DE3685517T2

DE3685517T2 - Klonierung und expression von delta-endotoxin-genen von bacillus thuringiensis in bakterienzellen und daraus gewonnene produkte.

Info

Publication number: DE3685517T2
Application number: DE19863685517
Authority: DE
Inventors: Terry Anne Benson; Gerard James Gundling; Annapur G Shivakumar; Brian Blackburn Spear
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1985-05-20
Filing date: 1986-04-15
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2006-04-16
Also published as: EP0202470A1; JPS62181777A; EP0202470B1; DE3685517D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft insektizide δ-Endotoxinproteinkristalle, die in Bacillus subtilis gefunden werden und den in Bacillus thuringiensis, Varietät Kurstaki, gefundenen entsprechen, neue Formen und Zusammensetzungen davon sowie neuartige Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Stand der Technik

Die Beschreibung soll im Zusammenhang mit den zitierten Druckschriften gelesen werden, die in der anhängenden Bibliographie aufgeführt sind.
Bacillus thuringiensis ist ein sporenbildender Organismus, der eng mit Bacillus cereus verwandt ist. Seine Besonderheit ist jedoch das Erscheinen von proteinartigen Kristallen bei der Sporulierung. Die Kristalle sind in der Form bipyramidal und machen bis zu 30 % des Trockengewichts der sporulierten Kultur aus, wobei bekannt ist, daß sie toxisch für die meisten lepidopteranen und einige dipterane Insektenarten sind.
Varietäten von B. thuringiensis sind anhand ihrer flagellaren oder "H"-Antigene unterscheidbar. Sie können auch nach ihrem Kristalltyp klassifiziert werden. Die beiden Klassifizierungen überlappen darin, daß die gleichen Serovare mehr als einen Kristalltyp und verschiedene Serovare den gleichen Kristalltyp haben können. Verschiedene Varietäten zeigen verschiedene Toxizitäten für spezifische Insekten. Unter diesen Varietäten befindet sich B. thuringiensis, Varietät Kurstaki (auch als HD-1 bezeichnet), das ein besonders wirksames Isolat gegen Lepidoptera ergibt.
Das Kurstaki-Isolat wurde vielfach kommerziell als Insektizid gegen viele landwirtschaftliche Schädlinge verwandt, etwa Kohlläufer (Trichoplusia ni), Tabakknospenwürmer (Heliothis virescens) und Tabakhornwürmer (Manduca sexta), wie auch gegen Waldschädlinge, wie Zigeunermotten (Lymantria dispar), verwandt. Die Vorteile dieses Isolats gegenüber chemischen Insektiziden liegt darin, daß sie gegenüber Säugetieren und Nutzinsekten nicht toxisch sind (Heimpel, 1971), bei den Zielinsekten keine Resistenz induzieren und sich in der Umwelt nicht anreichern.
Die Nachteile sind ihre Spezifität gegenüber nur einer kleinen Anzahl von Insekten und ihre Empfindlichkeit gegenüber Wettereinwirkung und Sonnenlicht (Cantwell & Franklin, 1966; Morris & McErlane, 1975).
Die toxische Einheit des HD-1-Kristalls wird δ-Endotoxin genannt. Das δ-Endotoxin muß von den Zielinsekten verdaut werden, um seine Pathogenizität zu entwickeln. Der alkalische pH- Wert des Insektendarms erlaubt das Aufbrechen des Kristallproteins, was zu Darmparalyse und zu allgemeiner Toxämie führt. Weder der intakte noch der verdaute Kristall ist toxisch, wenn er in das Insekt injiziert wird, beide sind aber bei der oralen Verabreichung toxisch (Angus, 1964). Es muß ferner eine Wechselwirkung zwischen dem Kristall und der Spore bestehen, die die Toxizität erhöht. Die Natur dieser Wechselwirkung ist unbekannt (Yamurias, 1962; Burges, 1976).
Das Kristallprotein erfordert einen hohen pH-Wert und die Gegenwart von Reduktionsmittel zu seiner Auflösung. Die denaturierten Untereinheiten des Kristallproteins haben Molekulargewichte von etwa 130 und 134 Tausend Dalton. Es gibt Hinweise auf ein separates Protein in geringen Mengen, P2 (auch als Moskitofaktor bezeichnet), in HD-1, das separat aus den Kristallen abgetrennt werden kann, ein Molekulargewicht von etwa 65.000 Dalton hat und sowohl gegenüber Lepidoptera als auch Diptera toxisch ist (Yamamoto, 1983).

Genetik von B. thuringiensis ("B.t.")

Es wurden Beweise dafür geliefert, daß es mehr als ein strukturelles Gen gibt, die zur Bildung des B. thuringiensis- Kristalls beitragen. Schnepf & Whiteley (1981) haben ein Kristallgen aus dem Kurstaki-Stamm kloniert, das Homologität für zwei große B. thuringiensis-Plasmide von 30 und 47 Megadalton zeigt. Klier et al. (1982) haben unter Verwendung der Subspezies thuringiensis Stamm berliner 1715 sowohl ein Plasmid als auch eine chromosomale Kopie eines Kristallgens identifiziert. In Kurstaki hat Kliers Gruppe jedoch nur eine Plasmidkopie gefunden. Held et al. (1982) behaupten, sowohl chromosomale als Plasmidkopien in Kurstaki gefunden zu haben.
Whiteleys Gruppe hat eine Plasmidkopie aus einer partiellen Sau3A-Bibliothek der in den E. coli-Plasmidvektor pBR322 klonierten Plasmid-DNS isoliert. Die rekombinanten Plasmide wurden in den E. coli-Stamm HB101 transformiert und auf Basis der Immunoreaktivität gegenüber gereinigten B.t.-Kristallen erzeugten Antikörpern auf Inserte hin überprüft. Sie isolierten einen Klon, der ein Protein von 130.000 Dalton ergab, die gleiche Größe wie das Kristallprotein, und der Toxizität gegenüber Tabakhornwürmern zeigte. Dieser Klon wurde partiell sequenziert, wobei zwei Startpunkte für die Transkription festgestellt wurden (Wong et al., 1982). Unter Verwendung von in B.t. während der Sporulierung erzeugter RNS lokalisierten sie zwei beieinanderliegende Startpunkte, von denen einer die Transkription zu Beginn der Sporulation und der andere in der Mitte der Sporulation initiierte. Nur eine RNS-Spezies wurde im E. coli-Klon entdeckt, der das Gen enthielt. Das Kristallprotein in E. coli wurde in allen Wachstumsstadien erzeugt, obwohl nur auf geringem Niveau. Die ersten 8 von der Kodierungsregion kodierten Aminosäuren entsprechen denen am Aminoende des Kristallproteins. Eine potentielle ribosomale Bindestelle wurde ebenfalls lokalisiert.
Whiteleys Gruppe verwandte auch einen Teil dieses Klons zur Sondierung von Genbibliotheken anderer Stämme unter Einschluß von Kurstaki, HD73 und Sotto. HD73 ergibt einen anderen Kristalltyp und Sotto hat nur zwei Plasmide. Beide dieser Bibliotheken ergaben Klone, die Proteine von 130.000 Dalton erzeugten, welche mit Antiseren auf HD1-Kristallprotein kreuzreagierten und Toxizität gegenüber Tabakhornwürmern zeigten.
Held et al. (1982) klonierte eine vollständige B.t.-DNS- Bibliothek aus der EcoRI-Verdauung in den Phagenvektor Charon 4A. Mit einem Antikörpernachweis wurde ein Klon identifiziert, der, wenn in E. coli-Plasmid pBR328 und B. subtilis-Plasmid pHV33 subkloniert, Antigen erzeugte, das mit Antikristall- Proteinantikörper kreuzreagierte. Bestimmte Fragmente der Subklone hybridisierten zu einem B.t.-Plasmid von 45.000 Dalton. Andere Fragmente hybridisierten sowohl zu Plasmid- als auch zu chromosomaler DNS, und ein Fragment hybridisierte nur zu chromosomaler DNS, was vermuten läßt, daß der ursprüngliche Klon von chromosomaler Herkunft war. Dieser Klon zeigte Toxizität gegenüber Tabakhornwürmern.
Klier et al. (1983) verwandte markierte stabile B.t.- mRNS, die zusammen mit der Sporulation auftrat, um eine E. coli- Bibliothek der Gesamt-DNS von thuringiensis-Stamm berliner 1715 zu sondieren. Vier positive Klone wurden zur gesamten B.t.-RNS zurückhybridisiert, wobei entdeckt wurde, daß drei davon zu einer 26s-mRNS hybridisierten. Diese 26s-mRNS war in vegetativen oder keine Kristalle liefernden Mutanten nicht vorhanden. Diese Klone wurden als eine chromosomale Genkopie bestimmt, transkribierten oder exprimierten in E. coli nicht. Ein Subklon von 4,0 Kilobasen dieses Gens transkribierte sowohl in E. coli als auch B. subtilis, exprimierte jedoch nicht.
Kliers Gruppe erhielt auch eine in E. coli-Stamm HB101 transformierte Plasmidgenkopie. Diese Klon war ein BarnHI-Fragment von 14 Kilobasen eines berliner 1715-Plasmids von 42 Megadalton. Dieser Klon fällte Antikörper gegen B.t.-Kristallprotein aus und zeigte Toxizität. Beim Transfer in B. subtilis erzeugte dieser Klon ein Protein von 130.000 Dalton, jedoch nur während der Sporulation. Einschlüsse wurden in E. coli-Klonen und sporulierenden B. subtilis beobachtet, jedoch wurde keine reguläre kristalline Struktur oder ein solches Muster bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung sichtbar.
Kürzlich haben Kronstad, Schnepf und Whiteley (1983) die mögliche Präsenz von multiplen Kristallproteingenen in mehreren Stämmen von thuringiensis- und Kurstaki-Unterspezies berichtet. Die Hybridisierung eines intragenen Restriktionsfragments aus einem klonierten Kristallproteingen zu den Restriktionsverdauungsprodukten von Plasmiden und zellulärer Gesamt-DNS zeigte, daß die ganze Homologie zum Kristallproteingen Plasmid-assoziiert war und daß mehrere dieser Stämme multiple Homologieregionen enthielten.

DNS-Rekombinationstechnik

Die kürzlich entwickelte DNS-Rekombinationstechnik hat Mittel bereitgestellt, mit denen Gene isoliert, auf höhere Aktivitätsniveaus befördert oder in der Nukleotidsequenz geändert werden können. Solche Verfahren wurden für einen großen Bereich von Forschungsexperimenten in der Genetik und zunehmend zur Erzeugung von Proteinen von wirtschaftlicher Bedeutung verwandt. Trotz weitverbreiteter Verwendung solcher Verfahren bleibt die Isolierung und Expression eines jeden Gens ein experimentelles Problem. Die spezifischen molekularen und biochemischen Anforderungen für die effiziente Synthese eines Proteins und seine Gewinnung in biologisch verwendbarer Form konnten nicht zu allgemeinen Verfahren vereinfacht werden. Die biologischen Besonderheiten eines jeden Gens und seiner Wirtumgebung verlangen weiterhin Kreativität und Erfindungsreichtum auf der Seite des Wissenschaftlers.
DNS-Rekombinationsverfahren beinhalten die in vitro-Zusammenstellung von DNS-Molekülen aus mehreren Quellen in einem einzelnen, schimären Molekül. Die Zusammenstellung erfordert typischerweise die Fragmentierung der DNS mit stellenspezifischen Restriktionsnukleasen und das Zusammenfügen dieser DNS- Fragmente an ihren Enden mit dem Enzym DNS-Ligase. Die Auswahl geeigneter Segmente für Ligation führt zu erwünschten rekombinierten DNS-Molekülen. In den meisten Fällen hat das resultierende Molekül einen Replikationsursprung (so daß die DNS in einer Wirtzelle dupliziert werden kann), ein Markierungsgen, oft eine spezifizierende Resistenz gegen ein Antibiotikum, und das Fremdgen, dessen Proteinprodukt erwünscht ist.
In bakterielle Systeme werden solche rekombinanten DNS- Moleküle in Zellen eingeführt und danach innerhalb dieser Zellen entweder als Bakteriophage oder Plasmide repliziert. Bakteriophagen können in vitro zusammengestellt werden, wobei das rekombinante DNS-Molekül innerhalb der viralen Proteinhülle eingeschlossen ist. Die rekombinante DNS wird dann in das Bakterium eingeführt und über normale virale Infektionsprozesse dupliziert. Plasmide sind DNS-Moleküle, die Replikationsursprünge enthalten und sich damit selbst während des Zellwachstums duplizieren können. In vitro konstruierte rekombinante Plasmide können in Bakterien eingeführt werden, indem die Zellen zur Aufnahme exogener Moleküle behandelt werden. Die so mit rekombinaten Plasmiden behandelten Bakterien werden mit geringer Dichte auf Platten aufgebracht. Eine einzelne Kolonie repräsentiert damit einen Klon von Bakterien, die alle das identische Fremdgen enthalten.
Die Wirtzelle, in die Fremdgene eingeführt werden, hat einen wesentlichen Effekt auf die Expression der Fremdgene.
Typischerweise ist der verwandte Bakterienwirt E. coli. E. coli wurde genetisch ausführlich charakterisiert und nimmt Fremd-DNS bereitwillig auf. Gleichwohl wurde Bacillus subtilis mit zunehmender Häufigkeit als Wirtzelle verwandt. B. subtilis reagiert auf einen anderen Satz von Regulationssignalen für die Genexpression, was bei einigen Genen zu einer erhöhten Proteinsynthese führen kann. B. subtilis wurde ferner für einige Proteine wegen seiner Fähigkeit begünstigt, Proteine in das Medium abzugeben und wegen des Fehlens von Toxinen.
Die Expression von fremden Proteinen in Bakterien erfordert die Aktivität einer Sammlung von wechselwirkenden Mechanismen. Die RNS-Synthese erfordert die Gegenwart von an das Gen angrenzenden Promotorsequenzen. In einigen Fällen können die Promotoren, die natürlicherweise in Nachbarschaft zu einem klonierten Gen angeordnet sind, von der Wirtgenexpressionsmaschinerie verwandt werden. In anderen Fällen muß das Vektorplasmid oder der Bakteriophage die Promotoren für die Expression des insertierten Gens bereitstellen.
Die Erzeugung von Fremdprotein innerhalb einer Bakterienzelle erfordert nicht nur die RNS-Synthese, sondern auch die Synthese und Anreichung des kodierten Proteins. Bakterielle Ribosomen, die die Proteinsynthese ausführen, erkennen eine kurze Bindungssequenz in RNS, die vom Gen kodiert sein muß. Diese Ribosom-Bindungsstelle kann Teil des insertierten Gens oder Teil des Vektors sein. In einigen Fällen ist das insertierte Gen an ein residentes Gen im Vektor auf solch eine Weise gebunden, daß ein zusammengefügtes Protein erzeugt wird, wobei der Promotor und die Ribosom-Bindungsstelle des Vektors und die die Aminosäure kodierende Sequenz des Inserts verwandt werden. Die Menge an erzeugtem Protein kann von Gen zu Gen stark variieren, abhängig von den verwandten Regulationssequenzen und von anderen Faktoren, die nicht verstanden sind. Das Schicksal eines Fremdproteins ist auch unterschiedlich. Es kann sich als Inklusion oder intrazellularer Kristall anreichen, in der Zelle löslich bleiben, sequenziert werden oder sich wegen der Aktivität von Proteasen zersetzen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die unten aufgeführten Ziffern bezeichnen die Figurennummern der beigefügten Zeichnungen.
1. Strategie für die Konstruktion des rekombinanten Plasmids pHBHE. Die dicken Striche stellen die DNS aus dem Plasmid pUC9 dar. Die schraffierte Fläche im Block stellt das Toxingen von B.t.-DNS dar.
2. B.t.-Toxingenexpression in HBHE. SDS-Polyacrylamid- Gelelektropherogramm von Proteinen (A) und der entsprechende Protein-Immunblot (B) sind dargestellt. Die Spuren 1 bis 3 entsprechen aus HD1-Dipel, einem E. coli-Stamm, der pUC9 enthält, bzw. E. coli-Stamm HBHE. Die Spur 4 zeigt Molekulargewichtstandards für Proteine. Die Größen von Markierungsproteinen sind angegeben.
3. Die Bildung von insektiziden Kristallen in gentechnisch veränderten Bakterien. Transmissionselektronische Mikrographien von Bakterienzellsektionen von ABS-5 (A), ABS-9 (B), HD-73 (C), ABS-55 (D) , ABS-58 (E) und HBHE (F).
4. Auswahl von B. subtilis-Transformanten durch Koloniehybridisierung. Die dunklen Flecke auf der rechten Seite stellen Kolonien dar, die zu einer Nick-translatierten Sonde hybridisierten. Zuordnung dieser Flecken zu Zellen auf den links gezeigten Master-Platten identifizierten die toxingenhaltigen Transformanten.
5. Southern-Blot-Nachweis von B.t.-Toxingen in Plasmidfraktionen von B. subtilis-Transformanten. A. Schnelle Plasmidherstellung einiger Transformanten, analysiert auf 0,8 % Agarosegel durch Elektrophorese. B. Autoradiogramm von Plasmiden aus dem gleichen Gel, die auf ein Nitrocellulosepapier transferiert zu einer Nick-translatierten Sonde hybridisiert wurden.
6. Strategie zur Konstruktion von rekombinanten Plasmiden pABS-5 und pABS-9. Die schraffierte Fläche im Block zeigt das Toxingen von B.t.-DNS.
7. Die B.t.-Toxingenexpression in B. subtilis-Transformanten. Ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektropherogramm (A) und ein entsprechender Protein-Immunblot (B) sind dargestellt. Spur 1, E. coli-Klon HBHE; Spur 2, Molekulargewichtstandards; Spur 3, ABS-5 (PSL1, enthaltend pABS-5); Spur 4, ABS-58 (BD 224, enthaltend pABS-5); Spur 5, ABS-9 (PSL1, enthaltend pABS-9); Spur 6, ABS-57 (SpoOH-Stamm, mit pABS-9); Spur 7, ABS-11 (PSL1, enthaltend nur den Vektor pBD64); Spur 8, ABS-59 (PSL1, enthaltend pABS-59); Spur 9, Molekulargewichtsmarkierungsproteine).
8. Wachstumskurve von HD1-Dipel ( - ), ABS-5 (0-0) und HBHE (X---X), in Luria-Brühe als Medium.
9. B.t.-Toxingenexpression in B. subtilis und HD1-Dipel zu verschiedenen Wachstumszeitpunkten. Ein SDS-Polyacrylamid- Gelelektropherogramm (A) und ein entsprechender Proteinimmunoblot (B) sind dargestellt. Die Spuren 1 bis 9 zeigen Proteine von B. subtilis-Klon ABS-5 nach 3, 6, 9, 22, 31, 45, 50, 76 bzw. 120 Stunden Wachstum und die Spuren 11 bis 19 Proteine von HD1-Dipel nach 3, 6, 9, 22, 31, 45, 50, 76 bzw. 120 Stunden Wachstum. Die Spur 20 zeigt Molekulargewichtsmarkierungen.
10. Toxinkristallbildung in B. subtilis-Stamm ABS-5. Elektronenmikrographische Sektionen von Zellen nach 9 h (A), 13 h (B) , 24 h (C), 30 h (D) und 36 h (E) Wachstum.
11. Toxinkristallbildung in B. thuringiensis-Stamm HD1- Dipel. EM-Sektionen von Zellen nach 24 h (A), 30 h (B) und 36 h (C) Wachstum.
12. Strategie zur Konstruktion des rekombinanten Plasmids pHC45. Die durchgezogene Linie weist auf das Toxingen hin.
13. B.t.-Toxingenexpression in B. subtilis und E. coli. SDS-Polyacrylamidgelelektropherogramme (A) und entsprechende Proteinimmunoblots (B) sind dargestellt. Spur 1, Molekulargewichtsmarkierer; Spuren 2 und 3, ABS-55 (PSL1-Stamm, der das rekombinante Plasmid pABS-55 enthält); Spur 4, BSW7 (TB1-Stamm, der das rekombinante Plasmid pBSW7 enthält); Spur 5, HC45 (TB1- Stamm, der das Plasmid pHC45 enthält); Spur 6, TB1-Stamm, der nur den Vektor pUC9 enthält; Spur 8, B.t.-Stamm HD1-Dipel.
14. Strategie zur Konstruktion von Plasmid pBSW7. Die durchgezogene Linie weist auf das Toxingenfragment von pHC45 hin und die schraffierte Linie auf das Genfragment aus pHBHE.
15. Strategie zur Konstruktion von Plasmid pABS-55. Die durchgezogene Linie weist auf das Toxingenfragment von pHC45 hin und die schraffierte Linie auf das Genfragment von pHBHE.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß die Gene für das Toxinkristallprotein auf den endogenen Plasmiden von Bacillus thuringiensis, Varietät Kurstaki, lokalisiert werden konnte. Diese Entdeckung ermöglichte die Erzeugung der Toxinkristalle in Bacillus subtilis unter Verwendung der DNS-Rekombinationstechnik, indem die jeweiligen Gene durch Escherichia coli und in B. subtilis eingeschleust wurden. Die Toxizität der Kristalle für Insekten wurde dann in Labortests gezeigt.
Das von Bacillus thuringiensis erzeugte Kristallprotein wurde als toxisch für die Larven einer Anzahl von lepidopteranen Insekten befunden. Abbott Laboratories vermarktet seit einiger Zeit das Kristallproteinprodukt unter dem Warenzeichen DIPEL zur Verwendung als Insektizid. Die Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Erzeugung des Bacillus thuringiensis-Kristallproteins in einer anderen bakteriellen Wirtspezies, genannt Bacillus subtilis, bereit. Bacillus subtilis ist ein nichtpathogener Erdorganismus, der für die Erzeugung mehrerer industriell wichtiger Enzyme verwandt wurde. Die Erfindung verbessert weiterhin das bestehende Verfahren zur Erzeugung des Insektizids, indem die Toxinproteinsynthese in der neuen Wirtspezies, Bacillus subtilis, in allen Wachstumsphasen auftritt. Im Ursprungsorganismus, Bacillus thuringiensis, beginnt die Synthese des Toxins nur sehr viel später in der Wachstumsphase während der Sporulation. Somit überwindet die Erfindung diese Limitationen durch die Wachstumsphase und kann wahrscheinlich die Produktionskosten des Insektizids herabsetzen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Bacillus thuringiensis, Varietät Kurstaki (Dipel HD-1- Stamm) wurde viele Jahre als Organismus zur Erzeugung einer Insektizidzusammensetzung verwandt, die von Abbott Laboratories unter dem Warenzeichen DIPEL vertrieben wird. Die aus δ-Endotoxinprotein bestehenden bipyramidalen Kristalle sind das Ergebnis der Expression der an Plasmiden von B.t. gefundenen Genen. Durch Anwendung der DNS-Rekombinationstechnologie gemäß der Erfindung wurden die relevanten Gene lokalisiert und auf solche Weise gentechnisch behandelt, daß sie in Escherichia coli und Bacillus subtilis hineingebracht werden können, von denen beide solche Gene normalerweise nicht besitzen. Die gentechnisch veränderten Stämme von E. coli und B. subtilis erzeugen δ-Endotoxinproteine, die für Raupen toxisch sind. Weiterhin nehmen die Proteine kristalline Strukturen an. In den modifizierten B. subtilis-Stämmen startet die klonierte DNS die Expression von δ- Endotoxinproteinen in der vegetativen Phase; ihre Expression ist nicht nur auf das Sporulationsstadium beschränkt, wie es im Ursprungsstamm B. thuringiensis der Fall ist. Dies kann zu einer kostenwirksamen Produktionsweise des Insektizids führen.

Wirtzellkulturen und Vektoren

Die zur DNS-Klonierung und Expression verwandten E. coli-Stämme erlauben die Auswahl geeigneter Markierungen, wie die Ampicillin-Resistenz, die durch die Einbringung eines spezifischen Klonierungsvektors verliehen wird. Die als Vektoren verwandten Plasmide enthalten auch Markierungen, wie die Galaktosidaseaktivität, deren Gegenwart oder Abwesenheit die Insertion der fremden DNS in das Markierungsgen anzeigt. Stämme, wie IM83 oder IM105 (Messing, 1981) und Plasmide, wie pUC8 und pUC9 (Viera und Messing, 1982) wurden als sehr brauchbar bei der Klonierung von B.t.-DNS befunden.
Vektoren des Bakteriophagen Lamda, wie Lambda 1059 (Karn et al., 1980) wurden ebenfalls bei der Klonierung von B.t.-DNS verwandt. Diese Vektoren wachsen nur auf P2-Lysogenen, wenn fremde DNS in ihr Genom eingebracht worden ist und ein Fragment mit red- und gam-Genen ersetzt.
Die zur Klonierung und Expression verwandten Bacillus subtilis-Stämme sind natürlicherweise empfindlich gegenüber Antibiotika. Die Einführung von spezifischen Plasmiden in die empfindlichen Stämme verleiht jedoch Resistenz gegen spezifische Antibiotika. Der B. subtilis-Stamm PSL1 (Ostroff und Pene, 1983) ist ein Restriktion minus, Modifikation minus, recE4-Stamm und soll einen stabilen Transformationsphänotyp zeigen. Der Bazillenstamm BD224, der ein anderer rekombinationsdefizienter Stamm (redE4) ist und einige sporulationsdefiziente Mutanten wurden ebenfalls verwandt.
Der Vektor pBD64, ein rekombinantes Plasmid von pUB110 und pC194, die Resistenz gegen Chloramphenicol und Kanamycin verleihen, wurde zur Klonierung des B.t.-Toxingens verwandt. Insertion eines Fremd-DNS-Segments in die einzige BglII-Stelle von pBD64 inaktiviert das Gen für die Kanamycinresistenz.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung verwandte Verfahren

1. DNS-Herstellung

B. thuringiensis-DNS zur Klonierung wird mit einem SDS- Phenol-Verfahren isoliert, das sowohl Plasmid- als auch chromosomale DNS ergibt. B. thuringiensis-Protoplasten werden mit Natriumdodecylsulfat bei 60º lysiert. Das Lysat wird dann mit Phenol deproteinisiert, wonach mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt wird. Das gelöste Ethanolpräzipitat wird mit Ribonuklease und Pronase behandelt, danach mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt.

2. Lambda-Klonierung von B. thuringiensis-DNS.

DNS von Lambda 1059 (Bethesda Research Laboratories), die mit BamHI geschnitten wurde, wird an die BgIII-Fragmente von B. thuringiensis in einem Molverhältnis von 1:1 ligatiert. Ungefähr 0,3/mcg der ligatierten Mischung wird unter Verwendung der von BioTec bezogenen "Packagen"-Mischung in Phagenteilchen gepackt. Rekombinante Phagen werden in E. coli Q358 (Bethesda Research Laboratories), das das P2-Lysogen aufweist, absorbiert.

3. Gelelektrophorese der DNS

DNS wird durch Elektrophorese an Gelen mit 0,75 bis 1,2 % Agarose in 5mM Natriumacetat, 2mM EDTA und 40 mM Tris bei pH 7,6 und einer Spannung von 15 bis 25 V über Nacht oder 80 bis 120 V 1 bis 4 Stunden separiert.

4. Größentrennung von DNS-Fragmenten

Durch Verdauung mit Restriktionsnukleasen erzeugte DNS- Fragmente werden durch Gel-Elektrophorese aufgetrennt und durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. DNS-Moleküle der gewünschten Länge enthaltende Regionen des Gels werden herausgeschnitten, in ein Mikrozentrifugenrohr gegeben und bei -70ºC eingefroren. Nach dem Auftauen wird die Agarose mit einem Glasstab zerstoßen. Wasser wird bis zu einem Gesamtvolumen (von Agarose und Flüssigkeit) von 0,5 ml zugegeben. Die Suspension wird zweimal mit Phenol, einmal mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt.

5. Herstellung von kompetenten E. coli-Zellen

E. coli-Zellen, die in LB-Medium bei 37ºC wachsen, werden bis auf eine Dichte von ungefähr 5 x 10&sup7; Zellen/ml verdünnt und mit 1/5 Vol kaltem Transformationspuffer (CTB) (45 mM MnCl&sub2;, 60 mM CaCl&sub2;, 100 mM RuCl&sub2;, 40 mM KOAc, pH 6,2 und 15 % Saccharose, filtersteril) gewaschen. Das Pellet wird erneut in 1/40 Volumen CTB suspendiert, 10 Minuten auf Eis gehalten und mit 0,02 ml DMSO zu jeweils 0,5 ml resuspendierten Zellen versetzt und bei -70ºC eingefroren, bis sie zur Verwendung zur Transformation bereit sind.

6. Restriktionsverdauung und E. coli-Transformation

Insertion von Fremd-DNS in einen Plasmidvektor wird durch Spalten der fremden und der Plasmid-DNS mit Restriktionsenzymen und Ligatieren der Fragmente bewirkt. Etwa 1 mcg DNS wird mit 1 bis 10 Einheiten Restriktionsenzym durch gemeinsames Inkubieren für ungefähr 1 Stunde bei 37ºC gespalten. Ein geeigneter Puffer nach Angaben des Enzymherstellers ist in die Reaktionsmischung einbezogen. Das Reaktionsvolumen beträgt gewöhnlich 20 µl. Nach der Inkubation wird die DNS entweder mit Isopropanol ausgefällt (wenn die DNS auf einem Gel zur Restriktionsanalyse laufengelassen werden soll) oder mit Phenol und Chloroform extrahiert, danach mit Ethanol ausgefällt (wenn die DNS weiterbehandelt werden soll). Ein Restriktionsverdauungsprodukt kann entweder glatte oder klebrige Enden erzeugen. Falls es notwendig ist, klebrige Enden mit 5'-Verlängerungen stumpf zu machen, wird die gespaltene DNS mit freien Nukleotiden und fünf Einheiten T4-DNS- Polymerase I (Klenow-Fragment) 30 Minuten bei 25ºC inkubiert.
Vor der Ligation wird der gespaltene Vektor dephosphoryliert, um Selbstligation zu vermeiden. Dies erfolgt durch 15minütiges Erhitzen auf 65ºC mit bakteriellen alkalischen Phosphatasen und dem geeigneten Puffer, gefolgt von Phenol-Chloroform-Extraktionen und Ausfällung mit Ethanol. Ligationen werden durch Kombinieren von DNS-Fragmenten und Plasmid (ein arbeitsfähiges Molverhältnis ist 4:1) in einem Volumen von 20 µl mit zwischen 2 (für klebrige Enden) und 10 Einheiten (für glatte Enden) Ligase in dem angegebenen Puffer durchgeführt. Die Mischung wird mehrere Stunden bei 20ºC gehalten.
Die so erhaltenen Plasmidkonstruktionen werden durch Mischen der DNS mit Zellen und 1,5minütiges Erhitzen auf 42ºC in kompetente E. coli-Zellen transformiert. Eine geringe Menge Medium wird hinzugegeben und die Zellen 1/2 bis 1 Stunde bei 37ºC gehalten, bevor sie auf Platten mit selektivem Medium aufgebracht werden. Das Plasmid wird aus kleinen Kulturen von durch alkalische Hydrolyse ausgewählten Kolonien isoliert (wie von Maniat, Fritsch und Sambrook in "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, 1982, S. 368) beschrieben. Das Plasmid kann dann durch Restriktionsverdauung und Gelelektrophorese analysiert werden.

7. Immunologischer Nachweis von B.t.-Kristallproteinen

Auf B.t.-Kristallproteine spezifische Antikörper werden nach Standardverfahren in Kaninchen erzeugt. Hochgereinigte Kristallproteine werden als Antigen verwandt. Mit Renografin gereinigte Kristalle werden in einem SDS-Harnstoff-Probenpuffer löslich gemacht, und die Proteine von 130 bis 135 kd mittels SDS- PAGE aufgelöst. Die Proteinbanden werden mit 3M Natriumacetat sichtbar gemacht und herausgeschnitten. Die Gelscheibe wird in Kaninchen injiziert, um eine immunologische Antwort hervorzurufen. Die erzeugten Antikörper sind spezifisch auf B.t.-Kristallproteine.
Die Erzeugung von B.t.-Kristallproteinen durch Phagenkolonien und bakterielle Klone wird mit den Kaninchenantikörpern untersucht. Die Proteine in den Phagenkolonien sind an ein Nitrocellulosefilter gebunden, das direkt auf der Kulturplatte angeordnet ist. Die in bakteriellen Klonen erzeugten Proteine werden mittels SDS-PAGE aufgelöst und dann elektrophoretisch auf Nitrocelluloseblätter transferiert. Die Gegenwart von B.t.-Kristallproteinen wird unter Verwendung einer doppelten Antikörpertechnik sichtbar gemacht. Die Nitrocelluloseblätter und -filter werden mit Kaninchen-Immunserum inkubiert, das nur an die immobilisierten B.t.-Kristallproteine bindet. Die Nitrocellulose wird dann mit Ziegen-Antikaninchen-IgG behandelt, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist. Der zweite Antikörper bindet nur an den Kaninchenantikörper. Die Peroxidase reagiert mit einem Reagens, Bio-Rad HRP-Farbentwicklungsreagens, das eine Farbreaktion dort erzeugt, wo Antikörper an B.t.-Kristallproteine auf der Nitrocellulose binden.

8. Synthetische Sonden

Synthetische DNS-Sonden werden manuell unter Verwendung der Phosphoramiditchemie (Matteuci und Caruthers 1981) konstruiert und mit Standard-PAGE-Techniken gereinigt. Eine Sonde, die komplementär zu den fünfzehn ersten kodierenden Basen des B.t.- Kristallproteingens ist, hybridisiert spezifisch mit klonierter DNS, die diese Sequenz enthält.

9. Koloniehybridisierung

Bakterielle Transformanten werden auf Nitrocellulosefilter, die auf Kulturmedium gelegt wurden aufgetupft und dort wachsen gelassen, . Die Zellen werden durch Schwimmenlassen des Filters auf 0,5M NaOH lysiert und danach mit 1M Tris auf pH 7,4 neutralisiert. Die Filter werden dann mit 1,5M NaCl, 0,5M Tris (pH 7,4) behandelt, bevor sie eine Stunde auf 80ºC erhitzt werden. Die Filter werden zuerst in 6 x SSC gewaschen und danach in 50mM Tris (pH 8,0), 1M NaCl, 1mM EDTA und 0,1% SDS. Die Filter werden in 50mM Tris von pH 7,4, 1M NaCl, 10mM EDTA, 5X Denhards Lösung, 0,1% SDS und Kalbthymus-DNS, 0,1 mg/ml bei 32ºC 3 Stunden vorhybridisiert. Die Filter werden bei 32ºC in der gleichen Lösung, die die synthetische Sonde oder eine mit ³²P-ATP markierte, Nick-translatierte Sonde enthält, hybridisiert. Die Sonde wird durch Waschen der Filter mit 2X SSC, 0,1% SDS und 0,1% Na-Pyrophosphat entfernt. Klone, die mit der Sonde hybridisieren, werden durch Autoradiographie lokalisiert.

10. Insektentoxizitätstests

Die Klone werden durch Verfüttern von Zellextrakten an Insekten, hauptsächlich Tricoplusia ni, auf Toxizität getestet. Gefriergetrocknete Phagelysate und gefriergetrocknete bakterielle Beschallungsprodukte werden direkt mit einer Insektennahrung gemisch. Zellextrakte, in einem Carbonat-DTT-Puffer löslich gemacht, werden auf ihren Proteingehalt hin bestimmt und mit der Nahrung gemischt, um Verdünnungskurven zum Testen der Wirksamkeit des Proteins zu erzeugen. Frisch gehäutete T. ni der dritten Inzuchtgeneration werden dann auf die feste Diät gesetzt, und ihr Wachstum wird eine Woche gemessen. Toxische Proben töten die Insekten in hoher Konzentration oder verzögern ihr Wachstum in geringer Konzentration. Die relative Toxizität der Probe wird mit bekannten Mengen B.t.-Kristallprotein in Kontrolltests verglichen.

11. Kristallherstellung

Die parasporalen Kristalle von B.t. werden an den linear vorgeformten Gradienten von Renografin-76, Natriumdiatrizoat, nach dem Verfahren von Sharpe et al., 1975, gereinigt. B.t.-Kulturen werden bis zur vollständigen Sporulation gezogen. Die Zellen, Sporen und Kristalle werden durch Zentrifugieren gesammelt und mit Wasser gewaschen. Das Pellet wird in einem geringen Volumen Wasser aufgenommen und beschallt. Die Mischung wird durch eine Lösung aus 50% Renografin und Wasser pelletisiert. Dieses Verfahren wird mit dem Pellet wiederholt, das jetzt hauptsächlich Kristalle und Sporen enthält. Das Pellet wird dann in Wasser aufgenommen, beschallt und auf einem linearen Gradienten von 62 bis 67 % Renografin-76 gelagert. Das Kristallband, das weniger dicht ist, als das Sporenband, wird gesammelt und das Verfahren wiederholt, bis reine Kristalle erhalten sind. Die Kristalle werden dann mehrere Male mit Wasser zur Entfernung des Renografin gewaschen und bei 4ºC gelagert.

12. Behandlung von Bazillen- und E. coli-Zellen für die EM Untersuchung

Gereinigter Gutaraldehyd in EM-Qualität (Ted Pella Co., Tustin, Calif.) wird in Zellsuspensionen zugesetzt (Endkonz. 0,2 %), gemischt und dann 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Vorfixierungszeit wird 2 % Agar in Wasser zuerst gekocht und dann auf 40ºC in einem Wasserbad abgekühlt. die Zellsuspension wird bei 1500 xg pelletisiert, die überstehende Flüssigkeit verworfen und das das Pellet enthaltende Röhrchen in das Wasserbad gegeben und etwa 5 min bei 40ºC equilibrieren gelassen. Unter Verwendung einer vorgewärmten Pasteur-Pipette werden etwa 0,5 ml des Agars auf das Zellpellet transferiert und gemischt, so daß die Bakterienzellen im Agar suspendiert wurden. Ein Teil der Suspension wird als nächstes in die Spitze der Pipette aufgezogen, kurz auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und auf eiskalten, phosphatgepufferten 3%igen Glutaraldehyd ausgeblasen.
Die resultierenden, zylindrisch geformten, eingefrorenen Agarstopfen mit den Bakterien werden für weitere 3 bis 18 Stunden im Glutaraldehyd fixiert, in Phosphatpuffer gewaschen und in kleine Stücke geschnitten. Proben werden zunächst 1 Stunde in phosphatgepuffertem, 1%igem Osmiumtetroxid postfixiert, in einer gradierten Ethanolserie dehydratisiert und in eine Epon-Araldit- Einbettungsmischung eingebettet. Nach der Erzeugung von Dünnschnitten werden Proben mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt. Die Bakterien werden elektronenmikroskopisch bei Vergrößerungen im Bereich von 10-30.000 auf die Gegenwart von kristallinen Einschlüssen untersucht.

13. Transformation von B. subtilis

Kompetente Zellen werden hergestellt, wie von Dubnau und Davidoff-Abelson (1971) beschrieben. Die Plasmidtransformation wird durchgeführt, wie von Contente und Dubnau (1979) beschrieben. Plasmid-DNS und kompetente Zellen werden bei 37ºC 30 min unter Verwendung 1-3 mcg DNS pro ml inkubiert. EGTA (1 mM) wird in der Mischung aus kompetenten Zellen und DNS verwandt. Die Selektion auf die Antibiotikumresistenz wurde nach der Auflagemethode in TBAB-Agar mit 90 min Verzögerung bei 37ºC, um die Expression zu ermöglichen, durchgeführt. Selektive Konzentrationen von Chloramphenicol und Kanamycin sind 5 mcg/ml.

14. B. subtilis-Koloniehybridisierung

B. subtilis-Transformanten werden auf TBAB-Agarplatten gegeben, die Chloramphenicol (5 mcg/ml) enthalten und durch Inkubation bei 30ºC 20-36 Stunden wachsen gelassen. Ein Nitrocellulosefilter wird auf die Agaroberfläche gelegt und sorgfältig nach 5 Minuten hochgenommen und mit der Kolonieseite nach oben auf drei mit 7 ml Lysozym (2 mg/ml) getränkte Whatman Nr. 1-Filter gelegt, danach 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Nitrocellulosefilter werden dann nacheinander 14 min auf eine Petrischale mit Denaturierungspuffer (0,5 M NaOh, 2,5 M NaCl) und Neutralisationspuffer (0,5 M Tris, 3 M NaCl) (10 min) transferiert. Sie werden dann kurz mit 2 x SSC gespült und 2 Stunden auf 80ºC erhitzt. Die Filter werden in 6 x SSC 5 min getränkt und in 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA und 0,1 % SDS 10 min gewaschen. Sie werden dann in einer Lösung mit 50 % Formamid, 5 x Denhardts Lösung, 5 x SSPE, 0,1 % SDS und 125 µg/ml Kalbthymus-DNS 2 Stunden bei 42ºC in einem "seala'meal"-Beutel prähybridisiert. 15 ml der Prähybridisierungsmischung werden entfernt und mit einer geeigneten Nick-translatierten Sonde versehen, wonach die Inkubation bei 42ºC 15 h fortgesetzt wird. Die Filter werden mit wiederholten Wäschen mit SSPE (0,18 M MaCl, 0,01 M Napp, 1 mM EDTA) sondenfrei gewaschen. Die luftgetrockneten Filter werden dann einem Kodak X-omat-Film ausgesetzt.

15. B. subtilis-Extrakte für den Toxizitätstest

Die Klone, die durch Southern-Hybridisierung und durch Expression, identifiziert durch Western-Blotting, als positiv identifiziert wurden, werden in Kulturen von 1 l in LB-Medium 2 Tage bei 30ºC wachsen gelassen. Nach der Ernte und Wäsche des Zellpellets wird dieses 3 min beschallt, in der Hülle gefroren und gefriergetrocknet. Diese pulverisierte Zubereitung wird auf die Toxizität gegen Insekten getestet.

Allgemeine Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Die E. coli- und B. subtilis-0rganismen wurden gentechnisch zur Erzeugung von insektiziden Proteinen nach folgender Vorgehensweise verändert:
1. Eine Plasmidbibliothek von B.t.-Genen wurde durch Ligatieren mit Restriktionsenzymen behandelter DNS-Fragmente aus B.t. an eine universelle Klonierungsstelle von Plasmid pUC9 erhalten.
2. Die Bibliothek der B.t.-Gene in pUC9 wurde in kompetente Zellen des E. coli-Stammes IM83 eingeführt, und die Transformanten wurden durch Koloniehybridisierung mit einer synthetischen Sonde ausgelesen.
3. Das 16,5 Kb-Plasmid pHB-1 von HB1 wurde zu einem 8,2 kb-Plasmid mit Namen pHBHE zusammengetrimmt.
4. Es wurde gezeigt, daß der von HBHE erzeugt Proteinextrakt ein Protein von 135.000 Dalton enthält, das mit dem B.t.-Toxinantikörper kreuzreagiert.
5. Es wurde gezeigt, daß die Zellextrakte von HBHE toxisch auf Raupen wirken.
6. Das Toxingen von pHBHE wurde an den Plasmidvektor pBD64 ligatiert und durch Transformation in B. subtilis eingeführt.
7. Die B. subtilis-Transformanten wurden durch Koloniehybridisierung an ein ³²P-markiertes Fragment von pHBHE ausgesiebt.
8. Die Transformanten ABS-5 und ABS-9, von denen gezeigt wurde, daß sie das Toxingen in entgegenstehenden Orientierungen insertiert enthalten, erzeugten ein Protein von 135.000 Dalton, das mit B.t.-Toxinantikörper in allen Wachstumsphasen kreuzreagierte.
9. In ABS-5 und ABS-9 wurden bipyramidale kristalline Strukturen gefunden.
10. Zellextrakte von ABS-5 und ABS-9 wurden für toxisch auf Raupen befunden.
11. Es wurde gefunden, daß die Toxingenexpression in B. subtilis unabhängig von der Sporulierung ist, wie von der Expression in einer nicht-sporulierenden Mutante von B. subtilis bestätigt.
12. Ein anderes B.t.-Toxingen, das ein Protein von 130.000 Dalton spezifiziert, wurde in E. coli kloniert, indem zuerst eine Bibliothek der B.t.-Gene im Bakteriophagen 1059 erstellt wurde und dann in pUC9 subkloniert wurde.
13. Es wurde gezeigt, daß der E. coli-Transformat pHC45, der das Plasmid pHC45 enthält, ein Protein von 130.000 Dalton erzeugt.
14. Das strukturelle Toxingen von pHC45 wurde mit der Promotorregion von pHBHE fusioniert und das rekombinante Plasmid pBSW7 durch Transformation in E. coli eingeführt.
15. Es wurde gezeigt, daß der E. coli-Stamm BSW7, der das Plasmid pBSW7 enthält, ein Protein von 130.000 Dalton erzeugt, das mit dem B.t.-Toxinantikörper kreuzreagiert.
16. Das zusammengesetzte Gen von pBSW7 wurde in pBD64 kloniert und in B. subtilis durch Transformation eingeführt.
17. Es wurde gefunden, daß der neue B. subtilis-Transformant ABS-55 ein Protein von 130.000 Dalton erzeugt, das mit dem B.t.-Toxinantikörper kreuzreagiert.
18. Zellextrakte von ABS-55 wurden als toxisch für Raupen befunden.
19. Der B. subtilis-Klon ABS-55 erzeugte bipyramidale kristalline Strukturen.

Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken. Geeignete Stämme von E. coli, B. subtilis und eines Bakteriphagen Lambda-1059 wurden verwandt. Die Stämme von B. subtilis, die aus der Erfindung resultierten, wurden bei der American Type Culture Collection unter den Stammbezeichnungen 53120, 53121 und 53122 hinterlegt, entsprechend dem HBHE-Gen in Plasmid pBD64 in B. subtilis PSLI, dem Pst-Subklon des Gens, das ein Protein von 130.000 d in einem Shuttle- Vektor codiert, der pUC9 und pBD64 in B. subtilis PSL1 enthält, dem Pst-Subklon des ein Protein von 130.000 d codierenden Gens in einem Shuttle-Vektor, der pUC9 und pBD64 in B. subtilis PSL1 einschließt, sowie einem Subklon des für ein Protein von 130.000 d codierenden Gens mit dein HBHE-Promotor in pBD64 im Wirt B. subtilis PSL1.

Beispiel I

Klonierung der δ-Endotoxinprotein von 135.000 Dalton spezifizierenden Gene von B. thuringiensis, Varietät Kurstaki HD-1 Dipel in E. coli.

E I A. Konstruktion einer Plasmidbibliothek von B.t.- Genen

Eine Plasmidbibliothek von HD-1-DNS wurde mit Plasmid pUC9 und IM83-Zellen konstruiert. Das Plasmid pUC9 wurde an der universellen Klonierungsstelle mit Restriktionsenzym BamHI geöffnet. Das Plasmid, 60 ng, wurde mit 2 mcg BglII-geschnittener HD-1-DNS in eine Reaktionsmischung von 20 µl unter Verwendung von zwei Einheiten T4DNS-Ligase ligatiert. Die Ligationsmischung wurde dann zur Transformation kompetenter E. coli IM83-Zellen verwandt. Die DNS wurde mit 100 µl Zellen gemischt und 10 min auf Eis gehalten. Die Zellen wurden bei 42ºC 1,5 Minuten hitzegeschockt, abgekühlt, mit 400 µl LB-Brühe gemischt und bei 37ºC 20 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann auf LB-Platten gezogen, die 50 mcg/ml Ampicillin und 4 mcg/ml Xgal enthielten. Weiße Kolonien, die die Gegenwart einer Insertion in pUC9 zeigten, wurden herausgesucht und auf B.t.-Kristallproteingensequenzen durch Koloniehybridisierung unter Verwendung einer synthetischen Sonde, die komplementär zu den ersten fünfzehn Basen des B.t.-Kristallproteingens ist, gesichtet. Das resultierende, 16,5 Kilobasen lange rekombinante Plasmid wurde als pHB1 bezeichnet. pHB1 wurde dann mit HincII verdaut und durch Fragmente durch Ligation zirkularisiert. Die Einführung der Ligationsmischung in E. coli durch Transformation führte zu einer Sammlung von Plasmiden, von denen eines, pHBH, ein Fragment von 6,3 Kb oberhalb der Codierungssequenz verloren hatte. Dieses Plasmid wurde weiterhin teilweise mit EcoRV verdaut und erneut ligatiert. Wenn diese Mischung in E. coli transformiert wurde, trat ein weiterer Verlust eines Fragments von 2,0 kb unterhalb der Codierungssequenz auf, was zu einem neuen Plasmid von 8,2 kb führte, das als pHBHE bezeichnet wurde. Die Sequenz der Konstruktionen ist in Fig. 1 wiedergegeben. Der bakterielle Stamm, der pHBHE enthielt, wurde als HBRE bezeichnet.

E I B. Expression eines B.t.-δ-Endotoxinproteins von 135.000 Dalton durch den rekombinanten E. coli-Stamm HBHE.

Der E. coli-Stamm HBHE und ein Stamm, der nur pUC9 enthält, wurden etwa 16 Stunden in ampicillinhaltigem LB-Medium von 32ºC wachsen gelassen. Die Proteinextrakte wurden aus den Zellen hergestellt, wie bei den Verfahren beschrieben, und wurden elektrophoretisch an einem 8% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt.
Ergebnisse aus Fig. 2 zeigen, daß das rekombinante Plasmid pHBHE ein Gen exprimiert, das ein Protein der Größe von etwa 135.000 Dalton codiert und daß dieses Protein die gleiche Mobilität hat, wie das des HD1-Kristallproteins. Die Spuren 1, 2 und 3 zeigen die Proteine des ursprünglichen B.t.-Stamms HD-1, des E. coli-Stamms mit dem Vektor pUC9 sowie des rekombinanten E. coli-Stamms HBHE, aufgetrennt an 8 % SDS-Polyacrylamidgel. Spur 4 zeigt die vorgefärbten Standards mit hohem Molekulargewicht. Die gefärbten Proteine sind in Fig. 2A gezeigt und ein Western- Blot eines ähnlichen Gels in Fig. 2B. Das Protein von 135.000 Dalton scheint spezifisch mit dem B.t.-Toxinantikörper zu reagieren.

E I C. Auftreten eines kristallinen Körpers im rekombinanten E. coli-Stamm HBHE.

Eine wachsende Kultur von HBHE in LB-Medium wurde für die elektronenmikroskopische Untersuchung aufbereitet, wie im Verfahren, oben beschrieben. Fig. 3F zeigt das transmissionselektronenmikroskopische Bild einer Sektion des rekombinanten E. coli-Stamms HBHE. Der rekombinate E. coli-Stamm bildet deutlich einen Kristall, obwohl nicht vom gleichen Profil, wie im ursprünglichen B.t.-Stamm (Fig. 3C). Dies war in den Stämmen, die nur den Vektor enthielten, nicht sichtbar.

E I D. Toxizitätstest der Extrakte des rekombinante DNS enthaltenden E. coli-Stamms HBHE.

Toxizitättests wurden durchgeführt, wie in den Verfahren beschrieben. Bei einer Konzentration von 1 mg/ml Zellextraktpulver in der Nahrung waren alle 12 Trichoplasia ni Larven der dritten Inzuchtgeneration nach 4 Tagen tot. Bei 0,25 mg/ml waren 9 von 12 T.ni-Larven tot nach 6 Tagen und 3 sehr stark gehemmt.
Die Ergebnisse aus Beispiel I können dahingehend zusammengefaßt werden, daß der rekombinante E. coli-Stamm HBHE ein Protein von 135.000 Dalton produziert, der einen halbdefinierten Kristall bildet und mit dem spezifischen B.t.-Antikörper reagiert. Der Plasmidvektor pUC9 produziert jedoch kein Protein, das mit dem B.t.-Antikörper reagiert, und hat auch keinen Kristall, was zeigt, daß das B.t.-Insert im Vektor zur Produktion des Toxinkristallproteins führt. Die Tatsache, daß die Extrakte aus dem Stamm, der nur den Vektor pUC9 enthält, keine toxischen Wirkungen an Raupen zeigt, wohingehen der HBHE-Extrakt toxisch ist, zeigt, daß das neue protein, das in HBHE exprimiert wird, toxisch auf Raupen wirkt.

Beispiel II

Klonierung des δ-Endotoxingens in Bacillus subtilis

Hier wird die Isolierung des B.t.-Toxingens aus dem rekombinanten E. coli-Plasmid pHBHE, das in Beispiel I beschrieben ist, seine Einführung in Bacillus subtilis und seine Expression in B. subtilis beschrieben.

E II A. Konstruktion des rekombinanten Plasmids, das das δ-Endotoxingen von B. thuringiensis, Varietät Kurstaki, aufweist, zur Propagierung in B. subtilis.

Das im Beispiel I beschriebene rekombinante Plasmid pHBHE wurde als Quelle für das B.t.-δ-Endotoxingen verwandt. Der Vektor war pBD64 (Gryczan et al., 1980), der Gene für die Resistenz gegen Chloramphenicol und Kanamycin in B. subtilis aufweist. Ein Klonierungsereignis in der einzigen BglII-Stelle inaktiviert die Kanamycinresistenz. Das pHBHE wurde mit den Restriktionsendonukleasen SmaI und HincII geschnitten, was zur Erzeugung von zwei Fragmenten von 5,5 und 2,7 Kilobasen mit zwei glatten Enden führte. Der Vektor pBD64 wurde an seiner einzigen BglII-Stelle durch Verdauen mit BglII-Enzym linearisiert. Die erzeugten klebrigen Enden wurden unter Verwendung eines Klenow-Fragments von DNS-Polymerase I aufgefüllt.
1 mcg des linearisierten und geglätteten pBD64 wurde dann mit etwa 4 mcg HincII-SmaI-Doppelverdauungsprodukt von pHBHE gemischt und mit Ligase verbunden. Das Ausmaß der Ligation wurde durch Agarosegelelektrophorese verfolgt. Die ligatierte DNS wurde dann in die kompetenten Zellen von B. subtilis Stamm PSLI durch Transformation eingeführt. Die resultierenden Chloramphenicol-resistenten Kolonien wurden auf die Gegenwart des δ- Endotoxingens durch Koloniehybridisierung getestet, wobei das aus der doppelten Verdauung von pHBHE mit HincII und SmaI erhaltene ³²P-markierte Fragment von 5,5 kb verwandt wurde. Fig. 4 ist zur Erläuterung eines typischen Experiments der Art angegeben. Die dunklen Regionen des auf der rechten Seite der Abbildung gezeigten Röntgenfilms repräsentieren die DNS enthaltenden Kolonien, die mit der Sonde hybridisieren. Diese wurden mit den Kolonien auf der Masterkolonieplatte korreliert, um die Positiven zu identifizieren. Die als positiv identifizierten Kolonien wurden für einzelne Kolonien auf mediumreiche Agarplatten (TBAB) mit 5 mcg/ml Chloramphenicol gestrichen. Schnelle Plasmidzubereitungen wurden von einigen dieser Positive gemacht und die Gegenwart von B.t.-Toxingeninsert darin durch Southern-Hybridisierung bestätigt. Fig. 5A zeigt an 0,8 % Agarosegel elektrophoresierten Plasmide und 5B ein Autoradiogramm des Southern-Blot des gleichen Gels. Spur 1 zeigt den zur Klonierung verwandten Vektor pBD64 und die Spuren 2-5 einige der Transformanten. Es ist klar, daß die Transformanten das B.t.-Toxingeninsert enthalten, der Vektor selbst dagegen nicht.
Die Kartierung der rekombinanten Plasmide einiger dieser Transformanten durch Restriktionsenzyme zeigte, daß das Insert in beliebiger Orientierung vorhanden sein kann. Eines davon, das in Orientierung A vorliegt, wurde als pABS-5 bezeichnet und ein anderes in gegenläufiger Orientierung als pABS-9. Die Sequenz der Konstruktionsereignisse ist in Figur 6 wiedergegeben.
Ein anderes rekombinantes Plasmid pABS-59 wurde durch Ligatieren des HincII-SmaI-Doppelverdauungsprodukts von pHBHE an die einzige PvuII-Stelle von pBD64, Transformation in kompetente PSLI-Zellen und Sichtung durch Koloniehybridisierung und Kolonie-Immunblotten konstruiert.

E II B. Expression von δ-Endotoxin durch gentechnisch veränderte B. subtilis-Stämme.

Die die rekombinanten Plasmide pABS-5, pABS-9 und pABS-59 enthaltenden Stämme werden als ABS-5, ABS-9 sowie ABS-59 bezeichnet. ABS-5, ABS-9 und ABS-59wurden in Luria-Brühe als Medium mit 5 mcg/ml Chloramphenicol 16 Stunden bei 30ºC in einem Rüttelinkubator wachsen gelassen. Die Zellen wurden versponnen und einmal in Puffer A (60 mM, NH&sub4;Cl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 6 mM β-Mercaptoethanol, 2 mm PMSF, 10 % Glycerin und 1 M KCl) sowie zweimal in TESP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7,6, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 2 mM PMSF) gewaschen. Die Zellen wurden mit 1 mg/ml Lysozym in TESP lysiert, mit gleichem Volumen von zweimal Probenpuffer (12 M Harnstoff, 5 % SDS, 2 % β-Mercaptoethanol, 0,25 M Tris-HCl, pH 6,8) gemischt, 10 min gekocht, abgekühlt und versponnen. Die klare überstehende Lösung wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf Proteine hin analysiert.
Fig. 7A zeigt die an 8 % Polyacrylamidgel abgetrennten und gefärbten Proteine. Fig. 75 zeigt ein Western-Blot der Proteine.
Aus der Figur wird deutlich, daß die Stämme ABS-5, ABS-9 und ABS-59 (Spuren, 3, 5 und 8) ein Protein mit etwa 135.000 Dalton exprimieren und daß dieses Protein spezifisch mit dem Antikörper auf B.t.-Kristallprotein reagiert. Die Spuren 1 und 7 zeigen Proteine des E. coli-Klons pHBHE und den PSL-Stamm, der nur den Vektor pBD64 enthält. Weder der Ursprungsstamm PSL1 noch der nur den Vektor pBH64 beherbergende Stamm exprimieren Proteine, die mit dem Antikörper reagieren.
Die Bildung von wohldefinierten bipyramidalen kristallinen Strukturen durch ABS-5 und ABS-9 wurde mit Hilfe von Transmissionselektronenmikrographien gefunden und ist in den Fig. 3A und 3B dargestellt.
Die folgenden Fakten deuten ebenfalls darauf hin, daß das in B. subtilis geklonte B.t.-Toxingen seinen eigenen Promotor zur Expression des Proteins von 135.000 Dalton verwendet.
1. pABS-5 und pABS-9, die beiden rekombinanten Plasmide, in die das Toxingen in entgegengesetzten Orientierungen insertiert ist, exprimieren ein Protein von 135.000 Dalton.
2. pABS-59, das das Toxingen in die einzige pvuII-Stelle abseits von sowohl dem Kanamycin- als auch dem Chloramphenicol- Resistenzgen des pBD64-Vektors insertiert enthält, exprimiert ebenfalls eine proteinähnliche Größe.

E II C. Expression des δ-Endotoxins in ABS-5 in verschiedenen Wachstumsstadien.

ABS-5 wurde über Nacht (etwa 16 Stunden) bei 30ºC in LB- Medium mit 5 mc/ml Chloramphenicol wachsen gelassen. Eine Kultur von HD-1 (Dipel) wurde ebenfalls in LB-Medium wachsen gelassen. Aliquote wurden hundertfach am Morgen in ihre jeweiligen frischen Kulturen hinein verdünnt, und das Wachstum wurde mit einem Klett-Kolorimeter verfolgt. Aliquote wurden in regelmäßigen Intervallen aus beiden Kulturen entfernt, Extrakte hergestellt, wie in Beispiel EIIB beschrieben, und die Proteine durch Elektrophorese an 8 % SDS-Polyacrylamidgel abgetrennt. Fig. 8 zeigt eine Wachstumskurve der beiden Kulturen.
Fig. 9A zeigt die gefärbten Proteine, und Fig. 95 zeigt ein Western-Blot der Proteine.
Aus der Figur wird deutlich (siehe Figurenlegenden zur Erläuterung), daß der B. subtilis-Stamm die Expression früh in der vegetativen Phase startet, während die HD-1(Dipel)-Zellen die Expression fraglos nicht vor der Sporulation starten. Die Spuren 1 bis 9 zeigen Proteine aus dem B. subtilis-Klon ABS-5 und die Spuren 11 bis 19 die Proteine der ursprünglichen B.t.- Stämme HD1-Dipel.

E II D. Elektronenmikroskopische Untersuchung.

Der ABS-5-Stamm wurde in LB-Medium mit 5 mcg/ml Chloramphenicol über Nacht (16 Stunden) bei 30ºC wachsen gelassen und am Morgen durch 100fache Verdünnung in frisches Medium in Unterkulturen unterteilt. Aliquote wurden in regelmäßigen Abständen entnommen und für die Transmissionselektronenmikroskopie behandelt, wie unter Verfahren, oben, beschrieben.
Fig. 10 zeigt einige elektronenmikroskopische Sektionen von Kulturen von ABS-5 in verschiedenen Wachstumsstadien. Zum Vergleich wurde der HD-1(Dipel)-Stamm ebenfalls in LB-Medium wachsen gelassen, und es wurden Aliquote in verschiedenen Wachstumsstadien entnommen, die auf ähnliche Weise für die Transmissionselektronenmikroskopie behandelt wurden. Fig. 11 zeigt EM-Sektionen von B.t. in verschiedenen Stadien (wie Figurenlegende zur Erläuterung).
Das Auftreten von kleinen kristallinen Strukturen wurde nach nur 13 Stunden bei B. subtilis-Klonen deutlich, während bei B.t. klar identifizierbare Kristalle erst nach etwa 20 Stunden Wachstum aufzutreten schienen.

E II E. Expression des rekombinanten Plasmids pABS-5 in einer rekombinationsdefizienten Mutante von B. subtilis.

Um zu zeigen, daß die Stabilität des rekombinanten Plasmids und die Expression von insektizidem Protein in Form von Kristallen nicht auf die Eigenschaft des Stammes PSLI zurückgeht, war es nötig, das rekombinante Plasmid in einen anderen Stamm mit einem anderen Hintergrund zu transferieren.
Der B. subtilis-Stamm BD 224 wurde vom Public Health Research Institute of the City of New York zur Verfügung gestellt. Es ist eine rekombinationsdefiziente Mutante, deren Marker trpC2 recE4 thr-5 sind.
BD 224-Zellen wurden mit dem üblichen Verfahren kompetent gemacht, wie unter Verfahren, oben, beschrieben. Das rekombinante Plasmid pABS-5 wurde durch Transformation in die kompetenten Zellen von BD225 eingeführt. Die Transformanten wurden auf ihre Resistenz gegen Chloramphenicol hin selektiert. Es wurde gefunden, daß die aus den Transformanten isolierte Plasmid-DNS die gleiche war, wie bei pABS-5. Dieser Stamm wurde als ABS-58 bezeichnet. Zellextrakte wurden zur Proteinanalyse aus wachsenden Kulturen von ABS-58 in LB-Medium hergestellt, und die Proteine durch Elektrophorese an 8 % SDS-Polyacrylamidgel abgetrennt. Die gefärbten Proteine sind in Spur 4 von Fig. 7A dargestellt, und ein Western-Blot ist in Spur 4 von Fig. 7B gezeigt. Hieraus wird klar, daß ABS-58 ein Protein von ähnlicher Größe wie in B.t. exprimiert und daß es mit dem Antikörper gegen B.t.-Kristallprotein kreuzreagiert.

E II F. Expression des rekombinanten Plasmids pABS-9 in einer sporulationsdefizienten Mutante von B. subtilis.

Um zu klären, daß das in B. subtilis klonierte Toxingen tatsächlich unabhängig von der Sporulation ist, war es notwendig, seine Expression in einem nichtsporulierenden Stamm von B. subtilis zu testen.
Der B. subtilis-Stamm IS 160 wurde vom Public Health Research Institute of the City of New York zur Verfügung ge-ü stellt. Dieser Stamm ist eine Mutante mit früher Sporulation und hat die Markierungen trpC2 pheA SpoOH15.
Kompetente Zellen IS 160 wurden hergestellt, wie im Abschnitt Verfahren, oben, beschrieben. Das rekombinante Plasmid pABS-9 wurde in diese kompetenten Zellen durch Transformation eingeschleust. Transformanten wurden auf die Chloramphenicolresistenz hin selektiert. Es wurde gefunden, daß die isolierte Plasmid-DNS die gleiche war, wie in ABS-9. Dieser nichtsporulierende Stamm mit dem Plasmid pABS-9 wird als ABS-57 bezeichnet.
Zellextrakte wurden aus ABS-57 hergestellt und durch Elektrophorese an 8 % SDS-Polyacrylamidgel auf Proteine hin analysiert. Die gefärbten Proteine sind in Spur 6 von Fig. 7A gezeigt und ein Western-Blot des gleichen Proteins ist in Spur 6 von Fig. 7B gezeigt. Aus der Figur ist klar, daß das Plasmid pABS-9 in ABS-57 ein Protein von etwa 135.000 Dalton exprimiert, das immunologisch reaktiv mit dem Antikörper auf das Kristallprotein ist. Somit ist die Sporulation für die Expression von δ- Endotoxin in B. subtilis nicht erforderlich.

E II G. Expression des rekombinanten Plasmids pABS-9 in einem wurzelkolonisierenden Stamm A-13 von B. subtilis.

A-13 ist ein B. subtilis-Stamm, der aus Sclerotium Rolsii in Australien isoliert wurde, und wurde kommerziell zur Behandlung von Erdnußsamen behandelt. A-13 ist bekannt, daß er Erdnußwurzeln besiedelt und das Aufgehen der Saat erhöht und die Wurzelpathologie verbessert.
Das rekombinante Plasmid pABS-9 wurde in A-13 durch Transduktion unter Verwendung eines generalisierten transduzierenden Phagen AR9 (Belyaeva und Azizbekyan, 1968) eingeschleust. Selektion erfolgte auf Chloramphenicol unter Verwendung von 5 mg/ml. Es wurde gefunden, daß die aus diesen Transduktanten isolierte Plasmid-DNS der von pABS-9 ähnlich war. Dieser wurzelnkolonisierende B. subtilis-Stamm A-13, der pABS-9 enthält, wird als ABS-65 bezeichnet.
Aus ABS-65 hergestellte Zellextrakte wurden elektrophoretisch an 8 % SDS-Polyacrylamidgel auf Proteine hin analysiert und die Expression eines δ-Endotoxinproteins von 135.000 Dalton durch Western-Blot-Analyse bestätigt.

E II H. Klonierung und Expression der rekombinanten Plasmide pABS-60 und pABS-61 in B. subtilis.

Zwei weitere rekombinante Plasmide wurden unter Verwendung eines anderen B. subtilis-Plasmids pC194 (Horinswich und Weisblum, 1982) konstruiert. Dieses Plasmid hatte zwei einzelne Klonierungsstellen HindIII und HaeIII.
1 mg pC194-Plasmid-DNS, die mit HindIII oder mit HaeIII linearisiert worden war, wurde mit 4 µg des HincII-SmaI-Doppelverdauungsprodukts von pHBHe (siehe E II A) gemischt und mit T4 DNS-Ligase fusioniert. Transformation, Selektion und Identifikation der Transformanten erfolgte auf die gleiche Weise, wie in E II A skizziert.
In die HindIII-Stelle von pC194 insertiertes Toxingen (HincII-SmaI-Fragment von pHBHE) wird als pABS-60 bezeichnet und das in die HaeIII-Stelle insertierte als pABS-61, während die Stämme, die diese Plasmide enthalten, als ABS-60 und ABS-61 bezeichnet werden. Zellextrakte dieser Stämme ergaben ein Protein von 135.000 Dalton, das mit dem B.t.-Toxinantikörper kreuzreagierte. Es wurde gefunden, daß der Expressionsgrad ähnlich dem in pABS-5 und pABS-9 war.

Beispiel III

Klonierung von δ-Endotoxinprotein von 130.000 Dalton spezifizierenden Genen aus B. thuringiensis, Varietät Kurstaki HD1- Dipel in E. coli.

E III A. Konstruktion einer Lambda 1059-Bibliothek von B.t.-Genen und Klonierung eines Toxingens in E. coli

Ein Gen des HD1-Dipel-Stamms von B.t., der das toxische Protein von 130.000 d kodiert, wurde in den Bakteriophagen Lambda 1059 kloniert. B.t.-DNS wurde mit BglII geschnitten und mit Lambda 1059-DNS gemischt, die mit BamHI geschnitten worden war. T4 DNS-Ligase (40 Einheiten) wurde zugesetzt, zusammen mit Reaktionspuffer zu einem Endvolumen von 20 µl. Die Ligationsreaktion wurde über Nacht bei 16ºC durchgeführt. Ein Viertel der ligatierten DNS-Lösung wurde zu 50 µl Lambda-Packextrakt (Pakagene; Biotec) gegeben und die Mischung 2 Stunden bei 22ºC gehalten. Ein ml 5M-Puffer wurde zusammen mit 25 ml Chloroform als Konservierungsmittel zugesetzt.
Ein Volumen von 0,1 ml einer Verdünnung auf 10&supmin;¹ des gepackten rekombinanten Phagen wurde mit E. coli Q359 in weichem Agar gemischt und jeweils auf fünf NZA-Platten aufgetragen. Insgesamt wurden 3,5 x 10³ Platten erhalten. Phagen wurden dann auf Nitrocellulosefilter von 82 mm transferiert. Die Filter wurden auf die Oberfläche des Agar gebracht, und die Phagen wurden 2 Stunden bei 22ºC binden gelassen. Filter mit gebundenen Phagen wurden in 3%iger Gelatinelösung getränkt und danach in einer Lösung mit Kaninchenantikörpern gegen gemischte B.t.-Kristallproteine von 135.000 d und 130.000 d. Gebundene Antikörper wurden durch Binden an mit Meerrettichperoxidase konjugierte Ziegen-Antikaninchen-Antikörper und danach Entwickeln mit Immunoblot-Farbreagens (Bio-Rad) nachgewiesen. Plaques rekombinanter Viren, die B.t.-Kristallprotein enthielten und exprimierten, erschienen purpurfarben auf dem Filter. Plaques, die Positiven auf dem Filter entsprachen, wurden von der Agarplatte aufgenommen, im Plaque gereinigt und in 5M-Puffer mit chloroform gelagert.
DNS wurde aus dem rekombinanten Phagen Lambda S4B isoliert, der eine starke Immunoblotreaktion hat, und teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3A verdaut. Die DNS-Fragmente wurden in das Plasmid pUC9 ligatiert, das mit BamHI geschnitten worden war. Die resultierenden rekombinanten Plasmide wurden dann mit einem Immunoblottest gesichtet. Einer der positiven Klone, LSS2 bezeichnet, enthielt 8,3 kb B.t.-DNS und kodierte das B.t.-Kristallprotein von 130 kd. Ein Fragment der insertierten LSS2-DNS, durch Verdauung mit Restriktionsnuklease HincII erzeugt, wurde in pUC9 subkloniert, die ebenfalls mit HincII geschnitten worden war. Dieser Subklon kodiert das Protein mit 130 kd und wird als pHC45 bezeichnet.
Die Sequenz von Ereignissen, die zur Konstruktion von pHC45 führt, ist in Fig. 12 dargestellt.

E III B. Expression eines Polypeptids von 130.000 Dalton durch pHC45.

Der E. coli-Stamm HC45, der pHC45 enthält, wurde in LB- Medium 22 Stunden wachsen gelassen und auf Protein hin aufbereitet, das analysiert wurden, wie unter Verfahren, oben, beschrieben.
Die Ergebnisse aus Fig. 13 bestätigen, daß das rekombinante Plasmid pHC45 in E. coli ein Protein von 130.000 Dalton exprimiert, die Größe des kleineren der Toxinproteine im B.t. Dipel-Stamm.
Spur 6 in Fig. 13A zeigt die mit Coomassie-Blau gefärbten Proteine, die durch den Vektor pUC9 allein exprimiert werden, und Spur 5 die von pHC45 exprimierten Proteine. Die Spuren 6 und 5 in Fig. 13B zeigen einen Western-Blot der Proteine von pUC9 und pHC45. Es ist deutlich zu sehen, daß das pHC45 spezifisch mit dem Antikörper auf B.t.-Kristallprotein reagiert.

Beispiel IV

Klonierung eines Verbund-Plasmids mit der Steuerregion aus pHBHE und dem Strukturgen aus pHC45 in E. coli.

E IV A. Konstruktion eines rekombinanten Plasmids pBSW7.

Das in Beispiel 1 beschriebene rekombinante Plasmid pHBHE wurde als Quelle für die Promotorregion und das in Beispiel 2, E II A beschriebene rekombinante Plasmid pHC45 als Quelle für das Toxin-Strukturgen für die Konstruktion eines neuen rekombinanten Plasmids pBSW7 verwandt.
Das Plasmid pHBHE wurde mit dem Restriktionsenzym ClaI verdaut und unter Verwendung von bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Es wurde dann mit einem zweiten Enzym SmaI behandelt. Das aus der pUC 9-Portion bestehende Fragment von 3,0 kb wurde zusammen mit der Promotorregion zwischen der HincII- und der ClaI-Stelle des Toxingeninserts isoliert und an einem Agarosegel gereinigt. Das Plasmid pHC45 wurde mit PstI und SmaI geschnitten und dann partiell mit dem Restriktionsenzym ClaI verdaut. Die Fragmente wurden durch Elektrophorese getrennt und ein Fragment von 3,6 kb wurde isoliert und gereinigt. Die Identität der beiden Fragmente von 3,0 kb und 3,6 kb wurde durch Restriktionsanalyse geprüft. Diese wurden dann gemischt und in Gegenwart von T4 DNS-Ligase ligatiert.
Die ligatierte DNS wurde in kompetente Zellen eines E. coli TB-1-Stammes eingeschleust. Nach dem Sichten durch Koloniehybridisierung und durch Studieren schneller Plasmidzubereitungen, wie in früheren Beispielen beschrieben, wurde eines von den Positiven selektiert, das Plasmid aus diesem Transformanten isoliert und auf seine Restriktionsstellen hin kartiert. Dieses Plasmid wird als pBSW7 bezeichnet und der Stamm, der es enthält, als BSW7. Das Fließdiagramm der Konstruktion ist in Fig. 14 dargestellt.

E IV B. Expression eines insektiziden Proteins von 130.000 Dalton aus BSW7.

Der E. coli-Stamm BSW7, der das rekombinante Plasmid pBSW7 beherbergt, wurde in LB-Medium 20 Stunden bei 30ºC wachsen gelassen. Die Zellen wurden versponnen und zwecks Erhalt von Zellextrakten zur Proteinanalyse aufbereitet, wie in früheren Beispielen beschrieben.
Die Spuren 6 und 4 in Fig. 13 zeigen jeweils die Proteine aus pUC9 und pBSW7. Fig. 13A zeigt die mit Coomassie-Blau gefärbten Proteine und 13B zeigt ein Western-Blot eines ähnlichen Gels. Das rekombinante Plasmid pBSW7 exprimiert ein Protein von 130.000 Dalton, ähnlich in der Größe dem von pHC45 exprimierten Protein.

E IV C. Insektentoxizitätstest an Extrakten von pBSW7.

Zellextrakte von BSW7 würden hergestellt, wie beschrieben, und Toxizitätstests wurden durchgeführt, wie in früheren Beispielen beschrieben. Es wurde gefunden, daß sie hochtoxisch auf Raupen wirken.

Beispiel V

Konstruktion eines rekombinanten Plasmids pABS-55 zur Exprimierung des insektiziden B.t.-Proteins in B. subtilis.

E V A. Das rekombinante Plasmid pBSW7, beschrieben im Beispiel E IV A, wurde als Quelle für das Toxingen verwandt. Der verwandte B. subtilis-Vektor war bPD64.
Das Plasmid pBD64 wurde mit dem Restriktionsenzym BglII verdaut, und die erzeugten klebrigen Enden wurden unter Verwendung eines Klenow-Fragments von DNS-Polymerase I aufgefüllt. pBSW7 wurde mit HincII geschnitten. Ein Teil des pBD64-Verdauungsprodukts wurde mit 4 Teilen pBSW7-Verdauungsprodukt gemischt und mit T4-DNS-Ligase 16 Stunden bei 15ºC ligatiert. Die ligatierte DNS wurde in die kompetenten Zellen von B. subtilis-Stamm PSL1 eingeschleust und auf eine Chloramphenicolresistenz hin selektiert. Gegen Chloramphenicol resistente Kolonien wurden durch Koloniehybridisierung auf Inserte und durch Kolonie-Immunblotten auf Toxinantigen hin gesichtet. Das resultierende Plasmid wird als pABS-55 bezeichnet und der Stamm, der dieses Plasmid beherbergt, als ABS-55. Die Konstruktionssequenz ist in Fig. 15 wiedergegeben.

E V B. Expression eines Proteins von 130.000 Dalton durch B. subtilis-Stamm ABS-55

Zellextrakte wurden zur Proteinanalyse aus ABS-55-Zellen hergestellt, die in LB-Medium bei 30ºC 20 Stunden wachsen gelassen worden waren, wie in früheren Beispielen beschrieben. Die Proteine wurden an 8 % SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die gefärbten Proteine und ein Immunoblot des Gels sind jeweils in Fig. 13A und 13B wiedergegeben. Die Spuren 2 und 3 zeigen die Proteine des pABS-55 enthaltenden Stamms pSL1. Diese B. subtilis-Zellen erzeugen ein Protein von 130.000 Dalton, das mit dem Antikörper auf B.t.-Kristallprotein spezifisch reagiert.

E V C. Insektentoxizitätstest der Zellextrakte aus ABS- 55.

Zellextrakte wurden aus dem Stamm ABS-55 erzeugt und auf Toxizität getestet, wie in früheren Beispielen beschrieben. Es wurde gefunden, daß sie gegen Insekten hochtoxisch wirken.

E V D. Bildung eines bipyramidalen Kristalls im Stamm ABS-55.

Eine Kultur von ABS-55 wurde nach 22 Stunden Wachstum bei 33ºC geerntet und zur elektronenmikrographischen Sektionierung behandelt, wie unter Verfahren, oben, beschrieben. Bipyramidale Kristalle wurden nachgewiesen. Ein Bild einer ABS-55-Zelle mit dem Kristall ist in Fig. 3D wiedergegeben.
Es ist festzuhalten, daß verschiedene Modifikationen und Variationen der hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung vom normalen Fachmann vorgenommen werden können. Solche Modifikationen und Variationen ergeben sich aus der detaillierten Beschreibung und sollen voll im Schutzbereich der folgenden Ansprüche liegen.

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Claims

1. Gentechnisch veränderter Stamm von B. subtilis, der sowohl in der vegetativen als auch in der Sporulations-Wachstumsphase ein Polypeptid von etwa 135.000 Dalton exprimiert und die immunologischen Eigenschaften eines Kristallproteins von B. thuringiensis, Varietät Kurstaki HD1 DIPEL, aufweist, wobei für das Polypeptid ein B. thuringiensis-DNS-Fragment kodiert, das, wenn durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen ClaI und EcoRI charakterisiert, die folgende Restriktionskarte zeigt

wobei das DNS-Fragment in beliebiger Orientierung in ein rekombinantes Plasmid insertiert ist, das jede B. subitilis- Wirtsspezies transformieren kann.

2. Rekombinantes Plasmid, das zur Replikation in jeder B. subtilis-Wirtsspezies fähig ist, welches Plasmid ein exprimierbares heterologes DNS-Fragment von B. thuringiensis, Varietät Kurstaki, enthält, welches, wenn durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen ClaI und EcoRI charakterisiert, die folgende Kestriktionskarte zeigt

wobei das DNS-Fragment in beliebiger Orientierung insertiert ist und für ein Polypeptid von etwa 135.000 Dalton kodiert, das die immunologischen Eigenschaften eines Kristallproteins von B. thuringiensis, Varietät Kurstaki, aufweist, und welches Plasmid weiterhin einen Expressionsmechanismus für die heterologe DNS einschließt, der von der Wirtsspezies erkannt wird.

3. Gentechnisch veränderter B. subtilis-Stamm ABS-55 (deponiert bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer 53122), der sowohl während der vegetativen als auch während der Sporulations-Wachstumsphase ein Polypeptid von etwa 130.000 Dalton mit den immunologischen Eigenschaften eines Kristallproteins von B. thuringiensis, Varietät Kurstaki, exprimiert, welches Polypeptid von einem B. thuriengiensis-DNS-Fragment kodiert wird, das, wenn durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen ClaI und EcoRI charakterisiert, die folgende Restriktionskarte aufweist

wobei das DNS-Fragment in ein rekombinantes Plasmid insertiert ist, das jede B. subtilis-Wirtsspezies transformieren kann.

4. Kekombinantes Plasmid, das zur Replikation in jeder B. subtilis-Wirtsspezies fähig ist, welches Plasmid ein exprimierbares heterologes DNS-Fragment von B. thuringiensis, Varietät Kurstaki, enthält, das, wenn durch Verdauung mit den Pestriktionsenzymen ClaI und EcoRI charakterisiert, die folgende Restriktionskarte aufweist

wobei das DNS-Fragment für ein Polypeptid von etwa 130.000 Dalton kodiert, das die immunologischen Eigenschaften eines Kristallproteins von B. thuringiensis, Varietät Kurstaki, aufweist, welches Plasmid weiterhin einen Expressionsmechanismus für die heterologe DNS einschließt, der von der Wirtsspezies erkannt wird.

5. Verfahren zur Erzeugung von Delta-Endotoxin-Proteinen von B. thuringiensis, Varietät Kurstaki, durch Exprimieren des B. subtilisstamms nach Anspruch 1 oder 3 während seiner vegetativen Phase.