DE4042160C2

DE4042160C2 - N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen und neue rekombinante DNA sowie ein Verfahren zur Herstellung von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase

Info

Publication number: DE4042160C2
Application number: DE4042160A
Authority: DE
Inventors: Hideko Otake; Yasuji Koyama; Tatsuo Horiuchi; Eiichi Nakano
Original assignee: Kikkoman Corp; Noda Institute for Scientific Research
Current assignee: Kikkoman Corp; Noda Institute for Scientific Research
Priority date: 1989-12-28
Filing date: 1990-12-28
Publication date: 1999-02-25
Anticipated expiration: 2010-12-29
Also published as: JP2589287B2; US5942427A; DE4042160A1; JPH03201988A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen und eine neue rekombinante DNA sowie ein Verfahren zur Herstellung von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase.

Die Erfinder haben bereits früher Untersuchungen durchgeführt hinsichtlich eines Verfahrens zur Bestimmung von Sialsäure in einer einfachen Art und mit einer hohen Genauigkeit. Sie haben herausgefunden, daß Bakterien, die der Art Flavobacterium angehören, die aus dem Boden isoliert wurden, auf N-Acetylmannosamin wirken, um N-Acetylmannosamin-Lacton herzustellen und um gleichzeitig ein neues Enzym herzustellen, welches in der Lage ist, NAD zu NADH zu reduzieren. Sie haben weiterhin herausgefunden, daß dieses Enzym effektiv für die Bestimmung von Sialsäure verwendet werden könnte, und sie haben eine Patentanmeldung eingereicht, die auf N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase und ein Verfahren zu deren Herstellung gerichtet ist (USSN 07/121,916).

Eine Struktur des N-Acetylmannosamin-Dehydrogenasegens, welches sich von Bakterien ableitet, die zu der Art Flavobacterium gehören, beispielsweise Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm, ist ziemlich unbekannt. Die gegenwärtige Lage ist, daß das Gen noch nicht isoliert worden ist.

Wenn diese N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase verwendet wird, kann auf der anderen Seite eine quantitative Untersuchung von N-Acetylmannosamin mit einer guten Genauigkeit durchgeführt werden und eine Menge von Sialsäure kann auf der Basis von N-Acetylmannosamin untersucht werden. Als Ergebnis kann eine Diagnose von verschiedenen Krankheiten wirksam durchgeführt werden. Jedoch sind mit der Herstellung von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase im industriellen Maßstab verschiedene Einschränkungen verbunden. Es ist gegenwärtig gewünscht, diese Einschränkungen zu eliminieren. Das bedeutet, es ist zwingend erforderlich für das oben genannte Erfahren zur Herstellung von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase, teures N-Acetylmannosamin oder N-Acetylglucosamin als einen Induktor in das Medium zufügen. In diesem Hinblick ist das oben genannte Verfahren somit von einem ökonomischen Gesichtspunkt nachteilig. Zusätzlich wächst der Stamm langsam, so daß eine lange Periode für die Inkubation erforderlich ist, Techniken wie Gefäßinkubation, etc., die Beschränkungen für die Anwendung in einem industriellen Maßstab beinhalten, sind erforderlich, um eine hohe Ausbeute zu erreichen, die Reinigungsschritte davon sind kompliziert, etc. Daher beinhaltet das Verfahren ebenfalls komplizierte Arbeitsvorgänge. Aus diesen Gründen beinhaltet das Verfahren den Nachteil, daß die Ausbeute des Enzyms manchmal ernsthaft vermindert ist.

Die Erfinder haben verschiedene Studien mit dem N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen durchgeführt, das sich von Bakterien ableitet, die zu der Art Flavobacterium, beispielsweise Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm, gehören, und als ein Ergebnis haben die Erfinder dieser Erfindung das Gen zum erstenmal isoliert. Anschließende Untersuchungen bezüglich einer effizienten Produktion von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase unter Verwendung des oben beschriebenen Gens haben zu der Erkenntnis geführt, daß durch Inkubation im Medium Escherichia coli, das mit rekombinanter DNA transformiert ist, welche durch Einfügen eines Gens des Enzyms, das sich von Flavobacterium, beispielsweise Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm, ableitet, in Vektor DNA, beispielsweise Plasmidvektor DNA, erhalten ist, das Enzym effizient in den Bakterienzellen hergestellt werden kann, ohne Ergänzung des oben genannten teuren Zusatzes zu diesem Medium. Somit kannte die vorliegende Erfindung vervollständigt werden.

DE 37 41 198 C2 beschreibt die Isolierung von NAM-DH aus unter der Hinterlegungsnummer FERM-BP-1222 hinterlegtem Flavobacterium. Die vorliegende Patentanmeldung beschreibt dagegen die Bestimmung der DNA und Aminosäuresequenz der isolierten NAM-DH.

Aus Horiuchi et al. (J. Biochem. 104, 466-471, 1988) geht eine spezifische Aktivität für aus Flavobacterium sp 141-8 stammender NAM-DH von 320-340 U/mg hervor (siehe Tabelle 1), während die spezifische Aktivität rekombinanter NAM-DH 545 U/mg beträgt. Die spezifische Aktivität rekombinanter NAM-DH ist somit ungefähr 2-fach höher als die des natürlichen Enzyms.

Yamamoto-Otake et al. (Applied and Environmental Microbiology, 1418-1422, 1991), eine Druckschrift, die nach dem Anmeldetag der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, beschreibt, daß E. coli Transformanten eine wesentlich höhere NAM-DH Aktivität aufweisen, als der Flavobacterium sp. 141-8 Stamm.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in dem N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen, welches sich von einem Mikroorganismus ableitet, der zu der Art Flavobacterium gehört, und das durch die folgende Restriktionsenzym-Schnittstellenkarte definiert ist:

(worin S Sal I, A Aat II und Sp Sph I bedeuten). Das erfindungsgemäße Gen ist ein N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen, das eine Aminosäuresequenz codiert, die 271 Aminosäuren aufweist, gezeigt durch SEQ ID Nr. 2, und die mit Methionin beginnt.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in einer neuen rekombinanten DNA, die durch Einfügen von N-Acetylmannosamin-dehydrogenase-Gen, das von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Art Flavobacterium gehört, und das durch die folgende Restriktionsenzym-Schnittstellenkarte definiert ist:

(worin S Sal I, A Aat II und Sp Sph I bedeuten), in Vektor DNA gekennzeichnet ist. Dies bedeutet, die vorliegende Erfindung ist auf eine neue rekombinante DNA gerichtet, die durch Einfügen von N-Acetylmannosamin-dehydrogenase-Gen, das eine Aminosäuresequenz codiert, die 271 Aminosäuren aufweist, gezeigt durch SEQ ID Nr. 2, und die mit Methionin beginnt, in Vektor DNA erhalten wird.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in einem Verfahren zur Herstellung von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch Anlegen einer Kultur eines Mikroorganismus in einem Medium, der zu der Art Escherichia gehört, der mit einer neuen rekombinanten DNA transformiert wurde, die durch Einfügen von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen, das sich von einem Mikroorganismus, der zur Art Flavobacterium gehört, ableitet und durch die folgende Restriktionsenzym-Schnittstellenkarte definiert ist:

(worin S Sal I, A Aat II und Sp Sph I) bedeuten, in Vektor DNA enthalten ist; und wobei das Verfahren außerdem dadurch gekennzeichnet ist, daß N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase aus der Kultur gesammelt wird. Dies bedeutet, die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase gerichtet, das darin besteht, daß im Medium ein Mikroorganismus, der zur Art Escherichia gehört, der mit neuer rekombinanter DNA transformiert wurde, die durch Einfügen von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen, das eine Aminosäuresequenz kodiert, die 271 Aminosäuren aufweist, gezeigt durch SEQ ID Nr. 2, und die mit Methionin beginnt, in Vektor DNA erhalten wurde, gezüchtet wird, und daß N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase aus der Kultur gesammelt wird.

Fig. 1 zeigt eine Restriktionsenzym-Schnittstellenkarte von rekombinanter Plasmid pNAM 106 DNA.

Fig. 2 zeigt eine Restriktionsenzym-Schnittstellenkarte von rekombinanter Plasmid pNAM 301 DNA.

Fig. 3 zeigt die gesamte Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1) von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen.

Fig. 4 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) von Polypeptid, welches von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen translatiert ist.

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung detaillierter beschrieben.

Unter Bezugnahme auf Bakterien, die zur Art Flavobacterium gehören, die erfindungsgemäß als Donoren von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen verwendet werden, gibt es beispielsweise den Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm (FERM BP-1222), etc.

Der oben genannte Mikroorganismus wird in ziemlich der gleichen Art und Weise, wie es in USSN 07/121,916 beschrieben ist, gezüchtet, um die Kultur zu erhalten. Die Zellen von beispielsweise Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm werden aus der Kultur in einer üblichen Art und Weise erhalten, beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation, etc.

Von den Zellen kann chromosomale DNA durch ein Verfahren erhalten werden, welches beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, Unit 2. 4. 3 (John Wiley & Sons, Inc., 1987) oder dergleichen, beschrieben ist.

Als nächstes wird die somit erhaltene chromosomale DNA in Phagenvektor lambda gtll eingeführt, wobei beispielsweise ein cDNA Clonierungssystem verwendet wird, welches von Amersham Co., Ltd. hergestellt ist, um verschiedene rekombinanten Phagen zu erhalten. Die Phagen werden mit E. Coli Y-1090 infiziert, um Plaques zu erhalten, die verschiedene Fusionsproteine herzustellen vermögen.

Um die Plaques nachzuweisen, die das Fusionsprotein mit N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase herstellen (nämlich rekombinante Phage, der eine N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Genfraktion enthält), kann das Verfahren angewandt werden, das in der Broschüre (Abschnitt 5, Seite 8) von Promega Biotec Co., Ltd. beschrieben ist.

Zur Reinigung der Phagen DNA von dem somit erhaltenen rekombinanten Phagen kann die Technik angewandt werden, die in Molecular Cloning, Seiten 371 und 372, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschrieben ist.

Dann wird die unvollständige N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen-DNA beipielsweise mit (alpha-P³²)dCTP (gekauft von Amersham Japan) durch ein Verlängerungsmarkierungssystem mit Hilfe eines Primers mit Zufallssequenz (hergestellt von Du Pont Inc.) oder dergleichen markiert. Unter Verwendung der DNA als eine Sonde kann eine DNA-Fraktion, die vollständiges N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen enthält, von chromosomaler DNA-Bank erhalten werden, die unter Verwendung von Phagen-Vektor EMBL 3 (hergestellt von STRATAGENE Co., Ltd.) als ein Vektor entsprechend der Plaquehybridisierung (Current Protocols in Molecular Biology) hergestellt ist.

Mit dem somit erhaltenen DNA-Fragment wird beispielsweise eine übliche Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt, dann wird es weiterhin gereinigt mit Hilfe von Reinigungsschritten, beispielsweise Extraktion mit Phenol, etc. und mit Hilfe von Konzentrationsmethoden, beispielsweise Ethanolausfällung etc., konzentriert. Somit kann ein DNA-Fragment erhalten werden, welches gereinigtes N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen (SEQ ID Nr. 1) enthält.

Als Vektor-DNA, die in der rekombinanten DNA gemäß dieser Erfindung verwendet werden kann, kann irgendeine Vektor-DNA verwendet werden. Es gibt beispielsweise Plasmid-Vektor-DNA, Bacteriophagen-Vektor-DNA, etc. Genauer ausgedrückt ist Plasmid pUC19 DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.,) oder dergleichen bevorzugt.

Die Vektor-DNA, die oben beschrieben ist, wird mit Restriktionsenzym zur Erzeugung eines versetzten Endes, beispielsweise BamH I (hergestellt, von Takara Shuzo Co., Ltd.) bei einer Temperatur oberhalb von 30°C, vorzugsweise 37°C, in einer Enzymkonzentration von 10 bis 1000 Einheiten/ml für zumindest eine Stunde, vorzugsweise 1 bis 3 Stunden, digeriert, um eine gespaltene Vektor-DNA zu ergeben.

Dann wird das somit erhaltene DNA-Fragment, welches sich von der Art Flavobacterium, beispielsweise Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm ableitet und N-Acetylmannoasamin-Dehydrogenase-Gen enthält, mit der gespaltenen Vektor-DNA vermischt. E. Coli DNA-Ligase (hergestellt von New England Biolabs Co., Ltd.), T4 DNA-Ligase (hergestellt von Boeringer Mannheim Co.), etc., vorzugsweise T4 DNA-Ligase wirkt dann auf die Mischung bei einer Temperatur von 4 bis 37°C, vorzugsweise 4 bis 16°C, in einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten/ml für eine Stunde oder länger, vorzugsweise für 6 bis 24 Stunden unter Erhalt von rekombinanter DNA. Die somit erhaltene rekombinante DNA wird dann mit Restriktionsenzymen zur Erzeugung von versetzten Enden, beispielsweise Pst I und Xba I (beide von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt) bei einer Temperatur oberhalb von 30°C, vorzugsweise 37°C, in einer Enzymkonzentration von 10 bis 100 Einheiten/ml für zumindest eine Stunde, vorzugsweise 1 bis 3 Stunden, verdaut. Dann wird DNA deletiert unter Verwendung von Deletionskit für Kilosequenzierung (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd) unter Erhalt von rekombinanter DNA, die einen weiter begrenzten Bereich aufweist, der vollständiges N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen enthält.

Unter Verwendung dieser rekombinanten DNA werden beispielsweise E, Coli K-12, vorzugsweise E. Coli JM 109 (erworben von Takara Shuzo Co., Ltd.), E. Coli HB 101 (ATCC 33694), E. Coli DHI (ATCC 33849), E. Coli X-1776 (ATCC 31244) und dergleichen transformiert oder überführt, unter Erhalt der entsprechenden Stämme. Die Transformation kann nach dem Verfahren don D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326-331 (1979)) durchgeführt werden. Die Überführung kann entsprechend dem Verfahren von B. Hohn (Methods in Enzymology, 68, 299-309 (1979)) durchgeführt werden.

Von den oben beschriebenen Stämmen wird ein Stamm, der N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase zu produzieren vermag, durch Verfahren gescreent, die kurz nachfolgend beschrieben sind. Somit kann ein Stamm erhalten werden, der rekombinante DNA trägt, die durch Einführen der N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase genhaltigen DNA in Vektor DNA erhalten wird, und der in der Lage ist N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase zu erzeugen und zur Art Escherichia gehört.

Schüttelkultur vom rekombinanten Stamm in 1 ml T-Y-Medium, welches mit 1 mM IPTG ergänzt ist, bei 37°C und für eine Dauer von 16 Stunden.

Zentrifugation (8000 Umdrehungen/min. 10 Minuten)

Zugabe von 1 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,2 (Standardpuffer), enthaltend 0,5% Triton X-100, zu den Zellen.

Ultraschallhomogenisierung (3 Minuten), unter Erhalt einer rohen Enzymlösung.

Rohe Enzymlösung	150 µl
4% NAD	50 µl
0,35 M NAM	50 µl
PMS-NBT Mischung	50 µl

Ein Stamm, der mit der folgenden Zusammensetzung blau gefärbt wurde, wurde ausgewählt:

AL=L<PMS (Phenazinmethosulfat,
Wako Pure Chemicals)	1 mg
AL=L<NBT (Nitroblau-Tetrazolium,
Wako Pure Chemicals)	10 mg
H₂O	10 ml

Die neue, gereinigte, rekombinante DNA kann aus dem somit erhaltenen Stamm beispielsweise durch das Verfahren von P. Guerry et al. (J. Bacteriology, 116, 1064-1066 (1973)), das Verfahren von D. B. Clewell (J. Bacteriology, 110, 667-676 (1972)) etc. gesammelt werden.

Unter Verwendung der oben genannten DNA, die das N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen enthält, wurde die gesamte Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1) des N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen alleine durch das Verfahren erzielt, das in Beispiel, Schritt (6) gezeigt ist. Dann wird die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) vom Polypeptid, das durch das Gen mit der Nucleotidsequenz translatiert ist, gebildet.

Das Gen, das die somit gebildete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) kodiert, ist das N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen der vorliegenden Erfindung.

Als nächstes wird N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase durch Züchten des somit erhaltenen Stammes hergestellt, der die rekombinante DNA enthält, die durch Einfügen der N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-genhaltigen DNA in Vektor DNA erhalten wurde, der in der Lage ist, N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase herzustellen und zur Art Escherichia gehört, um die Kultur zu erhalten, wie es unten beschrieben ist.

Der oben beschriebene Mikroorganismus kann durch konventionelle feste Inkubation gezüchtet werden, aber es ist bevorzugt, flüssige Inkubation anzuwenden, da ein schnelles Wachstum erreicht werden kann.

Als Medium für die Inkubation des Mikroorganismus kann irgendein Medium für die Inkubation von E. Coli verwendet werden. Im allgemeinen wird jedoch ein Medium verwendet, welches zumindest eine Stickstoffquelle von Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt und Maiseintauchflüssigkeit oder Sojabohnen- oder Weizenkleieextrakt enthält, das mit zumindest einem anorganischen Salz ergänzt wird, beispielsweise primäres Kaliumphosphat, sekundäres Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Ferrichlorid, Ferrisulfat, Mangansulfat, etc.; und das, falls erforderlich und gewünscht, auf geeignete Weise mit Glycidmaterialien, Vitaminen etc. ergänzt ist. Falls erforderlich, kann Isopropyl-beta-D-thio-galactosid (nachfolgend mit IPTG abgekürzt) ebenfalls zugegeben werden.

Es ist angemessen, den anfänglichen pH-Wert des Mediums auf einen Bereich von 7 bis 9 einzustellen. Es ist erwünscht, die Inkubation bei 30 bis 42°C, vorzugsweise bei etwa 37°C für eine Dauer von 4 bis 24 Stunden, vorzugsweise 6 bis 24 Stunden, durch eine Luftspinn-Tiefkultur, Schüttelkultur, stationäre Kultur etc. durchzuführen.

Nach Vollendung der Inkubation wird N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase gesammelt, isoliert und aus der Kultur gereinigt und zwar genau nach der gleichen Art und Weise, wie es in USSN 07/121,916 beschrieben ist. Im allgemeinen ergibt jedoch Säulenchromatographie auf DEAE-Cellulose, Säulenchromatographie unter Verwendung von Phenyl-Sepharose oder Gelfiltration durch Sephadox das Enzym in einer hohen Reinheit. Die Reinigung ist ebenfalls vorteilhaft, weil mehrere Schritte ausgelassen werden können, im Vergleich zu dem Fall, wo Bakterien verwendet werden, die zur Art Flavobacterium gehören.

Die somit erhaltene N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase weist physikochemische Eigenschaften auf, die der ähnlich sind, die in USSN 07/121,916 beschrieben ist, wobei die spezifische Wirksamkeit etwa 1,5mal höher ist.

Durch Züchten des Stammes, der die rekombinante DNA enthält, die darin das N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen der vorliegenden Erfindung eingefügt enthält, und zur Art Echerichia gehört, kann N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase wirksam erhalten werden, ohne daß ein Medium verwendet wird, das mit teurem N-Acetylmannosamin, N-Acetylglucosamin, etc. ergänzt ist, von denen bekannt ist, daß sie Induktoren von Dehydrogensase darstellen. Daher ist die vorliegende Erfindung vom industriellen Gesichtspunkt her äußerst nützlich.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele noch genauer beschrieben.

(1) Herstellung von chromosomaler DNA

Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm (FERM BP-1222) wurde auf einem Liter Medium (0,75% Glucose, 0,2% Bactohefeextrakt (hergestellt von Difco Co.), 0,9% Nährbrühe (hergestellt von Difco Co.) und 0,1% KH₂P0₄ (pH 8.0)) inokuliert, das bei einer Temperatur von 30°C für zwei Tage durch Schütteln kulturiert wurde, um die Kultur zu ergeben. Nachdem die Kultur 10 Minuten lang bei 8000 Umdrehungen/min. zentrifugiert war, wurden 90 µg chromosomaler DNA aus der Kultur durch das Verfahren extrahiert, das in Molecular Biology, Unit 2.4.3. (John Wiley & Sons, Inc., 1987) beschrieben ist.

(2) Herstellung von rekombinanter Bakteriophage lamdagtll-NAM 6 DNA

Nachdem 90 µg der gemäß Schritt (1) erhaltenen chromosomalen DNA und jeweils zwei Einheiten von Restriktionsenzymen Acc I, Alu I und Hae III (alle von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt) mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 10 mM MgCl₂ bzw. 1 mM Dithiothreitol (nachfolgend als L-Puffer abgekürzt) vermischt waren, wurde die. Mischung 30 Minuten lang bei einer Temperatur von 37°C zur Reaktion gebracht. Nach Vollendung der Reaktion wurde mit der Reaktionsmischung eine 0,7% (W/V)-Agarosegel-(hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.)- Elektrophorese durchgeführt. Ein DNA-Fragment mit einer Größe von 0,5 bis 2,5 kb wurde dann nach dem Verfahren von R. C. A. Yang et al. (Methods in Enzymology, 68, 176-182 (1979)) eluiert unter Erhalt des Eluats. Das Eluat wurde mit Phenol extrahiert und in einer üblichen Art und Weise mit Ethanol ausgefällt unter Erhalt von 15 µg eines chromosomalen DNA-Fragmentes von Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm, der mit Acc I, Alu I und Hae III verdaut war.

Das DNA-Fragment, 15 µg, das somit erhalten wurde, wurde mit Phagen Vektor lambdagtll Arm DNA nach dem "cDNA-Clonierungssystem" lambdagtll, hergestellt von Amersham Co., Ltd. ligasiert.

Dann wurde die DNA mit Hüllprotein von Bacteriophage durch das in vitro Packverfahren eingeschlossen, um Bacteriophagenteilchen herzustellen. Die Bacteriophagen teilchen, die somit erhalten wurden, wurden auf T-Y Agarmedium (1% Trypton (hergestellt von Difco Co.), 0,5% Hefeextrakt (hergestellt von Difco Co.), 0,5% NaCl und 1,2% Agar), das 25 µg/ml Ampicillin (Sigma Co.), 0,25 mM IPTG (Wako Pure Chemicals) und 0,005% X-gal (Sigma Co.) enthielt, inokuliert, wobei E. Coli Y-1090 (erworben von Amersham Co.) als Indikatorstamm verwendet wurde. Nach einer 16stündigen Inkubation bei einer Temperatur von 42°C wurden etwa 7,4 × 10⁵ Plaques erhalten, und die Plaques wurden als Bank verwendet. Im Hinblick auf die somit hergestellte Bank wurde eine Untersuchung mit anti-N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Serum entsprechend dem Verfahren durchgeführt, das in der Broschüre (Abschnitt 5, Seite 8) von Promega Biotec Co, beschrieben ist, um rekombinante bacteriophage lambdagtll-NAM 6 DNA zu ergeben, die einen Teil des N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gens enthält.

(3) Herstellung von rekombinanter Plasmid pNAM 106 DNA und Herstellung der Restriktionsenzym-Schnittstellenkarte von rekombinanter Plasmid pNAM 106 DNA

Nachdem 2 µg der DNA, die durch Reinigen der rekombinanten bacteriophagen lambdagtll-NAM 6 DNA erhalten wurde, die in Schritt (2) erhalten wurden, entsprechend dem Verfahren, das in Molecular Cloning, Seiten 371-372, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschrieben ist, und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoR I (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gemischt wurden, der 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol und 100 mM NaCl (nachfolgend mit H-Puffer abgekürzt) enthielt, wurde die Mischung 16 Stunden lang bei einer Temperatur von 37°C zur Reaktion gebracht.

Nach Vollendung der Reaktion wurde die Reaktionslösung durch 0,7% (W/V) Agarosegel(hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.)-Elektrophorese getrennt. Der Gelanteil, der 2,0 kbp des EcoR I-EcoR I-DNA-Fragmentes in der rekombinanten bacteriophagen lambdagtll-NAM 6 DNA enthielt wurde aus dem Gel herausgeschnitten und die DNA wurde durch das DIA-IATRON DNA PREP-Verfahren wiedergewonnen.

Dann wurden 0,5 µg Plasmid pUC19 DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoR I jeweils mit H-Puffer gemischt. Nach einer zweistündigen Reaktion bei einer Temperatur von 37°C wurde die Reaktionsmischung mit Phenol extrahiert und in einer konventionellen Art mit Ethanol ausgefällt, unter Erhalt von Plasmid pUC19 DNA, die mit EcoR I degeriert ist.

Eine Mischung aus 0,5 µg 2,0 kbp EcoR I-EcoR I-Fragment der rekombinanten bacteriophagen lambdagtll-NAM 6-DNA, die somit erhalten ist, 0,5 µg Plasmid pUC19 DNA, mit EcoR I digeriert, und einer Einheit T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) wurde zu Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 66 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothriitol und 10 mM ATP enthielt, hinzugegeben. Die Mischung wurde 16 Stunden lang bei einer Temperatur von 16°C zur Reaktion gebracht, um DNA zu ligasieren. Unter Verwendung der Reaktionslösung wurde E. Coli JM 109-Stamm (erworben von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit dieser Reaktionslösung transformiert, entsprechend dem Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326-331 (1979)). Die Transformanten wurden im Hinblick auf die chemische Resistenz (Ampicillin-Resistenz) und beta-Galactosidase-Wirksamkeit untersucht. Das rekombinante Plasmid, das in dem gewünschten Transformanten enthalten war, der somit erhalten wurde, wurde mit pNAM 106 bezeichnet.

E. Coli JM 109 (pNAM 106) wurde im Medium, das aus 1% (W/V) Trypton, 0,5% (W/V) Hefeextrakt und 0,5% (W/V) NaCl bestand, bei einer Temperatur von 37°C für 16 Stunden kulturiert. Die Kulturlösung, 20 ml, wurde auf einem Liter des Mediums inokuliert. Nach dreistündiger Schüttelkultur bei einer Temperatur von 37°C wurden 0,2 g Chloramphenicol zu der Kulturlösung hinzugegeben. Die Inkubation wurde für weitere 20 Stunden bei der gleichen Temperatur durchgeführt, unter Erhalt der Kulturlösung.

Dann wurde die Kulturlösung 10 Minuten lang bei 10.000 Umdrehungen/min. in einer üblichen Weise zentrifugiert, unter Erhalt eines nassen Kuchens. Nachdem der nasse Kuchen in 50 ml Tris-HCl (pH 8.0), das 20 ml 25% (W/V) Sucrose enthielt, wurden 10 mg Lysozym, 8 ml 0,25 M EDTA-Lösung (pH 8.0) und 8 ml 20% (W/V) Natriumdodecysulfat zu der Suspension jeweils zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 60°C gehalten, um eine Lysis zu bewirken. Das Lysat wurde somit erhalten.

Zu diesem Lysat wurden 13 ml 5 M NaCl-Lösung hinzugegeben.

Die Mischung wurde 16 Stunden lang bei 4°C behandelt und dann 30 Minuten bei 15.000 Umdrehungen pro Minuten in einer üblichen Weise zentrifugiert, um das Extrakt zu ergeben. Nach Extraktion mit Phenol und anschließender Ausfällung mit Ethanol in einer üblichen Weise wurden die Präzipitate erhalten.

Dann wurde mit den Präzipitaten eine übliche Trocknungbehandlung unter vermindertem Druck durchgeführt, wobei diese dann in 6 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 1 mM EDTA enthielt, gelöst. Nachdem 6 g Cäsiumchlorid und 0,2 ml Ethydiumbromid mit einer Konzentration von 10 mg/ml zu der Lösung hinzugegeben waren, wurde mit der Mischung eine Gleichgewichtsdichtegradientenzentrifugation bei 39.000 Umdrehungen/min. für eine Dauer von 42 Stunden durchgeführt, wobei eine Ultrazentrifugationsmaschine verwendet wurde, um rekombinante Plasmid pNAM 106 DNA zu isolieren. Ethydiumbromid wurde dann mit n-Butanol entfernt, und es wurde eine Dialyse gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer, der 1 mM EDTA enthielt, durchgeführt, unter Erhalt von 800 µg gereinigter rekombinanter Plasmid pNAM 106 DNA.

Mit der rekombinanten Plasmid pNAM 106 DNA wurde eine einfache Digestion und eine doppelte Digestion mit Restriktionsenzymen Aat II und EcoR I (beide hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt. Die Mobilität der resultierenden DNA-Fragmente wurde durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Die somit erhaltenen Mobilitätsmuster wurden den Standardmobilitätsmustern des DNA-Fragmentes gegenübergestellt, das durch Digestion von Bacteriophagen lambdaDNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit Hind III erhalten wurde, um eine Restriktionsenzymkarte herzustellen. Die Karte ist in Fig. 1 dargestellt.

(4) Herstellung von rekombinanter Plasmid pNAM 301 DNA

Entsprechend den Verfahren von Schritt (1) wurde chromosomale DNA von Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm extrahiert, und 60 µg dieser chromosomalen DNA und 50 Einheiten des Restriktionenzyms Sau3 AI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gemischt, der 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol und 50 mM NaCl (nachfolgend mit M-Puffer abgekürzt) enthielt, gefolgt von der Reaktion dieser Mischung bei einer Temperatur von 37°C für eine Dauer von 1 Stunde. Nach Vollendung der Reaktion wurde die Reaktionslösung mit Phenol extrahiert und in üblicher Weise mit Phenol ausgefällt und es wurde eine Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt. Durch Elution entsprechend dem Verfahren von R. C. A. Yang et al., das in Schritt (2) beschrieben ist, wurde das Eluat erhalten. Das Eluat wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol in einer üblichen Weise ausgefällt, unter Erhalt von 5 µg des chromosomalen DNA-Fragmentes von Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm, mit Sau3 AI verdaut.

Als nächstes wurden 1 µg des Digestionsproduktes von EMBL 3 Bacteriophage/Vektor-DNA mit BamH I (hergestellt von STRATAGENE Co., Ltd.), 1 µg des chromosomalen DNA-Fragmentes von Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm, degeriert mit Sau3 AI, wie es oben erhalten wurde, und 2 Einheiten T4 DNA-Ligase, hergestellt von Boehringer Mannheim Co. wurden zu 66 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) hinzugegeben, der 66 mM MgCl₂ 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP enthielt. Die Mischung wurde 16 Stunden lang bei einer Temperatur von 16°C zur Reaktion gebracht, um DNA zu legasieren.

Dann wurde die DNA-Mischung mit Hüllproteinen von Bacteriophage durch das in vitro Packverfahren (Methods in Enzymology, 68, 281-298 (1979)) eingehüllt, um Bacteriphagenpartikel herzustellen. Die somit erhaltenen Bacteriophagenpartikel wurden auf Trypton-Agarmedium (1% Trypton (hergestellt von Difco Co.), 0,25% NaCl und 1,2% Agar) unter Verwendung von E. Coli P2392 (erworben von STRATAGENE Co.) als ein Indikatorstamm inokuliert. Nach einer 16stündigen Inkubation bei einer Temperatur von 37°C wurden etwa 4000 Plaques erhalten, und die Plaques wurden als Bank verwendet.

Nachdem 2 µg der rekombinanten Plasmid pNAM 106 DNA, die gemäß Schritt (3) erhalten wurde, und Restriktionsenzym Aat II (hergestellt von Boehringer Mannheim Co., Ltd.) mit M-Puffer gemischt waren, wurde die Mischung zwei Stunden lang bei einer Temperatur von 37°C zur Reaktion gebracht. Nach Vollendung der Reaktion wurde die Reaktionslösung durch 0,7% (W/V) Agarosegel-Elektrophorese getrennt. Der Gelanteil, der 0,9 kbp von Aat II-Aat II-DNA-Fragment in der rekombinanten Plasmid pNAM 106 DNA enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA wurde durch das DIA-IATRON DNA PREP-Verfahren wiedergewonnen. Aus 0,1 µg des 0,9 kbp Aat II-Aat II-DNA Fragmentes, welches so erhalten wurde, wurde eine radioaktive Sonde durch (alpha-P³²) dCTP (gekauft von Amersham Japan, 3000 ci/nmol) durch ein Verlängerungsmarkierungssystem mit Hilfe eines Primers mit Zufallssystem (hergestellt von Du Pont Inc.) hergestellt.

Unter Verwendung dieser radioaktiven Sonde wurde eine Plaquehybridisierung mit der Bank durchgeführt, die mit dem oben genannten EMBL 3 Phagenvector hergestellt war, entsprechend dem Verfahren, das in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.) beschrieben ist. Als Ergebnis wurden vier positive Klone erhalten. Diese rekombinanten Phagen wurden unter Verwendung von E. Coli LE392 (erworben von STRATAGENE Co.) als ein Indikatorstamm vermehrt, und die DNA wurde durch das Verfahren extrahiert, das von T. Maniatis et al., Molecular Cloning beschrieben ist. Die BamH I Digestionsprodukte dieser Phagen DNAs wurden einer 0,7% Agarosegel-Elektrophorese unterworfen und auf eine Nitrozellulose übertragen. Dann wurde eine Southern Blot Hybridisierung durchgeführt, unter Verwendung der oben genannten radioaktiven Sonde, die aus dem 0,9 kpb Aat II-Aat II-DNA-Fragment hergestellt war, durchgeführt, entsprechend dem Verfahren, das in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.) beschrieben ist. Als Ergebnis wurde BamH I-BamH I-DNA-Fragment von 3,9 kb hybridisiert, wobei die Sonde in vier Stämmen gemeinsam vorhanden war. Daher wurde der Gelanteil, der dieses 3,9 kb BamH I-BamH-I-DNA-Fragment enthielt, aus dem Gel herausgeschnitten, und die DNA wurde durch das DIA-IATRON-DNA-PREP-Verfahren wiedergewonnen.

Anschließend wurden 0,5 µg der Plasmid pUC19 DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamH I jeweils mit H-Puffer gemischt. Nach einer zweistündigen Reaktion bei einer Temperatur von 37°C wurde die Reaktionsmischung mit Phenol extrahiert und mit Phenol in einer üblichen Weise ausgefällt, unter Erhalt von Plasmid pUC19 DNA, die mit BamH I verdaut war. Das 3.9 kb BamH I-BamH-I-DNA Fragment, 0,5 µg, das oben erhalten wurde, wurde mit 0,5 µg Plasmid pUC19 DNA, die mit BamH I entsprechend dem Verfahren, das in Schritt (3) beschrieben ist, digeriert ist, ligasiert, unter Erhalt von rekombinanter Plasmid pNAM 301 DNA. Weiterhin wurde E. Coli JM 109 (pNAM 301) durch die Verfahrensschritte, die in Schritt (3) beschrieben sind, inkubiert, und das Plasmid, welches in diesem Stamm enthalten war, wurde gereinigt, unter Erhalt von 800 µg gereinigter rekombinanter Plasmid pNAM 301 DNA.

Die rekombinante Plasmid pNAM 301 DNA wurde einer einfachen Digestion und einer doppelten Digestion mit Restriktionsenzymen Aat II, BamH I, Bgl II, Sal I und Sph I (alle von Takara Shuzo Co., Ltd, hergestellt) unterworfen. Mobilitätsmuster der resultierenden DNA Fragmente wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert. Die somit erhaltenen Mobilitätsmuster wurden Standardmobilitätsmustern von dem DNA-Fragment gegenübergestellt, welches durch Digestion von bacteriophagen lamdaDNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit Hind III erhalten wurde, um eine Restriktionsenzymkarte herzustellen. Diese Karte ist in Fig. 2 dargestellt.

(5) Herstellung von rekombinanter Plasmid pNAM 305 DNA

Nachdem 2 µg der rekombinanten Plasmid pNAM 301 DNA, die gemäß Schritt (4) erhalten wurde, und Restriktionsenzyme BamH I und Bgl II (beide von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt) mit H-Puffer gemischt waren, wurde die Mischung zwei Stunden lang bei einer Temperatur von 37°C zur Reaktion gebracht. Nach Vollendung der Reaktion wurde die Reaktionslösung durch 0,7% (W/V) Agarosegel-Electophorese getrennt. Der Gelbereich, der 2,4 kpb einer BamH I-Bgl II DNA-Fragment in der rekombinanten Plasmid pNAM 301 DNA enthielt, wurde aus dem Gel herausgeschnitten, und 2 µg der DNA wurden durch das DIA-IATRON DNA PREP-Verfahren wiedergewonnen.

Anschließend wurden 0,5 µg Plasmid pUC19 DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd) mit BamH I in einer dem Schritt (4) vergleichbaren Weise digeriert. Das Digestionsprodukt dieser Plasmid pUC19 DNA mit BamH I wurde mit dem 2,4 kg BamH I-Bgl II DNA-Fragment der oben genannten rekombinanten Plasmid pNAM 301 DNA entsprechend den Verfahren, die in Schritt (3) beschrieben sind, ligasiert, unter Erhalt von rekombinanter Plasmid p NAM 304 DNA. Weiterhin wurde E. Coli JM 109 (pNAM 304) durch das in Schritt (3) beschriebene Verfahren inkubiert, und das Plasmid, das in diesem Stamm enthalten war, wurde gereinigt, unter Erhalt von 800 µg gereinigter rekombinanter Plasmid pNAM 304 DNA.

Die rekombinante Plasmid pNAM 304 DNA, 15 µg, die, wie oben beschrieben, erhalten wurde, und die Restriktionsenzyme Pst II und Xba I (beide von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt) wurden mit H-Puffer vermischt. Nachdem die Mischung 2 Stunden lang bei einer Temperatur von 37°C zur Reaktion gebracht wurde, wurde die Reaktionsmischung mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, unter Erhalt von pNAM 304 DNA, die mit Pst II und Xba I degeriert war. Die somit erhaltene DNA wurde mit einem Kilo Sequenzierungskit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, wodurch DNA deletiert wurde unter Erhalt von rekominanter Plasmid pNAM 305 DNA, die die eingefügte Fraktion aufwies, die durch 0,4 kb von Xba I ausserhalb der eingefügten Fragmente der rekombinanten Plasmid pNAM 304 DNA deletiert war.

Unter Verwendung von rekombinanter Plasmid pNAM 305 DNA wurde Transformant E. Coli JM 109 (pNAM 305) transformiert, und zwar nach dem Verfahren don D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326-331 (1979)) (der Transformant wurde im Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of Japan under FERM BP-2692) hinterlegt. Es wurde für eine Dauer von 8 Stunden bei einer Temperatur von 37°C eine Schüttelkultur in 10 ml T-Y-Medium (1% (W/V) Trypton, 0,5% (W/V) Hefeextrakt und 0,5% (W/V) NaCl), das 1 mM IPTG enthält, durchgeführt. Die Zellen wurden dann gesammelt und mit Ultraschallwellen homogenisiert. Die resultierende rohe Enzymlösung zeigte eine N-Acetylmannosamine- Dehydrogenase-Wirksamkeit von 0,12 U/ml. Überraschenderweise war dieser Wert nahezu vergleichbar oder besser als der Wert von Flavobacterium sp. Nr. 141-8-Stamm, der eine komplizierte Inkubation über eine lange Zeitdauer entsprechend USSN 07/121,916 erforderte, was eine bestehende Anmeldung der Erfinder darstellt.

Zum Vergleich wurde die Wirksamkeit von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase, die in einer vergleichbaren Weise erhalten wurde, mit der Ausnahme, daß E. Coli JM 109 (erhalten von Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde, das das Plasmid pUC19 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) trug, bestimmt, jedoch wurde keine Wirksamkeit beobachtet.

(6) Analyse der Nucleotidsequenz von DNA, die das N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen enthält

Die Sequenzierung von rekombinantem Plasmid pNAM 305 wurde unter Verwendung eines Sequenzierungskits (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) durchgeführt. Ein Primer wurde hergestellt, wobei das System 1 Plus DNA Synthesizer (hergestellt von Beckmann Co.) verwendet wurde.

Die Gelelektrophorese für die Analyse der Nucleotidsequenz wurde durchgeführt, unter Verwendung von 8% (W/V) Polyacrylamidgel (hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.).

Die gesamte Nucleotidsequenz des N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gens allein und die Aminosäuresequenz des Polypeptids, welches von dem Gen translatiert ist, sind als SEQ ID Nr. 1 bzw SEQ ID Nr. 2 gezeigt.

Claims

1. N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen, welches sich von einem Mikroorganismus ableitet, der zu der Art Flavobacterium gehört, dadurch gekennzeichnet, daß es durch die folgende Restriktionsenzym-Schnittstellenkarte definiert ist:
worin S Sal I, A Aat II und Sp Sph I bedeuten, und die SEQ ID Nr. 2 von 271 Aminosäuren kodiert, wobei die SEQ ID Nr. 2 Bestandteil des Anspruchs ist.

2. Rekombinante DNA, die in einen Vektor eingefügt ist, umfassend das N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen, welches sich von einem Mikroorganismus ableitet, der zu der Art Flavobacterium gehört, dadurch gekennzeichnet, daß es durch die folgende Restriktionsenzym-Schnittstellenkarte definiert ist:
worin S Sal I, A Aat II und Sp Sph I bedeuten, und die SEQ ID Nr. 2 von 271 Aminosäuren kodiert, wobei die SEQ ID Nr. 2 Bestandteil des Anspruchs ist.

3. Verfahren zur Herstellung von N-Acetylmannosamin- Dehydrogenase, gekennzeichnet durch Anlegen einer Kultur eines Mikroorganismus, der zu der Art Escherichia gehört, in einem Medium, das rekombinante DNA enthält, die durch Einfügen von N- Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen, das sich von einem Mikroorganismus ableitet, der zu der Art Flavobacterium gehört, und das durch die folgende Restriktionsenzym- Schnittkartenstelle definiert ist:
worin S Sal I, A Aat II und Sp Sph I bedeuten, und die SEQ ID. Nr. 2 von 271 Aminosäuren kodiert, wobei die SEQ ID Nr. 2 Bestandteil des Anspruchs ist, in Vektor-DNA erhalten wurde und Sammeln von N-Acetylmannosamin- Dehydrogenase aus der Kultur.