
CN112708608B (zh) | 木聚糖酶突变体及其制备方法与应用 | |
CN105018448B (zh) | 一种真菌来源的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用 | |
Wierzbicka-Woś et al. | Biochemical characterization of a novel monospecific endo-β-1, 4-glucanase belonging to GH family 5 from a rhizosphere metagenomic library | |
CN109182360B (zh) | 一种小分子纤维素内切酶基因及其蛋白和应用 | |
CN102732494B (zh) | β-甘露聚糖酶及其制备方法 | |
CN102120971A (zh) | 一种普鲁兰酶产生菌及其所产生的耐热普鲁兰酶及编码基因 | |
CN104560927A (zh) | 一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用 | |
CN103555690A (zh) | 一种新型果糖苷酶及其编码基因和应用 | |
CN103103206B (zh) | 一种α-淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用 | |
CN104745612A (zh) | 一种高温木聚糖酶和一种高温木糖苷酶的基因及其蛋白表达和应用 | |
Elsababty et al. | Purification, biochemical characterization, and molecular cloning of cellulase from Bacillus licheniform is strain Z9 isolated from soil | |
CN102816728A (zh) | β-1,4-内切木聚糖酶工程菌的构建及其酶的应用 | |
CN101402964B (zh) | 一种耐碱、高活性的碱性木聚糖酶及其编码基因 | |
CN111117986B (zh) | 一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用 | |
CN105112433A (zh) | 一种新的i型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用 | |
CN103184203A (zh) | 木聚糖酶AnxB及其编码基因 | |
CN105154417B (zh) | 一种真菌来源的酸性纤维素酶及其基因和应用 | |
CN101736023A (zh) | 纤维素水解酶β-1,4葡聚糖内切酶基因 | |
CN103184204A (zh) | 木聚糖酶SoxB及其编码基因 | |
CN111575261A (zh) | 一种耐热耐酸木葡聚糖酶基因及其表达蛋白与应用 | |
CN105886520B (zh) | 一种木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_2及其应用 | |
Ding et al. | Molecular cloning and transcriptional expression analysis of an intracellular β-glucosidase, a family 3 glycosyl hydrolase, from the edible straw mushroom, Volvariella volvacea | |
CN106148369A (zh) | 高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863及其编码基因和应用 | |
CN108410903A (zh) | 一种耐低pH值的内切木聚糖酶及其编码基因和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130703 |