JPS6251588B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、補助因子を必要としないα−ガラク
トシダーゼを生産するがインベルターゼを形成し
ない微生物及びその製法、この種の微生物をα−
ガラクトシダーゼ及び新規微生物の製造に使用す
ることに関する。 サトウダイコンからの抽出物は、主成分として
存在する糖分サツカロースと共に、少量のラフイ
ノース即ち単糖類ガラクトース／グルコース／フ
ラクトースよりなる三糖を含有する。このラフイ
ノースは、結晶化上澄み中で濃度増大し、糖全量
の約１％を越えるとその結晶化を困難にするか又
は一定方法で阻止する不都合な特性を有する。１
製糖工場ですら、３ケ月操業の間に１日当り結晶
化上澄み中にラフイノース５〜10tが生じる。西
ドイツ国において、１日当りのラフイノース量は
200tより多い次元で存在するはずである。 このラフイノースをサツカロースに換えること
は、従来操作できなかつたか又は不満足にのみ操
作することができた大きな経済的問題となつてい
る。即ち、所望の簡潔な相応する技術は確立され
ていない。ここで「簡潔な」とは、使用試薬によ
り更に離脱又は分解可能なサツカロースの残留下
にラフイノース分子からガラクトースを選択的に
離脱することを意味する。このことは、従来は化
学的にも酵素的にも不可能である。 天然に存在する酵素α−ガラクトシダーゼを使
用する酵素的方法は公知である。この酵素は、定
義によれば、ガラクトースをラフイノース分子か
ら定量的に離脱させる。しかしながら、すべての
公知のα−ガラクトシダーゼ−製剤は、従来は、
原則的に、サツカロースをガラクトース及びフラ
クトースに分解する酵素インベルターゼで不純化
されている。サツカロース対存在するラフイノー
スの割合の高濃度（約60〜80対１）を考慮して
も、α−ガラクトシダーゼのインベルターゼによ
る僅かな不純化も、非常に障害となつている。そ
れというのも、これにより著るしい量のサツカロ
ースが更に分解されて、これに伴ない１種の障害
性不純物のみが他と交換されるからである。従つ
て、相応する方法は、実際には使用できなかつ
た。 ところで、従来工業的に使用されていたインベ
ルターゼで不純化されている公知のα−ガラクト
シダーゼのうちで、特に、その入手容易性に基づ
き製糖工業で使用されている菌類−酵素（pilz−
Enzyme）に注目すべきである。これらは前記の
不純物と共に、なお菌類−酵素としてのそれら
が、大規模工業（100cbm／ｈ）以上の工場）で
は酸性化及び再中和の際の大問題を生じる明らか
に酸性PH領域で活性最大を有する欠点を有する。 精製後にインベルターゼ不含である唯一のα−
ガラクトシダーゼが公知である。しかしながらこ
のα−ガラクトシダーゼは、補助因子
（Cofactor）としてマンガンイオン及びNADを必
要とし、更に、安定性が低く、かつ低濃度でのみ
バイオマス中に存在する。従つて、このα−ガラ
クトシダーゼは、連続的な製糖工業の条件下にお
ける方法では使用されていなかつた。 従つて、本発明の課題は、インベルターゼをま
つたく含有しないα−ガラクトシダーゼを得るこ
とである。同時にこの酵素は次の特性を有すべき
である：即ちこれは、中性に非常に近い点で高い
活性を示し、確実な温度安定性を示し、かつ比較
的濃縮された糖溶液中でもしくは植物抽出物（サ
トウダイコン）の濃縮物中でその活性を長時間に
わたり保持し、補助因子を必要としない。 この課題の解決のために、本発明は、DNA−
組換えの使用により、α−ガラクトシダーゼに通
例混入している酵素インベルターゼをインベルタ
ーゼ中でコード化されている遺伝子片の削除によ
り不可逆的に除くことができ、α−ガラクトシダ
ーゼのコード化のために関与するベクター中の遺
伝子片を増殖させ、高い遺伝子量効果及び調節の
変化の結果として、所望のインベルターゼ不含の
酵素をできるだけ高濃度で得ることができるはず
であるということより出発している。理論的に
は、細菌粗抽出物そのもの又は同様に不動態化さ
れた形のものも使用可能である。このための前提
は、好適な方法、好適なオペロン及び好適な制限
酵素の発見である。 この課題は、本発明により補助因子を必要とし
ないα−ガラクトシダーゼを形成しインベルター
ゼを形成しない微生物を製造する方法で解決さ
れ、これは、α−ガラクトシダーゼ−遺伝子を有
するDNA及び使用すべき形質転換可能な細胞に
対して好適なベクター（耐抗生物質遺伝子を有す
る）を、制限酵素sal（EC3.1.23.27）を用いて
完全に解裂させ、α−ガラクトシダーゼ遺伝子含
有DNAのフラグメントから約４メガダルトンの
相対分子量を有する断片を得：salで解裂され
たベクターの溶液と混合し、DNA−リガーゼの
存在下で、組換えて、組換型DNAを形成させ、
得られる組換型DNAを形質転換可能な細胞と共
にインベキユベートし、形質転換された細胞を唯
一のＣ−源としてのラフイノースを含有する栄養
培地上で培養し、生じる耐抗生物質性コロニーを
単離し、溶解させ、この溶解物からプラスミド−
DNAを単離させ、これを制限酵素Hind（EC、
3.1.23.21）又はEcoRI（EC3.1.23.13）を用いて
解裂させ、得られる溶液を稀釈し、DNA−リガ
ーゼで処理し、得られる再生プラスミドを改めて
形質転換可能な細胞中に入れ、この形質転換され
た細胞を再びＣ−源としてのラフイノース及び抗
生物質を含有する栄養培地上で培養し、生じたラ
フイノースを利用しないコロニーを単離すること
よりなる。 α−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するDNA
は、有利に、E.コリーBMTU2743、DSM2092か
ら、これを適当な栄養培地中で高めた温度有利に
37〜42℃で倍養し、ポリエチレングリコールを用
いて沈殿させかつ例えば密度勾配法及びフエノー
ル抽出法で精製することにより得られる。 α−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するDNA及
びベクターDNAの解裂は、公知方法で、制限酵
素Salを有利に35〜37℃の温度で、DNA−分子
が完全に解裂されるまで作用させることにより行
なう。引続き、この制限酵素を有利に加熱により
変性させる。得られるα−ガラクトシダーゼ遺伝
子含有DNAの断片をゲル電気泳動により分別
し、約４メガダルトンの相対分子量を有するフラ
グメントを単離する。 この断片の切出されたベクターでの組換えは、
溶液の混合及び好適なDNA−リガーゼの添加に
より行なう。T4−フアージのDNA−リガーゼ
（EC6.5.1.1）を使用するのが有利であるが、他の
起源のDNA−リガーゼも使用できる。 こうして、組換型DNAが得られ、これを常法
で形質転換可能な細胞（DNA吸収能を有する反
応能を有する菌株）と混合すると、形質転換反応
が進行する。 形質転換可能な細胞として、本発明の範囲で、
このために公知の細胞を使用することができる。
形質転換可能な細胞の例は、E.コリー（Coli）、
クレブシエラ・プノイモニアエ（Klebsiella
pneumoniae）、シユードモナス・アエルギノサ
（Pseudomonas aeruginosa）及びバシルス・ス
ブチリス（Bacillus subtilis）である。例えば
BMTU2744、DSM2093の菌株のE.コリーが特に
有利である。 このことは、特に本発明の方法の範囲の第１の
形質転換工程にあてはまる。本発明方法における
第２の形質転換工程のために、細胞のその他の特
性例えばα−ガラクトシダーゼ取得後の細胞成分
の利用性、生長特性及び供給性を考慮しながら形
質転換可能な細胞の選択を行なう。特に、第２の
形質転換のためにはE.コリー及びシユードモナ
ス・プチダ（Pseudomonas putida）が有利であ
る。 フアクターの選択は、形質転換可能な細胞の選
択により決まる。形質転換可能な細胞としての
E.コリー菌株を使用する際には、ベクターとし
てのプラスミドpBR322（DSM2089）〔これは市
場で入手される；Nucl.Acid.Res.（1978年）５巻
2721〜2728頁参照〕を使用するのが有利である。 サツカロミセス細胞に対して、ベクターとして
は、プラスミドpFL1（Mercereau−Puijalon等
によるGene、11巻、163〜167頁（1980年）に記
載〕が好適である。バシルス・スブチリス細胞に
対しては、特にベクターとしてプラスミド
pHV23〔B.Michel等によるGene、12巻147〜154
頁（1980年）に記載〕が好適である。前記の他の
すべての微生物並びにE.コリーに対しては、
pRSF1010も好適である。同様に、pKT230もこ
れに該当する〔双方共Microbial Degradation of
Xenobiotics and Recalcitrant compounds（Ｈ
ｕ¨tter und Leisinger.Acad.Press（1981年）
London発行）に記載されている。 考慮される形質転換可能な細胞のうちで、それ
自体はプラスミドを有しないもの例えば前記の
E.コリーBMTU2774、DSM2093が有利である。 本発明にとつて重要なことは、α−ガラクトシ
ダーゼ−遺伝子を有するDNAを用い、差当りsal
を用いて解裂させ、第１の形質転換の後に得ら
れるプラスミド−DNAをHind又はEcoRIを用
いて解裂させることである。それというのもこれ
らの制限酵素は、DNAの本発明にとつて重要な
位置での解裂に作用するからである。４メガダル
トン解裂断片の解裂されたベクターによる組換え
のために、原理的には、任意に好適なDNA−リ
ガーゼを使用することができる。T4−フアージ
のDNA−リガーゼが有利である。その除去は、
それぞれの溶液をATP、スルフヒドリル化合物
及びマグネシウムイオンの存在で混合することに
より行なう。 この調節の後に、α−ガラクトシダーゼ遺伝子
を有するベクターを含有する細胞を見つけるため
に、唯一炭素源としてのラフイノース並びに必要
な塩を含有する最小培地上での培養を行なう。抗
生物質耐性遺伝子を有するベクターの使用に基づ
き、この培地に付加的になお１種の抗生物質（こ
れに対してベクター中に耐性遺伝子を有する）を
添加するのが有利である。例えばプラスミド
pBR322はアンピシリン及びテトラサイクリンに
対する耐性遺伝子を有するから、この場合にはこ
れらの抗生物質の１種（これは形質転換後にその
遺伝子を有しないような細胞の生長を抑制する）
を使用するのが有利である。ここで最小培地と
は、必要な塩以外にはラフイノースのみを含有す
る培地を意味する。 この際に得られるハイブリツド−プラスミド
DNAをHind又はEcoRIで解裂することは、ラ
フイノース−ペルミアーゼ及びインベルターゼの
表現のためにコード化された遺伝子配列を欠失す
る作用をする。従つてDNA−リガーゼの作用に
よる再生の際に、先の工程で不所望の遺伝子をも
はや含有せず、第２工程の形質転換のために使用
されるベクターが得られ、このためには、更に、
第１工程の形質転換のために示した前記の内容が
同様に通用する。 第２の形質転換工程で得られる細胞を選択し、
これらをPH−指示薬を示し、Ｃ−源としてのラフ
イノース及び相応する抗生物質を含有する完全栄
養培地上で培養する。完全栄養培地は、最小栄養
培地の成分に加えてペプトン及び酵母エキスを含
有する。欠失の結果、ラフイノース−ペルミアー
ゼ及びインベルターゼに対する遺伝子がもはやそ
の中に存在しない形質転換された細胞は、ラフイ
ノースをもはや細胞内に移送することはできず、
従つて利用できない。従つて、培地のPH値は中性
領域に留まり、変色しない。従つて、これらはそ
の遺伝子配列を欠失しておらず、ラフイノースの
吸収及び引続く培養により酸を形成する細胞か
ら、培地の異なる色（PH−指示薬）に基づき区別
できかつ分離することができる。 ラフイノース−ペルミアーゼの影響下にもはや
直接ラフイノースを使用することはできない細胞
は常にα−ガラクトシダーゼを形成するので、こ
れはラフイノースを解裂させるが、もはやラフイ
ノース利用しない細胞のコロニーも生じる。特に
マツク・コンキイ−プレート〔Mac Conkeyr−
platten；Difco社製、PH−指示薬としての中性レ
ツド（neutralrot）を含有する〕の使用により、
ラフイノース−ペルミアーゼ及びインベルターゼ
に関する遺伝子配列を有するか又は有しない細胞
の間の区別を行なうのが有利である。それという
のは、ラフイノース利用コロニーはその上で赤色
になり、これに反してラフイノースを利用しない
コロニーは白色のまま残るからである。この白色
コロニーを単離し、次いで、基礎となつている出
発微生物にとつて慣用の方法で培養する。 この際この新規微生物は工業的規模で培養する
こともでき、安定して残る。この微生物は、出発
菌株の酵素活性よりも10の数乗倍の酵素活性を示
す。 生じた酵素は、インベルターゼ痕跡量をも含ま
ず、ほぼ中性のPH値でサツカロース結晶上澄み中
のラフイノースを工業的に使用可能な温度で分解
することができた。この酵素は、補助因子例えば
Mn−イオン及びADNを必要とせず、安定であ
り、慣用方法で例えばブロムシアン活性化された
不溶のポリサツカライド上への作用により担体に
固定させることができた。単離された酵素の代り
に、微生物そのものも適当な担体上に固定され、
この形で工業的に使用することもできる。この場
合ペルミアーゼ−遺伝子欠失の結果、ラフイノー
スに対して不適性にされた細胞膜を固定化工程に
より再びラフイノースに対して適性にする。この
場合、慣用の固定化法が好適である。 新規の微生物からこのα−ガラクトシダーゼを
単離することはα−ガラクトシダーゼの取得に慣
用の方法で行なうことができる。有利な方法は、
常法で例えば高圧分散、超音波処理等によるバイ
オマスの崩壊よりなる。当初微生物に関して好適
な崩壊法を使用するのが有利である。 この崩壊の後に、α−ガラクトシダーゼが通例
上澄み中に残るポリアニオン沈殿法を実施するの
が有利である。ポリアニオンとしては、ポリエチ
レンイミン殊に中程度の分子量のポリエチレンイ
ミンが有利である。 こうして得た沈殿から、硫酸アンモニウムを用
いて酵素を沈殿させることができ、この際、有利
に硫酸アンモニウムの0.8〜1.6Mのフラクシヨン
が得られる。透析及び凍結乾燥により、高収率
で、90％より高い純度の工業的使用に好適なα−
ガラクトシダーゼ調整物が得られる。 ベクターとしてのプラスミドpBR322及び形質
転換可能な細胞としてのE.コリーBMTU2093を
使用して、前記の方法で、新規の微生物E.コリ
ーBMTU2742、DSM2091が得られ、これも同様
に本発明の目的物である。 この新規微生物は、次の特性を有する： これはプラスミドpBT102を含有し、アンピシ
リン５μｇ／mlに抵抗し、補助因子を必要としな
い細胞内α−ガラクトシダーゼを生産するが本質
的にインベルターゼを生産しない。その他に関し
て、これはE.コリーＫ−12−株とは異ならず、
37℃で標準培地中で有利に通気下に培養すること
ができる。 本発明方法で得られる、α−ガラクトシダーゼ
の高含分により前記の特に有利な特性を示す（可
溶性プロテイン全量の30％までがα−ガラクトシ
ダーゼより成つていてよい）新規微生物は、その
新規特性を他の微生物に伝達することができる。
これにより得られる微生物も同様に本発明の目的
物である。 この伝達の可能性は例えば、本発明の方法で得
られた微生物を受容微生物と一緒に培養例えば寒
天上でインキユベートすることよりなる。例えば
本発明方法の第２形質転換工程に、プラスミド
RP4を含有するE.コリー株（J.Bacteriol108巻
1244〜1249頁（1971年）参照）を使用すると、
RP4と共にハイブリツドベクター例えばpBT103
を含有する（即ち２個のプラスミドを有する）微
生物が生じる。この微生物はシユードモナス−菌
株pBT103と共に培養することにより容易に後者
菌株に伝達する。 この方法にその都度使用される形質転換可能な
形の微生物いわゆる反応性菌株は、当業者にとつ
て公知の方法で得られる。培養を指数増殖期の終
りまで行なうのが有利である。次いで細胞を単離
し、氷冷塩化カルシウム溶液中に懸濁させる。こ
の形で、これはDNAを収容する能力がある。 E.コリーの使用の際に培養のための培地とし
て、有利に、メルク社（Firma Merck、
Darmstadt）のいわゆるスタンダード−栄養ブ
イヨン（Standard−Ｎａ¨hrbouillon）を使用す
る。 本発明によれば、高活性の酵素α−ガラクトシ
ダーゼを形成するが同時にはインベルターゼを生
じない微生物の製法が得られる。こうして、例え
ばサトウダイコン糖からの糖結晶化の際のラフイ
ノース又は他のα−ガラクトシダーゼ分解性の結
合糖の解裂のために、従来公知のα−ガラクトシ
ダーゼ製剤よりも好適であるα−ガラクトシダー
ゼ源が得られる。これにより、大規模な、サトウ
ダイコン−製糖時のラフイノース増加の問題を経
済的に解決することが可能である。本発明による
微生物又はこれから得られる未精製又は精製され
たα−ガラクトシダーゼ調製物は、α−ガラクト
シダーゼ分解性炭化水素の解裂が望ましい食料品
工業における他の目的にも使用できる。この例
は、大豆粉からのスタキオースの除去である。こ
の除去は、大豆粉を食料品として使用可能にする
場合に必要である。 次に実施例につき本発明を説明する： 例 １ 菌株エセリシア・コリー（Escherichia coli）
BMTU2743、DSM2092（これは、α−ガラクト
シダーゼ遺伝子を含有するDNA−断片（P1raf）
を有する）から、次の方法により、α−ガラクト
シダーゼに関する高い生産性を有する新規菌株を
製造する。 (1) E.コリー リゼートからのraf−オペロンに
関する遺伝情報を有するP1raf DNAの製造 E.コリーＫ−12（BMTU2744、DSM2093）
から誘導された菌株エセリシア・コリー
BMTU2743（thr-、Leu-、thi-、LacY、
tonA、raf+、P1ts−溶原菌）を、30℃で振動
下に、栄養ブイヨン（トリプトン１％、酵母エ
キス0.5％、グルコース0.2％及びNaCl0.5％を
含有し、PH7.8に調節した）１中で４時間培
養し、0.5OD650の光学密度（650nｍで測定）に
達したら、温度敏感なフアージリプレツサーの
加熱誘発のために40℃で更に２時間振動させ
る。 培養液上澄みから、遊離したフアージをポリ
エチレングリコールでの沈殿により取得し、塩
化セシウム−密度勾配法により精製する。フエ
ノール抽出及び緩衝液（10ｍＭトリス・HCl、
PH8.0）に対する透析の後に、精製されたフア
ージDNA0.6mgが得られる。 (2) ベクターDNAの製造 P1raf DNAのフラグメントのクローン化の
ために、プラスミドDNApBR322のDNAを、識
別遺伝子（マーカー）としてのアンピシリン−
及びテトラサイクリン−耐性遺伝子を有するベ
クターに使用する。市場で入手されるプラスミ
ドを使用するか又はこれを次の方法で製造す
る： プラスミドpBR322を有するエセリシア・コ
リー菌株を(1)に記載と同じ組成の栄養ブイヨン
１中、37℃で振動下に指数増殖期の終りまで
培養する。次いで、クロラムフエニコール150
μｇ／mlの添加の後に、同じ温度で更に15分間
振動させる。この方法によりプラスミドDNA
は有利に複製され、細菌中で増加される。引続
き、細菌細胞を得、リソチーム及び非イオン性
界面活性剤を用いて溶解させ、この溶解物を
48000ｇで30分間遠心分離させて、上澄み液を
取得する。次に、これから２回の塩化セシウム
−臭化エチジウム−平衡密度勾配遠心、引続く
フエノール抽出及び緩衝液（10ｍＭトリス・
HCl、PH8.0）に対する透析により、プラスミ
ド−DNA420μｇが得られる。 (3) P1rafからのraf−オペロンをベクター中へ挿
入 P1raf DNA及びベクターDNA各10μｇを、
DNA分子を完全に解裂させるために、37℃
で、制限酵素salで１時間処理し、次いで、
それぞれ５分間65℃まで加熱する。 その後、このP1raf DNAを0.7％アガロース
ゲル中で電気泳動により分別する。相対分子量
４メガダルトンを有するフラグメントが切り出
され、フエノール抽出及び緩衝液（10ｍＭトリ
ス・HCl、PH8.0）中での透析の後に溶液中に
得られる。 こうして得たP1raf DNAのフラグメントの
溶液を、解裂されたpBR322−ベクターDNAの
溶液と混合し、ATP、ジチオエリスリツト及
び塩化マグネシウムの添加のもとに、40℃で、
T4−フアージのDNA−リガーゼを24時間作用
させる。こうして得た溶液は組換型DNAを含
有する。 (4) α−ガラクトシダーゼに関する遺伝子情報を
有する組換型DNAを用いるE.コリー細菌の遺
伝的形質転換 通常のE.コリー菌株（BMTU2744、
DSM2093）を振動下に、栄養ブイヨン50ml
中、37℃で、指数増殖期の終りまで培養する。
細胞を取得し、これを氷浴中の50ｍMCaCl2溶
液中に懸濁させる。 この懸濁液を(3)工程からの組換型DNAの溶
液と混合し、氷浴中で20分間保持し、次いで、
３分間37℃に加温する。細胞を栄養ブイヨン中
に移殖し、37℃で45分間振動させて形質転換反
応を終了させる。細胞を取得し、洗浄しかつ再
び懸濁させる。少量の細胞懸濁液を寒天プレー
ト（１当りK2HPO410.5ｇ、KH2PO44.5ｇ
（NH4）2SO41ｇ、クエン酸ナトリウム×
2H2O0.5ｇ、MgSO4×7H2O0.1ｇ、チアミン１
mg、ラフイノース２ｇ、アンピシリン25mg及び
寒天15ｇを含有し、PH値は7.2に調節されてい
る）上に塗布する。このプレートを37℃で温置
する。２日間温置の後に、多数のコロニーがプ
レート上に現われる。すべてのコロニーを取り
出し、精製し、単離する。 こうして得た各コロニーは、唯一Ｃ−源とし
てのラフイノースを利用する能力を有し、同時
にアンピシリン耐性である。従つて、これは、
宿主微生物として用いた菌株のそれとは異なる
特性を有する。このことは、P1rafからのsal
フラグメントにα−ガラクトシダーゼ遺伝子を
挿入したpBR322−プラスミドを有する生長性
コロニーとしての細胞のみを選択することを意
味する。 得られたコロニーから、それぞれ、プラスミ
ドDNAを(2)に記載の方法で単離する。全コロ
ニーとしてのプラスミドは、制限酵素EcoRI及
びHindでの処理及びアガロースゲル中での
電気泳動による分析の後に、ハイブリツドプラ
スミドの起源コロニーに応じて２種の異なる寸
法の群に分けることができるが合計では同じで
ある２フラグメントを示す。 即ち、４メガダルトンの大きさのフラグメン
ト（(3)で製造）がプラスミドpBR322中に、時
計廻り方向でも時計廻りと反対の方向でも導入
されるので、異なる寸法（大きい及び小さい）
群の２種のフラグメントが生じる。これによ
り、そのEcoRもしくはTind切断部位がそ
れぞれ他の位置にある２種の異なるプラスミド
が生じる。従つて、EcoRもしくはHindで
の切断時に異なる寸法群の２種のフラグメント
が生じる。 双方の寸法の群は約１：１の割合で見い出さ
れる。双方のフラグメント−寸法群に関する異
なる分析結果は、pBR322中のP1rafからのsal
フラグメントの異なる挿入方向に帰因する。 更に操作するために、制限酵素EcoR又は
Hindでの処理により他のコロニーのプラス
ミドよりも小さい第２のフラグメントを生じる
コロニーのプラスミドを選択する。このプラス
ミドはpBT100（BMTU2741、DSM2090、分子
量約6.8Md）と称される。このプラスミドを有
する細菌は、唯一Ｃ−源としてのラフイノース
を利用し、Raf−オペロンのすべての酵素を本
質的に生産することができる。 (5) BMTU2471（DSM2090）からのpBT100の
DNA各10mgを制限酵素Hind又は制限酵素
EcoRで37℃で１時間処理して、DNA分子を
解裂させる。次に各々５分間65℃まで加熱す
る。 このように処理したプラスミド−DNA溶液
を稀釈し、それぞれ(3)に記載のようにT4−リ
ガーゼで再生処理する。 引続き、(4)に記載のE.コリー菌株の反応性
細胞に、それぞれ最終工程からの再生DNAの
溶液を形質転換反応に導びく。それぞれこのよ
うに処理した細胞の少部分を、アンピシリン25
μｇ／mlを有するマツク・コンケイ・ラフイノ
ース・プレート（Mac Conkey Raffinose
Platte；Difco Laboratories、Detroit）上に塗
布する。予めHindで処理したプラスミド−
DNAでの形質転換のプレート上に37℃で24時
間温置の後に約20のコロニーが認められ、予め
EcoRで処理したDNAの形質転換のプレート
上には、同じ条件下に30のコロニーが存在す
る。赤色コロニーと白色コロニーの割合は前者
では１：４、後者では１：３である。 赤色コロニーは、それぞれラフイノース分解
可能であり、相変らず全raf−オペロンを有
し、白色細胞は、すべてラフイノース分解可能
ではない。しかしながら、これらは、細胞を予
めラフイノース−添加せずに栄養ブイヨン中
に、37℃で定常相になるまで温置する際に、色
基質としてのｐ−ニトロフエニル−α−ガラク
トシド（α−PNPG）を用いる細胞不含の抽出
物中の試験が示すように、相変らず本質的に酵
素α−ガラクトシダーゼを生産する。しかしな
がら、これらの細胞は、宿主微生物又は
pBT100で形質転換されている細胞BMTU2741
（DSM2090）の特性とは異なる特性を有する。 pBT100の前記Hind処理の後に、マツク・
コンケイ・プレート上の白色コロニー中に得ら
れるプラスミドをpBT101（分子量約4.8Md）
と称し、前記のEcoR反応で得られるものを
pBT102（分子量約4.5Md）と称する。pBT102
を有するE.コリー菌株をBMTU2742
（DSM2091）と称する。 (6) pBT102を有する菌株（BMTU2742）からの
α−ガラクトシダーゼの取得 第１表は、細胞不含の抽出物の、(5)の工程で
得られるクローンである菌株BMTU2742の25
℃での培養の後のα−PNPGを有するα−ガラ
クトシダーゼの含分に関する実験結果を示す。
細胞を100mlフラスコ中の栄養ブイヨン10ml中
に接種し、30℃で15時間振動させる。対照実験
は、同じ条件であるが培地にラフイノース0.2
％を添加して、出発菌株BMTU2743を培養し
て実施する。 第１表から認められるように、菌株
BMTU2742の抽出物はBMTU2743と比べて極
めて高いα−ガラクトシダーゼ含分を示した。
トシダーゼを生産するがインベルターゼを形成し
ない微生物及びその製法、この種の微生物をα−
ガラクトシダーゼ及び新規微生物の製造に使用す
ることに関する。 サトウダイコンからの抽出物は、主成分として
存在する糖分サツカロースと共に、少量のラフイ
ノース即ち単糖類ガラクトース／グルコース／フ
ラクトースよりなる三糖を含有する。このラフイ
ノースは、結晶化上澄み中で濃度増大し、糖全量
の約１％を越えるとその結晶化を困難にするか又
は一定方法で阻止する不都合な特性を有する。１
製糖工場ですら、３ケ月操業の間に１日当り結晶
化上澄み中にラフイノース５〜10tが生じる。西
ドイツ国において、１日当りのラフイノース量は
200tより多い次元で存在するはずである。 このラフイノースをサツカロースに換えること
は、従来操作できなかつたか又は不満足にのみ操
作することができた大きな経済的問題となつてい
る。即ち、所望の簡潔な相応する技術は確立され
ていない。ここで「簡潔な」とは、使用試薬によ
り更に離脱又は分解可能なサツカロースの残留下
にラフイノース分子からガラクトースを選択的に
離脱することを意味する。このことは、従来は化
学的にも酵素的にも不可能である。 天然に存在する酵素α−ガラクトシダーゼを使
用する酵素的方法は公知である。この酵素は、定
義によれば、ガラクトースをラフイノース分子か
ら定量的に離脱させる。しかしながら、すべての
公知のα−ガラクトシダーゼ−製剤は、従来は、
原則的に、サツカロースをガラクトース及びフラ
クトースに分解する酵素インベルターゼで不純化
されている。サツカロース対存在するラフイノー
スの割合の高濃度（約60〜80対１）を考慮して
も、α−ガラクトシダーゼのインベルターゼによ
る僅かな不純化も、非常に障害となつている。そ
れというのも、これにより著るしい量のサツカロ
ースが更に分解されて、これに伴ない１種の障害
性不純物のみが他と交換されるからである。従つ
て、相応する方法は、実際には使用できなかつ
た。 ところで、従来工業的に使用されていたインベ
ルターゼで不純化されている公知のα−ガラクト
シダーゼのうちで、特に、その入手容易性に基づ
き製糖工業で使用されている菌類−酵素（pilz−
Enzyme）に注目すべきである。これらは前記の
不純物と共に、なお菌類−酵素としてのそれら
が、大規模工業（100cbm／ｈ）以上の工場）で
は酸性化及び再中和の際の大問題を生じる明らか
に酸性PH領域で活性最大を有する欠点を有する。 精製後にインベルターゼ不含である唯一のα−
ガラクトシダーゼが公知である。しかしながらこ
のα−ガラクトシダーゼは、補助因子
（Cofactor）としてマンガンイオン及びNADを必
要とし、更に、安定性が低く、かつ低濃度でのみ
バイオマス中に存在する。従つて、このα−ガラ
クトシダーゼは、連続的な製糖工業の条件下にお
ける方法では使用されていなかつた。 従つて、本発明の課題は、インベルターゼをま
つたく含有しないα−ガラクトシダーゼを得るこ
とである。同時にこの酵素は次の特性を有すべき
である：即ちこれは、中性に非常に近い点で高い
活性を示し、確実な温度安定性を示し、かつ比較
的濃縮された糖溶液中でもしくは植物抽出物（サ
トウダイコン）の濃縮物中でその活性を長時間に
わたり保持し、補助因子を必要としない。 この課題の解決のために、本発明は、DNA−
組換えの使用により、α−ガラクトシダーゼに通
例混入している酵素インベルターゼをインベルタ
ーゼ中でコード化されている遺伝子片の削除によ
り不可逆的に除くことができ、α−ガラクトシダ
ーゼのコード化のために関与するベクター中の遺
伝子片を増殖させ、高い遺伝子量効果及び調節の
変化の結果として、所望のインベルターゼ不含の
酵素をできるだけ高濃度で得ることができるはず
であるということより出発している。理論的に
は、細菌粗抽出物そのもの又は同様に不動態化さ
れた形のものも使用可能である。このための前提
は、好適な方法、好適なオペロン及び好適な制限
酵素の発見である。 この課題は、本発明により補助因子を必要とし
ないα−ガラクトシダーゼを形成しインベルター
ゼを形成しない微生物を製造する方法で解決さ
れ、これは、α−ガラクトシダーゼ−遺伝子を有
するDNA及び使用すべき形質転換可能な細胞に
対して好適なベクター（耐抗生物質遺伝子を有す
る）を、制限酵素sal（EC3.1.23.27）を用いて
完全に解裂させ、α−ガラクトシダーゼ遺伝子含
有DNAのフラグメントから約４メガダルトンの
相対分子量を有する断片を得：salで解裂され
たベクターの溶液と混合し、DNA−リガーゼの
存在下で、組換えて、組換型DNAを形成させ、
得られる組換型DNAを形質転換可能な細胞と共
にインベキユベートし、形質転換された細胞を唯
一のＣ−源としてのラフイノースを含有する栄養
培地上で培養し、生じる耐抗生物質性コロニーを
単離し、溶解させ、この溶解物からプラスミド−
DNAを単離させ、これを制限酵素Hind（EC、
3.1.23.21）又はEcoRI（EC3.1.23.13）を用いて
解裂させ、得られる溶液を稀釈し、DNA−リガ
ーゼで処理し、得られる再生プラスミドを改めて
形質転換可能な細胞中に入れ、この形質転換され
た細胞を再びＣ−源としてのラフイノース及び抗
生物質を含有する栄養培地上で培養し、生じたラ
フイノースを利用しないコロニーを単離すること
よりなる。 α−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するDNA
は、有利に、E.コリーBMTU2743、DSM2092か
ら、これを適当な栄養培地中で高めた温度有利に
37〜42℃で倍養し、ポリエチレングリコールを用
いて沈殿させかつ例えば密度勾配法及びフエノー
ル抽出法で精製することにより得られる。 α−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するDNA及
びベクターDNAの解裂は、公知方法で、制限酵
素Salを有利に35〜37℃の温度で、DNA−分子
が完全に解裂されるまで作用させることにより行
なう。引続き、この制限酵素を有利に加熱により
変性させる。得られるα−ガラクトシダーゼ遺伝
子含有DNAの断片をゲル電気泳動により分別
し、約４メガダルトンの相対分子量を有するフラ
グメントを単離する。 この断片の切出されたベクターでの組換えは、
溶液の混合及び好適なDNA−リガーゼの添加に
より行なう。T4−フアージのDNA−リガーゼ
（EC6.5.1.1）を使用するのが有利であるが、他の
起源のDNA−リガーゼも使用できる。 こうして、組換型DNAが得られ、これを常法
で形質転換可能な細胞（DNA吸収能を有する反
応能を有する菌株）と混合すると、形質転換反応
が進行する。 形質転換可能な細胞として、本発明の範囲で、
このために公知の細胞を使用することができる。
形質転換可能な細胞の例は、E.コリー（Coli）、
クレブシエラ・プノイモニアエ（Klebsiella
pneumoniae）、シユードモナス・アエルギノサ
（Pseudomonas aeruginosa）及びバシルス・ス
ブチリス（Bacillus subtilis）である。例えば
BMTU2744、DSM2093の菌株のE.コリーが特に
有利である。 このことは、特に本発明の方法の範囲の第１の
形質転換工程にあてはまる。本発明方法における
第２の形質転換工程のために、細胞のその他の特
性例えばα−ガラクトシダーゼ取得後の細胞成分
の利用性、生長特性及び供給性を考慮しながら形
質転換可能な細胞の選択を行なう。特に、第２の
形質転換のためにはE.コリー及びシユードモナ
ス・プチダ（Pseudomonas putida）が有利であ
る。 フアクターの選択は、形質転換可能な細胞の選
択により決まる。形質転換可能な細胞としての
E.コリー菌株を使用する際には、ベクターとし
てのプラスミドpBR322（DSM2089）〔これは市
場で入手される；Nucl.Acid.Res.（1978年）５巻
2721〜2728頁参照〕を使用するのが有利である。 サツカロミセス細胞に対して、ベクターとして
は、プラスミドpFL1（Mercereau−Puijalon等
によるGene、11巻、163〜167頁（1980年）に記
載〕が好適である。バシルス・スブチリス細胞に
対しては、特にベクターとしてプラスミド
pHV23〔B.Michel等によるGene、12巻147〜154
頁（1980年）に記載〕が好適である。前記の他の
すべての微生物並びにE.コリーに対しては、
pRSF1010も好適である。同様に、pKT230もこ
れに該当する〔双方共Microbial Degradation of
Xenobiotics and Recalcitrant compounds（Ｈ
ｕ¨tter und Leisinger.Acad.Press（1981年）
London発行）に記載されている。 考慮される形質転換可能な細胞のうちで、それ
自体はプラスミドを有しないもの例えば前記の
E.コリーBMTU2774、DSM2093が有利である。 本発明にとつて重要なことは、α−ガラクトシ
ダーゼ−遺伝子を有するDNAを用い、差当りsal
を用いて解裂させ、第１の形質転換の後に得ら
れるプラスミド−DNAをHind又はEcoRIを用
いて解裂させることである。それというのもこれ
らの制限酵素は、DNAの本発明にとつて重要な
位置での解裂に作用するからである。４メガダル
トン解裂断片の解裂されたベクターによる組換え
のために、原理的には、任意に好適なDNA−リ
ガーゼを使用することができる。T4−フアージ
のDNA−リガーゼが有利である。その除去は、
それぞれの溶液をATP、スルフヒドリル化合物
及びマグネシウムイオンの存在で混合することに
より行なう。 この調節の後に、α−ガラクトシダーゼ遺伝子
を有するベクターを含有する細胞を見つけるため
に、唯一炭素源としてのラフイノース並びに必要
な塩を含有する最小培地上での培養を行なう。抗
生物質耐性遺伝子を有するベクターの使用に基づ
き、この培地に付加的になお１種の抗生物質（こ
れに対してベクター中に耐性遺伝子を有する）を
添加するのが有利である。例えばプラスミド
pBR322はアンピシリン及びテトラサイクリンに
対する耐性遺伝子を有するから、この場合にはこ
れらの抗生物質の１種（これは形質転換後にその
遺伝子を有しないような細胞の生長を抑制する）
を使用するのが有利である。ここで最小培地と
は、必要な塩以外にはラフイノースのみを含有す
る培地を意味する。 この際に得られるハイブリツド−プラスミド
DNAをHind又はEcoRIで解裂することは、ラ
フイノース−ペルミアーゼ及びインベルターゼの
表現のためにコード化された遺伝子配列を欠失す
る作用をする。従つてDNA−リガーゼの作用に
よる再生の際に、先の工程で不所望の遺伝子をも
はや含有せず、第２工程の形質転換のために使用
されるベクターが得られ、このためには、更に、
第１工程の形質転換のために示した前記の内容が
同様に通用する。 第２の形質転換工程で得られる細胞を選択し、
これらをPH−指示薬を示し、Ｃ−源としてのラフ
イノース及び相応する抗生物質を含有する完全栄
養培地上で培養する。完全栄養培地は、最小栄養
培地の成分に加えてペプトン及び酵母エキスを含
有する。欠失の結果、ラフイノース−ペルミアー
ゼ及びインベルターゼに対する遺伝子がもはやそ
の中に存在しない形質転換された細胞は、ラフイ
ノースをもはや細胞内に移送することはできず、
従つて利用できない。従つて、培地のPH値は中性
領域に留まり、変色しない。従つて、これらはそ
の遺伝子配列を欠失しておらず、ラフイノースの
吸収及び引続く培養により酸を形成する細胞か
ら、培地の異なる色（PH−指示薬）に基づき区別
できかつ分離することができる。 ラフイノース−ペルミアーゼの影響下にもはや
直接ラフイノースを使用することはできない細胞
は常にα−ガラクトシダーゼを形成するので、こ
れはラフイノースを解裂させるが、もはやラフイ
ノース利用しない細胞のコロニーも生じる。特に
マツク・コンキイ−プレート〔Mac Conkeyr−
platten；Difco社製、PH−指示薬としての中性レ
ツド（neutralrot）を含有する〕の使用により、
ラフイノース−ペルミアーゼ及びインベルターゼ
に関する遺伝子配列を有するか又は有しない細胞
の間の区別を行なうのが有利である。それという
のは、ラフイノース利用コロニーはその上で赤色
になり、これに反してラフイノースを利用しない
コロニーは白色のまま残るからである。この白色
コロニーを単離し、次いで、基礎となつている出
発微生物にとつて慣用の方法で培養する。 この際この新規微生物は工業的規模で培養する
こともでき、安定して残る。この微生物は、出発
菌株の酵素活性よりも10の数乗倍の酵素活性を示
す。 生じた酵素は、インベルターゼ痕跡量をも含ま
ず、ほぼ中性のPH値でサツカロース結晶上澄み中
のラフイノースを工業的に使用可能な温度で分解
することができた。この酵素は、補助因子例えば
Mn−イオン及びADNを必要とせず、安定であ
り、慣用方法で例えばブロムシアン活性化された
不溶のポリサツカライド上への作用により担体に
固定させることができた。単離された酵素の代り
に、微生物そのものも適当な担体上に固定され、
この形で工業的に使用することもできる。この場
合ペルミアーゼ−遺伝子欠失の結果、ラフイノー
スに対して不適性にされた細胞膜を固定化工程に
より再びラフイノースに対して適性にする。この
場合、慣用の固定化法が好適である。 新規の微生物からこのα−ガラクトシダーゼを
単離することはα−ガラクトシダーゼの取得に慣
用の方法で行なうことができる。有利な方法は、
常法で例えば高圧分散、超音波処理等によるバイ
オマスの崩壊よりなる。当初微生物に関して好適
な崩壊法を使用するのが有利である。 この崩壊の後に、α−ガラクトシダーゼが通例
上澄み中に残るポリアニオン沈殿法を実施するの
が有利である。ポリアニオンとしては、ポリエチ
レンイミン殊に中程度の分子量のポリエチレンイ
ミンが有利である。 こうして得た沈殿から、硫酸アンモニウムを用
いて酵素を沈殿させることができ、この際、有利
に硫酸アンモニウムの0.8〜1.6Mのフラクシヨン
が得られる。透析及び凍結乾燥により、高収率
で、90％より高い純度の工業的使用に好適なα−
ガラクトシダーゼ調整物が得られる。 ベクターとしてのプラスミドpBR322及び形質
転換可能な細胞としてのE.コリーBMTU2093を
使用して、前記の方法で、新規の微生物E.コリ
ーBMTU2742、DSM2091が得られ、これも同様
に本発明の目的物である。 この新規微生物は、次の特性を有する： これはプラスミドpBT102を含有し、アンピシ
リン５μｇ／mlに抵抗し、補助因子を必要としな
い細胞内α−ガラクトシダーゼを生産するが本質
的にインベルターゼを生産しない。その他に関し
て、これはE.コリーＫ−12−株とは異ならず、
37℃で標準培地中で有利に通気下に培養すること
ができる。 本発明方法で得られる、α−ガラクトシダーゼ
の高含分により前記の特に有利な特性を示す（可
溶性プロテイン全量の30％までがα−ガラクトシ
ダーゼより成つていてよい）新規微生物は、その
新規特性を他の微生物に伝達することができる。
これにより得られる微生物も同様に本発明の目的
物である。 この伝達の可能性は例えば、本発明の方法で得
られた微生物を受容微生物と一緒に培養例えば寒
天上でインキユベートすることよりなる。例えば
本発明方法の第２形質転換工程に、プラスミド
RP4を含有するE.コリー株（J.Bacteriol108巻
1244〜1249頁（1971年）参照）を使用すると、
RP4と共にハイブリツドベクター例えばpBT103
を含有する（即ち２個のプラスミドを有する）微
生物が生じる。この微生物はシユードモナス−菌
株pBT103と共に培養することにより容易に後者
菌株に伝達する。 この方法にその都度使用される形質転換可能な
形の微生物いわゆる反応性菌株は、当業者にとつ
て公知の方法で得られる。培養を指数増殖期の終
りまで行なうのが有利である。次いで細胞を単離
し、氷冷塩化カルシウム溶液中に懸濁させる。こ
の形で、これはDNAを収容する能力がある。 E.コリーの使用の際に培養のための培地とし
て、有利に、メルク社（Firma Merck、
Darmstadt）のいわゆるスタンダード−栄養ブ
イヨン（Standard−Ｎａ¨hrbouillon）を使用す
る。 本発明によれば、高活性の酵素α−ガラクトシ
ダーゼを形成するが同時にはインベルターゼを生
じない微生物の製法が得られる。こうして、例え
ばサトウダイコン糖からの糖結晶化の際のラフイ
ノース又は他のα−ガラクトシダーゼ分解性の結
合糖の解裂のために、従来公知のα−ガラクトシ
ダーゼ製剤よりも好適であるα−ガラクトシダー
ゼ源が得られる。これにより、大規模な、サトウ
ダイコン−製糖時のラフイノース増加の問題を経
済的に解決することが可能である。本発明による
微生物又はこれから得られる未精製又は精製され
たα−ガラクトシダーゼ調製物は、α−ガラクト
シダーゼ分解性炭化水素の解裂が望ましい食料品
工業における他の目的にも使用できる。この例
は、大豆粉からのスタキオースの除去である。こ
の除去は、大豆粉を食料品として使用可能にする
場合に必要である。 次に実施例につき本発明を説明する： 例 １ 菌株エセリシア・コリー（Escherichia coli）
BMTU2743、DSM2092（これは、α−ガラクト
シダーゼ遺伝子を含有するDNA−断片（P1raf）
を有する）から、次の方法により、α−ガラクト
シダーゼに関する高い生産性を有する新規菌株を
製造する。 (1) E.コリー リゼートからのraf−オペロンに
関する遺伝情報を有するP1raf DNAの製造 E.コリーＫ−12（BMTU2744、DSM2093）
から誘導された菌株エセリシア・コリー
BMTU2743（thr-、Leu-、thi-、LacY、
tonA、raf+、P1ts−溶原菌）を、30℃で振動
下に、栄養ブイヨン（トリプトン１％、酵母エ
キス0.5％、グルコース0.2％及びNaCl0.5％を
含有し、PH7.8に調節した）１中で４時間培
養し、0.5OD650の光学密度（650nｍで測定）に
達したら、温度敏感なフアージリプレツサーの
加熱誘発のために40℃で更に２時間振動させ
る。 培養液上澄みから、遊離したフアージをポリ
エチレングリコールでの沈殿により取得し、塩
化セシウム−密度勾配法により精製する。フエ
ノール抽出及び緩衝液（10ｍＭトリス・HCl、
PH8.0）に対する透析の後に、精製されたフア
ージDNA0.6mgが得られる。 (2) ベクターDNAの製造 P1raf DNAのフラグメントのクローン化の
ために、プラスミドDNApBR322のDNAを、識
別遺伝子（マーカー）としてのアンピシリン−
及びテトラサイクリン−耐性遺伝子を有するベ
クターに使用する。市場で入手されるプラスミ
ドを使用するか又はこれを次の方法で製造す
る： プラスミドpBR322を有するエセリシア・コ
リー菌株を(1)に記載と同じ組成の栄養ブイヨン
１中、37℃で振動下に指数増殖期の終りまで
培養する。次いで、クロラムフエニコール150
μｇ／mlの添加の後に、同じ温度で更に15分間
振動させる。この方法によりプラスミドDNA
は有利に複製され、細菌中で増加される。引続
き、細菌細胞を得、リソチーム及び非イオン性
界面活性剤を用いて溶解させ、この溶解物を
48000ｇで30分間遠心分離させて、上澄み液を
取得する。次に、これから２回の塩化セシウム
−臭化エチジウム−平衡密度勾配遠心、引続く
フエノール抽出及び緩衝液（10ｍＭトリス・
HCl、PH8.0）に対する透析により、プラスミ
ド−DNA420μｇが得られる。 (3) P1rafからのraf−オペロンをベクター中へ挿
入 P1raf DNA及びベクターDNA各10μｇを、
DNA分子を完全に解裂させるために、37℃
で、制限酵素salで１時間処理し、次いで、
それぞれ５分間65℃まで加熱する。 その後、このP1raf DNAを0.7％アガロース
ゲル中で電気泳動により分別する。相対分子量
４メガダルトンを有するフラグメントが切り出
され、フエノール抽出及び緩衝液（10ｍＭトリ
ス・HCl、PH8.0）中での透析の後に溶液中に
得られる。 こうして得たP1raf DNAのフラグメントの
溶液を、解裂されたpBR322−ベクターDNAの
溶液と混合し、ATP、ジチオエリスリツト及
び塩化マグネシウムの添加のもとに、40℃で、
T4−フアージのDNA−リガーゼを24時間作用
させる。こうして得た溶液は組換型DNAを含
有する。 (4) α−ガラクトシダーゼに関する遺伝子情報を
有する組換型DNAを用いるE.コリー細菌の遺
伝的形質転換 通常のE.コリー菌株（BMTU2744、
DSM2093）を振動下に、栄養ブイヨン50ml
中、37℃で、指数増殖期の終りまで培養する。
細胞を取得し、これを氷浴中の50ｍMCaCl2溶
液中に懸濁させる。 この懸濁液を(3)工程からの組換型DNAの溶
液と混合し、氷浴中で20分間保持し、次いで、
３分間37℃に加温する。細胞を栄養ブイヨン中
に移殖し、37℃で45分間振動させて形質転換反
応を終了させる。細胞を取得し、洗浄しかつ再
び懸濁させる。少量の細胞懸濁液を寒天プレー
ト（１当りK2HPO410.5ｇ、KH2PO44.5ｇ
（NH4）2SO41ｇ、クエン酸ナトリウム×
2H2O0.5ｇ、MgSO4×7H2O0.1ｇ、チアミン１
mg、ラフイノース２ｇ、アンピシリン25mg及び
寒天15ｇを含有し、PH値は7.2に調節されてい
る）上に塗布する。このプレートを37℃で温置
する。２日間温置の後に、多数のコロニーがプ
レート上に現われる。すべてのコロニーを取り
出し、精製し、単離する。 こうして得た各コロニーは、唯一Ｃ−源とし
てのラフイノースを利用する能力を有し、同時
にアンピシリン耐性である。従つて、これは、
宿主微生物として用いた菌株のそれとは異なる
特性を有する。このことは、P1rafからのsal
フラグメントにα−ガラクトシダーゼ遺伝子を
挿入したpBR322−プラスミドを有する生長性
コロニーとしての細胞のみを選択することを意
味する。 得られたコロニーから、それぞれ、プラスミ
ドDNAを(2)に記載の方法で単離する。全コロ
ニーとしてのプラスミドは、制限酵素EcoRI及
びHindでの処理及びアガロースゲル中での
電気泳動による分析の後に、ハイブリツドプラ
スミドの起源コロニーに応じて２種の異なる寸
法の群に分けることができるが合計では同じで
ある２フラグメントを示す。 即ち、４メガダルトンの大きさのフラグメン
ト（(3)で製造）がプラスミドpBR322中に、時
計廻り方向でも時計廻りと反対の方向でも導入
されるので、異なる寸法（大きい及び小さい）
群の２種のフラグメントが生じる。これによ
り、そのEcoRもしくはTind切断部位がそ
れぞれ他の位置にある２種の異なるプラスミド
が生じる。従つて、EcoRもしくはHindで
の切断時に異なる寸法群の２種のフラグメント
が生じる。 双方の寸法の群は約１：１の割合で見い出さ
れる。双方のフラグメント−寸法群に関する異
なる分析結果は、pBR322中のP1rafからのsal
フラグメントの異なる挿入方向に帰因する。 更に操作するために、制限酵素EcoR又は
Hindでの処理により他のコロニーのプラス
ミドよりも小さい第２のフラグメントを生じる
コロニーのプラスミドを選択する。このプラス
ミドはpBT100（BMTU2741、DSM2090、分子
量約6.8Md）と称される。このプラスミドを有
する細菌は、唯一Ｃ−源としてのラフイノース
を利用し、Raf−オペロンのすべての酵素を本
質的に生産することができる。 (5) BMTU2471（DSM2090）からのpBT100の
DNA各10mgを制限酵素Hind又は制限酵素
EcoRで37℃で１時間処理して、DNA分子を
解裂させる。次に各々５分間65℃まで加熱す
る。 このように処理したプラスミド−DNA溶液
を稀釈し、それぞれ(3)に記載のようにT4−リ
ガーゼで再生処理する。 引続き、(4)に記載のE.コリー菌株の反応性
細胞に、それぞれ最終工程からの再生DNAの
溶液を形質転換反応に導びく。それぞれこのよ
うに処理した細胞の少部分を、アンピシリン25
μｇ／mlを有するマツク・コンケイ・ラフイノ
ース・プレート（Mac Conkey Raffinose
Platte；Difco Laboratories、Detroit）上に塗
布する。予めHindで処理したプラスミド−
DNAでの形質転換のプレート上に37℃で24時
間温置の後に約20のコロニーが認められ、予め
EcoRで処理したDNAの形質転換のプレート
上には、同じ条件下に30のコロニーが存在す
る。赤色コロニーと白色コロニーの割合は前者
では１：４、後者では１：３である。 赤色コロニーは、それぞれラフイノース分解
可能であり、相変らず全raf−オペロンを有
し、白色細胞は、すべてラフイノース分解可能
ではない。しかしながら、これらは、細胞を予
めラフイノース−添加せずに栄養ブイヨン中
に、37℃で定常相になるまで温置する際に、色
基質としてのｐ−ニトロフエニル−α−ガラク
トシド（α−PNPG）を用いる細胞不含の抽出
物中の試験が示すように、相変らず本質的に酵
素α−ガラクトシダーゼを生産する。しかしな
がら、これらの細胞は、宿主微生物又は
pBT100で形質転換されている細胞BMTU2741
（DSM2090）の特性とは異なる特性を有する。 pBT100の前記Hind処理の後に、マツク・
コンケイ・プレート上の白色コロニー中に得ら
れるプラスミドをpBT101（分子量約4.8Md）
と称し、前記のEcoR反応で得られるものを
pBT102（分子量約4.5Md）と称する。pBT102
を有するE.コリー菌株をBMTU2742
（DSM2091）と称する。 (6) pBT102を有する菌株（BMTU2742）からの
α−ガラクトシダーゼの取得 第１表は、細胞不含の抽出物の、(5)の工程で
得られるクローンである菌株BMTU2742の25
℃での培養の後のα−PNPGを有するα−ガラ
クトシダーゼの含分に関する実験結果を示す。
細胞を100mlフラスコ中の栄養ブイヨン10ml中
に接種し、30℃で15時間振動させる。対照実験
は、同じ条件であるが培地にラフイノース0.2
％を添加して、出発菌株BMTU2743を培養し
て実施する。 第１表から認められるように、菌株
BMTU2742の抽出物はBMTU2743と比べて極
めて高いα−ガラクトシダーゼ含分を示した。
【表】
＊ 粗抽出物中の可溶性プロテインのmg
この試験条件下で、公知の菌株E.コリー
BMTU2744では＜0.001μ／mgの活性が認められ
る。 例 ２ 例１(1)の記載と同様にして、E.コリー
BMTU2481（DSM2101）から、フアージを単離
させ、例１(3)の記載と同様にEcoRを用いて解
裂させる。こうして得た調製物はα−ガラクトシ
ダーゼに関する遺伝情報を有するDNA源として
役立つ。 ベクターDNAの製造のために、E.コリー
BMTU2745（DSM2100）から例１(2)の記載と同
様にしてプラスミドpKT230のDNAを得るが、細
胞を、通気下に37℃で、クロラムフエニコールが
添加されている栄養ブイヨン中で、１夜にわたり
培養した。 得られたプラスミドDNAを例１(3)の記載と同
様にEcoRを用いて解裂させた。 ４メガダルトンの大きさのフアージフラグメン
トの単離及びこのフラグメントと解裂された
pKT230DNAとの混和は例１(3)の記載と同様にし
て行なつた。 こうして得た組換型DNAの溶液をE.コリー
BMTU2602（DSM2102）中に、例１(4)の記載と
同様にして伝達させる。カナマイシン25μｇ／ml
を含有する寒天−プレート上で選択を行なう。カ
ナマイシンに対して耐性のコロニー約40個が得ら
れ、これをストレプトマイシン敏感性（50μｇ／
ml）に関して試験する。ストレプトマイシン敏感
性のコロニー約20個が認められるが、これらはな
お、ストレプトマイシン20μｇに対しては耐性で
ある。例１の記載と同様に単離されたコロニー中
でα−ガラクトシダーゼの形成が立証される。こ
うして得たカナマイシン耐性、低いストレプトマ
イシン耐性及びα−ガラクトシダーゼ−生産性に
関して出発菌株BMTU2602（DSM2102）とは異
なる新規菌株E.コリーBMTU2746（DSM2103）
は、後者に関する点を除きその他の点は同様であ
る。この新規菌株の細胞は、生じたα−ガラクト
シダーゼの検出により立証されるα−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を有するプラスミドpBT103（分子
量約11.8Md）を含有する。 BMTU2746（DSM2103）からのpBT103をシユ
ードモナス・プチダBMTU2749（DSM2106）に
伝達させるために、まず、菌株BMTU2746
（DSM2103）及びBMTU2747（DSM2104）（後者
は形質転換可能なプラスミドRP4を有する）の対
数期増殖する細菌の細胞を混合し、ストレプトマ
イシン20μｇ／ml及びテトラサイクリン20μｇ／
mlまでを含有するスタンダード−寒天プレート
（Fa.Merck、Darmstadt）上で平面培養する。37
℃で温置の後にコロニー約50個が生長する。コロ
ニー１個を単離する。相応する抗生物質含分を有
するプレート上に塗布することにより、この新規
菌株BMTU2748（DSM2105）は、ストレプトマ
イシン20μｇ／ml、カナマイシン26μｇ／ml、テ
トラサイクリン20μｇ／ml及びアンピシリン50μ
ｇ／mlに対して抵抗することが立証される。前記
の菌株は、生じるα−ガラクトシダーゼの検出に
より立証されるプラスミドRP4及びpBT103を有
する。 BMTU2748（DSM2105）からのプラスミド
pBT103をシユードモナス・プチダBMTU2749
（DSM2106）に伝達することは、双方の菌株の対
数期増殖培養液を混合し、混合物をスタンダード
寒天プレート（Fa.Merck、Darmstadt）上、
30℃で24時間温置し、引続き、細胞を滅菌培養ブ
イヨン上に懸濁させ、選択的栄養ブイヨンスタン
ダード（これはカナマイシン100μｇ／ml及び
クロラムフエニコール25μｇ／mlを含有する）を
有する寒天プレート上で平面培養することにより
行なう。２日後に20コロニーが生長し、これを精
製すると、テトラサイクリン敏感であり、α−ガ
ラクトシダーゼ−遺伝子を含有するプラスミド
pBT103を有するシユードモナス・プチダとして
同定される（BMTU2750、DSM2107）。α−ガラ
クトシダーゼ検出は、例１に記載と同様にして行
なう。 例 ３ 製造工場の結晶化廃液中のラフイノースの分解 ラフイノース802mgを含有する廃液45mlを水45
mlで稀釈した。この溶液をPH6.5に調節した。こ
の溶液を、並行実験で細胞不含の抽出物及び本発
明による菌株E.コリーDSM2091のトルオール処
理した細胞と共にインキユベートし、この際抽出
物もしくは処理した細胞はα−ガラクトシダーゼ
各57単位を含有した。 混合物を40℃で60分、120分及び180分放置し
た。前記の時間に、溶液のガラクトース含分を酵
素試験により測定し、バツチ中のラフイノース残
量を計算した。 所定の処理時間の後に、当初ラフイノース含分
に対して57.2、47.1及び39.2％までの抵下に相応
して459、378及び315mgのラフイノース残量が認
められた。次の第２表に得られた結果をまとめ
た。
この試験条件下で、公知の菌株E.コリー
BMTU2744では＜0.001μ／mgの活性が認められ
る。 例 ２ 例１(1)の記載と同様にして、E.コリー
BMTU2481（DSM2101）から、フアージを単離
させ、例１(3)の記載と同様にEcoRを用いて解
裂させる。こうして得た調製物はα−ガラクトシ
ダーゼに関する遺伝情報を有するDNA源として
役立つ。 ベクターDNAの製造のために、E.コリー
BMTU2745（DSM2100）から例１(2)の記載と同
様にしてプラスミドpKT230のDNAを得るが、細
胞を、通気下に37℃で、クロラムフエニコールが
添加されている栄養ブイヨン中で、１夜にわたり
培養した。 得られたプラスミドDNAを例１(3)の記載と同
様にEcoRを用いて解裂させた。 ４メガダルトンの大きさのフアージフラグメン
トの単離及びこのフラグメントと解裂された
pKT230DNAとの混和は例１(3)の記載と同様にし
て行なつた。 こうして得た組換型DNAの溶液をE.コリー
BMTU2602（DSM2102）中に、例１(4)の記載と
同様にして伝達させる。カナマイシン25μｇ／ml
を含有する寒天−プレート上で選択を行なう。カ
ナマイシンに対して耐性のコロニー約40個が得ら
れ、これをストレプトマイシン敏感性（50μｇ／
ml）に関して試験する。ストレプトマイシン敏感
性のコロニー約20個が認められるが、これらはな
お、ストレプトマイシン20μｇに対しては耐性で
ある。例１の記載と同様に単離されたコロニー中
でα−ガラクトシダーゼの形成が立証される。こ
うして得たカナマイシン耐性、低いストレプトマ
イシン耐性及びα−ガラクトシダーゼ−生産性に
関して出発菌株BMTU2602（DSM2102）とは異
なる新規菌株E.コリーBMTU2746（DSM2103）
は、後者に関する点を除きその他の点は同様であ
る。この新規菌株の細胞は、生じたα−ガラクト
シダーゼの検出により立証されるα−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を有するプラスミドpBT103（分子
量約11.8Md）を含有する。 BMTU2746（DSM2103）からのpBT103をシユ
ードモナス・プチダBMTU2749（DSM2106）に
伝達させるために、まず、菌株BMTU2746
（DSM2103）及びBMTU2747（DSM2104）（後者
は形質転換可能なプラスミドRP4を有する）の対
数期増殖する細菌の細胞を混合し、ストレプトマ
イシン20μｇ／ml及びテトラサイクリン20μｇ／
mlまでを含有するスタンダード−寒天プレート
（Fa.Merck、Darmstadt）上で平面培養する。37
℃で温置の後にコロニー約50個が生長する。コロ
ニー１個を単離する。相応する抗生物質含分を有
するプレート上に塗布することにより、この新規
菌株BMTU2748（DSM2105）は、ストレプトマ
イシン20μｇ／ml、カナマイシン26μｇ／ml、テ
トラサイクリン20μｇ／ml及びアンピシリン50μ
ｇ／mlに対して抵抗することが立証される。前記
の菌株は、生じるα−ガラクトシダーゼの検出に
より立証されるプラスミドRP4及びpBT103を有
する。 BMTU2748（DSM2105）からのプラスミド
pBT103をシユードモナス・プチダBMTU2749
（DSM2106）に伝達することは、双方の菌株の対
数期増殖培養液を混合し、混合物をスタンダード
寒天プレート（Fa.Merck、Darmstadt）上、
30℃で24時間温置し、引続き、細胞を滅菌培養ブ
イヨン上に懸濁させ、選択的栄養ブイヨンスタン
ダード（これはカナマイシン100μｇ／ml及び
クロラムフエニコール25μｇ／mlを含有する）を
有する寒天プレート上で平面培養することにより
行なう。２日後に20コロニーが生長し、これを精
製すると、テトラサイクリン敏感であり、α−ガ
ラクトシダーゼ−遺伝子を含有するプラスミド
pBT103を有するシユードモナス・プチダとして
同定される（BMTU2750、DSM2107）。α−ガラ
クトシダーゼ検出は、例１に記載と同様にして行
なう。 例 ３ 製造工場の結晶化廃液中のラフイノースの分解 ラフイノース802mgを含有する廃液45mlを水45
mlで稀釈した。この溶液をPH6.5に調節した。こ
の溶液を、並行実験で細胞不含の抽出物及び本発
明による菌株E.コリーDSM2091のトルオール処
理した細胞と共にインキユベートし、この際抽出
物もしくは処理した細胞はα−ガラクトシダーゼ
各57単位を含有した。 混合物を40℃で60分、120分及び180分放置し
た。前記の時間に、溶液のガラクトース含分を酵
素試験により測定し、バツチ中のラフイノース残
量を計算した。 所定の処理時間の後に、当初ラフイノース含分
に対して57.2、47.1及び39.2％までの抵下に相応
して459、378及び315mgのラフイノース残量が認
められた。次の第２表に得られた結果をまとめ
た。
【表】
例 ４（参考例）
シユードモナス中でのα−ガラクトシダーゼの
出現 ４(a) 例１の(1)〜(4)によりpBT100を製造する。
このプラスミドpBT100のDNA10μｇを制限エ
ンドヌクレアーゼEcoRを用いて、37℃まで
の温度で１時間処理して、DNA−分子を解裂
させる。次いで、それぞれ５分間65℃まで加熱
する。大きいフラグメントを、例１(3)に記載と
同様にして単離する、 プラスミドpRSF1010を同様にECoRで解
裂させる（pRSF1010は、pKT230から得ら
れ、この際、pKT230をBMTU2745
（DSM2100）から単離し、pstで解裂させ、
稀釈再継合させ（religiert）、E.コリー中に移
す。ストレプトマイシン50μｇ／mlを含有する
培地上で生長するがアンピシリン50μｇ／mlに
対しては抵抗しないこのコロニーは、所望プラ
スミドを含有する）。このように処理したプラ
スミド−DNA−量を、例１(3)に記載のように
T4−リガーゼで継合させる。 引続き、例１(4)の記載と同様に、E.コリー
菌株の感応細胞をリガーゼ反応
（Ligierungsreaktion）の最終工程からの継合
されたDNAの溶液に供給する。このように処
理された細胞の小さい部分をマツク・コンキ
イ・ラフイノース・プレート（Mac Conkey
Raffi nose Platte）上に、ストレプトマイシン
20μｇ／mlと共に塗布する。この形質転換から
のプレート上で、37℃で24時間の恒温保持の後
に約50のコロニーが認識可能になる。赤色対白
色コロニーの割合は約１：10である。赤色コロ
ニーは、それぞれラフイノース分解可能であ
り、なお全raf−オペロンをも含有する。白色
細胞は、すべてがラフイノース−分解可能では
ない。これらから、ストレプトマイシン50μ
ｇ／mlに対して抵抗を有しないものを選択す
る。これらは、なお本質的に、細胞不含の抽出
物中での呈色基質としてのｐ−ニトロフエニル
−α−ガラクトシドを用いる試験において示さ
れるように、酵素α−ガラクトシダーゼを産生
する（例１(5)参照）。これら細胞は、アンピシ
リン50μｇ／mlに対しても抵抗し、従つて、
pBT100又はpRSF100のみを含有する出発菌株
とは異なる特性を有する。E.コリー及びシユ
ードモナスを得るために同様に好適なベクター
プラスミドpRSF1010の使用により、こうして
得たプラスミドは、E.コリーからのその単離
の後にシユードモナス細胞中に移すか又は変換
動員（transfermobilisieren）することができ
る。 ４(b) ４(a)に記載のように、形質転換のために、
感応シユードモナス・プチダ細胞を使用するこ
ともできる。しかしながら、公知のシユードモ
ナス・プチダは、マツク・コンキイ培地上で生
長させることはできないので、この形質転換さ
れた細胞を、例１(1)による栄養ブイヨンプレー
ト上に、ストレプトマイシン50μｇ／mlの添加
のもとに塗布し、30℃で培養する。単離物を、
択一的糖源としてのラフイノース又はグルコー
スを添加した例１(4)におけると同様な培地を有
するプレート上に移すことにより、炭素源とし
てのラフイノースを利用することのできる又は
できない従つてグルコース上での生長が指示さ
れるコロニーが区別される。ストレプトマイシ
ン50μｇ／mlに耐えるがストレプトマイシン
500μｇ／mlには抵抗せず、ラフイノースを利
用することのできないコロニー（シユードモナ
ス中のpRSF1010により仲介されるストレプト
マイシン抵抗は、それぞれE.コリー中の
pRSF100により仲介されるものよりも大き
い）は、α−ガラクトシダーゼ産生性である
が、ストレプトマイシンに対する同じ抵抗を有
するラフイノース利用性コロニーとは反対に、
総raf−オペロンを含有しない。同時に、すべ
てのコロニーは、少なくともアンピシリン50μ
ｇ／mlに対して抵抗する。 従つて、この特性のシユードモナス・プチダ
コロニーは、pRSF1010のみ又はpRSF1010を
総raf−オペロンと共に含有するシユードモナ
ス・プチダコロニーとは異なる。 このことは、シユードモナス・プチダ細胞
が、このＥ・コリー遺伝子を有効に表現するこ
とができることを示している。 例 ５（参考例） バシルス・スブチリス中でのα−ガラクトシダ
ーゼの出現 例４と同様にしてα−ガラクトシダーゼ産生性
バシルス・スブチリス菌株を取得する。バシル
ス・スブチリスに対して好適なベクタープラスミ
ドとして、リガーゼ反応で、市販のプラスミド
pUB110（これはEcoRにより線状化されうる）
を使用する。これは、細胞にコナマイシン
（Konamycin）20μｇ／mlに対する抵抗を伝達す
るコナマイシン抵抗遺伝子を有する。EcoR−
解裂及び大フラグメントの単離により得られる
pBT100からのDNA−フラグメントを、継合によ
りEcoRで解裂されたpUB110DNAと結合させ
る。この継合バツチをバシルス・スブチリス細胞
中に移す。このように処理された感応細胞は、コ
ナマイシン25μｇ／mlを有する栄養培地上で得ら
れる。この形質転換物のアンピシリン抵抗細胞
は、糖源としてのラフイノース又はグルコースを
添加した例１(4)による培地上に移し、ラフイノー
スを利用しないがグルコースを利用することので
きるものを選択する。ラフイノースを利用しない
がアンピシリン及びコナマイシン抵抗性である細
胞は、例１(5)によるように、細胞不含の抽出物中
のｐ−ナフチル−α−ガラクトシドを用いて立証
できるような構成性ガラクトシダーゼを産生す
る。 このことは、バルシス・スブチリス−細胞が、
このE.コリー遺伝子を表現することができるこ
とを示している。 例 ６（参考例） 他の出発菌株からのインベルターゼ不含のα−
ガラクトシダーゼの出現 E.コリーBMTU2743からの代りに、E.コリー
D1021又はD1022又はSF711（Schmid und
Schmitt Eur.J.Biochem.67、95〜104、1976；
Orskov and Orskov、J.Bacterid91、69〜75、
1973；Shipley等によるInfect.Immun.20、559〜
566、1978）からも、プラスミドDNAが得られ、
これから、制限酵素Salを用いる解裂の後に、
約4Mdの大きさのフラグメントを分取することが
できる。これを例１の記載と同様にSal中で切
断されたpBR322を継合させると、pBT100類縁
プラスミド−担持細胞が得られる。これから、例
１(4)と同様に、EcoR又はHindでのプラスミ
ド−DNAの解裂により新規プラスミドが、再継
合及び形質転換、並びにアンピシリン抵抗性であ
るラフイノース不利用性細胞に対する選択の後に
新規種類のプラスミドを得ることができる。この
ようなプラスミドを含有する細胞は構成性α−ガ
ラクトシダーゼを産生するがインベルターゼを産
生しない。
出現 ４(a) 例１の(1)〜(4)によりpBT100を製造する。
このプラスミドpBT100のDNA10μｇを制限エ
ンドヌクレアーゼEcoRを用いて、37℃まで
の温度で１時間処理して、DNA−分子を解裂
させる。次いで、それぞれ５分間65℃まで加熱
する。大きいフラグメントを、例１(3)に記載と
同様にして単離する、 プラスミドpRSF1010を同様にECoRで解
裂させる（pRSF1010は、pKT230から得ら
れ、この際、pKT230をBMTU2745
（DSM2100）から単離し、pstで解裂させ、
稀釈再継合させ（religiert）、E.コリー中に移
す。ストレプトマイシン50μｇ／mlを含有する
培地上で生長するがアンピシリン50μｇ／mlに
対しては抵抗しないこのコロニーは、所望プラ
スミドを含有する）。このように処理したプラ
スミド−DNA−量を、例１(3)に記載のように
T4−リガーゼで継合させる。 引続き、例１(4)の記載と同様に、E.コリー
菌株の感応細胞をリガーゼ反応
（Ligierungsreaktion）の最終工程からの継合
されたDNAの溶液に供給する。このように処
理された細胞の小さい部分をマツク・コンキ
イ・ラフイノース・プレート（Mac Conkey
Raffi nose Platte）上に、ストレプトマイシン
20μｇ／mlと共に塗布する。この形質転換から
のプレート上で、37℃で24時間の恒温保持の後
に約50のコロニーが認識可能になる。赤色対白
色コロニーの割合は約１：10である。赤色コロ
ニーは、それぞれラフイノース分解可能であ
り、なお全raf−オペロンをも含有する。白色
細胞は、すべてがラフイノース−分解可能では
ない。これらから、ストレプトマイシン50μ
ｇ／mlに対して抵抗を有しないものを選択す
る。これらは、なお本質的に、細胞不含の抽出
物中での呈色基質としてのｐ−ニトロフエニル
−α−ガラクトシドを用いる試験において示さ
れるように、酵素α−ガラクトシダーゼを産生
する（例１(5)参照）。これら細胞は、アンピシ
リン50μｇ／mlに対しても抵抗し、従つて、
pBT100又はpRSF100のみを含有する出発菌株
とは異なる特性を有する。E.コリー及びシユ
ードモナスを得るために同様に好適なベクター
プラスミドpRSF1010の使用により、こうして
得たプラスミドは、E.コリーからのその単離
の後にシユードモナス細胞中に移すか又は変換
動員（transfermobilisieren）することができ
る。 ４(b) ４(a)に記載のように、形質転換のために、
感応シユードモナス・プチダ細胞を使用するこ
ともできる。しかしながら、公知のシユードモ
ナス・プチダは、マツク・コンキイ培地上で生
長させることはできないので、この形質転換さ
れた細胞を、例１(1)による栄養ブイヨンプレー
ト上に、ストレプトマイシン50μｇ／mlの添加
のもとに塗布し、30℃で培養する。単離物を、
択一的糖源としてのラフイノース又はグルコー
スを添加した例１(4)におけると同様な培地を有
するプレート上に移すことにより、炭素源とし
てのラフイノースを利用することのできる又は
できない従つてグルコース上での生長が指示さ
れるコロニーが区別される。ストレプトマイシ
ン50μｇ／mlに耐えるがストレプトマイシン
500μｇ／mlには抵抗せず、ラフイノースを利
用することのできないコロニー（シユードモナ
ス中のpRSF1010により仲介されるストレプト
マイシン抵抗は、それぞれE.コリー中の
pRSF100により仲介されるものよりも大き
い）は、α−ガラクトシダーゼ産生性である
が、ストレプトマイシンに対する同じ抵抗を有
するラフイノース利用性コロニーとは反対に、
総raf−オペロンを含有しない。同時に、すべ
てのコロニーは、少なくともアンピシリン50μ
ｇ／mlに対して抵抗する。 従つて、この特性のシユードモナス・プチダ
コロニーは、pRSF1010のみ又はpRSF1010を
総raf−オペロンと共に含有するシユードモナ
ス・プチダコロニーとは異なる。 このことは、シユードモナス・プチダ細胞
が、このＥ・コリー遺伝子を有効に表現するこ
とができることを示している。 例 ５（参考例） バシルス・スブチリス中でのα−ガラクトシダ
ーゼの出現 例４と同様にしてα−ガラクトシダーゼ産生性
バシルス・スブチリス菌株を取得する。バシル
ス・スブチリスに対して好適なベクタープラスミ
ドとして、リガーゼ反応で、市販のプラスミド
pUB110（これはEcoRにより線状化されうる）
を使用する。これは、細胞にコナマイシン
（Konamycin）20μｇ／mlに対する抵抗を伝達す
るコナマイシン抵抗遺伝子を有する。EcoR−
解裂及び大フラグメントの単離により得られる
pBT100からのDNA−フラグメントを、継合によ
りEcoRで解裂されたpUB110DNAと結合させ
る。この継合バツチをバシルス・スブチリス細胞
中に移す。このように処理された感応細胞は、コ
ナマイシン25μｇ／mlを有する栄養培地上で得ら
れる。この形質転換物のアンピシリン抵抗細胞
は、糖源としてのラフイノース又はグルコースを
添加した例１(4)による培地上に移し、ラフイノー
スを利用しないがグルコースを利用することので
きるものを選択する。ラフイノースを利用しない
がアンピシリン及びコナマイシン抵抗性である細
胞は、例１(5)によるように、細胞不含の抽出物中
のｐ−ナフチル−α−ガラクトシドを用いて立証
できるような構成性ガラクトシダーゼを産生す
る。 このことは、バルシス・スブチリス−細胞が、
このE.コリー遺伝子を表現することができるこ
とを示している。 例 ６（参考例） 他の出発菌株からのインベルターゼ不含のα−
ガラクトシダーゼの出現 E.コリーBMTU2743からの代りに、E.コリー
D1021又はD1022又はSF711（Schmid und
Schmitt Eur.J.Biochem.67、95〜104、1976；
Orskov and Orskov、J.Bacterid91、69〜75、
1973；Shipley等によるInfect.Immun.20、559〜
566、1978）からも、プラスミドDNAが得られ、
これから、制限酵素Salを用いる解裂の後に、
約4Mdの大きさのフラグメントを分取することが
できる。これを例１の記載と同様にSal中で切
断されたpBR322を継合させると、pBT100類縁
プラスミド−担持細胞が得られる。これから、例
１(4)と同様に、EcoR又はHindでのプラスミ
ド−DNAの解裂により新規プラスミドが、再継
合及び形質転換、並びにアンピシリン抵抗性であ
るラフイノース不利用性細胞に対する選択の後に
新規種類のプラスミドを得ることができる。この
ようなプラスミドを含有する細胞は構成性α−ガ
ラクトシダーゼを産生するがインベルターゼを産
生しない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ α−ガラクトシダーゼ−遺伝子を有する
DNA並びに使用形質転換可能な細胞に対して好
適で、耐抗生物質遺伝子を有するベクターを、制
限酵素SalIにより完全に解裂させ、このα−ガラ
クトシダーゼ−遺伝子を有するDNAのフラグメ
ントから、約４メガダルトンの相対分子量を有す
る断片を取得し、同様にSalで解裂したベクタ
ーの溶液と混合し、DNA−リガーゼの存在で組
換えさせて組換型DNAを形成させ、得られる組
換型DNAを形質転換可能な細胞と共にインキユ
ベートして組換型DNAを細胞内に形質導入さ
せ、この形質転換された細胞を、ラフイノースを
唯一のＳ−源として含有する栄養培地上で培養
し、生じる耐抗生物質コロニーを単離し、溶解さ
せ、この溶解物から、プラスミド−DNAを単離
し、これを制限酵素Hind又はEco RIを用いて
解裂させ、得られる溶液を稀釈しかつDNA−リ
ガーゼで処理し、得られる再生プラスミドを改め
て本質的にインベルターゼを形成しない形質転換
可能な細胞中に入れ、この形質転換された細胞を
再びＣ−源としてのラフイノース並びに抗生物質
を含有する栄養培地上で培養し、生じるラフイノ
ースを利用しないコロニーを単離することにより
得られた、補助因子を必要としないα−ガラクト
シダーゼを形成するがインベルターゼを形成しな
い特性を有するE.コリー、シユードモナス・プ
チダ又はバチルス・スブチリス属の微生物。 ２ 本質的α−ガラクトシダーゼを形成するがイ
ンベルターゼを形成しない特性を有するE.コリ
ー、シユードモナス・プチダ又はバチルス・スブ
チリス属の微生物を製造するため、α−ガラクト
シダーゼ遺伝子を有するDNA並びに使用形質転
換可能な細胞に対して好適で、耐抗生物質遺伝子
を有するベクターを、制限酵素Salにより完全
に解裂させ、このα−ガラクトシダーゼ−遺伝子
を有するDNAのフラグメントから、約４メガダ
ルトンの相対分子量を有する断片を取得し、同様
にSalで解裂したベクターの溶液と混合し、
DNA−リガーゼの存在で組換えさせて組換型
DNAを形成させ、得られる組換型DNAを形質転
換可能な細胞と共にインキユーベートして組換型
DNAを細胞内に形質導入させ、この形質転換さ
れた細胞を、ラフイノースを唯一のＣ−源として
含有する栄養培地上で培養し、生じる耐抗生物質
コロニーを単離し、溶解させ、この溶解物から、
プラスミド−DNAを単離し、これを制限酵素
Hind又はEco RIを用いて解裂させ、得られる
溶液を稀釈しかつDNA−リガーゼで処理し、得
られる再生プラスミドを改めて、本質的にインベ
ルターゼを形成しない形質転換可能な細胞中に入
れ、この形質転換された細胞を再びＣ−源として
のラフイノース並びに抗生物質を含有する栄養培
地上で培養し、生じるラフイノースを利用しない
コロニーを単離することを特徴とする、微生物の
製法。 ３ α−ガラクトシダーゼ−遺伝子としてE.コ
リーDSM209からの遺伝子を使用する、特許請求
の範囲第２項記載の方法。 ４ 再生プラスミドでの第２形質転換のために、
形質転換可能な細胞としてE.コリー、シユード
モナス・プチダ又はバルシス・スブチリスを使用
する、特許請求の範囲第２項から第３項までのい
ずれか１項に記載の方法。 ５ 耐抗生物質遺伝子を有するベクターとしてプ
ラスミドpBR322を使用する、特許請求の範囲第
２項から第４項までのいづれか１項に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| DE19813122216 DE3122216A1 (de) | 1981-06-04 | 1981-06-04 | Verfahren zur herstellung eines mikroorganismus, welcher (alpha)-galactosidase, aber keine invertase bildet, so erhaltener mikroorganismus und seine verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57208985A JPS57208985A (en) | 1982-12-22 |
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