CN115975829A - 一株高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母突变菌及其应用 - Google Patents
一株高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母突变菌及其应用 Download PDFInfo
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本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母突变菌及其应用。所述突变菌为毕赤酵母ALG2A‑88（Pichia pastoris ALG2A‑88），已于2022年7月15日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221122。该突变菌可广泛用于海藻酸裂解酶的生产，能大大降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母突变菌及其应用。
背景技术
海藻酸裂解酶主要是通过β-消除反应切断海藻酸分子中的糖苷键，产生非还原性端具有不饱和双键的糖的酶。通常作为制备海藻酸寡糖的工具酶，广泛应用于医疗、食品和生物质能源等领域的研究。海藻酸裂解酶主要来自微生物和一些海洋动植物，由于其来源较多，因此对于海藻酸分子具有不同的底物特异性，据此海藻酸裂解酶按其降解海藻酸片段的不同可分为两大类：1,4-β-D-甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)和1,4-α-L-古罗糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11)，它们分别作用于海藻酸的甘露糖醛酸段和古罗糖醛酸段，生成寡聚糖醛酸，并在非还原末端产生C4，C5不饱和双键，不论是D-甘露糖醛酸或L-古罗糖醛酸为单体的海藻酸盐都生成不饱和衍生物。
海洋藻类的资源开发利用，特别是对褐藻类植物作为巨大的营养来源及寡糖源进行开发利用，具有明显的经济效益，现已受到广泛关注。利用酶法处理海藻，取代传统的方法，为人类提供具有更多有益生物活性物质，将成为今后的一个研究热点。随着对海藻寡糖结构与功能的进一步深入研究，海藻酸裂解酶已被广泛应用于食品、饲料、医药等工业以及科研工作中。海藻酸裂解酶能高效催化以海藻为原料的动物饲料中海藻多糖的降解，提高饲料利用率，并能生成有益寡糖，促进肠道益生环境的形成，抑制有害菌生长，起到替代多种抗生素的作用；同时，海藻酸裂解酶可用作药物酶治疗由铜绿假单胞菌感染造成的肺囊性纤维化症，在治疗中该酶可降低菌体产生的聚甘露糖醛酸的粘度，减弱细菌在病人体内的附着能力，提高治疗效果；在海藻遗传工程研究中，由于海藻细胞壁中富含高黏度海藻多糖，使DNA提取非常困难，添加海藻酸裂解酶以后，海藻多糖黏度下降，细胞壁降解，方便了DNA的提取。总之，随着海藻酸裂解酶的不断深入研究，将为该酶的应用提供有利的理论依据和更加广阔的前景。
随着基因工程的发展，利用基因工程技术构建高效表达海藻酸裂解酶的高产稳产菌株，解决其在天然生物体中含量低、生产成本昂贵的问题将为人们提供一种高效生产的新途径。大量研究发现大型海藻饲料富含生物活性物质，可促进养殖业和健康发展，为人民提供营养丰富的健康食品，因此利用海藻酸裂解酶生产加工大型海藻饲料具有广阔的发展前景。然而，目前海藻酸裂解酶的生产大多是依靠富集海藻酸分解菌产酶菌株，但原始菌株产酶量有限、提取和纯化步骤繁琐、成本高，因此在构建筛选高产稳产高酶活菌株方面的研究具有重要意义。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母突变菌及其应用。申请人通过紫外诱变的方法筛选获得海藻酸裂解酶产量显著提高的突变菌，可广泛应用于该酶的生产。
本发明一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有表达海藻酸裂解酶基因的重组质粒。
所述海藻酸裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQID NO：2。
本发明另一方面涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。
所述突变菌株为毕赤酵母ALG2A-88(Pichia pastoris ALG2A-88)，已于2022年7月15日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221122。
本发明还涉及上述毕赤酵母突变菌在海藻酸裂解酶生产中的应用。
本发明提供的毕赤酵母突变菌能显著提高海藻酸裂解酶的产量，摇瓶发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活高达3650U/ml，比出发菌提高了69.8％，取得了意料不到的技术效果。该突变菌株可广泛应用于海藻酸裂解酶的生产，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的推广与应用。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、pPICZA、Amp、G418、Zeocin购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：DNA聚合酶购买自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
培养基配方：
1.大肠杆菌培养基(LB培养基)：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，先加800mL蒸馏水，待各试剂完全溶解，再用容量瓶定容至1L，调节p H至7.0，121℃，20min灭菌；
2.LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；
3.酵母培养基(YPD培养基)：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，先加800m L蒸馏水，待各试剂完全溶解，再用容量瓶定容至1L，115℃，20min灭菌；
4.YPD+Zeocin培养基：YPD培养基加100μg/ml Zeocin；
5.酵母筛选培养基(MD培养基)：1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油、2％琼脂糖；
6.BMGY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油；
7.BMMY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇。
实施例1、海藻酸裂解酶基因的克隆
将来源于黄杆菌(Flavobacterium sp.)的海藻酸裂解酶基因(AEB69783.1)命名为ALG2A。以该酶的氨基酸序列为基础，去除其自身信号肽，并且根据毕赤酵母的密码子偏好性，对其进行密码子优化，由华大基因公司进行全基因合成。海藻酸裂解酶ALG2A基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
根据优化后的海藻酸裂解酶ALG2A基因序列设计PCR扩增计引物引物1(F)和引物1(R)，其中上、下游引物中分别引入EcoR I和Not I酶切位点，如下划线所示，引物序列如下，并采用PCR反应克隆目的片段。ALG2A基因全长为801bp。
引物1(F)：GCGCGAATTCCAAGATAAAAAATCTAAATCTAAAA；
引物1(R)：TAAAGCGGCCGCTTAATGAGTAACTTGCAAAGAATAA。
根据引物合成单的说明加入适量的无菌水溶解引物，浓度为100μM，-20℃保存。待用时，取出适量的-20℃保存的100μM的引物，加入无菌水稀释至10μM(即工作浓度)混匀后即可使用。
PCR条件为：
实施例2、表达重组海藻酸裂解酶基因的毕赤酵母工程菌的构建
1、重组质粒的构建
将克隆得到的海藻酸裂解酶ALG2A基因的PCR产物，用限制性内切酶EcoR I和NotI进行双酶切，酶切体系如下：
| 成分 | 酶切体系(100μl) |
| ALG2A PCR产物 | 40μl |
| 10×H buffer | 10μl |
| 10×BSA | 10μl |
| EcoR I | 5μl |
| Not I | 5μl |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 30μl |
37℃酶切4h后，琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段。将表达载体pPIC9K先用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，酶切体系如下：
| 成分 | 酶切体系(100μl) |
| pPIC9K | 20μl |
| 10×H buffer | 10μl |
| EcoR I | 5μl |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 65μl |
37℃酶切4h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶Not I进行单酶切，酶切体系如下：
37℃酶切4h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
将经过EcoR I和Not I双酶切的ALG2A片段与表达载体pPIC9K连接，构建表达载体pPIC9K-ALG2A。连接体系如下：
| 成分 | 酶切体系(100μl) |
| 表达载体pPIC9K双酶切产物 | 5μl |
| ALG2A基因双酶切产物 | 3μl |
| <![CDATA[10×T<sub>4</sub> ligase buffer]]> | 1μl |
| <![CDATA[T<sub>4</sub> ligase]]> | 1μl |
22℃过夜连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，把转化后的大肠杆菌DH5α涂于加有氨苄青霉素的平板上，37℃过夜培养，筛选氨苄青霉素抗性重组子菌落，并进行测序验证。测序验证正确的转化子转接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pPIC9K-ALG2A。
2、转化与筛选
将重组酵母表达质粒pPIC9K-ALG2A用限制性内切酶Sal I进行线性化处理，37℃酶切4h后，利用纯化试剂盒对其进行纯化。利用电穿孔法将其转化到毕赤酵母GS115，涂布MD平板，30℃培养直至转化子出现。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素G418的YPD平板上进行多拷贝转化子的筛选。
3、摇瓶发酵验证
挑取单个多拷贝转化子分别接入到装有30ul BMGY液体培养基的摇瓶中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入装有30ul BMMY液体培养基中，继续30℃、220rpm振荡培养，每24小时补加甲醇至终浓度0.5％，进行诱导表达。诱导表达4天后，离心去除菌体，收集上清液进行海藻酸裂解酶酶活力测定。
酶活测定结果显示，在摇瓶水平下，上述构建得到的毕赤酵母工程菌发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活最高达到2150U/ml。将酶活水平最高的转化子命名为毕赤酵母ALG2A(Pichia pastoris ALG2A)。
海藻酸裂解酶检测方法
(1)海藻酸裂解酶酶活单位的定义
在40℃、pH7.5的条件下，每分钟降解底物海藻酸钠产生不饱和糖醛酸，在235nm下具有吸光值，吸光值每增加0.1，为一个酶活单位U。
(2)试剂
磷酸缓冲液(0.05M，pH7.5)
1)配制0.05M磷酸二氢钠溶液
称取3.9g二水合磷酸二氢钠，去离子水溶解后，定容至500ml。
2)配制0.05M磷酸氢二钠溶液
称取17.91g十二水合磷酸氢二钠，去离子水溶解后，定容至1000ml。
3)混合配制0.05M磷酸缓冲液
将2)中的磷酸氢二钠溶液放置于2L烧杯中，用0.05M磷酸二氢钠溶液调节其pH至7.5。
底物：0.3％海藻酸钠溶液
取100ml小烧杯，加入约80ml磷酸缓冲液；称取0.3g海藻酸钠，磁力搅拌条件下均匀加入到小烧杯中，搅拌至溶解；用磷酸缓冲液定容至100ml，此溶液需现配现用。
终止液：0.06mol/L的磷酸终止液。根据不同的磷酸浓度进行计算。
(3)海藻酸裂解酶酶活测定步骤
取三支15mm*150mm试管，加入1.8ml底物，40℃水浴预热5min，加入准备好的酶液0.2ml，准确计时，涡旋振荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2ml磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。
空白：取15mm*150mm试管，加入1.8ml底物，40℃水浴预热5min，加入0.2ml缓冲液，准确计时，涡旋振荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2ml磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。
比色：每个样品的空白和酶反应终止后，立即在235nm比色，并记录吸光值A0和A样。
计算：X＝(A0-A样)*2*N/(t*0.1)。
X——酶活力，U/ml或U/g；
2——加入2ml磷酸终止液的体积系数；
t(min)——酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)；
0.1——体系系数，即将吸光值增长单位换算为0.1；
N——稀释倍速。
经简化：酶活力(U/ml)＝吸光值差值*2*N。
实施例3、海藻酸裂解酶高产菌株的诱变筛选
诱变是最早在抗生素上应用的一种育种技术，它通过物理、化学、生物因素作用于抗生菌，人为的使其遗传物质发生变异，从中选育高产菌株。紫外诱变属于一种物理诱变，他是在微生物发酵技术育种中最早使用的一种诱变方法。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外诱变可以用于大量不同的菌种育种中，通过紫外线对微生物进行诱变，得到了大量比较优秀的工业菌株。由于紫外诱变育种简便易行、对条件和设备要求较低并能较好的提高代谢产物的产量，故在微生物育种中仍广泛应用。
申请人以毕赤酵母ALG2A为出发菌株，通过紫外诱变方法进行遗传学改造，进一步提高海藻酸裂解酶的产量。
将出发菌株接种于YPD平板，30℃培养2-3天，使用无菌水将平板上的菌体进行冲洗，制成悬浮液，稀释至1×106个/mL，紫外灯(40W)照射2-10min，距离约22cm，致死率达到90％以上，涂布平板，30℃培养48h。
第一轮紫外诱变共得到了约180个突变菌单菌落，将各个单菌落分别接种于装有200ul BMGY液体培养基的96孔板，30℃、250rpm振荡培养1天后，离心去掉上层培养基，再加入200ul BMMY培养基，30℃、250rpm振荡培养2天，每天添加0.5％的甲醇。诱导表达2天后，离心去除菌体，得到含海藻酸裂解酶的上清液，测定海藻酸裂解酶的活力，以出发菌毕赤酵母ALG2A为对照，筛选出酶活力得到显著提高的突变菌株。
结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的突变菌中，没有发现任何突变菌发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活高于原始菌株。申请人又按照上述方法继续进行了11轮诱变筛选，最终获得1株海藻酸裂解酶产量显著高于出发菌的突变菌株，并将其命名为毕赤酵母ALG2A-88(Pichia pastoris ALG2A-88)。
所述突变菌株毕赤酵母ALG2A-88在摇瓶发酵条件下其发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活力高达3650U/ml，比出发菌提高了69.8％，取得了意料不到的技术效果。
申请人已于2022年7月15日将毕赤酵母ALG2A-88(Pichia pastoris ALG2A-88)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221122。
本发明提供的毕赤酵母突变菌可用于海藻酸裂解酶的生产，有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域的广泛应用。
Claims (5)
1.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有表达海藻酸裂解酶基因的重组质粒。
2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述海藻酸裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
3.一种毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述的突变菌是以权利要求2所述的毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。
4.如权利要求3所述的毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述突变菌的保藏编号为CCTCCNO：M 20221122。
5.权利要求4所述的毕赤酵母突变菌在海藻酸裂解酶生产中的应用。
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