JPS62181777A - 遺伝子工学由来の菌株及び組換えプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）ズブチリス
に見い出されそしてバチルス・ツリンギエンシス変種ク
ルスタキに見い出されるものに相当する殺虫δ−エンド
トキシン蛋白結晶、その新規な形及び組成物そしてその
大造の新規な手段及び方法に関する。

〔従来の技術〕

本明細書の記述は、末尾に示された引用文献に関連して
読まれることを目的としている。

バチルス・ツリンギエンシスは、バチルス・セレウス（
Ｂ、　ｃｅｒｅｕｓ　）　　に極めて似た胞子形成微生
物である。しかし、その特異性は、胞子形成時の蛋白様
結晶の外観である。結晶は？ｊ７錐体１　ｂｉｐｙｒａ
ｍｉｄａｌ　）の形をし、胞子培養物の３０重稈−％（
乾量）以下を占め、そして昆虫の多くの鱗翅類汲び若干
の双翅類に対して毒性があることが知られている。

ピー・ツリンギエンシスの変種は、それらの鞭毛の又け
ｒＨＪ抗沖により区別されうる。それらは、又それらの
結晶型により分類されつる。同一の抗原変９　（５ｅｒ
ｏｖａｒ　ｌは１神より多い結晶型を有し、そして異っ
た抗原変社は同一の結晶型を有するかも知れない点で、
２ａ＋の分類は重複する。異った変種は、特定の昆虫に
対して異った毒性を示す。こわらの変種の中で、ビー・
ツリンギエンシス、パル（ｖａｒ）クルスタキ（又ＨＤ
−１とされる）は、鱗翅類に対して特に有力な分離物で
ある。

クルスタキ分離物は、多くの農業上の害虫例えはイラク
サキンウワバ〔トリコブルシア・＝　（Ｔｒｉｅｈｏｐ
ｌｕｓｉａ　ｎｉ）〕、タバコガ〔ヘリオチス・ビレセ
ンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅ−１１ｅｅｎｌｌ
））、タバコ・ホーン会ワーム（Ｔｏｂａｃｃｏ　ｈｏ
ｒｍｗｏｒｍ　）、〔マンデュカ・セクスタ（Ｍａｎｄ
ｕｃａ　５ｅｘｔａ　）　）運に林の害虫例えばマイマ
イガ〔リマントリア・ジスパー（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ　
ｄｉｓｐａｒ　）　）に対して殺虫剤として工業的に広
く用いられてきた。化学的な殺虫剤よりもこの分離物の
良い点は、は乳動物及び有用な昆虫に対し無毒であり〔
ヘイムペル（Ｈｅｉｍｐｅｌ　）、１９７１）、目的と
する昆虫に抵抗性を誘導させずそして重視に；ｔ’ｓさ
れないことを含む。不利な点は、極めて少数の昆虫に対
してのみその特異性を有し、さらにそれが風化及び日光
に対して棒めて変化し易いので適用後のその有効期間が
短いことである（キャントウエル（Ｃａｎｔｗｅｌｌ　
）及びフランクリン（Ｆｒａｎｋｌｉｎ　）、１９６６
；モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）及びマツクエラ７　（ＭｃＥ
ｒｌａｎｅ。

１９７５）。

ＨＤ−１結晶の毒性部分は、δ−エンドトキシンと呼ば
れる。δ−エンドトキシンは、その病原性を付方するた
めに目的とする昆虫により消化されねばならない０昆虫
の胃のアルカリ性ｐＨは、結晶蛋白を分解して、胃を麻
痺させそして一般化毒血症を生じさセるっ昆虫に汗射さ
れたときそのままの結晶又は消化された結晶の佃ねも毒
性がないが、両者は経口投与されたとき毒性を示す〔ア
ンガス（Ａｎｇｕｓ）、１９６４）。又結晶と胞子との
間には相互作用があって毒性を増大させよう。この相互
作用の本ηは、不り１である〔ヤムブリアス（Ｙａｍｖ
ｒｉａｓ　）、　１９６２　　；　バージ７（Ｂｕｒｇ
ｅｓ　）、１９７６］。

結晶蛋白は、高いｐｉ（並にそれを溶解させる還元剤の
存在を必蚤とする。結晶蛋白の変性されたサブユニット
は、約１３０，０００及び１３４，０００クルトンの分
子ｔｉｉ−である。

ＨＤ−１には少量の別の蛋白Ｐ２（又モスキード因子と
呼ばれる）のＭＩＩ拠があり、それは結晶から別に単離
さね、約６５，０００ダルトンの分子−を有し、そして
ｖｒ翅類及び双翅類の両方にτＩ性を示す〔山邊、（ｘ
９ｇ３１）。

ビー・ツリンギエンシス結晶の形成に寄与する１セトよ
り多い構造遺伝子が存在する証扮が示されている。シュ
ネフ（５ｃｈｎｅｐｆ　）及びホワイレー（ｗｈｉｔｅ
ｌｅｙ）　（１９８１）は、３０メカダルトン及び４７
メガダルトンの２釉の大きなビー・ツリンギエンシス・
プラスミドへ相同を示すクルスタキ株から結晶遺伝子を
クローンした。ツリンギエンシス結晶紳の株バーリナ−
（ｂａｒｌｉｎｅｒ　）　１７１５を用いてクリアー（
Ｋｌｉｅｒ）ら（１９８２）は、結晶遺伝子のプラスミ
ド及び染色体コピーの両方を同定した。しかし、クルス
タキにおいて、クリアーのグループは、プラスミドのコ
ピーのみを児い出した。ベルト（１Ｉｅｌｄ　）ら（１
９８２）は、クルスタキに染色体及びプラスミドのコピ
ーの両方を見つけたと主張している。

ホワイレーのグループは、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ
）プラスミド拳ベクターｐＢＲ３２２１＼クローンした
プラスミドＤＮＡの部分的５ａｕ３Ａライブラリーから
、プラスミドコピーを単離した。組換えプラスミドは、
イー・コリ杵ＨＢＩＯＩへ移され、そして精製さｈｆｃ
ビー・トルスタキ結晶へ作られた抗体により免疫活例に
基いてインサートについてスクリーンした。彼等は、１
３０．０００タルト／の蛋白（結晶蛋白と目１じ大きさ
）を生成しそしてタバコ・ホーン・ワームに対して毒性
を示すクローンを単離しｆｃｏこのクローンは、部分的
にシーケンスされ、そして２１に！の転与開始部位を確
認した〔ワン（Ｗｏｎｇ）ら、１９８２］。胞子形成中
ビー・ツリンギエンシスに合成されたＲＮＡを用い、彼
等は２個の隣接した開始部位を児つけ、１個は胞子形成
の初期に転写を始め、そして仲は胞子形成の中層で転写
を始めた。ただ一つのＲＮ　Ａ　ＰＪｉが、遺伝子を含
むイー・コリ・クローン中に検出された。イー・コリ中
の結晶蛋白は、低いレベルであるが、成長のすべての段
階で生成された。遺伝子のコーディング飴域によりコー
ドされた初めの８個のアミノ酸は、結晶蛋白のアミン末
端におけるものと一致する。リボゾームの結合部位と思
われるものも、又確認された。

ホワイトレーのグループは、又クルスタキ、ＨＤ７３及
びソ）　（ａｏｔｔｏ　）を含む他の菌株から遺伝子ラ
イブラリーを調べるために、このクローンの一部を用い
た。ＨＤ７３は、異った結晶の形を作り、そしてントは
２個のプラスミドしか有しない。これらのライブラリー
の両方は、Ｈｌ）１結晶蛋白に作られる抗血清と交差反
応しそしてタバコ・ホーン・ワームに対する毒性を発塊
する１３０，０００ダルトンの蛋白を生成するクローン
を有した。

ベルト（Ｈｅｌｄ）ら（１９８２）は、イー・コリ消化
からのビー拳ツリンギエンシス全ＤＮＡライフ゛ラリ−
をファージベクターチア−ロン（Ｃｈａｒｏｎ　）　４
　Ａヘクローンし六つ抗体検出を用いて、クローンが同
定され、そわはイー・コリ　プラスミドｐＢＲ３２８及
びビー・ズブチリス　プラスミドｐＨＶ３３ヘサブクロ
ーンされたとき、抗結晶蛋白抗体と交差反応する抗原を
生成した。サブクローンの成るフラグメントは、４５，
０００ダルトンのビー・ツリンギエンシスプラスミドへ
交雑した。他の７ラグメントは、プラスミドき染色体Ｄ
ＮＡとの両方に交雑し、そして１個のフラグメントは染
色体ＤＮＡへのみ交雑し、それは初めのクローンが元々
染色体であることを示した。このクローンは、タバコ・
ホーン・ワームに対して毒性を示しｆｃ。

クライア−（Ｋ１１ｅｒ　）ら（１９８３）は、胞子形
成と一致するように思われるラベルされた安定しにビー
・ツリンギエンシスｍＲＮＡを用いて、ツリンギエンシ
ス菌株ベリナー（ｂｅｒｌｉｎｅｒ　）　ｌ　７１５か
ら全ＤＮＡのイー・コリライブラリーを証明した。４種
の陽性のクローンを全ビー・ツリンギエンシス（Ｒ，ｔ
）ＲＮＡへ交雑して戻し、そしてそれらの３種を２６５
ｍＲＮＡへ交雑したことが分った。

この２６　ｓ　ｍＲＮＡは、無性（ｖｅｇｅｔａｔｉｖ
ｅ　）又は非結晶（ａｃｒｙｓｔａｌｌｉｆｅｒｏｕｓ
　）の変れには存在しなかった。

このクローンは、染色体遺伝子のコピーであることが確
認され、そしてイー・コリには転写又は発現されなかっ
た。

この遺伝子の４．０キロベースのサブクローンは、イー
−コリ及びピー・ズブチリスの両方に転写したが、発現
しなかった。

クライア−のグループは、又イー魯コリ菌株ＨＢ　１０
１へ形質変換されたプラスミド遺伝子コピーを得た。こ
のクローンは、・１２メガダルトンのベリチー１フ１５
プラスミドからの１４キロベースのＢａｍＨ１フラグメ
ントであった。

このクローンは、ピー・ツリンギエンシス（Ｂ、　ｔ、
　）結晶蛋白に対する抗体を沈でんし、そして毒性を示
した。ビー・ズブチリスへ移すと、このクローンは、１
３０，０００ダルトンの蛋白を生成したが、胞子形成中
のみであった。封入は、イー・コリのクローン及び胞子
形成中のビー・ズブチリスに見られたが、電子顕微鏡に
より観察したときに、規則的な結晶構造又はパターンは
艶られなかった。

最近、クロンシュタット（Ｋｒｏｎｓｔａｄ　）、シュ
ネフ（５ｃｈｎｅｐｆ　）及びホワイトレー（１９８３
）は、亜種ツリンギエンシス及びクルスタキの数棟の菌
株に多重結晶蛋白遺伝子の可能な存在を報告した。クロ
ーン化結晶蛋白遺伝子からプラスミド及び全細胞ＤＮＡ
の制限分解物への遺伝子内の制限フラグメントの交雑は
、結晶蛋白遺伝子へのすべての相同が組合わさったプラ
スミドであり、そしてこれらの苗種の数種が相同の多重
領域を含むことを明らかにしていた。

最近開発された組換えＤＮＡの技術は、遺伝子が単離さ
れ、縮度の活性へｄ４されるか又はヌクレオチド配列を
変えられる手段を提供している。このやり方は、広い範
囲の遺伝子の研究実験に用いられ、そして次第に商業上
の関心のある蛋白の生産に用いられている。このような
やり方は広く用いられているが、それぞれの遺伝子の単
離及び発現は、実験的な問題を残している。蛋白の有効
な合成に対する特定の分子及び生化学上の要求、そして
生物学上用いられる形でのその回収は、一般的なやり方
にならなかった。

それぞれの遺伝子の生物学上の特性そしてその宿主の環
境は、科学者の側に創雀性及び発明性を侠求し続けてい
る。

組換えＤＮＡのやり方は、多数の源から単一のキメラ分
子へのＤＮＡ分子のアセンブリー（生体外）を含む。ア
センブリーは、代表的には、部位特異性制限ヌクレアー
ゼによるＤＮＡの切断並に酵素ＤＮＡＩＪパーゼによる
その末端におけるこれらのＤＮＡフラグメントの結合を
必要とする。

リゲーション（Ｉｉｇａｔｉｏｎ　）への適切なセグメ
ントの選択は、所望の組換えＤＮＡ分子をもたらす。多
くの場合、得られた分子は、複製原点（それ故、ＤＮＡ
は宿主細胞中で分裂されうる）、シばしば抗生物質への
抵抗性を明らかにするマーカー遺伝子そしてその蛋白生
成物が望まれる異貿の遺伝子を有しよう。

細菌のシステムでは、このような組換えＤＮＡ分子は、
細胞に導入さね、次にバクテリオファージ又はプラスミ
ドの倒れかとしてこれらの細胞内に複製される。バクテ
リオファージは、ウィルス蛋白カプセル内に封入された
組換えＤＮＡ分子により、生体外で組立てられる。組換
えＤＮＡは、次に細菌内に導入されて、そしてウィルス
感染の通常の方法により分裂される。プラスミドは、複
製の元を含みそして細胞成長中にそれ自体分裂する。生
体外で構成された組換えプラスミドは、細胞をして外来
の分子を取り上げる細胞の処理によシ、細菌に導入され
うる。組換えプラスミドによりこのように変型された細
胞は、低密度でプレートに１６かれる。単一のコロニー
は、従って同一の外来の遺伝子をすべて含む細菌のクロ
ーンを表わす。

゛　　外来の遺伝子が導入される宿主細胞は、外米の遺
伝子の発現に実實的な効果を有する。代表的には、用い
られる細菌の宿主は、イー・コリである。イー・コリは
、遺伝子学的に充分に特性を与えられ、そして容易に外
来のＤＮＡを取り上げる。しかし、バチルス・ズブチリ
スは、宿主細胞として用いられる頻度が大きくなってき
た。ビー−ズブチリスは、成る遺伝子にとっては増大し
た蛋白合成をもたらす、遺伝子発現の規則的なシグナル
の異った組合わせに応答する。ビー・ズブチリスは、培
地中へ蛋白を分泌する能力のためとトキシンがないため
ｖＣ１成る蛋白にとっては好まれる。

ｉｌｌ　Ｍ中の外米の蛋白の発現は、相互作用のメカニ
ズムを集める活性を要求する。ＲＮＡ合或は、遺伝子に
隣接したプロモーター配列の存在を必要とする。成る場
合、クローン化遺伝子の次に元来位置しているプロモー
ターは、宿主遺伝子発現機構により利用される。他のψ
１１では、ベクタープラスミド又はバクテリオファージ
は、そう人された遺伝子の発現のためのプロモーターを
提供すべきである。

細菌細胞内の外来の蛋白の生産は、ＲＮＡ合成ばかりで
なく、コードされた蛋白の合成及びＷｔ積を必要とする
。蛋白合成を行う細菌リポソームは、遺伝子によりコー
ドされねばならないＲＮＡ中の短い結合配列を認識する
。このリボンーム結合部位は、そう人された遺伝子の部
分であるか、又はベクターの部分である。成る場合、そ
う人された遺伝子は、ベクター中の内在する遺伝子に結
合し、そのやり方ではベクターのプロモーター及びリポ
ソーム結合部位差にそう人された遺伝子のアミノ酸コー
ディング配列を利用して、融合された蛋白が作られる。

合成された蛋白の量は、用いられた正規の配列及び理解
されない他のファクターに依存して、遺伝子毎に広く変
化する。外来の蛋白の運命も変化しうる。それは、包接
又は細胞内結晶として畜積されるか、細胞内に溶解した
ままか、分泌されるか又はプロテアセーゼの活性により
分解されよう。

下記の数字は、添付図面の図面の数字である。

（１）組換えプラスミド、１ｉ　Ｂ　ＨＥの構成のやり
方。太線はプラスミドｐＵＣ９からのＤＮＡを表わす。

ブロック中の斜線の領域は、Ｂ、ｔ、ＤＮＡからのトキ
シン遺伝子を表わす。

（２）ＨＢＨＩ中のＢ、ｔ、）キシン遺伝子発現。蛋白
（Ａ）及び対応する蛋白イムノプロット（ｂｒｏｔ　）
　（Ｂ）の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図
を示す。レーン１〜３は、それぞれ）（Ｄ１−ジペルか
ら分解された蛋白、ｐＵＣ９を運ぶイー・コリ菌株及び
イー・コリ菌株ＨＢ　ＨＥに相当する。レーン４は、蛋
白分子量の標準を示す。マーカー蛋白の大きさが示され
る。

（３）遺伝子工学由来の細菌中の殺虫結晶の形成。ＡＢ
Ｓ−５（Ａ）、ＡＢＳ−９（Ｂ）、ＨＤ−７３（Ｃ）、
Ａｌｌ５−５５　（Ｄ）、Ａ　Ｂ　Ｓ　−５８（Ｅｌ：
）及びＨＢＨＩ（Ｆ’）の細菌細胞の部分の透過型電子
顕微鏡写真。

（４）コロニー雑梗形成によるビー・ズブチリス転換物
のスクリーニング。右側の黒点は、ニック翻訳プローブ
へ交雑したコロニーを示す。左ＩＩ！１に示されるマス
タープレート上の細胞へのこれらの点の配列は、転換物
を含むトキシン遺伝子を同定した。

（５）ビー・ズブチリス転換物のプラスミド部分中のＢ
、　ｔ。

トキシン遺伝子のサウザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ　）プロ
ット検出。

Ａは、電気泳動法により０．８％が天ゲル上で分析され
た成る転換物の急速プラスミド標品である。Ｂは、ニト
ロセルロースペーパーへ移されそしてニック翻訳プロー
ブへ交雑した、同一のゲルからのプラスミドのオートラ
ジオグラムである。

（６）　　組換えプラスミドｐＡＢｓ−５及びｐＡＢｓ
−９の構成のやり方。ブロック中の斜線をつけた領域は
、Ｂ、　ｔ。

ＤＮＡからのトキシン遺伝子を示す。

（７）ビー・ズブチリス転換物におけるＢ、　ｔ、　）
キシン遺伝子発現。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動図（４）及び対応する蛋白イムノプロット（Ｂ）
が示される。レーン１はイー・コリクローンＨＢＨＥで
あり、レーン２は分子量の標準であり、レーン３はＡＢ
Ｓ−５（ｐＡＢＳ−５を含むＰＳＬＩ）であり、レーン
４はＡ　Ｂ　Ｓ　−５８（ｐＡＢｓ−５を含むＢＤ２２
４　）であり、レーン５はＡＢＳ−９（ｐＡＢｓ−９を
含むＰＳＬＩ　）であり、レーン６は胚−５７（ｐＡＢ
Ｓ−９を有する５ｐｏＯＨ菌株）であり、レーン７はＡ
ＢＳ−１１（ベクターｐＢＤ６４のみを含むＰＳＬＩ）
であり、レーン８はＡＢＳ−５９（ｐＡＢＳ−５９を含
むＰＳＬＩ　）であり、レーン９は分子量マーカー蛋白
である。

（８）は、ルリア（Ｌｕｒｉａ　）プロス培地中のＩ（
Ｄｉ−ジベル（ローロ）、ＡＢＳ−５（０−○）及びＨ
ＢＨＥ（ｘ−Ｘ）の成長曲線である。

（９）成長の異った間開におけるビー・ズブチリス及び
Ｉ（Ｄｌ−ジベルのＢ、ｔ、）キシン遺伝子の発現。５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図（Ａ）及び対
応する蛋白イムノプロット（Ｂ）を示す。レーン１〜９
は、それぞれ３．６．９．２２．３１，４５．５０．７
６及び１２０時間の成長におけるビー・ズブチリスクロ
ーンＡＢＳ−５からの蛋白を示し、レーン１１〜１９は
、それぞれ３．６．９．２２．３１，４５．５０．７６
及び１２０時間の成長におけるＨＤ１−ジペルからの蛋
白を示す。レーン２０は、分子量マーカーを示す。

（１０）　　ビー・ズブチリス菌株ＡＢＳ−５における
トキシン結晶形成。９時間（Ａ）、１３時間（Ｂ）、２
４時間（Ｃ）、３０時間（Ｄ）及び３６時間（Ｅ）へ成
長した細胞の電子顕微鏡写真。

（１１）　　ビー・ツリンギエンシス菌株ＭＤＩ　−ジ
ベルニオけるトキシン結晶の形成。２４時間（Ａ）、３
０時間（Ｂ）、３６時間（Ｃ）へ成長した細胞の電子顕
微鏡写真。

（１２）組換えプラスミドｐＨ０４５の構成のやυ方。

太線はトキシン遺伝子を示す。

（１３）　　ビー・ズブチリス及びイー・コリのＢ、ｔ
、）キシン遺伝子発現。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動図（Ａ）及び対応する蛋白イムノプロット（
Ｂ）を示す。レーンｌは分子量マーカーであυ、レーン
２及び３はＡＢＳ−５５（組換えプラスミドｐＡＢＳ−
５５を含むＰＳＬＩ菌株）であり、レーン４はＢ８Ｗ７
（ｆｆｉ換えプラスミドｐＢＳＷ７を含むＴＢＩ菌株）
であり、レー１５はＨＣ４５（プラスミドｐＩ（Ｃ４５
を含むＴＢＩ菌株）であり、レーン６はベクターｐＶＣ
９のみを含むＴＢＩ菌株であり、レーン８はＢ、　ｔ、
菌株ＨＤ１−ジペルである。

（１４）　　プラスミドｐＢＳＷ７の構成のやり方。太
線はｐＨ０４５からのトキクン遺伝子フラグメントを示
し、斜線はｐ）（ＢＨＥからの遺伝子フラグメントを示
す。

（１５）プラスミドｐＡＢｓ−５５の構成のやり方。太
線はｐＨｃ４５からのトキシン】靭仏子フラグメントを
示し、斜線はＩ）　ＨＢ　ＨＥからの遺伝子フラグメン
トを示す。

〔発明の概要〕

本発明は、トキシン結晶蛋白に関する遺伝子がバチルス
・ツリンギエンシス変桶クルスタキの外米のプラスミド
に存在するという発見から生じている。この発見は、エ
シェリキア・コリを通してピー・ズブチリスへ特定の遺
伝子を導くことにより、組換えＤＮＡ技術を用いて、バ
チルス・ズブチリスに、トキシン結晶を生成せしめた。

結晶の昆虫毒性は、次に実験室のテストで示された。

バチルス・ツリンギエンシスにより生成される結晶蛋白
は、多数のＶ＃翅類昆虫の幼虫に対して、毒性がめるこ
とが分っている。アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏ
ｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）は、殺虫剤として用い
られる結晶蛋白製品を釣標名ＤＩＰＥＬの名で、市販し
ている。本発明は、バチルス・ズブチリスと呼ばれる曲
の細菌宿主件において、バチルス・ツリンギエンンス結
晶蚤白ｋｆ）；Ｂする改良芒れた方法を提供する。バチ
ルス・ズブチリスは、数種の工梁上重要な酵素の生産に
用いられている非病原性土壌１印１菌である。本発明は
、さらにν丁しい宿主種バチルス・ズブチリスにおける
トキシン蛋白の合成が成長のすべての相で生ずるという
点で、殺虫剤の現存の製法を改良している。

親の細菌であるバチルス・ツリンギエンシスでハ、トキ
シンの合成は、胞子形成中の成長相の極めて後でのみ開
始される。従って、本発明は、このような成陛相の制限
を克服し、そして殺虫剤の生産コストを低下させようと
するものである。

バチルス自ツリンギエンシス変拙クルスタキＣジベルＨ
Ｄ−１菌株）は、商標名ＤＩＰＥＬとしてアボット−ラ
ボラトリーズにより販売されている殺虫剤組成物の生産
の細菌として、長い間用いられてきた。δ−エンドトキ
シンよりなる二錐体の結晶は、Ｂ、ｔ、にむけるプラス
ミドに見い出される遺伝子の発現の結果である。本発明
による組換えＤＮＡ技術の応用によって、関係のある遺
伝子は、それらがエシェリキア−コリ及びバスルス番ズ
ブチリス（その両者は、通常このような遺伝子を有しな
い）へ移動されるやり方で、位置されそしてうまく処理
されている。イー・コリ及びピー・ズブチリスの遺伝子
工学由来の菌株は、毛虫（ｃａｔｅｒ−ｐｉｌｌａｒ　
）に対して有毒なδ−エンドトキシン蛋白を生成する。

その上、蛋白は結晶状構造に組み立てられる。変性した
ビー・ズブチリス菌株において、クローン化ＤＮＡは、
ｂｙ長相においてδ−エンドトキシン蛋白の発現を開始
し、その発現は、それが親の菌株ビー・ツリンギエンシ
スにおける叩り、胞子形成段階にのみ限定されない。こ
れは、殺虫剤の生産のコストに有効な手段をもたらす。

（宿主細胞培養及びベクター） ＤＮＡクローニング及び発現に用いられるイー・コリ菌
株は、特定のクローニングベクターのそう人により与え
られる適切なマーカー例えばアンピシリン抵抗菌を選択
させる。ベクターとして用いられるプラスミドは、又マ
ーカー例えばガラクトシダーゼ活性を含むが、その存在
又は不存在は、そのマーカー遺伝子への外来のＤＮＡの
そう人を示す。菌株例えばＪＭ８３又はＪＭＩ　０５　
Ｃメツシング（Ｍｅ−ｓｓｉｎｇ　）、１９８１　）及
びプラスミド例えばｐＵｃ８及びｐＵＣ９（ビエラ（Ｖ
ｉｅｒａ　）及びメツシング、１９８２）は、Ｂ、ｔ、
ＤＮＡをクローンするのに極めて有用であることが分っ
た。

バクテリオファージラムダベクターｉ？１．ｉ　、ｔば
ラムダ１０５９〔カー７（Ｋａｒｎ　）ら、１９８０）
は、又Ｂ、ｔ、ＤＮＡのクローン化に用いられた。もし
外来のＤＮＡがそれらのゲノムへそう人されレッド及び
ガム角伝子を含むフラグメントを置換するならば、これ
らのベクターはＰ２ｆｒ４原にのみ成長する。

クロー二／グ及び発現に用いられるバチルス−ズブチリ
ス菌株は、元来抗生物質に感受性がある。しかし、これ
らの感受性菌株への特定のプラスミドの導入は、特定の
抗生物質へ抵抗性を与える。ビー・ズブチリス菌株ＰＳ
ＬＩ〔オストロフ（Ｏｓｔｒｏｆｆ　）及びペン（Ｐｅ
ｎｅ　）、１９８３）は制限マイナス修飾マイナス、ｒ
ｅｃＥ４菌株であり、そして安定な形質転換表現型を示
すものと主張される。他の組換え欠損菌株（ｒｅｃＥ４
　）であるバチルス菌株ＢＤ２２４そして成る胞子形成
欠損変種も又用いられた。

クロラムフェニコール及びカナマイシンに対する抵抗性
を与えるベクターｐＢＤ６４、ｐＵＢｌｌｏ及びｐ　Ｃ
１９４の組換えプラスミドは、Ｂ、　ｔ、　　）キシン
遺伝子をクローンするのに用いられた。ｐＢＤ６４のユ
ニークなりｇｌ　ｕ部位への外来のＤＮＡセグメントの
そう人は、カナマイシン抵抗性への遺伝子を不活性化す
る。

（本発明の好ましい態様に用いられる方法ン１．０ＮＡ
Ｉ！！！造 クローニング用のビー・ツリンギエンシスＤＮＡｔ−１
７”ラスミド及び染色体ＤＮＡの両方を生成する５ＤＳ
−フェノール法によす単離する。ビー・ツリンギエンシ
スのプロトプラストを６０°でナトリウムドデシルサル
フェートにより溶解する。溶解物は、次にフェノールに
より、次にクロロホルム伸出そしてエタノール沈でんに
より脱蛋白される。

ｚ　ビー・ツリンギエンシスＤＮＡのラムダ・クローニ
ング Ｂ　ａｍＨＩ　　により切断されたラムダ１０５９［ベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
　ｎｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒ　ｉｅｓ　）　
）のＤＮＡを１対１のモル比でビー・ツリンギエンシス
の８２ｍフラグメントへ結合される。約０．３／ｍｃｇ
の結合した混合物は、バイオチク（ＢｉｏＴｅａ　）か
ら売り出された「パック遺伝子」混合物を用いて、ファ
ージ粒子へ一括される。組換えファージは、Ｐ２溶原を
有するイー・コリＱ３５８　（ベセスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ）へ吸収される。

３、ＤＮＡのゲル電気泳動 ＤＮＡ７５ｆｌ晩１５−２５Ｖ又は１〜４時間８０〜１
２０Ｖの電圧でｐＨ７，６で５ｍＭ酢酸ナトリウム、２
ｍＭｇＤＴＡ及び４０ｍＭトリス中の０．７５〜１．２
％アガロースのゲル中の′ｎ℃気泳動によシ分離される
。

４、　　ＤＮＡ７ラグメントのサイズ分離制限ヌクレア
ーゼによる分解により生成され７’ｃＤＮＡフ２グメン
トは、ゲル電気泳動によシ分離され、そして臭化エチジ
ウム染色により視覚化される。所望のサイズのＤＮＡ分
子を含むゲルの領域を削り取り、マイクロ遠心分離チュ
ーブに入れ、−７０℃で凍結する。解凍後、アガロース
をガラス棒で砕く。水を加えて全容量（アガロース及び
液体）を０．５−とする。懸濁物上フェノールで２回、
クロロホルムで１回抽出し、エタノールにより沈澱させ
る。

５、イー・コリの有効な細胞の製造 ３７℃でＬＢ培地で成長したイー・コリ細胞を約５×１
０７細胞／ａｔの警度でスピンダウンさせ、そして局容
量の（ＣＴＢ）冷形質転挨緩衝液（４５ｍＭＭｎＣ／４
．６０ｍＭｃａｃｔｚ、１００ｍＭＲｕＣ２ｚ、４０ｍ
ＭＫＯＡｃ、ｐＨ６，２及び１５チしよ糖−滅菌濾過）
によシ洗う。ベレットを４容量のＣＴＢに再懸濁し、１
０分間氷に保ち、０．０２＊１！のＤＭＳＯをそれぞれ
の０．５　ｍｅの再懸濁細胞へｙ’ｔｎえ、そしてそれ
らが形質転換へ用いられるまで一７０℃で凍結する。

６、制限分解及びイー・コリ形質転換 プラスミドベクターへの外米のＤＮＡのそう人は、！１
ｊｌｌ限酵素により外米及びプラスミドのＤＮＡを開裂
し、そしてフラグメントをともに結合することＫより、
達成される。

約１ｍＣＨのＤＮＡを１〜１０単位の制限酵素により、
それら５！：３７℃で約１時間インキュベートすること
によって、開裂される。酵素製造者により特定された適
切な緩衝液を、反応混合物に含む。反応物のｄ量は、通
常２０ミクロｔでアル。インキュベーションの次に、Ｄ
ＮＡはインプロパツール（ＤＮＡが制限分析に関するゲ
ルで実験されるとき）又はフェノールの何れかで沈澱さ
れ、クロロホルムを抽出し、次にエタノールにより沈澱
させた（　ＤＮＡがさらに処理されるとき）。制限分解
物は、プラン）　（ｂｌｕｎｔ　）又はステイツキーエ
ンドの何れかを生成しうる。もしプラントに作られるこ
とが５′エキステンシヨンを有するステイツキーエンド
にとり必要ならは、開裂されたＤＮＡは、２５’Ｃ３０
分１１１１遊離のヌクレオチド及び５単位のＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ〔フレナラ（Ｋｌ　ｅｎｏｗ　）　）フ
ラグメントによりインキュベートされる。

結合（Ｉｉｇａｔｉｏｎ　）前に、開裂されたベクター
は脱燐酸化されて、自己結合を防ぐ。これは、細菌性ア
ルカリ性ホスファターゼ及び適切な緩衝液により１５分
間６５℃でそれを加熱し、次にフェノール・クロロホル
ムによシ抽出しそしてエタノールにより沈澱させること
により、行われる。特定の緩衝液中の２単位（ステイツ
キーエ／ドについて）そして１０単位（プラントエンド
について）の間のりガーゼを含む２０ミクロＬで、ＤＮ
Ａフラグメント及びプラスミド（作業しうるモル比は４
対１）を組み合わせることにより、結合が行われる。混
合物を数時間２０℃に保つ。

このように達成されたプラスミド構成物は、ＤＮＡ及び
ｌＩｇｉ胞″ｆ、混合しそして１．５分間４２℃で加熱
することにより、有効なイー・コリ細胞へ転換される。

少量の培地を加え、そして選択培地へ置かれる前に％〜
１時間３７℃で細胞を置く。プラスミドをアルカリ性加
水分解により選択されたコロニーの小さな培養から単離
する〔例えば［モレキュラー・クローニング（Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）Ｊコールド６スプリン
グ・ハーバ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏ
ｒ　）、１９８２．３６８ページに、＝エタス（Ｍａｎ
ｉａｔ’ｓ　）、フリチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ及びサムプ
ルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　）により記載されている方
法〕。プラスミドは、次に制限分解物及びゲル電気泳動
により分析されうる。

６、Ｂ、ｔ、結晶蛋白の免疫学的検出 Ｅ１．　ｔ、結晶蛋白にｔＶＦ、￥４的な抗体は、標準
的なやり方によリウサギに生成される。高純度の結晶蛋
白が抗原として用いられる。レッグラフイン（ｒｅｎｏ
ｇｒａｆｆｉｎ　）１４ｇ結晶は５Ｏ８−尿素サンプル
緩衝液に溶解され、そして１３０〜１３５Ｋｄ蛋白は５
ＤＳ−ＰＡＧＥで分解される。蛋白のバンドは、３Ｍ０
ｆ”ｆｆナトリウムにより視覚化され、そして削り取ら
れる。ゲルのスライスは、ウサギへ注入されて、免疫学
的応答を明らかにさせる。生成された抗体は、Ｂ、ｔ。

結晶蛋白に対して特異的である。

ファージコロニー及び細菌性クローンによるＢ、　ｔ、
結晶蛋白の生成は、ウサギの抗体により検出される。フ
ァージコロニーの蛋白は、培誉プレートに直接置かれた
ニトロセルロースフィルターへ結合される。細菌性クロ
ーンで生成される蛋白は、５Ｏ８−ＰＡＧＥにより分解
され、そして次に電気泳動的にニトロセルロースシート
へ移される。

Ｂ、ｔ、結晶蛋白の存在は、二Ａ（抗体技術を用いて視
覚化さレル。ニトロセルロースシート及びフィルターは
、不動化Ｂ、　ｔ、結晶蛋白へのみ結合する免疫ウサギ
血清とともにインキユベートサれる。ニトロセルロース
を、次にセイヨウワサビパーオキシダーゼとコンジュゲ
ートするヤギ・抗ウサギＩｇＧにより処理される。第二
の抗体は、ウサギ抗体のみへ結合する。パーオキシダー
ゼは、試薬、パイオーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）ＨＲ
Ｐ発色試楽と反応して、抗体がニトロセルロース上のＢ
、　ｔ、結晶蛋白へ結合するとき、色反応物を生成する
。

８、合成プローブ 合成りＮＡプローブは、ホスホルアミダイト化学〔マチ
ウシ（Ｍａｔｔｅｕｃｉ　）及びカルザース（Ｃａｒｕ
ｔｈｅｒｓ　）１９８１）ｋ用いてマニヌアル的に構成
され、そして標準のＰＡＧＥ技術により精製される。Ｂ
、　ｔ、結晶蛋白遺伝子の初めの１５棟のコーディング
ベースへ相補的なプローブは、特異的に交雑されて、そ
の配列を含むクローンされたＤＮＡとなるだろう。

９、コロニー交雑 Ｊｕｌｌ　Ｉ淘性形質転換物は、スポットされ、そして
培愛培地にｉｌｌ、かれたニトロセルロースフィルター
上で成長される。細胞は０．５　Ｍ　ＮａＯＨ上でフィ
ルターを浮遊させることにより酪解され、次にＩＭ）リ
スｐＨ７，４により中和される。フィルターは、１時間
８０℃で加熱される前に、１．５ＭＮａＣＬ、０．５Ｍ
　トリス（ｐＨ７，４）により処理される。フィルター
を先ず６Ｘ８−８Ｃ中で洗い、そして５０ｍＭトＩＪス
（ｐＨ８，０）、１ＭＮａＣ２，１ｍＭＥＤＴＡ及び０
．１％ＳＤＳ中で洗う。フィルターを３時間３２℃で５
０ｍＭトリスｐＨ７，４、ＩＭＮａＣｔ、１０ｍＭＥＤ
ＴＡ、５Ｘデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　）の溶液、
０．１％ＳＯ８，子ウシ胸腺ＤＮＡ０．１■／ｍｅ中で
予備交雑する。フィルターを同一の溶液（合成プローブ
又は”Ｐ−ＡＴＰによりラベルされたニック翻訳プロー
ブを含む）中で３２℃で交雑される。プローブは、フィ
ルターを２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ及び０．１％Ｎａ
ピロホスフェートにより洗うことにより除去される。プ
ローブへ交雑されるクローンは、オートラジオグラフィ
により確認される。

ｉｏ、昆虫毒性テスト クローンは、細胞抽出物を昆虫主としてトリコブルシア
・＝（Ｔｒｉｃｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　）へ与えること
により、毒性についてテストされる。凍結乾燥されたフ
ァージ溶解物及び凍結乾燥したａＩ菌性超音波処理物を
、昆虫の餌に内接混合される。カーボネートＤＴＴ緩衝
液に溶解された細胞抽出物を、蛋白含ｔ１Ｘについて測
定し、そして餌と混合して希釈曲線を生成して、蛋白の
有効性をテストする。新しく脱皮した第三令のＴ、旧を
次に固型の餌に置１、そしてその成長を１週間測定する
。有毒なサンプルは、高濃度で昆虫を殺すか、又は低濃
度でその成長を妨げる。サンプルの相対的砧性は、コン
トロールテストにおいてＢ、　ｌａ結晶蛋白の公知の量
と比較される。

１１、結晶の製造 Ｂ、　ｔ、のパラスボラル（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ　）
結晶は、シアープ（５ｈａｒｐｃ　）ら（１９７５）の
方法に従って、レッグラフイン−７６、ナトリウムジア
ドリゾエートの直線的に行われる匂配で精製される。胞
子形成が完了するまでＢ、　ｔ、培養物は成長する。細
胞、胞子及び結晶は、遠心分離により集められ、そして
水洗される。ペレットは少量の水に移されそして超音波
処理される。混合物は５０％リノグラフィン及び水の溶
液を通ってペレット化される。この方法は、今や主に結
晶及び胞子を含むペレットにより繰返される。ペレット
は、次に水に移され、超音波処理され、そして６２〜６
７俤リノグラフイン・７６直線匂配上に重ねられる。胞
子のバンドより密でない結晶のバンドは、集められ、そ
して純粋な結晶が得られるまで、方法を繰返す。

矢に結晶を数回水洗してリノグラフィンを除き、４℃に
貯蔵する。

已、電子顕微焼倹査用のバチルス及びイー・コリの処理
材製した電子顕微鏡グレードのゲルタールアルデヒド〔
テッド・ベラ・カンパニー（Ｔｅｄ　Ｐｅ１ｌａ　Ｃｏ
、）、タスチン（Ｔｕｓｔｉｎ　）、カルフォルニア〕
を細胞懸濁液に加え（最終濃度、０．２％）、混合し次
に室温で２時間インキュベートした。予備固定期間中、
水中の２％寒天を先ず煮沸し次に水浴中で４０℃に冷却
する。細胞懸濁液を１５００Ｘｊ’でペレットにし、上
澄み液を捨て、ペレットを含むチューブを水浴に入れそ
して４０℃で約５分間平衡させる。予め温ためたパスツ
ールピペットを用いて、約０、５　ｍｌの寒天を細胞ペ
レットに移し、そして混合して細菌の細胞を寒天中に懸
濁させる。一部の懸濁液を次にピペットの先に引き上げ
、室温に短時間冷却させそして氷冷したフォスフェート
緩衝された３％ゲルタールアルデヒドに加える。

、１４′１１菌を含む得られた円筒状の固定化した寒天
プラグをさらに３〜１８時間ゲルタールアルデヒド中で
固化し、フォスフェート緩衝液中で洗い、小さな片に切
断する。サンプルを次に７オスフエート緩衝した１チ四
酸化オスミウム中で１時間かけて後固定し、濃度の異る
エタノール中で脱水し、そしてエポ７ｍアシルダイト（
Ｅｐｏｎ−Ａｒａｌｄｉｔｅ　）埋込み混合物に埋込む
。薄く切った後に、サンプルをウラニルアセテート及び
くえん酸鉛により染める。細菌を、１０〜３ＱＯＯＯ倍
の倍率で、結晶包接の存在について電子顕微鏡により検
査する。

ｌλヒビ−ズブチリスの形質転換 有効な細胞が、デュブナウ（Ｄｕｂｎａｕ　）及びダビ
ド７・アベルソｙ　（Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏ
ｎ　）　（１９７１）により６己滅された如く、作られ
る。プラスミド形質転換は、コンテント（Ｃｏｎｔｅｎ
ｔｅ　）及びテユブナウ（１９７９）により記載された
如く、行われる。プラスミドＤＮＡ及び有効な細胞は、
１ｍｌ当り１〜３ｍｃｇＬｖＤＮＡを用いて、３０分間
３７℃でイフキュベートされる。ＥＧＴＡ（１ｍＭ　）
が有効な細胞・ＤＮＡ混合物中で用いられる。抗生′物
質抵抗菌の選択は、発現を許す３７℃における９０分間
の遅れ後のＴＢＡＢ寒天中寒天−バーレイ法により行わ
れた。クロラムフェニコール及びカナマイシンの選択的
濃度は５ｍｃｇ／ｍｌである。

１４、ビー・ズブチリスコロニー交雑 ピー・ズブチリス形質転換物は、クロラムフェニコール
（５ｍｃｇ／ｄ）を含むＴＢＡＢ寒天プレートに植付け
られ、そして２０〜３６時間３０℃でのインキュベーシ
ョンにより成長させられる。ニトロセルロースフィルタ
ーを寒天の表面に１はき、そして５分後注意深く取り去
り、そして７−のリゾチーム（２Ｔｑ／ｄ）に陵した３
枚のウオットマン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ　）　＃　１フイ
ルターの上にコロニーの側を上にして置き、次に３７℃
で３０分間インキュベートする。ニトロセルロースフィ
ルターを、次に連続して１０分間変性緩衝液（０，５Ｎ
　ＮａＯＨ，２，５Ｍ　ＮａＣ１）を含むベトリ皿、そ
してｉｏ分間中和緩１ｉｌｉ液（０，５Ｍトリス、３Ｍ
ＮａＣｔ）を含むペトリ皿に移す。それらを次に２ＸＳ
ＳＣにより手短かに洗い、そして２時間８０℃で加熱す
る。フィルターを５分間６ｘＳＳＣＫ浸し、そして１０
分ｌｌ３１５０　ｍＭ　）リス−ＣＬ、ｐＨ８，０，Ｉ
ＭＮａＣＬ、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．１ｉＳＤＳ中で洗
う。それらを、次に［シール・アミール（５ｅａｌ　−
ａ’ｍｅａｌ　）　Ｊ袋中で４２℃で２時間５０％ホル
ムアミド、５×デンハルト溶液、ｓＸｓｓｐｇ、０．１
％ＳＤＳ及び１２５μｆＩ／−子ウシ胸腺ＤＮＡを含む
浴液中で予備交雑する。１５１１１の予備交雑混合物を
除去し、そして適当なニック翻訳プローブを加え、そし
てインキュベーションを４２℃で１５時間続ける。フィ
ルターを５ＳＰＥ（０，１８ＭＮａＣ１，０，０１ＭＮ
ａｐｐ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）によシ繰返し洗って、
プローブがなくなる迄洗う。風乾したフィルターを次に
コダック（Ｋｏｄａｋ　）　Ｘ−オマト（ｏｍａｔ）フ
ィルムに曝す。

１５、毒性テスト用のビー・ズブチリス抽出物ウェスタ
ーン＠　７’　ロツテイ／グ（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏ
ｔｔｉｎｇ）により同定される発現によりそしてサウザ
ン交雑により正と同定されるクローンを、２日間３０℃
でＬＢ培地の１を培養物中で成長させる。培養し細胞ベ
レットを洗った後に、それを３分間超音波処理し、凍結
し乾燥させる。この粉末状製品を昆虫に対する毒性につ
いてテストする。

（好ましい態様の一般的な記述） イー・コリ及びビー・ズブチリス菌を、下記の実荻計画
に従って、遺伝子工学的に処理して殺虫性蛋白を生成さ
せる。

（１）　　Ｂ、　ｔ、　Ｒ伝子のプラスミドライブラリ
ーが、Ｂ、ｔ、からの酵素により制限されたＤＮＡフラ
グメントをプラスミドｐＵＣ９の普偏的なりローユング
部位へ結合することにより得られた。

（２）ｌＪｃ９のＢ、　ｔ、遺伝子のライブラリーがイ
ー・コリ菌株ＪＭ８３の有効な細胞へ導入され、そして
形質転換物がコロニー交雑によシ取り上げられて合成プ
ローブとなった。

（３）　ＨＢ　１からの１６．５ＫｂプラスミドｐＨＢ
−１をｐＨＢＨＥと名付けられるａ２Ｋｂプラスミドへ
小さくする。

（４）ＨＢＨＥから作られる蛋白抽出物が、Ｂ、　ｔ、
　　トキシン抗体と交差反応する１３！１４０００ダル
トン蛋白を含むことが示された。

（５）ＨＢＨＨの細胞抽出物は毛虫に対して有毒である
ことが示された。

（６）ｐＨＢＨＥからのトキシン遺伝子がプラスミドベ
クターｐＢ０６４へ結合され、そして形質転換によりビ
ー・ズブチリスへ導入された。

（７）ビー・ズブチリス形質転換物をコロニー交雑によ
りスクリーニングしてｐＨＢＨＥの”Ｐｔ−ラベルされ
たフラグメントとした。

（８）対立する定位にそう人されたトキシン遺伝子を有
することが示される形質転換物ＡＢＳ−５及びＡＢＳ−
９は、すべての成長相でＢ、ｔ、トキシン抗体と交差反
応する１３へ０００ダルトンの蛋白を生成した。

（９）二錐体結晶構造がＡＢＳ−５及びＡＢＳ−９に見
い出された。

（ＩＱ）　Ａ　Ｂ　Ｓ　−５及びＡＢＳ−９の細胞抽出
物が毛虫に対して有毒であることが分った。

（１１）ビー・ズブチリスにおけるトキシン遺伝子の発
現が、ビー・ズブチリスの胞子形成欠損変種におけるそ
の発現により確認されるように、胞子形成に無関係であ
ることが分った。

（ｇ　１３ＱＯＯＯダルトン蛋白でるる他のＢ、　ｔ、
　トキシン遺伝子を、先ずバクテリオファージ１０５９
にＨ，ｔ、　ｘｌＪ伝子のライブラリーを作りそしてｐ
ＵＣ９ヘサブクローニングすることにより、イー・コリ
にクローンした。

（１３）プラスミドｐＨＣ４５を含むイー・コリ形質転
換物ＨＣ４５は、１３α０００ダルトンの蛋白を生産す
ることを示した。

（１４）　ｐ　Ｈ０４５からのトキシン構造遺伝子をｐ
ＨＢＨＥのプロモーター領域と融合させ、そして組換え
プラスミドｐＢｓＷ７を形質転換によりイー・コリへ導
入した。

（１５）プラスミドｐＢＳＷ７を含むイー・コリ菌株Ｂ
　ＳＷ７は、Ｂ、　ｔ、　　トキシン抗体と交差反応す
る１３ＱＯＯＯダルトンの蛋白を生成することを示した
。

（１６）　ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｗ　７からの複合遺伝子をｐＢ
Ｄ６４ヘクローンし、そして形質転換によりビー・ズブ
チリスへ導入した。

（１７）　耕しいビー・ズブチリス形質転換物ＡＢＳ−
５５が、Ｂ、ｔ、）キシン抗体と交差反応する１３ＱＯ
ＯＯダルトンの蛋白を生成することが分った。

ｆ１８）ＡＢＳ−５５の細胞抽出物が毛虫に対して有毒
であることが分った。

（１９）ビー・ズブチリスクローンＡＢＳ−５５は、二
錐体結晶構造を生成した。

〔実施例〕

下記の実施例は、本発明を説明するためのものであって
、制限するだめのものではない。イー・コリ、ビー・ズ
ブチリス、バクテリオファージ人−１０５９の適当な菌
株が用いられた。本発明により得られたビー・ズブチリ
スの菌株は、菌株番号５３１２０．５３１２１．５３１
２２の下にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクシ
ョンに寄託された。それらは、それぞれビー自ズブチリ
スＰＳＬＩ中のプラスミドｐＢＤ６４のＨＢＨＥＭ伝子
、シャトルベクター（ビー・ズブチリスＰＳＬＩ中のｐ
ＵＣ９及びｐＢＤ６４を含む）中の１３（１０００ｄ蛋
白についてコーディングされた遺伝子のＰｓｔサブクロ
ーン、そして宿主と−・ズブチリスＰＳＬＩのｐＢＤ６
４のＨＢＨｇプロモーターによる１３ＱＯＯＯｄ蛋白に
ついてコーディングされた遺伝子のサブクローンに相当
する。

実施例１ イー・コリにおけるビー・ツリンギエンシス変種クルス
タキｆ（Ｄ−１ジベルからの遺伝子である１３５０００
ダルト／δ−エンドトキシン蛋白のクローニング（ｇ、
　１．　Ａ、　）　Ｂ、、　ｔ、遺伝子のプラスミドラ
イブラリーの構成 ＨＤ　−Ｉ　ＤＮＡのプラスミドライブラリーは、プラ
スミドｐＵＣ９及びＪＭ８３細胞により構成された。プ
ラスミドｐＵＣ９は、制限酵素ＢａｍＨＩにより一般的
なりローニング部位で開けられた。プラスミド（６０ｎ
Ｐ）を、２単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて２０ミ
クロを反応混合物の２ｍｃｇのＢｇｌｌｌ切断ＨＤ−Ｉ
ＤＮＡと結合させた。結合した混合物を、次に有効なイ
ー・コｌＪＪＭ８３細胞を形質転換するのに用いた。Ｄ
ＮＡをｌｏｏミクロｔの細胞と混合し、混合物を１０分
間氷に保った。細胞を１．５分間４２℃でヒートショッ
クし、冷却し、４００ミクロｔのＬＢ−プロスと混合し
、２０分間３７℃でインキュベートした。細Ｊ泡を、次
に５０　ｍｃｇ／ｍ７！のアンピシリン及び４ｍ　Ｃｇ
／ａｔのキシガル（Ｘｇａｌ）を含むＬＢプレートに置
いた。ｐＵＣ９へのそう人の存在を示す白色のコロニー
を取り上げ、そしてＢ、　ｔ、結晶蛋白遺伝子の初めの
１５個の塩基に対して相補的な合成プローブを用いて、
コロニー交雑によりＢ、　ｔ、結晶蛋白遺伝子配列につ
いてスクリーニングした。得られた１６．５キロベース
の長さの組換えプラスミドをｐｉ（Ｂ　１と名付けた。

ｐＨＢ　ｌ’ｉ次にＨｉｎｃ　［１により分解し、フラ
グメントを結合によシ円形にした。結合した混合物をイ
ー・コリに形質転換により導入すると、プラスミドの集
合が生じ、その一つであるｐＨＢＨはコーデイング配列
から上へ６．３Ｋｂフラグメントを失った。このプラス
ミドをさらにＥｃｏＲＶにより分解しそして再結合させ
た。

この混合物がイー・コリへ形質転換されたとき、コーデ
ィング配列から下へ２．０Ｋｂ７ラグメントの損失がさ
らにあ！’、Ｉ）ＨＢＨＥと名付けられる新しいａ２Ｋ
ｂプラスミドを生じた。構成の配列は、第１図に示され
る。ｐＨＢＨＥを含む細菌株はＨＢＨＥと名付けられた
。

（Ｅ、１．Ｂ、）組換えイー・コリ菌株ＨＢＨＥによる
１３５０００ダルトンＢ、　ｔｏ　δ−エンドトキシン
蛋白の発現イー・コリ菌株ＨＢＨＥ及びｐＵＣ９のみを
含む菌株を、３２℃でアンピシリンを含むＬＢ培地中で
約１６時間成長させ九。蛋白抽出物を前述の「本発明の
好ましい態様で用いられる方法」（以下「方法」とする
）に記載されたように、細胞から作り、そして８％５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によシ分離した
。

：ｖ、２図からの結果は、次のことを示す。組換えプラ
スミドｐＨＢＨＥは、約１３５，０００ダルトンの大き
さの蛋白をコーディングした遺伝子を発現し、そしてこ
の蛋白はＨＤＩ結晶蛋白のそれと同じ移動度を有する。

レーン１゜２及び３は、８％５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル上で分離された、それぞれ親Ｂ、　ｔ、菌株ＨＤ
−１から、ベクターｐＵＣＱを有するイー・コリ菌株か
らそして組換えイー・コリ菌株ＨＢＨＥからの蛋白を示
す。レーン４は予め染色された高分子被標準を示す。染
色された蛋白は第２Ａ図で示され、同様なゲルのウェス
タンプロットは第２Ｂ図に示される。１３５０００ダル
トン蛋白は、Ｂ、　ｔ、　　トキシン抗体と特に反応す
るように見える。

（Ｅ、１．Ｃ）イー・コリ組換え菌株ＨＢＨＥにおける
結晶体の発生 ＬＢ培地中のＨＢＨＥの成長培盪物を、「方法」の如く
電子顕微鏡検量のために処理した。第３Ｆ図はイー・コ
リ組換え菌株ＨＢＨｇの断片の透過型電子顕微鏡写真を
示す。

明らかに、組換えイー・コリ菌株は結晶を形成するが、
親のＢ、　ｔ、菌株Ｃ第３Ｃ図）に見られるのとは同じ
ではない。

これはベクターのみを含む菌株において明白ではなかっ
た。

（Ｅ、１．Ｄ）組換えＤＮＡ含有イー・コリ菌株ＨＢＨ
Ｅからの抽出物の毒性アッセイ 毒性テストは、前述の「方法」の如く行った。餌中の１
ｑ／ｗ濃度の細胞抽出物粉末で、すべての１２匹のトリ
コプラシア・二の第三令幼虫は、４日で死んだことが分
った。

０、２５１１９　／ｍｌで、１２匹のトリコプラシア・
二の幼虫の中９匹が６日で死に、３匹は極めて弱ったこ
とが分った。

実施例■からの結果を要約すると、イー・コリの組換え
菌株ＨＢＨＥは、半ば規定された（　ｓｅｍｉｄｅｆ　
１ｎｅｄ　）結晶を形成しそして特定のＢ、　ｔ、抗体
と反応する１３５，０００ダルト／蛋白を生成する。し
かし、プラスミドベクターｐＵＣ９は、Ｂ、ｔ、抗体と
反応する蛋白を生成せず、そしてベクター中のＢ、　ｔ
、そう入物がトキシン結晶蛋白の生産をもたらすことを
示す結晶を有しない。ベクターｐＵＣ９を含む菌株から
の抽出物が毛虫に対して有毒ではな（ＨＢＨＥ抽出物が
有毒であるという事実は、ＨＢＨＥ中に発現される新し
い蛋白が毛虫に対して有毒であることを示す。

実施例■ バチルス・ズブチリスにおけるδ−エンドトキシン遺伝
子のクローニング 本実施例では、実施例■に記載されたイー・コリ組換え
プラスミドｐＨＢＨＥからのＢ、ｔ、）キシン遺伝子の
単離、バチルス・ズブチリスへのその導入並にビー・ズ
ブチリスにおけるその発現を明らかにする。

（Ｅ、１１．Ａ）　ビー・ズブチリスにおける拡大のた
めのビ−−ツリンギエンンス変種クルスタキのδ−エン
ドトキシン遺伝子を有する組換えプラスミドの構成実施
例Ｉに記載されだ組換えプラスミドｐ　ＨＢ　ＨＥを、
Ｂ、　ｔ、　δ−エンドトキシン遺伝子の源として用い
た。ベクターは、ビー・ズブチリス中にクロラムフェニ
コール及びカナマイシン抵抗性の遺伝子を含むｐＢＤ６
４〔グリップ７　（Ｇｒｙｃｚａｎ　）ら、１９８０）
であった。唯一のＢｇ１部位におけるクローニング化は
、カナマイシン抵抗性を不活性化する。ｐＨＢＨＥは制
限エンドヌクレアーゼＳｍａ１及びＨｉｎｃ■によりｗ
ｒされて、５．５及びＺ７＝？ＧＩベースの２個のプラ
ントエンドの７ラグメントの発生をもたらした。ベクタ
ーｐＢＤ６４は、８ｇｌｎ酵素による分解により、その
唯一のＢｇ川用位で線状にされた。発生したスティンキ
ーエンドは、ＤＮＡポリメラーゼ■のクレナウンラグメ
ントを用いて充足された。

１ｍｃｇの直線化されそしてプラントされたｐＢＤ６４
を次にｐ　ＨＢ　ＨＥのＨｉｎｃ　ＩＩＩ　−Ｓｍａ　
に爪分解′吻約４ｍｅｇと混合した。結合の８度は、ア
ガロースゲル１に気泳動によりモニターされた。結合さ
れたＤＮＡを、次に形質転換により、ビー・ズブチリス
菌株ＰＳＬＩの有効な細胞へ導入した。得られたクロラ
ムフェニコール抵抗性コロニーを、Ｈｉｎｃ■及びＳｍ
ａＩによるｐ　ＨＢ　ＨＥの二重分解から得られる”Ｐ
ｋラベルした５、５Ｋｂのフラグメントを用いて、コロ
ニー交雑により、δ−エンドトキシン遺伝子の存在につ
いてスクリーニングした。第４図は、この棟の代表的な
実験を説明する。図面の右側に示されるＸ線フィルムの
黒い領域は、プローブへ交雑されたＤＮＡを含むコロニ
ーを示す。これらは、マスターコロニープレート上のコ
ロニーと配列されて実在を同定された。目的物として同
定されたコロニーは、３ｍｃｇ／−のクロラムフェニコ
ールを含むリッチ・メディア（ｒｉｃｈ　ｍｅｄｉａ　
）アガー（Ａｇａｒ）プレート（ＴＢＡＢ　）上の単一
のコロニーについてすしをつけた。高感匣プラスミド製
品をこれらの目的物の成るものから作り、そしてそれら
にそう人されたＢ、ｔ、トキシン遺伝子の存在は、サウ
ザン交雑により確認された。第５Ａ図は、０．８％アガ
ロースゲル上で電気泳動されたプラスミドを示し、そし
て第５Ｂ図は、同一のゲルのサウザンプロットのオート
ラジオグラムを示す。レーン１はクローニングに用いら
れたベクターｐＢＤ６４を示し、そしてレーン２〜５は
形質転換物の成るものを示す。形質転換物はＢ、ｔ、）
キシン遺伝子そう人物を含むが、ベクターそれ自体はそ
うではないことは明らかである。

制限酵素によるこれらの形質転換物の成るものからの組
換えプラスミドの図は、そう入物が何れかの定位に存在
すること全軍した。それらの一つは、定位Ａに存在しそ
してｐＡＢｓ−５と名付けられ、対立する定位の他のも
のは、ｐＡＢｓ−９と名付けられた。構成の配列は第６
図に示される。

他の組換えプラスミドｐＡＢｓ−５９は、ｐＨＢＨＥの
Ｈｉｎｃ　［１−Ｓｍａ　に重分解物′５ｒｐＢＤ６４
の唯一のＰｖｕ■部位へ結合させ、有効なＰＳＬＩ細胞
へ形質転換させ、そしてコロニー交雑及びコロニーイム
ノプロッティングによりスクリーニングすることにより
構成された。

（、Ｅ、Ｉｌ、Ｂ）ビー・ズブチリスの遺伝子工学由来
の菌株によるδ−エンドトキシンの発現 組換えプラスミドｐＡＢＳ−５、ｐＡＢＳ−９、ｐＡＢ
ｓ−５９を含む菌株を、それぞれＡＢＳ−５、ＡＢＳ−
９、ＡＢＳ−５９と名付ける。ＡＢＳ−５、ＡＢＳ−９
、ＡＢＳ−５９を、振盪培養器で３０℃で１６時間、Ｓ
ｍａｇ／ｒｎｌのクロラムフェニコールを含むルリアプ
ロス培地中で成長させた。細胞を取り出し、緩衝液Ａ（
６０ｍＭＮＨ４Ｃ２１２０ｍＭトリス−１（Ｃ１ＸｐＨ
７，５，１ｍＭＥＤＴＡ、６ｍＭβ−メルカプトエタノ
ール、２１１ａＰＭＳＦ、１０％グリセロール及びＩＭ
Ｋｃｔ）で１回、そしてＴＥＳＰ緩衝液（３０ｍＭ）リ
ス−ＨＣ１，ｐＨ７，６，５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＮ
ａＣ２，２ｍＭＰＭＳＦ）で２回洗った。細胞をＴＥＳ
Ｐ中のｌ　Ｗ　／１ｍｅのリゾチーム中でｆａ解し、等
客間：の２×サンプル緩衝液（１２Ｍ尿素、５チＳＤＳ
、２チーメルカプトエタノール、０．２５Ｊｌリス−Ｈ
Ｃｔ、ｐＨ６，８）と混合し、１０分間煮沸し、冷却し
そして遠心分離した。透明な上澄みｔＬを、５ＤＲ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により蛋白について分析
した。

第７Ａ図は、分離されそして８％ポリアクリルアミドゲ
ル上で染色された蛋白を示す。第７Ｂ図は、蛋白のウェ
スター／プロッティングを示す。

菌株ＡＢＳ−５、ＡＢＳ−９、ＡＢＳ−５９（レーン３
゜５．８）は約１３５０００ダルト／の蛋白を発現し、
そしてこの蛋白がａ、　ｔ、結晶蛋白に対する抗体と特
に反応することは、図面から明らかである。レーンｌ及
び７Ｖｉ、イー・コリクローンｐＨＢＨＥから並にベク
ターｐＢＤ６４のみを含むＰＳＬ菌株からの蛋白を示す
。親の菌株ＰＳＬＩ又はベクターｐＢＤ６４のみを有す
る菌株の何れも、抗体と反応する蛋白を発現しない。

ＡＢＳ−５及びＡＢＳ−９による充分に限定された二錐
体結晶構造の形成は、透過型電子顕値鋤により認められ
、そして第３Ａ及び３Ｂ図に示される。

下記の事実は、又と−・ズブチリスにクローンされたＢ
、ｔ、トキシン遺伝子が、１３５０００ダルトン蛋白の
発現のために、それ自体のプロモーターを用いることを
示している。

Ｌ　トキシン遺伝子が対立する定位にそう人された２ｍ
の組換えプラスミドであるｐＡＢｓ−５及びｐＡＢｓ−
９が、１３！１ｘｏｏｏダルトンの蛋白を発現する。

２、ｐＢＤ６４ベクターのカナマイシン及びクロラムフ
ェニコール抵抗性遺伝子の両方から離れて存在する唯一
のｐｖｕ■部位へそう人されたトキシン遺伝子を有する
ｐＡＢｓ−５９は、又同じ大きさの蛋白を発現する。

（ｇ、Ｉｌ、ｃ）成長の異った段階におけるＡＢＳ−５
中のＡＢＳ−５を、５ｍｃｇ／１ｙｒｅのクロラムフェ
ニコールを含むＬＢ培地中で、３０℃で１晩（約１６時
間）成長させた。

ＨＤ−１（ジベル）の培養物も又ＬＢ培地で成長させた
。

一部を朝に１００倍に希釈してそれぞれの新しい培養物
へ加えた。そして成長をクレツ）　（Ｋｌｃｔｔ　）比
色計によりモニターした。一部を一定の間隔で両方の培
養物から取り、抽出物を実施例Ｅ、　Ｉｌ、　Ｂに記載
されたように作り、蛋白を８％５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によシ分離した。第８図は、２棟の培
養物の成長曲線を示す。

第９Ａ図は、染色された蛋白を示し、第９Ｂ図は、蛋白
ノウニスターンプロティングを示す。

ビー・ズブチリス菌株が成長相の初めに発現を開始する
のに対し、ＨＤ−１（ジベル）細胞は明らかに胞子形成
まで発現を開始しないことは、図（記述のための図の記
号参照）から明らかである。レーン１〜９は、ビー・ズ
ブチリスクローンＡＢＳ−５からの蛋白を示し、レーン
１１〜１９は、親のＢ、　ｔ、菌株ＨＤ１−ジペルから
の蛋白を示す。

（Ｅ、　Ｉｌ、　Ｄ　）電子顕微鏡検査ＡＢＳ−５繭株
を、３０℃で１晩（１６時間）、５ｍｃｇ／−のクロラ
ムフェニコールを含むＬＢ培地で成長させ、そして１０
０倍の希釈によりνましい培地へ、朝培嚇した。一部を
定期的に除き、上述の「方法」に記載した如く、透過ｍ
電子顕微鏡用に処理した。

第１０図は、異った成長段階におけるＡＢＳ−５の培養
４勿の若干の也子顕倣■３５喀片を示す。比較のために
、ＨＤ−１（ジベル）菌株を又ＬＢ培地で成長させ、そ
して異った成長段階で除去した一部を同様に透過型電子
顕微鏡用に処理した。第４１図は、異った段階における
Ｂ、　ｔ、の電子顕微鏡断面を示す（記述用の図面の記
号参照）。

小さな結晶構造の出現は、ビー−ズブチリスクローンに
おいて１３時間で明らかである力ζ一方Ｂ、　ｔ、にお
いて明らかに同定しうる結晶が成長の約２０時間抜出現
するように思われる。

（Ｅ、■、Ｅ）　ビー・ズブチリスの組換え欠損変種に
おける組換えプラスミドｐＡＢｓ−５の発現 組換えプラスミドの安定性及び結晶の形の殺虫性蛋白の
発現が、菌株ＰＳＬＩの性質によらないことを示すため
に、組換えプラスミドを異った背景をＭする他の菌株へ
移動させることは、必要であった。

ビー・ズブチリス菌株ＢＤ２２４は、ニューヨーク市の
ビブリッターヘルス番リサーチ・インステイテユート（
Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ
５ｔ口ｕｔｅ　）により提供された。それは組換え欠損
変＜；＋＋であり、そしてそのマーカーＶｉｔｒｐｃ２
ｒｅｃＥ４　ｔｈｒ　−５である。

ＢＤ２２４細胞は、前述の１一方法」に記載された如く
、通常のやゆ方により有効にされた。組換えプラスミド
ｐＡＢｓ　−５は、形質転換によりＢＤ２２４の有効な
細胞へ尋人された。形質転換物は、クロラムフェニコー
ル抵抗性について選択された。形質転換物から単離され
たプラスミドＤＮＡは、ｐＡＢｓ−５と同じであること
が分った。

この菌株はＡＢＳ−５８と名付けられた。細胞抽出物は
、ＬＢ培地中のＡＢＳ−５８の成長培養物からの蛋白分
析についてなされ、そして蛋白は８％５Ｏ８−ポリアク
リルアミドゲル上の眠気泳動により分離された。染色し
た蛋白はｇ７Ａ図のレーン４に示され、そしてウェスタ
ーンプロットは第７Ｂ図のレーン４に示される。ＡＢＳ
−５８がＢ、　ｔ、におけると同じ大きさの蛋白を発現
し、そしてそれがＢ、　ｔ、結晶蛋白に対する抗体と交
差反応することは、これから明らかである。

（Ｅ、　Ｉｌ、　Ｆ　）ビー・ズブチリスの胞子形成欠
損変ａ［Ｋおける組換えプラスミドｐＡＢＳ　−９の発
現ビー１ズブチリスにクローンされたトキシン遺伝子が
、実際に胞子形成に無関係であることを明らかにするた
めに、ビー・ズブチリスの非胞子形成菌株におけるその
発現をテストするのが必要であった。

ビー・ズブチリス菌株ｌ８１６０は、ニューヨーク市の
パブリック・ヘルスーリサーチーインステイテユートに
よシ提供された。この菌株は、初期の胞子形成変隙であ
り、そしてマーカーｔｒｐ　Ｃ２ｐｈｅＡ　５ｐｏＯＨ
１５を有する。

ｌ５１６０の有効な細胞は、上述の「方法」に記載され
た如く製造された。ｐＡＢｓ−９組換えプラスミドを、
形質転換によシこれらの有効な細胞へ纒入した。形質転
蹟物をクロラムフェニコール耐性について選択した。単
離されたプラスミドＤＮＡは、ＡＢＳ−９におけるのと
同一であることが分った。プラスミドｐＡＢｓ−９を含
むこの非胞子形成菌株は、ＡＢＳ−５７と名付けられる
。

細胞抽出物をＡＢＳ−５７より作り、そして８％５ＤＳ
−ポリアクリルアミドケル上の電気法・ゆにより蛋白に
ついて分析した。染色した蛋白を第７Ａ図のレーン６に
示し、そして同じ蛋白のウエスタンプロッＩｆ第７Ｂ図
のレーン６に示す。ＡＢＳ−５７のプラスミドｐＡＢｓ
−９は、結晶蛋白に対する抗体と免疫学的に反応性の、
約１３５０００ダルトンの蛋白を発現しないことは、図
から明らかである。

従って、胞子形成は、ビー・ズブチリスのδ−エンドト
キシンの発現には、不必要でるる。

（Ｅ、１１．Ｇ）根コロニー化ビー・ズブチリス菌株Ａ
−１３における組換えプラスミドｐＡＢＳ−９の発現Ａ
−１３は、オーストラリアでスクレロチウム・ロルシイ
（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ　Ｒｏｌｓｉｉ　）から単離さ
れたビー・ズブチリス菌株であり、そしてそれはビーナ
ツツ種子の処理に工業的に用いられている。Ａ−１３は
、ビーナツツの根をコロニー化し、発芽を増大させ、根
の病気を低下させることで知られている。

組換えプラスミドｐＡＢＳ−９を、−膜化された形質導
入ファージＡＲ９（ベリアエバ（Ｂｅ１ｙａｅｖａ　）
及びアジズペキア７　（Ａｚ　ｉ　ｚｂｅｋｙａｎ　）
、１９６８）を用いて、形質導入によりＡ−１３へ導入
した。選択は、５岬／−を用いてクロラムフェニコール
についてされた。これらの形質導入物から単離されたプ
ラスミドＤＮＡは、ｐＡＢｓ−９に似ていることが分っ
た。この根コロニー化ビー・ズブチリス菌株Ａ−１３（
ｐＡＢＳ−９を含む）をＡＢＳ−６５と名付ける。

ＡＢＳ−６５から作られた細胞抽出物を、８％５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル上の電気体動により蛋白につい
て分析し、そして１３５，０００ダルトｙδ−エンドト
キシン蛋白の発現は、ウェスターンブロッティング分析
によシ確認された。

（Ｅ、　Ｉｌ、　Ｈ）　ビー・ズブチリスにおける組換
えプラスミドｐＡＢＳ−６０及びｐＡＢｓ−６１のクロ
ーニング及び発現 ２楕の他の組換えプラスミドが、他のビー・ズブチリス
プラスミドｐｃ１９４（ホリンスウィッチ（Ｈｏｒｉｎ
ｓｗｉｃｈ　）及びワイスプＡ／−Ａ　（Ｗｅｉｓｂｌ
ｕｍ　）、１９８２　］を用いて構成された。このプラ
スミドは、２個の唯一のクローニング部位Ｈｉｎｄｍ及
びＨａｅ　ＩＩＩを有する。

Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ又はＨａｅ　ＩＩＩの何れかで直線化
されたｐｃ１９４プラスミドＤＮＡ１＋１９をｐＨＢ）
ｉｅのＨｉｎｃ　ｎ　拳Ｓｍａ　ｌ二重分解物（ｇ、　
ｕ、　Ａ参照）４μｔと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーセと
一緒にした。形質転換物の形質転換、選択及び同定は、
Ｅ、Ａ、Ａに示されたのと同じやり方によった。

ｐｃ１９４のＨｉｎｄ　Ｉ１１部位にそう人されたトキ
シン遺伝子（ｐＨＢＨＥのＨｉｎｃ　Ｉｆ　ｍ　Ｓｍａ
　Ｉ　７ラグメント〕をｐＡＢＳ−６０とし、Ｈａｅｍ
部位へそう人されるものをｐＡＢｓ−６１とし、これら
のプラスミドを含む菌株をＡＢＳ−６０及びＡＢＳ−６
１とし、そしてこれらの菌株の細胞抽出物は、１３５，
０００ダルトン蛋白を示し、それはＢ、ｔ、トキシン抗
体と交差反応し、発現のレベルはｐＡＢｓ−５及びｐＡ
Ｂｓ−９からのものと同じであることが分った。

実施例ｍ イー・コリにおけるビー・ツリンギエンシス変株クルス
タキＨＤ１−ジペルからの遺伝子を明らかにする１３Ｑ
ＯＯ。

ダルトンδ−エンドトキシン蛋白のクローニング（Ｅ、
［［１，Ａ）　Ｂ、ｔ、Ｒ伝子のラムダ１０５９ライブ
ラリーの構成及びイー働コリにおけるトキシン遺伝子の
クロー二／グ １３ＱＯＯＯｄ有毒蛋白をコードされたＢ、　ｔ、のＨ
Ｄ１−ジペル鉋株からの遺伝子をバクテリオファージラ
ムダ１０５９ヘクローンした。Ｂ、ｔ、ＤＮＡはＢ　ｇ
　［［Ｉにより切断され、そしてＢａｍＨＩにより切断
されたラムダ１０５９ＤＮＡと混合した。Ｔ４’Ｊガー
セ（４０単位）を加え、反応緩衝液により最終容量を２
０ミクロｔとした。結合反応を１６℃で１晩行った。結
合したＤＮＡ溶液のにを５０ミクロｔのラムダパツケツ
ジング抽出物〔バカゲン（Ｐａｋａｇｅｎｅ　）、バイ
オチック（Ｂｉｏｔｅｃｈ　）社〕へ加え、そして混合
物を２時間２２℃に保った。■＃ｌ１０５Ｍ緩衝液を保
存剤としての２５−のクロロホルムとともに加えた。

０、１　ｍｌのｌｏ−１希釈のパッケージされた組換え
ファージをソフト寒天中でイー・コリＱ３５９とともに
混合し、そして５枚のＮＺＡプレートのそれぞれに置い
た。合計で３．５Ｘ１０３　プラークが得られた。ファ
ージを次に８２ｍのニトロセルロースフィルターに移し
た。フィルターヲ寒天の表面に適用し、そして２２℃で
２時］＃Ｊ１ファージを結合させた。結合された７アー
ジを有するフィルターを３％ゼラチン溶液に浸し、次に
混合された（３５，０００ｄ及び１３ａｏｏｏｄＢ、ｔ
、結晶蛋白に対するウサギ抗体を含む溶液に浸した。結
合された抗体は、セイヨウワサビパーオキシダーゼとコ
ンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体を結合し、次にイム
ノプロット（バイオ−ラッド）延色試薬により発色させ
ることにより、検出された。Ｂ、　ｔ、結晶蛋白を含み
そして発現する組換えウィルスのプラークは、フィルタ
ー上で紫色となった。フィルター上で目的物と並ぶプラ
ークを寒天プレートから取り上け、プラークを精表し、
クロロホルムを含む８Ｍ緩衝液に貯えた。

ＤＮＡを組換えファージラムダ８４Ｂから単離し、後者
は強力なイムノプロット反応を有し、そして制限酵素５
ａｕ３Ａにより部分的に分解された。ＤＮＡフラグメン
トは、ＢａｍＨＩにより切断されたプラスミドｐＵＣ９
へ結合された。得られた組換えプラスミドを次にイムノ
プロットアッセイによシスクリーニングした。ＬＳＳ２
と名付けられた目的物のクローンの一つは、８．３Ｋｂ
のＢ、ｔ、ＤＮＡを含み、そして１３０ＫｄＢ、ｔ、結
晶蛋白をコーディングされた。

制限ヌクレアーゼＨｉｎｃ　Ｉｔによる分解により発生
したＬＳＳ２そう人ＤＮＡの７ラグメントは、Ｈｉｎｃ
　ＩＩ　Ｉｃより同様に切断されたｐＵＣ９へサブクロ
ーンされた。このサブクローンけ１３０Ｋｄ蛋白にコー
ドしそしてｐＨ０４５と名付けられる。

ｐＨ０４５の構成へと導かれる事項の配列は、第１２図
に示される。

（Ｅ、Ｉｌｌ、Ｂ　）　　ｐＨＣ４５による１３ＱＯＯ
Ｏダルトンポリペプチドの発現 ｐＨＣ４５を廿むイー・コリ菌株１（Ｃ４５を２２時間
ＬＢ培地で成長させ、そして上述の「方法」Ｋ記載され
たＵ口〈蛋白の分析について処理した。

第１３図の結果は、組換えプラスミドｐＨＣ４５はイー
・コリにおいて１３ＱＯＯｏダルトンの蛋白を発現し、
その大きさはＲ，ｔ、ジベル菌株のトキシン蛋白のより
も小さいことを確証している。

第１３Ａ図のレーン６は、ベクターｐＵＣ９のみにより
発現されるクーマフ　（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　）ブルー
染色蛋白を示し、そしてレーン５は、ｐＨ０４５により
発現された蛋白を示す。第１３ｂ図のレーン６及び５は
、ｐＵＣ９及びｐ　Ｉ（Ｃ４５からの蛋白のウェスター
ンプロットｌ示す。

ｐＨＣ４５は、ｎ、ｔ、結晶蛋白に対する抗体と特異的
に反応することが、明らかに分る。

実）４（ｊ例■ ｐＨＢＨＥからの正規な領域及びｐＨｃ’４５がらの構
造遺伝子を含む複合プラスミドのイー・コリへのクロー
ニング （Ｅ、　ＩＶ、　Ａ　）組換えプラスミドｐ　ＩＩ　Ｓ
Ｗ７の＋ｊｑ成実施例１に記載された組換えプラスミド
ｐ　ｌ（Ｂ　ＨＥをプロモーター領域の源として用い、
そして実施例■、Ｅ、■、Ａに記載された組換えプラス
ミドｐＨ０４５を倉しい組換えプラスミドｐＢＳＷ７の
構成に関するトキシン構造遺伝子の源として用いた。

プラスミドｐＨＢＨＥは、制限酵素Ｃ１ａ　　Ｉによシ
分解され、そして細菌性アルカリホスファターゼを用い
て脱燐された。それを次に第二の酵素Ｓｍａ　Ｉにより
処理した。

トキシン遺伝子そう入物のＨｉｎｃ■部位とＣ１ａ　ｆ
部位との間のプロモーター領域とともにｐＵｃ９？ｆｌ
Ｓ分よりなる３、ＯＫｂフラグメントを単離し、そして
アガロースゲルから精製した。プラスミドｐＨＣ４５を
Ｐｓｔｌ及びＳｍａｌによシ切断し、次に制限酵素ＣＬ
ａ　Ｉにより部分的に分解された。

フラグメントをアガロースゲル上の電気泳動により分離
し、そして３．６Ｋｂフラグメントを単離し精製した。

３．ＯＫｂ及び３．６Ｋｂの７２グメントの両方の同定
は、制限分析によりチェックされた。これらを次に混合
し、そしてＴ４ＤＮＡＩＪガーゼの存在下結合した。

結合されたＤＮＡをイー・コＩＪ　Ｔ　Ｂ　−１菌株の
有効な細胞へ導入した。前述の実施例に記載された如く
急速プラスミド製造を研究することによりそしてコロニ
ー又雑にょるスクリーニング後、有効物の一つを選択し
、プラスミドをその形質転換物より単離し、そして制限
部位についてマツプを作った。このプラスミドをｐＢｓ
Ｗ７と名付け、それを含む菌株をＢＳＷ７と名付ける。

構成のフローチアートは、第１４図に示される。

（Ｅ、ＩＶ、Ｂ　）　ＢＳＷ７から１７）１３ＱＯＯｏ
ダルトン殺虫蛋白の発現 組換えプラスミドｐＢＳＷ７を有するイー・コリ菌株Ｂ
ＳＷ７を、２０時１＆１３０℃でＬＢ培地中で成長させ
た。

細胞を取り出しそして処理して前述の実施例におけるよ
うに蛋白の分析のため細胞抽出物を得た。

第１３図のレーン６及び４は、それぞれｐＵＣ９及びｐ
ＢＳＷ７からの蛋白を示す。第１３Ａ図は、クーマシイ
・ブルーによシ染め友蛋白を示し第１３Ｂ図は、同様な
ゲルのウェスターン弗プロットを示す。組換えプラスミ
ドｐＢｓＷ７は、ｐＨｃ４５から発現された蛋白と同様
な大きさの１３ｔ１０００ダルトン蛋白を発現する。

（Ｅ、ＩＶ、Ｃ）ｐＢｓＷ７の抽出物の昆虫毒性アッセ
イＢＳＷ７からの細胞抽出物を記載した通り作り、毒性
アッセイを前記の実施例に記載したように行った。それ
らは、毛虫に対して啄めて有毒であることが分った。

実施例Ｖ ビー・ズブチリス中にＢ、　ｔ、殺虫性蛋白を発現する
組換えプラスミドｐＡ［１ｓ−５５の構成 （Ｅ、　Ｖ、　Ａ　）実施例Ｅ、　ＪＶ、　Ａで記載さ
れた組換えプラスミ）’ｐＢＳＷ７を、トキシン遺伝子
の源として用いた。用いたビー−ズブチリスベクターは
、ｐＢＤ６４であった。

プラスミドｐＢ０６４を制限酵素Ｂｇｍにより分解し、
そして発生したステイッキーエンド’ＩｋＤＮＡポリメ
ラーゼＩのフレナラフラグメントを用いて光した。ｐＢ
ＳＷ７をＨｉｎｃＢによシ切断した。ｐＢＤ６４分解物
の１？ｆｌｓを４部のｐＢＳＷ７分解物と混合し、そし
て１６時間１５℃でＴ４ＤＮＡＩＪガーゼと結合させた
。結合したＤＮＡ（５ビー・ズブチリス菌株ＰＳＬＩの
有効な細胞に導入し、そしてクロラムフェニコール抵抗
性について選択した。クロラムフェニコール抵抗性コロ
ニーを、コロニー交雑によリソう入９勿についてそして
コロニー免疫プロッティングによりトキシン抗原につい
てスクリーニングした。得られたプラスミドをｐＡＢｓ
−５５と名付け、そしてこのプラスミドを有する菌株を
ＡＢＳ−５５と名付ける。構成の配列を第１５図に示す
。

（Ｅ、　Ｖ、　Ｂ　）　ビーーズブチリス凶株ＡＢＳ−
５５からの１３ＱＯＯＯダルトン蛋白の発現 細胞抽出物を、前述の実施例に記載した如く、２０時間
３０℃でＬＢ培地で成長させたＡＢＳ−５５昶１胞から
の蛋白の分析について作った。蛋白を８％５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル上で分離した。ゲルの染めた蛋白及
びイムノプロットをそれぞれ４１３Ａ図及び第１３Ｂ図
に示す。シー／２及び３ｔ’ｌ１ｍ、ｐＡＢｓ−５５を
含ｔｒｐｓＬ１ｍ株からの蛋白を示す。これらのビー・
ズブチリス細胞は、Ｂ、ｔ。

結晶蛍白の抗体と特異的に反応する１３ＱＯＯＯダルト
ン蛋白を作る。

（Ｉｌｉ：、Ｖ、Ｃ）ＡＢＳ−５５からの細胞抽出物に
関する昆虫毒性アッセイ 細胞抽出物を、前述の実施例に記載された如く、菌株Ａ
ＢＳ−５５から作り、そして毒性についてテストした。

これらは、昆虫に対して極めて有毒であることが分った
。

（Ｅ、　Ｖ、　Ｄ　）菌（ＩＡＨ８−５５における二碓
体結晶の形成ＡＢＳ−５５の培＃物を３０℃における２
２１．ｆ闇の成長後に採取し、前記の１方法」に記載さ
れた如く、電子顕微鏡用に処理した。二錐体結晶が検出
された。結晶を含むＡＢＳ−５５細胞の写真を第３Ｄ図
に示す。

本明細書に記載された本発明の特定の態様から徨々の変
法及び変化が、当業者によυなされうろことは、理解さ
れよう。このような変法及び変化は、本明細書の詳細な
記載から明らかであり、そして本願の特許請求の範囲の
範囲内に充分にあるものである。

〔参考文献〕

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インセクト・パン屑、６，２５４゜ （２）ペリアエバ、エヌ、ニス及びアジツヘキアン、ア
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ア−。

ファラリ９　イー０．ホツホ、ジエー６．アロンンン、
ニー。

アイ１．及びミ／ニチ、ニス、ニー、（１９８２）プロ
ス。

ナトン、アカデ、サイ、米国、７９，６０６５゜（９）
エリノウチ、ニス６及びワイスブルー、ビー。

（１，９８２）ジュー。パック、１５０，８１５゜Ｃｌ
０）カーン、ジエー、、プレンナー、ニス９．バーネッ
ト。

エル、及びセサレニ、　　ジ＋、（１９８０）７’ロス
、ナトン。

アカデミツク、米国、７７．５１７２゜（■）クライア
−、ニー０．ファーゲット、二フ１．リビアー。

リュー及びラボルト、ジー（１９８２）エムボ、ジエー
。

１．７９１゜ （１２）クロンスタット、ジュー。ダブリューｌ　７ユ
ネ乙　エッチ、イー、及びホワイトシー、エッチ、アー
ル。

（１９８３）ジエー、バクト、１５４，４１９゜（１３
）マチウシ、エム、ティ、及びカルサース、エム、エッ
チ、（１９８１）ジエー、アム、ケム、ソサ、１０３゜
３１８５゜ （１４）メツシング、ジエー１．クレア、アール、及ヒ
シーバーグ、ピー、エッチ（１９８１）ヌクレ、アシド
、レス。

９．３０９゜ （１５）モリス、オー、エヌ、及びマツクエラン、ビー
。

＋１９７５）インフォーメーション・レポートＣＣ−Ｘ
−１１２゜ケミカル・コントロール・リサーチ・インス
テイテユート。カナディアン・フオレストリー・サービ
ス、オツタワ。

（１Ｂ）オストロ乙　シー、アール、及びペン、ジエー
、ジエ−（１９８３）ジエー、バクト、１５６，９３４
゜（１７）シュネ乙　エッチ、イー及びホワイトシー、
エッチ。

アール、（１９８１）プロス、ナトン、アカデ、サイ、
米国、７８．２８９３゜ （１Ｂ）シャーフ、イー、ニス、ニツカーンン、ケー、
タフリュー、プラウエル、ニー、ジュニア−及びアロン
ンン、シエー、エヌ、（１９７５）アプル、ミクロビオ
ル、３０゜１０５２゜ Ｃｌ９）ビエラ、ジエー及びメツシング、ジエー１１９
８２）ジーン、１９，２５９゜ （１，Ａｎｇｕｓ、　Ｔ、Ａ、　（１９６４）Ｊ、　Ｉ
ｎ５ｅｃｔ　ｐａｔｈｏｌ、。

６．２５４゜ ２、　　Ｂｅ１ｙａｅｖａ、　Ｎ、　Ｎ、、　ａｎｄ　
Ａｚｉｚｂｅｋｙａｎ、　Ｒ，Ｒ。

（１９６８）、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ−、３４，１７６３
、ｎｕｒｇｅｓ、　Ｈ−Ｄ、、　Ｔｈｏｍｓｏｎ、　Ｅ
、　Ｍ、　ａｎｄＬａｔｃｈｆｏｒｄ、Ｒ，Ａ、（１９
７６）Ｊ　　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ。

ｐａｔｈｏｌ、、２７．８７゜ ４、　　Ｃａｎｔｗｅｌｌ、Ｇｌ；、ａｎｄ　Ｆｒａｎ
ｋｌｉｎ、Ｂ、Ａ。

（１９６６）Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ、ｐａｔｂｏｌ、
、３０，１３１゜５、　　Ｄｕｂｎａｕ、Ｄ、ａｎｄ　
Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｒ−（１９７１）
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、５６，２０９゜６、　　Ｇｒ
ｙｃｚａｎ、Ｔ、、Ｓｈｉｖａｋｕｍａｒ、Ａ、Ｇ、ａ
ｎｄＤｕｂｎａｕ、Ｄ、（１９８０）Ｊ、Ｂａｃｔ、、
１４１，２４６゜７、　　Ｈｅｉｍｐｅｌ、Ａ、Ｍ、（
１９７１）−ＩｎＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｎｔｒｏｌ　
　ｏｆ　　１ｎｓｅｃｔｓ　　ａｎｄ　ｍ１ｔｅｓ、Ｈ
，Ｄ。

１３ｕｒｇｅｓ　　ａｎｄ　Ｎ、Ｗ、Ｈｕｓｓｅｙ（Ｅ
ｄｓ、）、Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ、ｐｐ　　４６９−４８９゜８、　　Ｈｅ１ｄ、Ｇ
、Ａ、、Ｂｕｌｌａ、Ｌ、Ａ、、Ｊｒ、、Ｆａｒｒａｒ
ｌ。

Ｅ、、　Ｈｏｃｈ、　Ｊ、、　Ａｒｏｎｓｏｎ、んＬ　
ａｎｄ　Ｍｉｎｎｉｃｈ。

Ｓ、Ａ、（１９）＋２）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｎ、Ａｃａｄ
−Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９゜６０６５゜ ９、　　Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｗｅｉ
ｓｂｌｕ、Ｂ（１９８２）Ｊ−Ｂａｃｋ−，１５０＊　
　ｄ１５ １０、Ｋａｒｎ、Ｊ、、Ｂｒｅｎｎｅｒ、Ｓ、、Ｂａｒ
ｎｅｔｔ、Ｌ、ａｎｄＣｅｓａｒｅｎｉ、Ｇ、（１９８
０）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｈ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、、７７．５１７２゜ １１、Ｋ１１ｃｒ、Ａ、、Ｆａｒｇｅｔｔｅ、Ｆ、、Ｒ
ｉｂｉｅｒ、Ｊ、ａｎｄＲａｐｏｐｏｒｔ、Ｇ、（１９
８２）ＥｍｂＯＪ、、ｌ、７９１゜Ｌ２．Ｋｒｏｎｓｔ
ａｄ、Ｊ、Ｗ、、５ｃｈｎｅｐｆ、Ｈ，Ｅ、ａｎｄＷｈ
ｉｔｅｌｅｙ、）１．Ｒ，（ｌｓＪ８３）Ｊ、Ｒａｃｔ
、、１５４，４１９゜１３、Ｍａｔｔｅｕｃｉ、Ｍ、Ｄ
、ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、Ｈ。

（１９８１）Ｊ　　Ａｍ、Ｃｈｅｒｒｂ　５ｏｃ−，１
０３，３１８５゜１４、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、、Ｃｒｅ
ａ、Ｒ，ａｎｄ　　Ｓｅｅｌ）ｕｒｇ、Ｐ、Ｈ。

（１９８１）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｉ’Ｌｅｓ、、９，
３０９゜１５、Ｍｏｒｒｉｓ、Ｏ，Ｎ、ａｎｄ　Ｍｃｇ
ｒｌａｎｅ、Ｂ、（１９７５）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
　　Ｒｅｐｏｒｔ　　ＣＣ−Ｘ−１１２，Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌＣｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔ
ｕｔｅ、　　ＣａｎａｄｉａｎＦｏｒｅｓｔｒｙ　　５
ｅｒｖｉｃｅ、Ｏｔｔａｗａ。

１６゜０ｓｔｒｏｆｆ、Ｇ、Ｒ−ａｎｄ　Ｐｅｎｅ、Ｊ
、Ｊ、（１９８３）ＪＢａｃｔ、、　　１５６，９３４
− １７、５ｃｈｎｅｐｆ　、　Ｈ，Ｅ、　ａｎｄ　Ｗｈｉ
ｔｅｌｃｙ、　Ｈ−Ｒ−（１９８１）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｎ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、、７８　２８９３−１
８．５ｈａｒｐｅ、Ｅ、Ｓ、、Ｎ１ｃｋｅｒｓｏｎ、に
、Ｗ、、Ｂｕｌｌａ。

Ｌ、Ａ、、Ｊｒ、ａｎｄ　Ａｒｏｎｓｏｎ、Ｊ、Ｎ−（
１９７５）Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　３０．１０５２−１９゜Ｖ
ｉｅｒａ、Ｊ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、（１９８
２）Ｇｅｎｅ、。

１９．２５９．）

【図面の簡単な説明】

第１図は、組換えプラスミドｐＨＢＨＥの構成のやり方
を示し、第２図は、ＨＢＨＥ中のＢ、ｔ、）キシン遺伝
子の発現を示し、第３図は、遺伝子工学由来の細菌中の
殺虫結晶の形成を示し、第４図は、コロニー雑種形成に
よるビー・ズブチリス転換物のスクリーニングを示し、
第５図は、ビー・ズブチリス転換物のプラスミド部分中
のＢ、ｔ、）キシン遺伝子のサウザンプロット検出を示
す。 第６図は、組換えプラスミドｐＡＢｓ−５及びｐＡＢｓ
−９の構成のやり方を示し、第７図は、ビー・ズブチリ
ス転換物におけるＢ、ｔ、トキシン遺伝子発現を示し、
＠８図は、ルリアブロス培地中のＨＤ１−ジペル、ＡＢ
Ｓ−５、ＨＢ　ｆｌ　Ｅの成長曲線を示し、第９図は、
成長の異った期間におけるビー・ズブチリス及びＨＤ１
−ジペルのＢ、ｔ、トキシン遺伝子の発現を示し、第１
０図は、ビー・ズブチリス菌株ＡＢＳ−５におけるトキ
シン結晶形成を示し、第１１図は、ビー・ツリンギエン
シス菌株）ＩＤ１−ジペルにおけるトキシン結晶の形成
を示す。 第１２図は、組換えプラスミドｐＨＣ４５の構成のやり
方を示し、第１３図は、ビー・ズブチリス及びイー・コ
リのＢ、　ｔ、　　）キシン遺伝子発現を示し、第１４
図は、プラスミドｐＢｓｗ７の構成のやり方を示し、第
１５図は、プラスミドｐＡＢｓ−５５の構成のやり方を
示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビー・ツリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉ
   ｅｎｓｉｓ）変種クルスタキ（Ｋｕｒｓｔａｋｉ）ＨＤ
   １−ジペル（Ｄｉｐｅｌ）の結晶蛋白の免疫学的性質を
   実質的に有し、そして約１３５，０００ダルトンのポリ
   ペプチドを発現する遺伝子工学由来のビー・ズブチリス
   （Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株。
2. （２）任意のビー・ズブチリス宿主種において複製しう
   る組換えプラスミドであり、該プラスミドが約１３５，
   ０００ダルトンのポリペプチドについて発現しうる異種
   構造的ＤＮＡコーディングを含みそしてビー・ツリンギ
   エンシス変種クルスタキＨＤ１−ジペルの結晶蛋白の免
   疫学的性質を実質的に有し、さらに該プラスミドが宿主
   種により認識される該異種構造的ＤＮＡに関する発現メ
   カニズムを含む組換えプラスミド。
3. （３）ビー・ツリンギエンシス変種クルスタキの結晶蛋
   白の免疫学的性質を実質的に有しそして約１３０，００
   ０ダルトンの蛋白を発現する遺伝子工学由来のビー・ズ
   ブチリス菌株ＡＢＳ−５５。
4. （４）任意のビー・ズブチリス宿主種に複製しうる組換
   えプラスミドであり、該プラスミドが約１３０，０００
   ダルトンのポリペプチドについて発現しうる異種構造的
   ＤＮＡコーディングを含みそしてビー・ツリンギエンシ
   ス変種クルスタキの結晶蛋白の免疫学的性質を実質的に
   有し、さらに該プラスミドが宿主種により認識される該
   異種構造的ＤＮＡに関する発現メカニズムを含む組換え
   プラスミド。
5. （５）ビー・ツリンギエンシス変種クルスタキの結晶蛋
   白の免疫学的性質を実質的に有するポリペプチドを含む
   ビー・ズブチリス宿主種のイピラミジル（ｉｐｙｒａｍ
   ｉｄｚｌ）結晶性構造よりなる蛋白。