CN110157700B - 一种外切型寡褐藻胶裂解酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在金属离子和去污剂中保持稳定的外切型寡褐藻胶裂解酶OalV17及其应用。所述寡褐藻胶裂解酶OalV17的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的褐藻胶裂解酶最适反应温度为40℃；最适反应pH为7.2；具有金属离子和去污剂耐受性，在多种金属离子和去污剂中保持稳定；作用方式为外切，降解主产物为褐藻胶单糖。本发明所述的寡褐藻胶裂解酶OalV17具有工业化应用潜质。

Description

一种外切型寡褐藻胶裂解酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有具有金属离子和去污剂稳定特性的外切型寡褐藻胶裂解酶OalV17及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

褐藻胶是多种褐藻的细胞壁主要成分，可占到褐藻干重的20-40%。我国是海藻养殖大国，褐藻胶产量世界第一。褐藻胶由互为差向异构体的α-L-甘露糖醛酸（Mannuronicacid，M）和β-D-古罗糖醛酸（Guluronic acid，G）通过1,4糖苷键连接而成的线性多糖。褐藻胶广泛应用在化工、医药、食品等行业。近年来，褐藻胶作为一种新型替代能源，越来越受到关注。褐藻胶的降解分为以下几个步骤：1，内切型的褐藻胶裂解酶将大分子褐藻胶降解为褐藻胶寡糖（多为2-4糖）；2，外切型的寡褐藻胶裂解酶将大分子褐藻胶和褐藻胶寡糖进一步降解为褐藻胶单糖；3，褐藻胶单糖在非酶促的作用下开环，转化为4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid (DEH)，然后进一步进入ED途径，产生生物乙醇。

利用褐藻胶生产生物乙醇的过程中，将褐藻胶降解为单糖尤为重要。但是，目前研究的褐藻胶裂解酶大多数为内切的褐藻胶裂解酶，降解产物为褐藻胶寡糖。只有少数外切型的寡褐藻胶裂解酶能够将大分子褐藻胶和褐藻胶寡糖进一步降解为单糖。已经报道少数几个寡褐藻胶裂解酶活性较低，尤其是在褐藻加工过程中，在去污剂和金属离子存在的情况下不稳定，无法达到工业化应用的要求。因此，寻找具有特殊性质的寡褐藻胶裂解酶具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种新型寡褐藻胶裂解酶OalV17及其应用。该酶的最适反应温度为40℃，最适反应pH为7.2；本发明所述寡褐藻胶裂解酶OalV17具有金属离子和有机溶剂耐受性，在多种金属离子和有机溶剂中保持稳定。降解方式为外切，降解主产物为褐藻胶单糖，具有良好的工业化应用潜质。

一方面，本发明提供一种新型寡褐藻胶裂解酶OalV17，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

MIEPILLTEKEIADLYKEVGKPSLMGKSIEANRKGLEAFMRLPLDVPGHGEAGGYEHNRHKQNYTYMNLAGRLFLITQEDKYAQFVKDLLAIYAEKYLTFDFHVQKNTNPTGRLFHQILNEHCWLMFTSLAYSCVASVMTKEERTAVVERIFEPMLDMFTVKYAHDFDRIHNHGIWAVAAVGICGLAIGKPEYLEMSVYGQDRDDTGGFLAQISQLFAPSGYYMEGPYYHRYAIRPTCVFAEVVHRHMPEVDIYNYKDKVIGNTVQAMLATAYPNGEFPALNDASRTMSITDMGVQVAVSVYSKHYGMDDNILGMAKIQNAVWMHPCGLELSQAYDKAIADREIGMPFWPSVELNEGPTGNNGAQGFIRMQDKTGDVSQLVMNYGQHGMGHGNFDTLGITFFNRGQEVLREYGFCRWVNVEPKFGGRYLDENKSYARQTIAHNAVTIDEQCQNGFRCRPRDSVHGLPHFFKVEGTEINGMSAFANDHYPNTDMQRSVFMLNLDELEAPLLLDLYRIEGEGEHQYDYSHQYDGQIVRTNFDYQSFGELSTLGDDFGYQHLWKVASGKVQDTALVSWLQNNTYYTWLGTSSSAKQNGDNEVIFTRTGANDPSFNLRSEPAFILRSKGESTLFASVLETHGYFNEEFEQSVNARGQVKDIRVVGYNAVGSIVEITTEKSLVTVMISNVLGADDQTYHQVELNGKTYSWNGFYSLEVNAFGQEK

另一方面，本发明提供一种新型寡褐藻胶裂解酶OalV17对应的核酸序列，如SEQID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGATCGAACCTATTCTATTGACCGAAAAAGAAATTGCCGATTTGTACAAGGAAGTCGGAAAGCCGAGCTTAATGGGCAAATCCATTGAAGCGAATCGCAAGGGACTTGAAGCCTTCATGCGTCTGCCTCTAGACGTGCCAGGTCACGGCGAAGCGGGTGGCTACGAGCACAACCGCCACAAACAAAACTATACCTACATGAACTTAGCGGGTCGTTTGTTCTTGATCACTCAAGAAGACAAGTACGCGCAGTTCGTTAAAGATCTTCTCGCTATTTACGCAGAGAAGTACCTAACTTTTGATTTCCACGTACAGAAAAACACTAACCCAACAGGTCGTCTTTTCCACCAGATCCTTAATGAACATTGTTGGTTAATGTTTACTAGCCTTGCTTACTCTTGCGTGGCATCAGTGATGACAAAAGAAGAGCGCACAGCCGTTGTTGAGCGCATTTTCGAACCAATGCTAGACATGTTCACAGTGAAATACGCGCACGATTTCGACCGTATTCACAACCACGGTATCTGGGCAGTTGCGGCTGTTGGTATTTGTGGTCTAGCTATTGGCAAACCTGAATATCTAGAGATGTCGGTATACGGTCAAGATCGCGATGATACCGGCGGCTTTCTAGCGCAAATCTCACAATTGTTTGCCCCTTCTGGATACTACATGGAAGGTCCGTACTACCATCGTTATGCAATTCGTCCAACTTGTGTATTTGCAGAAGTAGTGCACCGTCACATGCCTGAAGTAGACATTTACAACTACAAAGACAAAGTGATTGGCAACACAGTACAAGCAATGCTGGCAACGGCTTACCCGAATGGTGAGTTTCCTGCCCTAAACGACGCATCTCGTACCATGAGCATTACCGACATGGGCGTTCAAGTGGCAGTTAGCGTTTACAGCAAACACTACGGTATGGATGACAACATCCTTGGCATGGCGAAGATTCAAAACGCCGTTTGGATGCACCCATGCGGTCTAGAACTTTCTCAAGCCTACGATAAAGCCATTGCTGACCGAGAAATCGGCATGCCTTTCTGGCCAAGTGTGGAACTTAACGAAGGTCCAACTGGTAACAATGGAGCACAAGGCTTTATCCGTATGCAGGATAAAACCGGTGATGTGTCACAGCTTGTGATGAACTACGGTCAACACGGCATGGGACATGGTAACTTCGATACGCTTGGCATTACCTTCTTCAACCGTGGTCAAGAAGTGCTGCGTGAATACGGCTTCTGTCGCTGGGTAAACGTAGAGCCTAAATTCGGCGGTCGTTACCTAGACGAAAACAAATCGTACGCACGTCAAACTATCGCGCATAACGCGGTAACGATTGATGAGCAATGTCAGAATGGTTTTCGATGTAGACCGCGCGATTCAGTGCACGGTTTGCCTCACTTCTTCAAAGTAGAAGGCACTGAAATCAACGGTATGAGCGCGTTTGCTAACGACCATTACCCGAATACAGACATGCAGCGCAGTGTGTTCATGCTTAACCTCGATGAGCTTGAAGCACCGCTACTGCTAGACCTTTACCGCATCGAAGGTGAAGGCGAGCATCAGTACGACTACTCTCATCAATACGATGGTCAAATCGTACGTACTAACTTTGATTACCAAAGCTTTGGTGAACTGAGCACGCTTGGCGATGACTTCGGTTACCAGCACCTTTGGAAAGTAGCAAGCGGCAAAGTGCAAGATACGGCGTTGGTTAGCTGGCTACAAAACAACACCTACTACACTTGGTTAGGCACAAGCAGCAGCGCGAAACAGAACGGCGATAATGAAGTGATCTTCACTCGCACTGGCGCCAATGACCCAAGCTTTAACCTACGTAGTGAACCGGCATTCATTCTACGCAGCAAGGGCGAATCGACACTATTTGCTTCTGTGCTAGAAACACACGGCTACTTCAACGAAGAGTTTGAGCAATCGGTGAATGCACGTGGCCAGGTGAAAGATATCCGCGTCGTGGGTTACAACGCCGTTGGCAGCATCGTAGAAATCACGACTGAAAAATCACTGGTTACTGTGATGATCAGCAATGTGCTAGGCGCTGACGACCAAACCTACCACCAAGTAGAATTGAACGGTAAAACCTACAGCTGGAATGGCTTCTACTCTCTAGAAGTGAACGCATTCGGGCAGGAGAAA

另一方面，本发明还提供一种新型寡褐藻胶裂解酶OalV17的制备方法。

另一方面，本发明还提供了所述寡褐藻胶裂解酶OalV17在裂解褐藻胶中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述寡褐藻胶裂解酶OalV17在裂解褐藻胶寡糖的应用。

另一方面，本发明还提供了所述寡褐藻胶裂解酶OalV17在制备褐藻单糖中的应用。

另一方面，一种裂解褐藻胶的方法，所选用的寡褐藻胶裂解酶为OalV17。

优选：所述裂解条件中反应温度为0~70℃。最适反应温度为40℃。

优选：所述裂解条件中反应pH为3.6~9.6。最适反应pH为7.2。

有益效果：

1.本发明的寡褐藻胶裂解酶OalV17为根据氨基酸序列在大肠杆菌中优化的人工合成序列，归属于多糖裂解酶第17家族（PL-17）。

2.本发明提供了一种制备该新型寡褐藻胶裂解酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将OalV17的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，发酵液酶活力高达490.5 U/mL，具有工业化生产的潜质。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达71.6%，蛋白质纯度高达95%。

3.本发明的寡褐藻胶裂解酶OalV17具有优良的理化性质，该酶最适反应pH为7.2，最适反应温度为40 ℃。本发明所述寡褐藻胶裂解酶OalV17具有金属离子和有机溶剂耐受性，在多种金属离子和有机溶剂中保持稳定。利用该重组酶进行了降解产物分析，该酶降解主产物为褐藻胶单糖。本发明所述的寡褐藻胶裂解酶OalV17具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明寡褐藻胶裂解酶OalV17蛋白质分离纯化图（M，蛋白质标准品；1，纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17）；

图2为本发明寡褐藻胶裂解酶OalV17的温度和pH适应性分析（A，寡褐藻胶裂解酶OalV17的最适反应温度；B，寡褐藻胶裂解酶OalV17的最适反应pH；C，寡褐藻胶裂解酶OalV17的温度稳定性；D，寡褐藻胶裂解酶OalV17的pH稳定性）；

图3为寡褐藻胶裂解酶OalV17的降解方式及降解产物。A为薄层层析（TLC）检测寡褐藻胶裂解酶OalV17的降解方式及降解产物；B为高效液相法（HPLC）检测寡褐藻胶裂解酶OalV17的降解产物；C为阴离子一级质谱（ESI-MS）法检测寡褐藻胶裂解酶OalV17的降解产物（DEH，不饱和褐藻胶单糖的转化产物；DP1，褐藻胶单糖；DP2，褐藻胶二糖；DP3，褐藻胶三糖）。

具体实施方式

实施例1 寡褐藻胶裂解酶OalV17序列分析

本发明所述寡褐藻胶裂解酶OalV17的产酶基因oalV17为人工合成序列。前期研究中，我们发现海洋细菌Vibrio sp. SY01具有良好的降解褐藻胶的能力，对其进行全基因测序时，发现其含有一个预测的寡褐藻胶裂解酶序列。在氨基酸序列不变的情况下，我们将该基因序列根据宿主（大肠杆菌的）的密码子偏好性，进行了碱基序列优化，利于其在大肠杆菌中进行高效表达。序列合成在华大基因公司进行。本发明所述寡褐藻胶裂解酶OalV17包含有2,160个碱基序列，编码720个氨基酸序列。利用National Center for BiotechnologyInformation (NCBI)中的保守结构域分析Conserved domain (CDD)和多重序列比对BasicLocal Alignment Search Tool (Blast)发现，该序列包含有一个多糖裂解酶第17家族（PL-17）的保守区。本发明的寡褐藻胶裂解酶OalV17与《Genbank》数据库中来源于Vibriosp. QY104的预测蛋白OalA（Genbank: AHC69712.1）只有三个氨基酸的不同（第1位M缺失，第16位的Y与R，293位的Y与P），OalA序列目前仅停留在预测阶段，在本发明之前尚未有实验证据证明其具有寡褐藻胶裂解酶功能。本发明针对预测蛋白OalA同样进行了重组表达、分离纯化和不同金属离子对其影响的性质研究，发现预测蛋白OalA不具有本发明所述寡褐藻胶裂解酶OalV17在多种金属离子和有机溶剂中保持稳定的特性。因此，这三处氨基酸的差异是造成本发明所述的寡褐藻胶裂解酶OalV17具备有益性质的关键因素。此外，目前尚未有文献报道其他寡褐藻胶裂解酶具有在多种金属离子和有机溶剂中保持稳定的特性有益性质。

实施例2 寡褐藻胶裂解酶OalV17的重组表达

将实施例1中全合成的oalV17基因序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下（下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基）：

正向引物：PoalV17F：

5’- CATGCCATGGATGATCGAACCTATTCTATT -3’ (Nco I)

反向引物：PoalV17R：

5’- CCGCTCGAGTTTCTCCTGCCCGAATGCGT -3’ (Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共 30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟。PCR反应所用DNA聚合酶为PrimerstarHS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET22b (+)质粒DNA（美国Invitrogen公司），同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系（温度、时间、DNA用量等）均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶（大连宝生物公司）说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株（美国Invitrogen公司），涂布在Luria-Bertani（LB）培养基固体平板上（含有50 μg/mL氨苄青霉素的），37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中（含有50 μg/mL氨苄青霉素），转速为180 rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-OalV17。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)（购自大连宝生物公司），将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-OalV17，保存在-80℃备用。

实施例3 寡褐藻胶裂解酶OalV17的发酵及纯化制备方法

将实施例2中构建的大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-OalV17转接至LB液体培养基中（50 μg/mL氨苄青霉素），在37℃摇床中180 rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.6。加入终浓度为0.1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在20℃诱导20 h。褐藻胶裂解酶活性测定方法为：100 μl酶液加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（20 mM 磷酸盐缓冲液，pH=7.2），在40℃下反应10 min，用分光光度计测定A235数值。酶活力定义为1 ml酶液引起A235数值增加0.1为一个酶活力单位。发酵液酶活力可达490.5 U/mL。

发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液，上样于100 mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5 ml/min，利用10 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150 mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到71.6%。纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），如图1所示，纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17的分子量为82 kDa，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17的蛋白纯度达到95%以上。

实施例4 温度和pH对寡褐藻胶裂解酶OalV17的影响

将实施例3中纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17100 μl加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（20 mM 磷酸盐缓冲液，pH=7.6），在不同温度（0-70℃）下反应10 min，用分光光度计测定A235数值，以最高酶活力为100%，计算不同温度下寡褐藻胶裂解酶OalV17的相对酶活力。如图2A所示，寡褐藻胶裂解酶OalV17的最适反应温度为40℃。

将实施例3中纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17取100 μl加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（20 mM 磷酸盐缓冲液，pH=7.2），在4种不同缓冲液中反应10 min，用分光光度计测定A235数值，以最高酶活力为100%，计算不同pH条件下寡褐藻胶裂解酶OalV17的相对酶活力。如图2B所示，寡褐藻胶裂解酶OalV17的最适反应pH为7.2。

将实施例3中纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17在不同温度（0-70 ℃）下孵育1 h，取出后，立即在其最适反应温度（40℃）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图2C所示，寡褐藻胶裂解酶OalV17在0-30 ℃下保持稳定。

将实施例3中纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17在不同pH条件下孵育12 h，取出后，立即在其最适反应pH（7.2）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图2D所示，寡褐藻胶裂解酶OalV17在pH 4-8的范围内均可保持80%以上的酶活力。

实施例5不同金属离子和去污剂对寡褐藻胶裂解酶OalV17的影响

将实施例3中纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17放置于不同浓度（10 mM, 20 mM，40mM）的常见金属离子（Fe³⁺, Zn²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺）中孵育24h，然后如实施例3所述褐藻胶裂解酶酶活力检测方法，检测其残留酶活力，以未孵育的寡褐藻胶裂解酶OalV17的测得活性为100%。如表1所述，在不同浓度的二价金属离子（Zn²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺）中孵育24h后，寡褐藻胶裂解酶OalV17均能保持90%以上的酶活力，在三价金属离子（Fe³⁺）中孵育24h后，寡褐藻胶裂解酶OalV17也能保持70%的酶活力，说明寡褐藻胶裂解酶OalV17具有很好的金属离子耐受性。

表1 不同金属离子和去污剂对寡褐藻胶裂解酶OalV17酶活力的影响

将实施例3中纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17放置于不同浓度（1 mM, 5 mM，10mM）的常见去污剂（SDS，Tween 20，Tween 80，TritonX-100）中孵育24h，然后如实施例3所述褐藻胶裂解酶酶活力检测方法，检测其残留酶活力，以未孵育的寡褐藻胶裂解酶OalV17的测得活性为100%。如表1所述，在不同浓度的去污剂（SDS, Tween 20, Tween 80 andTritonX-100）中孵育24h后，寡褐藻胶裂解酶OalV17均能保持75%以上的酶活力，说明寡褐藻胶裂解酶OalV17具有很好的去污剂耐受性。

实施例6 寡褐藻胶裂解酶OalV17的降解方式及产物鉴定

将实施例3中纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17（0.5 mg）与3 mg/mL的褐藻胶底物共孵育不同时间（0, 1, 5, 30 min），降解产物12,000 g离心10分钟，弃沉淀，将上清上样于高效薄层层析板（HPTLC）检测。具体为：TLC把预先在100℃烘箱中活化2 h的HPTLC层析板裁剪成7 cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂（正丁醇:冰乙酸:水=2:2:1）的展缸中20 min，吹干层析板，浸入显色剂（苯胺二苯胺）中2s，取出吹干，高温烘烤，至样品出现。如图3A所示，与标准品迁徙率比较发现，寡褐藻胶裂解酶OalV17的酶解主产物为褐藻胶单糖（DP1及其开环转化产物DEH），在降解过程中未发现中间片段糖的出现，说明降解方式为外切。将降解30 min的样品20 μl上样于预平衡（0.2 M的碳酸氢铵）的凝胶过滤柱（Superdex peptide 10/300）。流速为0.6 ml/min，流动相为0.2 M的碳酸氢铵，检测时间为40分钟，检测器为紫外检测器。如图3B所示，降解产物为不饱和褐藻胶单糖。将降解30 min的样品利用乙醇沉淀去除未降解的大糖，进行ESI-阴离子一级质谱检测，确定酶解产物的分子量。阴离子模式一级质谱结果表明（图3C），纯化所得寡褐藻胶裂解酶OalV17降解褐藻胶之后的寡糖主产物为不饱和单糖。

序列表

<110> 山东昊岳医药科技有限公司

<120> 一种外切型寡褐藻胶裂解酶及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ile Glu Pro Ile Leu Leu Thr Glu Lys Glu Ile Ala Asp Leu Tyr

1 5 10 15

Lys Glu Val Gly Lys Pro Ser Leu Met Gly Lys Ser Ile Glu Ala Asn

20 25 30

Arg Lys Gly Leu Glu Ala Phe Met Arg Leu Pro Leu Asp Val Pro Gly

35 40 45

His Gly Glu Ala Gly Gly Tyr Glu His Asn Arg His Lys Gln Asn Tyr

50 55 60

Thr Tyr Met Asn Leu Ala Gly Arg Leu Phe Leu Ile Thr Gln Glu Asp

65 70 75 80

Lys Tyr Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Ala Ile Tyr Ala Glu Lys

85 90 95

Tyr Leu Thr Phe Asp Phe His Val Gln Lys Asn Thr Asn Pro Thr Gly

100 105 110

Arg Leu Phe His Gln Ile Leu Asn Glu His Cys Trp Leu Met Phe Thr

115 120 125

Ser Leu Ala Tyr Ser Cys Val Ala Ser Val Met Thr Lys Glu Glu Arg

130 135 140

Thr Ala Val Val Glu Arg Ile Phe Glu Pro Met Leu Asp Met Phe Thr

145 150 155 160

Val Lys Tyr Ala His Asp Phe Asp Arg Ile His Asn His Gly Ile Trp

165 170 175

Ala Val Ala Ala Val Gly Ile Cys Gly Leu Ala Ile Gly Lys Pro Glu

180 185 190

Tyr Leu Glu Met Ser Val Tyr Gly Gln Asp Arg Asp Asp Thr Gly Gly

195 200 205

Phe Leu Ala Gln Ile Ser Gln Leu Phe Ala Pro Ser Gly Tyr Tyr Met

210 215 220

Glu Gly Pro Tyr Tyr His Arg Tyr Ala Ile Arg Pro Thr Cys Val Phe

225 230 235 240

Ala Glu Val Val His Arg His Met Pro Glu Val Asp Ile Tyr Asn Tyr

245 250 255

Lys Asp Lys Val Ile Gly Asn Thr Val Gln Ala Met Leu Ala Thr Ala

260 265 270

Tyr Pro Asn Gly Glu Phe Pro Ala Leu Asn Asp Ala Ser Arg Thr Met

275 280 285

Ser Ile Thr Asp Met Gly Val Gln Val Ala Val Ser Val Tyr Ser Lys

290 295 300

His Tyr Gly Met Asp Asp Asn Ile Leu Gly Met Ala Lys Ile Gln Asn

305 310 315 320

Ala Val Trp Met His Pro Cys Gly Leu Glu Leu Ser Gln Ala Tyr Asp

325 330 335

Lys Ala Ile Ala Asp Arg Glu Ile Gly Met Pro Phe Trp Pro Ser Val

340 345 350

Glu Leu Asn Glu Gly Pro Thr Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly Phe Ile

355 360 365

Arg Met Gln Asp Lys Thr Gly Asp Val Ser Gln Leu Val Met Asn Tyr

370 375 380

Gly Gln His Gly Met Gly His Gly Asn Phe Asp Thr Leu Gly Ile Thr

385 390 395 400

Phe Phe Asn Arg Gly Gln Glu Val Leu Arg Glu Tyr Gly Phe Cys Arg

405 410 415

Trp Val Asn Val Glu Pro Lys Phe Gly Gly Arg Tyr Leu Asp Glu Asn

420 425 430

Lys Ser Tyr Ala Arg Gln Thr Ile Ala His Asn Ala Val Thr Ile Asp

435 440 445

Glu Gln Cys Gln Asn Gly Phe Arg Cys Arg Pro Arg Asp Ser Val His

450 455 460

Gly Leu Pro His Phe Phe Lys Val Glu Gly Thr Glu Ile Asn Gly Met

465 470 475 480

Ser Ala Phe Ala Asn Asp His Tyr Pro Asn Thr Asp Met Gln Arg Ser

485 490 495

Val Phe Met Leu Asn Leu Asp Glu Leu Glu Ala Pro Leu Leu Leu Asp

500 505 510

Leu Tyr Arg Ile Glu Gly Glu Gly Glu His Gln Tyr Asp Tyr Ser His

515 520 525

Gln Tyr Asp Gly Gln Ile Val Arg Thr Asn Phe Asp Tyr Gln Ser Phe

530 535 540

Gly Glu Leu Ser Thr Leu Gly Asp Asp Phe Gly Tyr Gln His Leu Trp

545 550 555 560

Lys Val Ala Ser Gly Lys Val Gln Asp Thr Ala Leu Val Ser Trp Leu

565 570 575

Gln Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Trp Leu Gly Thr Ser Ser Ser Ala Lys

580 585 590

Gln Asn Gly Asp Asn Glu Val Ile Phe Thr Arg Thr Gly Ala Asn Asp

595 600 605

Pro Ser Phe Asn Leu Arg Ser Glu Pro Ala Phe Ile Leu Arg Ser Lys

610 615 620

Gly Glu Ser Thr Leu Phe Ala Ser Val Leu Glu Thr His Gly Tyr Phe

625 630 635 640

Asn Glu Glu Phe Glu Gln Ser Val Asn Ala Arg Gly Gln Val Lys Asp

645 650 655

Ile Arg Val Val Gly Tyr Asn Ala Val Gly Ser Ile Val Glu Ile Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Ser Leu Val Thr Val Met Ile Ser Asn Val Leu Gly Ala

675 680 685

Asp Asp Gln Thr Tyr His Gln Val Glu Leu Asn Gly Lys Thr Tyr Ser

690 695 700

Trp Asn Gly Phe Tyr Ser Leu Glu Val Asn Ala Phe Gly Gln Glu Lys

705 710 715 720

<210> 3

<211> 2160

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgatcgaac ctattctatt gaccgaaaaa gaaattgccg atttgtacaa ggaagtcgga 60

aagccgagct taatgggcaa atccattgaa gcgaatcgca agggacttga agccttcatg 120

cgtctgcctc tagacgtgcc aggtcacggc gaagcgggtg gctacgagca caaccgccac 180

aaacaaaact atacctacat gaacttagcg ggtcgtttgt tcttgatcac tcaagaagac 240

aagtacgcgc agttcgttaa agatcttctc gctatttacg cagagaagta cctaactttt 300

gatttccacg tacagaaaaa cactaaccca acaggtcgtc ttttccacca gatccttaat 360

gaacattgtt ggttaatgtt tactagcctt gcttactctt gcgtggcatc agtgatgaca 420

aaagaagagc gcacagccgt tgttgagcgc attttcgaac caatgctaga catgttcaca 480

gtgaaatacg cgcacgattt cgaccgtatt cacaaccacg gtatctgggc agttgcggct 540

gttggtattt gtggtctagc tattggcaaa cctgaatatc tagagatgtc ggtatacggt 600

caagatcgcg atgataccgg cggctttcta gcgcaaatct cacaattgtt tgccccttct 660

ggatactaca tggaaggtcc gtactaccat cgttatgcaa ttcgtccaac ttgtgtattt 720

gcagaagtag tgcaccgtca catgcctgaa gtagacattt acaactacaa agacaaagtg 780

attggcaaca cagtacaagc aatgctggca acggcttacc cgaatggtga gtttcctgcc 840

ctaaacgacg catctcgtac catgagcatt accgacatgg gcgttcaagt ggcagttagc 900

gtttacagca aacactacgg tatggatgac aacatccttg gcatggcgaa gattcaaaac 960

gccgtttgga tgcacccatg cggtctagaa ctttctcaag cctacgataa agccattgct 1020

gaccgagaaa tcggcatgcc tttctggcca agtgtggaac ttaacgaagg tccaactggt 1080

aacaatggag cacaaggctt tatccgtatg caggataaaa ccggtgatgt gtcacagctt 1140

gtgatgaact acggtcaaca cggcatggga catggtaact tcgatacgct tggcattacc 1200

ttcttcaacc gtggtcaaga agtgctgcgt gaatacggct tctgtcgctg ggtaaacgta 1260

gagcctaaat tcggcggtcg ttacctagac gaaaacaaat cgtacgcacg tcaaactatc 1320

gcgcataacg cggtaacgat tgatgagcaa tgtcagaatg gttttcgatg tagaccgcgc 1380

gattcagtgc acggtttgcc tcacttcttc aaagtagaag gcactgaaat caacggtatg 1440

agcgcgtttg ctaacgacca ttacccgaat acagacatgc agcgcagtgt gttcatgctt 1500

aacctcgatg agcttgaagc accgctactg ctagaccttt accgcatcga aggtgaaggc 1560

gagcatcagt acgactactc tcatcaatac gatggtcaaa tcgtacgtac taactttgat 1620

taccaaagct ttggtgaact gagcacgctt ggcgatgact tcggttacca gcacctttgg 1680

aaagtagcaa gcggcaaagt gcaagatacg gcgttggtta gctggctaca aaacaacacc 1740

tactacactt ggttaggcac aagcagcagc gcgaaacaga acggcgataa tgaagtgatc 1800

ttcactcgca ctggcgccaa tgacccaagc tttaacctac gtagtgaacc ggcattcatt 1860

ctacgcagca agggcgaatc gacactattt gcttctgtgc tagaaacaca cggctacttc 1920

aacgaagagt ttgagcaatc ggtgaatgca cgtggccagg tgaaagatat ccgcgtcgtg 1980

ggttacaacg ccgttggcag catcgtagaa atcacgactg aaaaatcact ggttactgtg 2040

atgatcagca atgtgctagg cgctgacgac caaacctacc accaagtaga attgaacggt 2100

aaaacctaca gctggaatgg cttctactct ctagaagtga acgcattcgg gcaggagaaa 2160

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg atgatcgaac ctattctatt 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagt ttctcctgcc cgaatgcgt 29

Claims (6)

1.一种寡褐藻胶裂解酶OalV17，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的寡褐藻胶裂解酶OalV17所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的寡褐藻胶裂解酶在裂解大分子褐藻胶中的应用。

4.如权利要求1所述的寡褐藻胶裂解酶在裂解褐藻胶寡糖中的应用。

5.如权利要求1所述的寡褐藻胶裂解酶在制备褐藻胶单糖中的应用。

6.一种裂解大分子褐藻胶的方法，其特征是，所选用的褐藻胶裂解酶为权利要求1所述的寡褐藻胶裂解酶OalV17。

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