JPS61202695A - Ｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は微生物の働きを利用してフマル酸またハマレイ
ン酸、フェニルピルビン酸およびアンモニアからＬ−フ
ェニルアラニンを製造する方法に関する。

（本発明の課題） Ｌ−フェニルアラニンは必須アミノ酸の一つとして栄養
上或いは疾病の予防、治療上重要な物質であり、また最
近低カロリーの甘味剤として注目されているアス・ぐル
テームの原料でもある。

その製造法については従来より種々の方法が知られてい
るが、いずれの方法も工業的な製造法として必ずしも充
分満足すべきものとは言い難く、より安価に製造し得る
方法が開発されることが望まれている。

本発明者らは微生物の働きを利用してフマル酸まだはマ
レイン酸、フェニルピルビン酸およびアンモニアからＬ
−７エニルアラニンを製造スヘく、当該能力を有する微
生物の検索について種々実験を重ねた結果、本発明を完
成するに至った。

（本発明の構成） 本発明はエシェリヒア属、セラチア属、エンチロバクｐ
−属、エルピニア属、クレブシェラ属まだはシトロバク
タ−属に属し、且フマル酸またはマレイン酸、フェニル
ピルビン酸およびアンモニアからＬ−フェニルアラニ／
を合成する能力を有する微生物菌体もしくはその培養物
またはそれらからの抽出物の存在下にフマル酸またはマ
レイン酸、フェニルピルビン酸およびアンモニアカラ応
させ、生成したＬ−フェニルアラニンを単離することを
特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造法を提供せんと
するものである。

以下に本発明の方法について更に詳しく説明する。

本発明の方法に於いて使用される微生物としては、エシ
ェリヒア属、セラチア属、エンチロバクター属、エルピ
ニア属、クレブシェラ属またはシトロバクタ−属に属し
、且フマル酸またはマレイン酸、フェニルピルビン酸お
よびアンモニアカラＬ−フェニルアラニンを合成する能
力を有する微生物であれば原則として何でも良いが、そ
の代表的なものを例示すれば、例えば、次のようなもの
が挙げられる。

エシェリヒア・コリ（Ｅａｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｔ　）　ＩＡＭ］　２６４　、　ＩＡＭ　１２６８　、
セラチア・マルセッセンス（５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓ　）　ＩＡＭ　１２１４２　＋エンテロ
バクター・クロアカニ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌ
ｏａｃａｅ　）　ＩＡＭ　１６１５　、エルヴイニア・
ヘルヴイコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ　
）　ＩＡＭ　１５６２　＋クレブシェラ・ニューモニア
エ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　
）ＩＡＭ１０６３．シトロバクタ−・フロインディ（Ｃ
１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ　）　ＩＩＤ
　９７６等。

上記の微生物はいずれも公知のものであり、その培養法
については格別の要件はない。即ち、本発明に係る微生
物を培養するに際しては炭素源。

窒素源、有機栄養源、無機塩類などを含む通常の栄養培
地が使用できる。培養条件は菌の種類にもよるが、通常
は−を５．０〜９．０に調整し、３０〜４０℃で好気的
に１８〜７２時間培養すればよい。

反応に際しては上記の如くして得られる培養液のほかに
該培養液から採取した菌体・該菌体の処理物をも用いる
ことができ、ここに菌体の処理物としては例えば洗浄菌
体・乾燥菌体・菌体磨砕物・菌体の自己消化物・菌体の
超音波処理物・菌体抽出物またはこれらをそれ自体公知
の固定化方法により固定化したものがあげられる。

フマル酸ｔ　タｉｄマレイン酸、フェニルピルビン酸と
アンモニアは種々の形で反応系に供給することができ、
例えば、フマル酸アンモニウム塩（まタハマレイン酸ア
ンモニウム塩）、フェニルピルビン酸アンモニウム塩と
して供給してもよく、更ニハフマル酸またはマレイ／酸
、フェニルピルビン酸もしくはその塩と無機アンモニウ
ム塩として供給してもよい。

フマル酸塩またはマレイ／酸塩、フェニルピルビン酸塩
としては例えばナトリウム塩、カリウム塩などを用いる
ことができ、無機アンモニウム塩としては例えば塩酸塩
、硫酸塩、リン酸塩などを好適に用いることができる。

フマメル酸またはマレイン酸もしくはその塩と無機アン
モニウム塩を用いる場合には、これらの２成分のモル比
は１：１．５〜１：２となるのが適当であす、フマル酸
とフェニルピルビン酸のモル比は１．５：１〜２：１と
なるのが適当である。

反応は約５〜５０℃の広い温度範囲で実施することがで
きるが安定性を考慮すると２０〜４５℃で実施すること
が望ましい。−は６〜１０となるよう実施することが望
ましい。また上記反応に際してはマグネシウム、カルシ
ウム、マンガン等の２価金属イオンをその濃度が０．１
〜１０ミリモル程度となるよう添加することが反応に関
与する酵素の安定性を高めることができる。又、ピリド
キサール−５−リン酸をその濃度が１〜１００マイクロ
モル程度となるよう添加することも好ましい。

反応は微生物菌体を用いる場合には培養後集菌した微生
物菌体を前記した様な基質溶液にけん濁しかく拌するこ
とによってＬ−フェニルアラニンが生成する。

また固定化微生物を用いる場合の反応はバッチ法のみな
らずカラム法によって連続的に反応を行なわせることも
できる。例えば、固定化菌体をカラムに充てんし、この
カラムに基質溶液を適当な速度にて流すことによってＬ
−フェニルアラニンを含む流出液が得られる。またパッ
チ式で行なう場合は、基質溶液に固定化微生物をけん濁
させ、かく拌することによって、Ｌ−フェニルアラニン
が生成する。この場合、反応終了液から固定化微生物を
口過または遠心分離することにより取得でき反復使用が
可能である。

上記反応の反応率は微生物の量、基質の濃度および流速
、温度２反応時間その他により影響されるが、カラム法
では固定化微生物の量に従い基質溶液の通液速度を、パ
ッチ法ではその反応時間を調整することにより反応率を
１００％にまで到達させる条件を見出すことも可能であ
る。

かくして反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンは慣
用に従いイオン交換樹脂法やその他の公知の方法と組合
わせて容易に分離精製できる。

以下に本発明の方法について代表的な例を示し更に具体
的に説明するが、これらは単なる例示であり、これらの
みに限定されないことは言うまでもない。

〔実施例１〕 グルコース０．５チ、ポリペプトン１％、リン酸２ナト
リウム０．５８％、リン酸１カリウム０．３％。

塩化ナトリウム０．５％、塩化アンモニウム０．１１硫
酸マグネシウム０．１％及びフマル酸アンモニウム２．
６％を含有する液体培地２１を５１ツヤ−ファーメンタ
−に入れ、１１５℃で２０分間加熱滅菌した。この５１
ツヤ−ファーメンタ−にあらかじめブイヨン培地中で３
０℃で１２時間振とう培養したエシェリヒア・コリＩＡ
Ｍ１２６８．セラチア・マルセッセンスＩＡＭ１２１４
２．シトロバクタ−・７０インデイｌＩＤ９７６の各々
を５％接種し、３５℃で通気攪拌培養を行った。

接種後１０時間経った時点で７エニルビルビン酸ナトリ
ウム塩およびフマル酸アンモニウム塩をそれぞれ培養液
中に１．１４％、２．６％になるように添加し培養液の
−を８．０に保ちながら更に１０時間培養を行なった。

反応終了後の培養液中のＬ−フェニルアラニン量は以下
の通りであった。

〔実施例２〕 〔実施例１〕に示した培地１００　ｍｌの入った５００
１１Ｌｌ容振とうフラスコにて培養したエシェリヒア・
コリＩＡＭ　１２６４　、　ＩＡＭ　１２６８　、セラ
チア・マルセッセンスＩＡＭ１２１４２．エンテロバク
タ−・クロアカニＩＡＭ１６１５．エルヴイニア・ヘル
ヴイコ７ＩＡＭ１５６２．クレブシェラ・ニューモニア
ｚＩＡＭ１０６３．シトロバクタ−・フロインディＩＩ
Ｄ　９７６を夫々培養後遠心分離によυ集菌した。

これらの湿菌体各ＩＩをそれぞれフェニルピルビン酸ナ
トリウム塩０．１１．ｌフマル酸アンモニウム塩０．１
９ｇ、ピリドキサール−５−リン酸０、１１ｎ９および
硫酸マグネシウム１ｆｎ９を含む１ｏゴのリン酸ノ々ツ
ファ−（ｐＨ８，０）の入った１００ｍ容三角フラスコ
にけん濁後３５℃に保った。

反応開始後１時間のＬ−７エニルアラニン蓄積量は以下
の表の通シであった。

〔実施例３〕 〔実施例２〕で得られたそれぞれの湿菌体１！ｉを１０
ｍ／のリン酸バッファー（ｐＨ８，０）にけん濁後、超
音波処理によシ菌体を破砕して粗酵素液とした。

この１０ｒｎｌの粗酵素液を７エニルピルピン酸ナトリ
ウム塩０．１１ｇ、７マル酸アンモニウム塩０．１９，
９．ピリドキサール−５−リン酸０．１　ｍ９および硫
酸マグネ７ウム１１ｎｇを含む１０ｍ１のリン酸バッフ
ァー（ｐｔＩ　８．　Ｏ）の入った１　００　ｍｌ容三
角フラスコに移して３５℃に保った。

反応開始３０分後、１時間後のＬ−フェニルアラニン蓄
積量は以下の表の通りであった。

〔実施例４〕 〔実施例１〕と同様の方法にて培養したエシェリヒア・
コＩＪＩＡＭ１２６８を培養液から遠心分離により集菌
した。

この湿菌体８ｇを生理食塩水８　ｍｌにけん濁して４５
℃に保ち、これに４５ｍ１の水に溶解させた１、１ｇの
に一力うギーナンの水溶液と混合した後、１５℃まで冷
却して固定化菌体とした。

これを３瓢角の大きさに切断したもの５０ｇを直径３副
、長さく高さ）１５ｃｙｎの（円筒型）カラムに充てん
しフェニルピルビン酸ナトリウム塩５．５ｇ、フマル酸
アンモニウム塩９．７９．ビリドキテールー５−リン酸
５ダおよび硫酸マグネシウム５０　ｍ９を含む５００ｍ
１（１’）水溶液（ｐＨ８，０）を２５ｍ１／ｈｒの流
速にて導通した。

流出液を合し、イオン交換樹脂法、濃縮法を経て４．３
ｇのＬ−フェニルアラニンの結晶を得た。

〔実施例５〕 〔実施例１〕に示した培地及びフマル酸アンモニウム２
．６チの代シにマレイン酸アンモニウム２．６チを含む
〔実施例１〕のそれぞれの液体培地１００　ｍｌの入っ
た５　００　ａｔ容振とうフラスコにて培養したエシェ
リヒア・コリＩＡＭ１２６８を培養後遠心分離により集
菌した〇 それぞれの湿菌体ＩＩＩをフェニルピルビン酸ナトリウ
ム塩０．１１．Ｆ、マレイン酸アンモニウム塩０．１９
ｇ、ピリドキサール−５−リン酸０．１　ｍｇおよび硫
酸マグネシウム１　ｍ９を含む１０１ｎｌのリン酸バッ
ファー（ＰＨ８，０）ノ入った１００ｍ７！容三角フラ
スコにけん濁後、３５℃に保った。

反応開始後１時間のＬ−フェニルアラニン蓄積量はそれ
ぞれ８．９２９／ｌ　、　８．８４９／ｌであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. エシェリヒア属、セラチア属、エンチロバクター属、エ
   ルビニア属、クレブシェラ属またはシトロバクター属に
   属し、且フマル酸またはマレイン酸、フェニルピルビン
   酸およびアンモニアからＬ−フェニルアラニンを合成す
   る能力を有する微生物菌体もしくはその培養物またはそ
   れらからの抽出物の存在下にフマル酸またはマレイン酸
   、フェニルピルビン酸およびアンモニアを反応させ、生
   成したＬ−フェニルアラニンを単離することを特徴とす
   るＬ−フェニルアラニンの製造法。