CS272753B2 - Method of alpha-galactosidase production - Google Patents
Method of alpha-galactosidase production Download PDFInfo
- Publication number
- CS272753B2 CS272753B2 CS363582A CS363582A CS272753B2 CS 272753 B2 CS272753 B2 CS 272753B2 CS 363582 A CS363582 A CS 363582A CS 363582 A CS363582 A CS 363582A CS 272753 B2 CS272753 B2 CS 272753B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- dna
- cells
- raffinose
- galactosidase
- alpha
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 title abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 title abstract description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 49
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 48
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 claims abstract description 47
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 47
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 claims abstract description 47
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000001573 invertase Substances 0.000 claims abstract description 12
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 claims description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 21
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 9
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 6
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 5
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- -1 fructose monosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 101100390711 Escherichia coli (strain K12) fhuA gene Proteins 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000283220 Odobenus rosmarus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 210000004916 vomit Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu výroby có-galaktosidázy kultivací mikroorganismu, který produkuje o^-galaktosidázu, avšak neprodukuje invertázu.
Extrakty z cukrové řepy obsahují kromě sacharozy malé množství rafinózy3 což je trisacharid, sestávající z monosacharidů galaktózy, glukózy a fruktózy. Tato rafinóza má tu nepříjemnou vlastnost, ža se hromadí nad krystalickým produktem a při množství vyšším než 1 % celkového cukru ztěžuje krystalizací. V každém cukrovaru se nachází denně v průběhu přibližně tříměsíční kampaně 5 až 10 tun rafinózy v matečném louhu po krystalizací. Jen v NSR je denní množství rafinózy více než 200 tun.
Převedeni rafinózy na sacharózu by bylo velmi hospodárné, protože toto množství nebylo až dosud možno dostatečně zpracovat, protože nebyla k dispozici technologie. Nejvýhodnější by bylo selektivní štěpení galaktózy z molekuly rafinózy tak, aby použité činidlo neštěpilo dále vznikající sacharózu. To nebylo až dosud chemickým způsobem možné.
Jsou známé enzymatické metody, při kterých se užívá přírodních enzymů, například -galaktosidázy. Tento erzym by měl odštěpit kvantitativně galaktózu z molekuly rafinózy. Všechny známé preparáty ^-galaktosidázy jsou však znečištěny enzymem invertázou, který štěpí sacharózu na glukózu a fruktózu. Vzhledem k vysoké koncentraci sacharózy v poměru k rafinóze, která se obvykle pohybuje v rozmezí 60 až 80:1, je i malé znečištěni oO-galaktosidázy invertázou velmi nepříjemné, protože dochází k rozštěpení velkého množství sacharozy, a tím i k nežádoucímu znečištění těmito cukry. Z tohoto důvodu nebylo možno štěpení c6-galaktosidázou použít v praxi.
Je nutno se zmínit o tom, že v případě οί-galaktosidáz, znečištěných invertázami, které byly až dosud technologicky použity, šlo především o enzymy z hub, které byly použity v technologii cukrů vzhledem ke své snadné přístupnosti. Tyto enzymy mají kromě znečištění ještě tu nevýhodu, že jako všechny enzymy z hub mají maximum účinnosti při poměrně kyselém pH, což působí při zpracování velkých množství, například v továrně, která zpracovává několik set m^/h za nutného okyselení a opětné neutralizaci velké problémy.
Je znám jediný typ <sG-galaktosidázy, která je po čištění prostá invertázy. Tato eě- -galaktosidáza však vyžaduje jako kofaktory ionty manganu a NAD a mimoto je málo stálá a nachází se v biologickém materiálu jen v nízké koncentraci. Z tohoto důvodu je použití tohoto typu o^-galaktosidázy v podmínkách kontinuálního provozu cukrovarů nemyslitelné.
Vynález si klade za úkol nalézt ^-galaktosidázu, která je přírodního původu a naprosto prostá invertázy. Kromě toho by měl enzym mít ještě následující vlastnosti:
Nejvyšší účinnost enzymu by měla být v blízkosti neutrální reakce, enzym by měl být stálý proti teplotě a v poměrně koncentrovaném roztoku cukru nebo rostlinného extraktu by měl mít dlouhou dobu působení, mimoto by nemělo být potřebné použití žádného kofaktoru.
Vynález vychází i toho, že při použití nové kombinace DNA by mělo být možné na jedné straně odstranit část genu, která je kódem pro enzym invertázy, a to ireversibilním způsobem, na druhé straně by mělo být možno tu část genu, která je kódem pro
CS 272 753 B2 ¢6 -galaktosidázu rozmnožit ve vhodném vektoru a změnou regulace takto získat požadovaný enzym, prostý invertázy v nejvyšší možné koncentraci. Žádoucí by bylo, aby byl použitelný již surový bakteriální extrakt nebo jeho imobilizovaná forma. Mělo by tedy jít o způsob, proveditelný při použití vhodného operonu a vhodné restrikční endunukleázy.
Předmětem vynálezu je způsob výroby o^-galaktosidázy kultivací mikroorganismů v živném prostředí s obsahem využitelných zdrojů uhlíku, dusíku a anorganických solí s následnou izolací a čištěním výsledného produktu, vyznačující se tím, že se ke zvýšení čistoty enzymu snížením obsahu invertázy izoluje z kmene Escherichia eoli DSM 2092 DNA s obsahem genu pro -galaktosidázu, tato DNA se rozštěpí endonukleázou Sal I za získáni frakce DNA s molekulovou hmotností přibližně 4 megajednotky s obsahem genu pro oL·-galaktosidázu, získaný fragment se inkubuje s vektorem pBR 322 po jeho rozštěpení restriktázou Sal I s obsahem genu pro odolnost proti ampicilinu, za přítomnosti DNAligázy fágu T4 za přítomnosti ATF, dithioerythritu a chloridu hořečnatého, získaná rekombinantní DNA se inkubuje s buňkami E. eoli, transformované buňky se pěstují na živých prostředcích s obsahem 2 až 10 g/1 rafinózy, vzniklé kolonie, odolné proti ampicilinu se izolují a rozruší, ze získaného materiálu se izoluje DNA plasmidu s molekulovou hmotností 6,9 až 12,4 megajednotek, tato DNA se rozštěpí restrikční endonukleázou Hind III a zpracuje působením DNA-ligázy, získané renaturované plasmidy pBT 102 se uvedou do suspenze s buňkami E. eoli, transformované buňky se znovu kultivují na živném prostředí s obsahem 2 až 10 g/1 rafinózy a ampicilinu, kolonie E. eoli, využívající rafinózu se izolují a získané klony mikroorganismů se pěstují.
Jako DNA, obsahující gen pro /3-galaktosidázu se s výhodou užije materiál z E. eoli MNTU 2743, DSM 2092 při pěstování tohoto kmene na vhodném živném prostředí při vyšší teplotě, s výhodou 37 až 4? °C po vysrážení polyetbylenglykolem a čištění například hustotním gradientem s extrakcí fenolu.
Štěpení DNA, obsahují gen pro oč-galaktosidázu i vektoru se provádí známým způsobem, působením restrikční endonukleázy Sal I, obvykle při teplotě 35 až 37 °C až do úplného rozštěpení molekuly DNA. Potom se endonukleáza denaturuje, obvykle zahřátím. Potom se frakcionují elektroforézou získané zlomky DNA, obsahující gen pro c^-galaktosidázu, a izoluje se fragment s relativní molekulovou hmotností přibližně 4 megadaltony.
Rekombinace tohoto zlomku s rozštěpeným vektorem nastává jednoduchým smísením roztoku s přísadou vhodné DNA ligázy. Výhodné je použití DNA ligázy fágu T4 (EC 5.9. 1.1), je však možno užít i ligázu jiného původu.
Tímto způsobem se získá rekombinanta DNA, která se běžným způsobem smísí s buňkami, schopnými transformace a se schopností přijmout DNA, čímž dochází k transformační reakci.
Jako buňky, schopné transformace, se užívají buňky nejrůznějšího původu. Příkladem vhodných buněk mohou být buňky E. eoli, ebsiella pneumoniae, Iseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiae a Bacillus substilis. Zvláště výhodné je použití E. eoli, například kmene BMTU 2744 DSM 2093.
CS 272 753 B2
Uvedené poznámky platí zejména pro první transformační stupeň způsobu podle vynálezu. Ve druhém transformačním stupni způsobu podle vynálezu se volí buňky, schopné transformace s ohledem na další vlastnosti těchto buněk, jako je použitelnost částí buněk po získání o6-galaktosidázy, růstové vlastnosti a dostupnost. Zvláště vhodnými buňkami pro druhý transformační stupeň jsou opět buňky E. eoli a Pseudomonas putida.
Volba vektoru závisí především na volbě buněk, schopných transformace. Při použití kmenů E. eoli jako buněk, schopných transformace se jako vektor s výhodou užije plasmid pBR-322, (DSBI 2089), který se běžně dodává a byl popsán v publikaci Nucl. Acid. Res. (1976) 5, 2723 až 2728.
Pro buňky Sacharomyces se jako vektor používá například plazmid pPLl, popsaný v publikaci Marcereau-Puijalon a další, Gene, sv. 11, 163 až 167 (1980). Pro buňky Bacillus substilis je zvláště vhodný jako vektor.plazmid pHB 23, popsaný v publikaci B. Miehel a další, Gen. sv. 12, 14-7 až 154- (1980). Pro všechny další svrchu uvedené mikroorganismy a také pro E. eoli je vhodný plazmid pBSE 1010. Totéž platí pro plazmid pKT 230, oba tyto plazmidy jsou popsány v publikaci Microbial Degradation of Xenobiotics and Recalcitrant Compounds Eds. Hutter und Leisinger, Acad. Press. (1981) Londýn) .
Z buněk, schopných transformace, padající v úvahu jsou výhodné ty, které samy neobsahují žádný plasmid, například shora uvedený kmen Ξ. eoli BMTU 2744- DSU 2093·
Pii provádění způsobu podle vynálezu se nejprve provádí štěpení DNA s obsahem genu pro oG-galaktosidázu působením Sal I a potom štěpení plazmidové DNA po první transformaci enzymem Hind III nebo Eco Rl, protože tyto restrikční endonukleázy odpovídají místům, obsaženým v DNA. Pro rekombinací zlomku o hmotnosti 4 megadaltony s rozštěpeným. vektorem je zásadně možno užít jakoukoli vhodnou DNA-ligázu. Výhodná je DNA ligáza fágu T4. Opětná vazba nastává smísením roztoků v přítomnosti adenosintrifosfátu, sulfhydrylové sloučeniny a hořečnatých iontů.
V případě, že má být stanoveno, které buňky obsahují vektor s obsahem genu pro <£ -galaktosidázu, je nutno provést pěstování na prostředí, které jako jediný zdroj uhlíku obsahuje rafínózu a mimoto obsahuje potřebné soli. Při použití vektoru s resistencí proti antibiotikům se přidává do živného prostředí ještě antibiotikum, proti kterému mají být buňky s obsahem vektoru odolné. Postupuje se například tak, že plazmid pBR 322 obsahuje gen pro odolnost proti ampicilinu a tetracyklinu, takže v tomto případě s výhodou včleňuje do živného prostředí jedno z těchto antibiotik, které potlačuje růst těch buněk, které po transformaci uvedený gén neobsahují. Jako prostředí se užije prostředí s minimálním množstvím živin, které kromě naprosto nezbytných solí obsahuje pouze rafínózu.
Štěpení takto získané hybridní plazmidové DNA působením enzymu Hind III nebo Eco Rl má za následek zničení sledu, který je kódem pro expresi rafinózopermeázy a invertázy. Při renaturaci působením DNA-ligázy se tímto způsobem získají vektory, které již neobsahují nežádoucí geny a je možno jich užit pro transformaci ve druhém stupni způsobu podle vynálezu, pro který jinak platí údaje, uvedené pro první stupeň.
Buňky, získané ve druhém transformačním stupni se podrobí selekci tak, že se pěstují na úplném živném prostředí s indikátorem pH a s obsahem rafinózy jako zdroje
CS 272 753 B2
- 4 uhlíku a odpovídajícího antibiotika. Úplné živné prostředí obsahuje kromě těchto látek ještě pepton a extrakt z kvasnic. Ty transformované buňky, ve kterých se vzhledem k předchozímu zpracování již nenachází gen pro rafinózopermeázu a pri invertázu, nemohou využívat rafinózu a z tohoto důvodu zůstává pH živného prostředí v neutrální oblasti a v prostředí tedy dochází ke změně zbarvení. Kolonie těchto buněk je tedy možno snadno odlišit od kolonií, ve kterých ke zničení genu nedošlo, které využívají rafinózu a produkují kyselinu na základ? odlišného zbarvení živného prostředí v okolí těchto kolonií vzhledem ke změně barvy indikátoru pH.
Protože takto zpracované buňky, které stále ješt? produkují oó-galaktosidázu, již neprodukují rafinózopermeázu, která rafinózu štěpí, vznikají kolonie, jejichž buňky již nevyužívají rafinózu. K odlišení kolonií, které obsahují nebo neobsahují gen pro rafinózopermeázu a invertázu je výhodné použití ploten podle Mac Conkeyho (Difco), tyto plotny obsahují neutrální červeň jako indikátor pH. Kolonie, využívající rafinózu, se zbarvuji červeně, kolonie, které rafinózu nevyužívají, zůstávají bílé.
Bílé kolonie se izolují a je možno je pěstovat způsobem, který odpovídá použitému výchozímu mikroorganismu.
Nové mikroorganismy je možno pěstovat v technickém měřítku a měly by zůstat stálé. Z nových mikroorganismů je možno získat enzym, jehož účinnost je o několik desítek vyšší, než účinnost enzymu z původního kmene.
Získaný enzym je prostý stop invertázy a štěpí rafinózu v matečném louhu při krystalizaci sacharózy při neutrálním pH a za použití teploty. Enzym nevyžaduje žádné kofaktory jako ionty manganu nebo NAD, je stálý a je možno jej fixovat na nosič, například na nerozpustné polysacharidy aktivované bromkyanem. Místo izolovaného enzymu je možno fixovat na vhodný nosič i mikroorganismus jako takový a je možno jej použít v této formě. Fixací se stává pro rafinózu znovu propustná buněčná membrána, která se původně stala nepropustnou pro rafinózu v důsledku zničení genu pro permeázu. Je samozřejmé, že je nutno použít vhodných fixačních metod.
I '.olaci cí-galaktosidázy z nových mikroorganismů je možno provádět běžným způsobem. S výhodou se tato izolace provádí tak, že se biologická hmota podrobí tlaku, zpracování ultrazvukem a podobně. Tyto metody se volí v závislosti na výchozím mikroorganismu.
Po rozrušení buněčné stěny se s výhodou provádí srážení působením polyaniontů, při kterém A-galaktosidáza obvykle zůstává v supernatantu. Jako polyaniontů se s výhodou užívá polyethylenaminů, zvláště sloučenin se střední molekulovou hmotností.
Z takto získané sraženiny je možno enzym získat působením síranu amonného, přičemž se užívá zejména koncentrace 0,8 až 1,6 M síranu amonného. Dialýzou a lyofiližací je možno ve vysokém výtěžku získat oó-galaktosidázu o čistotě větší, než 90' %, vhodnou pro technické užití.
Při použití plazmidu pBR 322 jako vektoru a E. coli BMTU 2744, DSM 2093 jako buněk schopných transformace se získá svrchu uvedeným způsobem nový mikroorganismus E, coli BMTU 2742, DSM 2091.
CS 272 753 B2
Tento nový mikroorganismus má následující vlastnosti:
Mikroorganismus obsahuje plazmid pBT 102, je odolný proti ampicilinu v koncentraci 50 /Ug/ml a produkuje nitrobuněčnou ^-galaktosidázu, která nevyžaduje přítomnost kofaktoru, neprodukuje žádnou invertázu. Zásadná se kromě uvedených znaků neliší od E. eoli kmene K-12 a je možno jej pěstovat při teplotá 37 °C ve standardním živném prostředí, s výhodou za provzdušňování.
Mikroorganismy, pěstované způsobem podle vynálezu, se vyznačují vysokým obsahem oů-galaktos.dázy, až 30 % celkové rozpustné bílkoviny sestává z oó-galaktosidázy a mohou přenášet své nové vlastnosti na další mikroorganismy.
Možnost přenosu spočívá například v tom, že se mikroorganismus, vypěstovaný způsobem podle vynálezu, pěstuje společně s dalším mikroorganismem, například na agaru.
V připadá, že se ve druhém transformačním stupni způsobu podle vynálezu užije kmen E. eoli, který obsahuje plasmid EP 4, jak je uvedeno například v J. Bacteriol. 108. 1244 až 1249 (1971), vzniká mikroorganismus, který kromě plasmidu EP 4 obsahuje také hybridní vektor, například pBT 103, obsahuje tedy 2 plazmidy. Tento mikroorganismus přenáší při společném pěstování s kmeny Pseudomonas plasmid pBT 103 na tyto kmeny.
Buňky mikroorganismů, schopné transformace, může snadno zvolit každý odborník. Buňky se získávají s výhodou na konci exponenciální růstové fáze, potom se buňky izolují a uvedou v suspenzi v roztoku chloridu vápenatého, který je chlazen ledem.
V této formě jsou buňky připraveny k příjmu DNA.
Při použití buněk E. eoli je výhodným prostředím pro pěstování standardní živný bujón II (Merck, Darmstadt).
Vynález poskytuje způsob pěstování mikroorganismů, které vytvářejí enzym «✓-galaktosidázu s velmi vysokou účinností, aniž by současně docházelo k výrobě invertszy. Získává se tedy zdroj ý/-galaktosídázy, která je daleko vhodnější ke štěpení rafi: ózy nebo obdobných cukrů, například při krystalizaci cukru z repného extraktu, než dosud známé přípravky 06-galaktosidázy. Tímto způsobem je tedy možné ve velkém technickém měřítku vyřešit problém získávání sacharózy z rafinózy. Mikroorganismus, pěstovaný způsobem podle vynálezu nebo tímto způsobem získanou oó-galaktosidázu je možno užít v potravinářské technologii i k jiným účelům, při kterých je zapotřebí rozštěpit uhlohydráty, štěpitelné «6-galaktosidázou. Příkladem může být odstranění Stachyózy ze sojové mouky, toto odstraiění se požaduje v případě, že sojová mouka má být použitelná pro potravinářské účely.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.
Příklad 1
Z kmene E. eoli BMHI 2743, DSM 2092, který jako DNA s obsfhem genu pro r^-galaktosidázu obsahuje Pl raf je možno získat jiné kmeny s vysokou produktivitou 06-galaktosidázz následujícím způsobem:
CS 272 753 B2 . - 6 1) Výroba PÍ raf DNA ε gentickou informací pro raf-operon z PÍ raf-lyzátu
Kmen E. eoli BMTU 2743, (thr-, leu“, thi-, lacY, tonA, raf+, Plts-Lysogen), který je odvozen od E. eoli K-12, BliTU 2744, DMS 2093, se pěstuje 4 hodiny při teplotě 30 °C za stálého třepání v 1 litru bujó.iu, který obsahuje 1 % tryptonu, 0,5 % extraktu z kvasnic, 0,2 % glukózy a 0,5 % chloridu sodného při pH 7,8 a po dosažení optické hustoty 0,5 ODg^Q, měřeno při 650 nm př. teplotě 40 °C, se k indukci represoru fágu, citlivého na teplotu, dále třepe 2 hodi.iy. Ze supernatantu se získávají uvolněné fágy vysrážením polyethylenglykolem a čis .í se hustotním gradientem při použití chloridu cezného. Po extrakci fenolem a dialýie proti tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou o koncentraci 10 mmolů a pH 8,0 se tímto způsobem získá 0,6 mg Čištěné DNA-fágu.
2) Výroba DNA vektoru
Ke klonování fragmentu PÍ raf DNA se užije DNA plazmidu pBR 322, to jest vektoru, který jako označení obsahuje gen pro odolnost proti ampicilinu i proti tetracyklinu. Užije se plazmid, který se běžně dodává nebo se plazmid získá následujícím způsoben ·
Kmen E. eoli, který obsahuje plazmid pBR 322 se pěstuje při teplotě 31 °C v 1 litru živného bujónu stejného složení jako v prvním stupni za stálého třepání až do ukončení exponenciální růstové fáze. Potom se mikroorganismus dále třepe po přidáni 150 /Ug/ml chloramfenikolu 15 hodin při téže teplotě. Tímto způsobem je možno plazmidovou DNA získat přibližně ve čtyřnásobném množství. Potom se bakteriální buňky izolují, rozruší se lysozymem nebo smáčedly neiontového typu a roztok s rozrušenými buňkami se odstreďuje 30 minut při 48 C00 g, supernatant se izoluje. Ze supernatantu se potom získá dvojnásobným odstředěním při použití hustotníh gradientu chloridu cezného a ethidiumbromidu s následnou extrakcí fenolem a dialýz >u proti tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou o koncentraci 10 mmolů a pH 8,0 celkem 420 /Ug plazmidové DNA.
3) Včlenění raf-operonu z PÍ raf do vektoru
Vždy 10 /Ug PÍ raf DNA a DNA vektoru se zpracovává při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny působením restrikčni endonukleázy Sal I k úplnému rozštěpení molekuly DNA, potom se materiál zahřívá 5 minut na teplotu 65 °C.
PÍ raf DNA se potom frakcionuje v 0,7 % agarózovém gelu elektroforézou, Fragment s relativní molekulovou hmotnostní 4 megadaltony se oddělí a po extrakci s fenolem a dialýze v tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou o koncentraci 10 mmolů a pH 8,0 se získá ve formě roztoku.
Roztok takto získaného fragmentu PÍ raf DNA se smísí s roztokem rozštěpeného vektoru pBR 322 a podrobí se za přidání ATP, dithioerythritu a chloridu hořečnatého po dobu 24 hodin při teplotě 4 °C působení DNA ligázy z fágu 74. Takto získaný roztok obsahuje rekombinantní DNA.
4) Genetická transformace bakterií E. eoli rekombinantní DNA, která obsahuje genetickou informaci pro (/-galaktosidázu
CS 272 753 Β2
Kmen. E. eoli BMTU 2744, DSM 2093 se pěstuje v 50 ml živného bujónu za stálého třepání při teplotě 37 °C až do ukončení exponenciální růstové fáze. Buňky se izolují a uvedou se v suspenzi v roztoku chloridu vápenatého o koncentraci 50 mmolů v ledové lázni.
Tato suspenze sí- smísí s roztokem rekombinantní DNA ze stupně 3 a udržuje se 20 minut na ledové lázni, potom se zahřeje na 3 minuty na teplotu 37 °C. Buňky se přeočkují do živného bujónu a 40 řinut se pěstují za třepání při teplotě 37 °C, čímž se dovrší transformační reakce.
Potom se buňky izolují, promyjí a znovu uvedou v suspenzi. Malý podíl buněčné suspenze se nanese na agarovou plotnu, která obsahuje v I litru 10,5 g KgHPO^, 4,5 g KHgPO^, 1 g (NH^)2S0^, 0,5 g citrátu sodného x 2 H20, 0,1 g MgSO^ x 7 HgO, 1 mg thiaminu, 2 g rafinózy, 25 mg ampicilinu a 15 g agaru při pH 7,2. Plotny se potom pěstují při teplotě 37 °C. Po 2 dnech pěstování vzniknou četné kolonie. Kolonie se odeberou, čistí a izolují.
Každá z takto získaných kolonií má schopnost využívat rafinózu. jako jediný zdroj uhlíku a současně je odolná proti ampicilinu. Má tedy jiné vlastnosti, než původní kmen. To znamená, že se izolují pouze kolonie, které obsahují plasmid pBB 322, do kterého byl včleněn Sal I fragment z Pl raf s genem pro cé-galaktosidázu.
Ze získaných kolonií se nejprve izoluje plazmidová DNA způsobem popsaným ve stupni 2. Plazmidy ze všech kolonií poskytují po zpracování působením restrikční endonukleázy Eco Bl nebo Hind II po analýze elektroforézou na agarózovém gelu dva fragmenty, které je možno zařadit podle původu kolonie hybridního plazmidu do dvou různých velikostí, celkově jsou však stejné.
Obě velikostní skupiny se vyskytují v poměru 1:1. Odlišné analytické údaje pro fragmenty obou velikostí jsou zřejmě výsledkem odlišného směru zařazení fragmentu po působení Sal I z Pl raf zpět do pBR 322.
Pro další zpracování se volí plazmid z kolonie, která po působení restričkního enzymu Eco Bl nebo Hind III peskytuje menší druhý fragment, než plazmidy jiných kolonií. Tento plazmid se označuje pBT 100 BMTU 2741 bakterií DSM 2090, tyto bakterie, nesoucí uvedený plazmid mohou využívat rafinózu jako jediný zdroj uhlíku a produkují všechny enzymy raf-operonu.
5) Vždy 10 yUg DNA plazmidu pBT 100 z MBTU 2741 DSM 2090 se zpracovává působením restrikční endonukleázy Hind III nebo Eco Bl při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny k rozštěpení molekul DNA. Potom se směs zahřívá 5 minut na teplotu 65 °C.
Takto získané roztoky plasmidové DNA se zředí a způsobem podle odstavce 3 podrobí působení T4-ligázy.
Potom se buňky kmene E. eoli ze stupně 4 uvedou ve styk s roztokem renaturované
DNA z posledního stupně transformační reakce. Malý podíl takto zpracovaného genu se nanese na Mac Conkeyovu plotnu (Difco) s obsahem 25 ^ug/ml ampicilinu. Na plotně po transformaci plazmidovou DNA předem zpracovanou enzymem Hind III je možno pozorovat
CS 272 753 B2
- 8 přibližně 20 kolonií po pěstování 24 hodin při teplotě 37 °C, na plotnu r. ptužitím DNA, štěpené enzymem Eco RI je možno za stejných podmínek pozorovat přibližně 30 kolonií. Poměr bílých kolonií k červeným je v prvním případě 4:1, ve druhém 3:1.
Červené kolonie jsou schopny odbourávat rafinózu, obsahují tedy ještě úplné raf-operon, bílé kolonie rafinózu neodbourávají. Tyto kolonie však ještě produkují enzym oO -galaktosidázy, jak je možno prokázat v textu v bezbuněčném extraktu při použití p-nitrofenyl-pó-galaktosidu (ρύ-PNPG) jako barevného substrátu při pěstování buněk bez přísady rafinózy v živném bujónu při teplotě 37 °C do stacionární polohy. Tyto buňky mají tedy odlišné vlastnosti, než původní organismus nebo buňky MBT'J 2741 DSM 2090, transformované pBT 100.
Plazmid, při jehož použití se po předchozím působení enzymu Hind III na plazmid pBT 100 na Mac Conkeyho plotnách získají bílé kolonie, se označuje pBT 101, plazmid, získaná po působení enzymu Eco RI, se označuje pBT 102. Kmen E. coli s obsahem pBT 102 se označuje BMTU 2742 DSM 2091.
6) Získání «t-galaktosidázy z kmenů s obsahem pBT 102 BMTU 2742
V tabulce 1 jsou uvedeny pokusné výsledky s bezbuněčnými extrakty na obsah <&galaktosidázy při použití OÓ-PNPG při teplotě 25 °C po vypěstování kmene MBTU 2742 s klonem ze stupně 5. Buňky se očkují v 10 ml živného bujónu v baňkách o obsahu 100 ml zim kmenem BMTU 2743 za stejných podmínek, avšak s přísadou 0,2 % rafinózy k živnému prostředí.
Jak je z tabulky zřejmé, mají extrakty kmene BMTU 2742 ve srovnání s extrakty kmene BMTU 2743 vyšší obsah pí--galaktosidázy.
«Tabulkal
Kmen č. c( gal jednotky/mg K
BMTU 2742 10 (DSM 2091)
2743 0,4 (DSM 2092) x mg rozpustné bílkoviny v surovém extraktu
Za těchto podmínek je možno prokázat ve známém kmenu E. coli BMTU 2744 účinnost menší než 0,001 jednotek/mg.
CS 272 753 B2
Příklad 2
Postupuje se způsobem podle přikladu 1, čímž se z fágu E. coli BMTU 2481 DSM 2101 způsobem podle příkladu 1 odstavec 3 odštěpí příslušný úsek působením enzymu Eco EE. Takto získaný prostředek je zdrojem DNA, která obsahuje genetickou informaci pro «O-galaktosidázu.
K získání vektoru DNA se z E. coli BMTU 2745 DSM 2100 způsobem podle příkladu 1 odstavec 2 získá DNA plazmidu pKT 230, pěstování buněk se však provádí přes noc při teplotě 37 °C za stálého provzdušňování v živném prostředí, ke kterému se nepřidává ehloramfenikol.
Získaná plazmidová DNA se štěpí způsobem podle příkladu 1 odstavec 3 působením enzymu EcoEE.
Izolace fragmentu na DNA rozštěpeného pKT 230 se provádí způsobem podle příkladu 1 odstavec 3.
Takto získaný roztok rekombinantní DNA se transformuje v E. coli BMTU 2602 DSM ?102 způsobem podle příkladu 1 odstavec 4. Selekce se provádí na agarové plotně s obsahem kanamycinu v -oncentraci 25 yug/ml. Tímto způsobem se získá přibližně 40 kolonii odolných proti .tai. smycinu, tyto kolonie se zkouší na citlivost na Streptomycin na koncentraci 50 yUg/sl. Zjistí se přibližně 20 kolonií, zásadně citlivých na streptomyein, avšak odolnýc.i ještě proti koncentraci 20 ^ug/ml střeptornyčinu. Způsobem popsaným v příkladu 1 se v těchto koloniích prokazuje tvorba -galaktosidázy. Takto získaný nový kmen 4. coli BMTU 2746 DSM 2103 je odolný proti kanamycinu, málo odolný proti streptomycinu a produkuje eó-galaktosidázu, těmito vlastnostmi se odlišuje od výchozího kmene BMTJ 2602 DSM 2102, ostatní vlastnosti má shodné s uvedeným kmenem.
Buňky tohoto nového kmene obsahují plazmid pBT 103, obsahující gen pro pó-galaktosi&
dázu, jak je možno také prokázat tvorbou «^-galaktosidázy.
K přenosu pBT 103 z BMTU 2746 DSM 2103 na Pseudomonas putida BMTU 2749 DSM 2106 se nejprve smísí buňky kmene BMTU 2746 DSM 2103 a BMTU 2747 DSM 2104 v logaritmické fázi růstu, přičemž druhý z uvedených kmenů obsahuje přenosný plazmid EP4 a oba kmeny ve směsi se potom pěstují na agarové plotně standard II (Merck Darmstadt) s obsahem 20 yUg/ml streptomycinu a 20 ^ug/ml tetracyklinu. V průběhu pěstování při teplotě 37 °C vyroste přibližně 50 kolonií. Jedna z těchto kolonií se izoluje a nanesením na plotny s obsaí em odpovídajících antibiotik je možno prokázat, že takto získaný nový kmen BMTU ?74ř· Dí.tí 2105 je odolný proti 20 ^ug/ml streptomycinu, 26 ^ug/ml kanamycinu, 20 yUg/ml tetracykliru a 50 ^ug/ml ampicilxnu. Uvedený kmen obsahuje plazmiáy EP4 a pBT 103, jak je mož: o prokázat tvorbou <*>-galaktosidázy.
Přenos plazmidu pBT 103 z BMTU 2748 DSM 2105 na Pseudomonas putida BMTU 2749 DSM 2106 se provádí smísením obou kmenů v logaritmické růstové fázi s následným pěsto/áním této směsi na agarové plotně standardu II (Merck Darmstadt) při teplotě 30 °C po dobu 24 hodin s následným promytím buněk sterilním živným bujónem a nanesením na agarové plotny s obsahem selektivního živného bujónu standard II s obsahem 100 ^ug/ml kanamycinu a 25 /Ug/ral chloramfenikolu. Po dvou dnech vyroste přibližně 20 kolonií,
CS 272 753 B2
- 10 tyto kolonie se čistí a identifikují jako kolonie, citlivé na tetracyklin, jde o Pseudomonas putida s obsahem plazmidu pBT 103, který obsahuje gen pro tvorbu á^-galaktosidázy BMTU 2750, DSM 2107 . Průkaz tvorby <só-galaktosidázy se provádí stejně jako v příkladu 1.
Příklad 3 štěpení rafinózy v průběhu krystalizace v cukrovaru ml odpadu s obsahem 802 mg rafinózy se zředí 45 ml vody. Roztok se upraví na pH 6,5. Tento roztok se v souběžném pokusu inkubuje s bezbuněčným extraktem a mimoto s buňkami kmene E. coli DSM 2091, které byly předem zpracovány působením toluolu, přičemž extrakt i buňky obsahují 57 jednotek A-galaktosidázy.
Směs se nechá stát 60, 120 a 180 minut při teplotě 40 °C. Po této době se stanoví enzymatickým způsobem obsah galaktózy v roztoku a vypočítá se zbývající množství rafinózy v takto zpracovaném vzorku.
Po uvedených dobách zpracování odpovídá zbytkový obsah rafinózy v jednotlivých vzorcích o velikosti 459, 378 a 315 mg poklesu původního mrožství rafinózy v jednotlivých vzorcích na 57,2, 47,1 a 39,2 % výchozího množství. V následující tabulce 2 jsou shrnuty výsledky získané svrchu uvedeným způsobem.
V tabulce 2 jsou uvedeny výsledky pokusu, získané při použití 90 ml krystalizačního odpadu s obsahem 802 mg rafinózy po zpracování 57 jednotkami </-galaktosidázy při teplotě 40 °C a pH 6,5.
Tabulka 2
Doba zpracování (min)
Obsah rafinózy % výchozí hodnoty (mg)
120
180
802
459
378
315
100,0
57,2
47.1
39.2
Claims (1)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZUZpůsob výroby «ó-galaktosidázy kultivací mikroorganismů v živném prostředí s obsahem využitelných zdrojů uhlíku, dusíku a anorganických soli s následnou izolací a čištěním výsledného produktu, vyznačující se tím, že se ke zvýšení čistoty enzymu snížením obsahu invertázy izoluje z kmene Escherichia eoli DSM 2092 DNA ε obsahem genu pro ¢4-galaktosidázu, tato DNA se rozštěpí endonukleázou Sal I za získání frakce DNA s molekulovou hmotností přibližně 4 megajednotky s obsahem genu pro jjí-galaktosidázu, získaný fragment se inkubuje s vektorem pBR 322 po jeho rozštěpení restriktázou Sal I s obsahem genu pro odolnost proti ampicilinu, za přítomnosti DNA-ligézy fágu T4 za přítomnosti ATF, dithioerythritu a chloridu hořečnatého, získaná rekombinantní DNA se inkubuje s buňkami E. eoli, transformované buňky se pěstují na živých prostředích s obsahem 2 až 10 g/1 rafinózy, vzniklé kolonie, odolné proti ampicilinu, se izolují a rozruší, ze získaného materiálu se izoluje DNA plasmidu s molekulovou hmotností 6,9 až 12,4 megajednotek, tato DNA se rozštěpí restrikční endonukleázou Hind III a zpracuje působením DNA-ligázy, získané renaturované plasmidy pBT 102 se uvedou do suspenze s buňkami E. eoli, transformované buňky se znovu kultivují na živném prostředí s obsahem 2 až 10 g/1 rafinózy a ampicilinu, kolonie E. eoli, využívající rafinózu se izolují a získané klony mikroorganismů se pěstují.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19813122216 DE3122216A1 (de) | 1981-06-04 | 1981-06-04 | Verfahren zur herstellung eines mikroorganismus, welcher (alpha)-galactosidase, aber keine invertase bildet, so erhaltener mikroorganismus und seine verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS363582A2 CS363582A2 (en) | 1990-06-13 |
| CS272753B2 true CS272753B2 (en) | 1991-02-12 |
Family
ID=6133914
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS363582A CS272753B2 (en) | 1981-06-04 | 1982-05-18 | Method of alpha-galactosidase production |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5061625A (cs) |
| EP (1) | EP0066857B1 (cs) |
| JP (1) | JPS57208985A (cs) |
| AT (1) | ATE29525T1 (cs) |
| AU (1) | AU531972B2 (cs) |
| CA (1) | CA1194433A (cs) |
| CS (1) | CS272753B2 (cs) |
| DD (2) | DD202735A5 (cs) |
| DE (2) | DE3122216A1 (cs) |
| DK (1) | DK251682A (cs) |
| HU (1) | HU193266B (cs) |
| SU (1) | SU1431681A3 (cs) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE81141B1 (en) * | 1983-06-24 | 2000-04-05 | Genencor Int | Procaryotic carbonyl hydrolases |
| SU1364343A1 (ru) * | 1984-07-13 | 1988-01-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Способ получени человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 |
| US5741672A (en) * | 1984-07-27 | 1998-04-21 | Unilever Patent Holdings B.V. | Expression and production of polypeptides using the promoters of the hansenula polymorpha MOX and DAS genes |
| US5240838A (en) * | 1984-07-27 | 1993-08-31 | Internationale Otrool Maatschappij "Octropa" B.V. | Regulatory sequences of alcohol oxidase (MOX) and dihydroxyacetonesynthase (DAS) of Hansenula polymorpha |
| FI861548A0 (fi) * | 1986-04-11 | 1986-04-11 | Alko Ab Oy | Nya jaeststammar vari med gentekniska foerfaranden infoerts en -galaktosidasgen och foerfaranden foer industriellt utnyttjande av dylika jaeststammar. |
| CA1339101C (en) * | 1986-06-03 | 1997-07-29 | Nicolaas Overbeeke | Production of guar alpha-galactosidase and immunologically related alpha-galactosidases by host organisms transformed with recombinant dna methods |
| EP0255153B1 (en) * | 1986-06-03 | 1995-01-18 | Unilever N.V. | Production of guar alpha-galactosidase by hosts transformed by recombinant DNA methods |
| EP0487159A1 (en) * | 1990-11-23 | 1992-05-27 | Unilever N.V. | A food-grade vector suitable for transforming a food-grade host cell, use of said vector for transforming food-grade host cells, and use of said transformed cells in biotransformation processes |
| US6770468B1 (en) | 1999-09-14 | 2004-08-03 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Phosphodiester-α-GlcNAcase of the lysosomal targeting pathway |
| US6642038B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-11-04 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | GlcNAc phosphotransferase of the lysosomal targeting pathway |
| US6800472B2 (en) | 2001-12-21 | 2004-10-05 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Expression of lysosomal hydrolase in cells expressing pro-N-acetylglucosamine-1-phosphodiester α-N-acetyl glucosimanidase |
| RU2504583C1 (ru) * | 2012-10-03 | 2014-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) | ПЛАЗМИДА 40Gal, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ α-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ α-PsGal, ШТАММ E.coli Rosetta(DE3)/40Gal - ПРОДУЦЕНТ ХИМЕРНОГО БЕЛКА, ВКЛЮЧАЮЩЕГО АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ α-PsGal, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ |
| CN115417510B (zh) * | 2022-09-20 | 2023-07-04 | 南京农业大学 | 一种水中胞外抗生素抗性基因的去除方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3957578A (en) * | 1975-01-03 | 1976-05-18 | Hokkaido Sugar Co., Ltd. | Method for manufacture of α-galactosidase by microorganism |
-
1981
- 1981-06-04 DE DE19813122216 patent/DE3122216A1/de not_active Withdrawn
-
1982
- 1982-05-18 CS CS363582A patent/CS272753B2/cs unknown
- 1982-05-19 AU AU83826/82A patent/AU531972B2/en not_active Ceased
- 1982-05-27 CA CA000403872A patent/CA1194433A/en not_active Expired
- 1982-06-02 DD DD82240391A patent/DD202735A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-06-02 JP JP57093239A patent/JPS57208985A/ja active Granted
- 1982-06-02 DD DD82255231A patent/DD210467A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-06-03 EP EP82104893A patent/EP0066857B1/de not_active Expired
- 1982-06-03 AT AT82104893T patent/ATE29525T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-06-03 DE DE8282104893T patent/DE3277213D1/de not_active Expired
- 1982-06-03 HU HU821796A patent/HU193266B/hu not_active IP Right Cessation
- 1982-06-04 DK DK251682A patent/DK251682A/da not_active Application Discontinuation
- 1982-06-04 SU SU823448724A patent/SU1431681A3/ru active
-
1988
- 1988-08-24 US US07/235,910 patent/US5061625A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS363582A2 (en) | 1990-06-13 |
| ATE29525T1 (de) | 1987-09-15 |
| EP0066857A2 (de) | 1982-12-15 |
| DK251682A (da) | 1982-12-05 |
| CA1194433A (en) | 1985-10-01 |
| AU531972B2 (en) | 1983-09-15 |
| SU1431681A3 (ru) | 1988-10-15 |
| AU8382682A (en) | 1982-12-09 |
| JPS6251588B2 (cs) | 1987-10-30 |
| EP0066857B1 (de) | 1987-09-09 |
| DD210467A5 (de) | 1984-06-13 |
| JPS57208985A (en) | 1982-12-22 |
| DD202735A5 (de) | 1983-09-28 |
| HU193266B (en) | 1987-09-28 |
| US5061625A (en) | 1991-10-29 |
| DE3277213D1 (en) | 1987-10-15 |
| EP0066857A3 (en) | 1983-06-22 |
| DE3122216A1 (de) | 1982-12-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CS272753B2 (en) | Method of alpha-galactosidase production | |
| KR20100092765A (ko) | Ｌ-아미노산 생산용 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법 | |
| Erarslan et al. | Purification and kinetics of penicillin G acylase from a mutant strain of Escherichia coli ATCC 11105 | |
| EP0057976A2 (en) | A process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis | |
| US4806480A (en) | Novel E. coli hybrid plasmid vector conferring sucrose fermenting capacity | |
| US4464471A (en) | Biologically engineered plasmid coding for production of β-glucosidase, organisms modified by this plasmid and methods of use | |
| EP0164754B1 (en) | Process for producing n-acetylneuraminate lyase | |
| US5395927A (en) | DNA-fragment having the cyclodextrin glycosyltranferase gene | |
| JP4774496B2 (ja) | α−マンノシダーゼ | |
| US20040235120A1 (en) | Method for producing vitamin b12 | |
| Mahesh et al. | Optimization for the production of extracellular alkaline phosphatase from Proteus mirabilis | |
| EP0206595B1 (en) | Thermally stable tryptophanase process for producing the same, and thermally stable tryptophanase-producing microorganism | |
| JPS61181374A (ja) | 中性プロテア−ゼの産生法 | |
| CZ279006B6 (en) | Creatinamidine hydrolase, process of its preparation and use | |
| SU1761803A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы BaV В II | |
| JP3557271B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| GB2031905A (en) | Preparing glucose isomerase | |
| JPS60180590A (ja) | プラスミド | |
| RU2302459C2 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИИ Arthrobacter species Mn372-ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ Asi372I, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5`-ATGCAT-3` | |
| CN120349918A (zh) | 黄麻链霉菌及其应用 | |
| JP3757598B2 (ja) | Ｌ−リボースの製造方法 | |
| SU1701745A1 (ru) | Способ получени биомассы SтRертомYсеS, обогащенной эндонуклеазой рестрикции SFI I. | |
| JPS6253150B2 (cs) | ||
| RU2070925C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco 71 ki | |
| RU2044054C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco 110 ki |