JP2589287B2 - Ｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、及びｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素の製造法 - Google Patents
Ｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、及びｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素の製造法Info
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- JP2589287B2 JP2589287B2 JP1338267A JP33826789A JP2589287B2 JP 2589287 B2 JP2589287 B2 JP 2589287B2 JP 1338267 A JP1338267 A JP 1338267A JP 33826789 A JP33826789 A JP 33826789A JP 2589287 B2 JP2589287 B2 JP 2589287B2
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- acetylmannosamine
- acetylmannosamine dehydrogenase
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- dehydrogenase gene
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝
子、新規な組み換え体DNA、及びＮ−アセチルマンノサ
ミン脱水素酵素の製造法に関する。
子、新規な組み換え体DNA、及びＮ−アセチルマンノサ
ミン脱水素酵素の製造法に関する。
先に、本発明者等は、操作が簡単でしかも精度の高い
シアル酸の測定法について検討したところ、土壌から分
離したフラボバクテリウム属に属する１細菌が、Ｎ−ア
セチルマンノサミンに作用してＮ−アセチルマンノサミ
ンラクトンを生成すると共に、NADをNADHに還元する新
規な酵素を生産し、この酵素がシアル酸の測定に有効に
利用出来るということを知見し、Ｎ−アセチルマンノサ
ミン脱水素酵素及びその製造法の特許出願を行った（特
開昭63−141585号公報）。
シアル酸の測定法について検討したところ、土壌から分
離したフラボバクテリウム属に属する１細菌が、Ｎ−ア
セチルマンノサミンに作用してＮ−アセチルマンノサミ
ンラクトンを生成すると共に、NADをNADHに還元する新
規な酵素を生産し、この酵素がシアル酸の測定に有効に
利用出来るということを知見し、Ｎ−アセチルマンノサ
ミン脱水素酵素及びその製造法の特許出願を行った（特
開昭63−141585号公報）。
そして、フラボバクテリウム属細菌例えばフラボバク
テリウムsp.No.141−８株由来のＮ−アセチルマンノサ
ミン脱水素酵素遺伝子の構造については、全く未知であ
り、また、該遺伝子は単離すらされていないのが実情で
ある。
テリウムsp.No.141−８株由来のＮ−アセチルマンノサ
ミン脱水素酵素遺伝子の構造については、全く未知であ
り、また、該遺伝子は単離すらされていないのが実情で
ある。
ところが、このＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素
を用いるとＮ−アセチルマンノサミンの定量を精度よく
行うことができ、これに基づいてシアル酸の量を知るこ
とができる。その結果、種々の病態診断を効率よく行う
ことができる。
を用いるとＮ−アセチルマンノサミンの定量を精度よく
行うことができ、これに基づいてシアル酸の量を知るこ
とができる。その結果、種々の病態診断を効率よく行う
ことができる。
しかしながら、上記Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素
酵素の製造法では、培地中に高価なＮ−アセチルマンノ
サミンもしくはＮ−アセチルグルコサミン等を添加する
ことが必須要件であるため、上記方法は、経済的に不利
であり、また製造操作も煩雑になり、更に、上記酵素の
収率も著しく低下する等の欠点があった。
酵素の製造法では、培地中に高価なＮ−アセチルマンノ
サミンもしくはＮ−アセチルグルコサミン等を添加する
ことが必須要件であるため、上記方法は、経済的に不利
であり、また製造操作も煩雑になり、更に、上記酵素の
収率も著しく低下する等の欠点があった。
そこで、本発明者等は、フラボバクテリウム属細菌例
えばフラボバクテリウムsp.No.141−８株由来のＮ−ア
セチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子について種々検討
した結果、該遺伝子を初めて単離し、その構造を決定す
ることに成功した。
えばフラボバクテリウムsp.No.141−８株由来のＮ−ア
セチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子について種々検討
した結果、該遺伝子を初めて単離し、その構造を決定す
ることに成功した。
更に本発明者等は、上記遺伝子を用い該酵素を効率よ
く生産すべく種々検討した結果、フラボバクテリウム属
細菌例えばフラボバクテリウムsp.No.141−８株由来の
該酵素遺伝子をベクターDNA例えばプラスミドベクターD
NAに挿入した組み換え体DNAを含み、該酵素生産能を有
する大腸菌を培地に培養すれば、培地中に前述の高価な
添加物を全く添加することなく、該大腸菌菌体内に効率
よく該酵素が生産されること等の知見を得、本発明を完
成した。
く生産すべく種々検討した結果、フラボバクテリウム属
細菌例えばフラボバクテリウムsp.No.141−８株由来の
該酵素遺伝子をベクターDNA例えばプラスミドベクターD
NAに挿入した組み換え体DNAを含み、該酵素生産能を有
する大腸菌を培地に培養すれば、培地中に前述の高価な
添加物を全く添加することなく、該大腸菌菌体内に効率
よく該酵素が生産されること等の知見を得、本発明を完
成した。
すなわち、本発明は、下記に示されるアミノ酸配列を
コードするＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子
である。
コードするＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子
である。
さらに、本発明は、下記に示されるアミノ酸配列をコ
ードするＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を
ベクターDNAに挿入したことを特徴とする新規な組み換
え体DNAである。
ードするＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を
ベクターDNAに挿入したことを特徴とする新規な組み換
え体DNAである。
さらに、本発明は、下記に示されるアミノ酸配列をコ
ードするＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を
ベクターDNAに挿入した新規な組み換え体DNAを含み、Ｎ
−アセチルマンノサミン脱水素酵素生産能を有するエッ
シェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物よ
りＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素を採取すること
を特徴とするＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素の製
造法である。
ードするＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を
ベクターDNAに挿入した新規な組み換え体DNAを含み、Ｎ
−アセチルマンノサミン脱水素酵素生産能を有するエッ
シェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物よ
りＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素を採取すること
を特徴とするＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素の製
造法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、本発明に用いられるＮ−アセチルマンノサミン
脱水素酵素遺伝子のドナーとして用いられるフラボバク
テリウム属菌としては、例えば、フラボバクテリウムs
p.No.141−８株（FERM BP−1222）等が挙げられる。
脱水素酵素遺伝子のドナーとして用いられるフラボバク
テリウム属菌としては、例えば、フラボバクテリウムs
p.No.141−８株（FERM BP−1222）等が挙げられる。
次いで、上記微生物を、特開昭63−141585号公報記載
の方法と全く同様にして培養し、培養物を得、該培養物
から常法、例えば、濾過、遠心分離処理等により例えば
フラボバクテリウムsp.No.141−８株の菌体を得る。
の方法と全く同様にして培養し、培養物を得、該培養物
から常法、例えば、濾過、遠心分離処理等により例えば
フラボバクテリウムsp.No.141−８株の菌体を得る。
この菌体より、例えばカレント・プロトコールズ・イ
ン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols
in Molecular Biology）unit2.4.3.（John Willey ＆ S
ons.Inc.1987）記載の方法等の方法により染色体DNAを
得ることができる。
ン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols
in Molecular Biology）unit2.4.3.（John Willey ＆ S
ons.Inc.1987）記載の方法等の方法により染色体DNAを
得ることができる。
次いで、このようにして得られた染色体DNAを、例え
ば、アマシャム社製のｃ−DNAクローニングシステムを
用い、ファージベクターλgt11に組み込み、種々の組み
換え体ファージを得、該ファージを大腸菌（E.coli）Ｙ
−1090に感染させ、種々の融合蛋白質を生産するプラー
クを得る。
ば、アマシャム社製のｃ−DNAクローニングシステムを
用い、ファージベクターλgt11に組み込み、種々の組み
換え体ファージを得、該ファージを大腸菌（E.coli）Ｙ
−1090に感染させ、種々の融合蛋白質を生産するプラー
クを得る。
Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素との融合蛋白質
を生産しているプラーク（すなわち、Ｎ−アセチルマン
ノサミン脱水素酵素遺伝子断片を含む組み換え体ファー
ジ）を検出するには、例えば、プロメガ・バイオテク社
（Promega Biotec）カタログ記載（sec5p.8）の方法に
より検出することができる。
を生産しているプラーク（すなわち、Ｎ−アセチルマン
ノサミン脱水素酵素遺伝子断片を含む組み換え体ファー
ジ）を検出するには、例えば、プロメガ・バイオテク社
（Promega Biotec）カタログ記載（sec5p.8）の方法に
より検出することができる。
このようにして得られた組み換え体ファージよりファ
ージDNAを精製するには、〔モレキュラー・クローニン
グ（Molecular Cloning）、第371〜372頁、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Ha
rbor Loboratory）（1982年）〕の方法により行うこと
ができる。
ージDNAを精製するには、〔モレキュラー・クローニン
グ（Molecular Cloning）、第371〜372頁、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Ha
rbor Loboratory）（1982年）〕の方法により行うこと
ができる。
次いで、不完全なＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵
素遺伝子DNAを、例えば〔α−P32〕dCTP（アマシャム
ジャパンより購入）とランダム・プライマー・エクステ
ンション・ラベリング・システム（Ramdom Primer Exte
ntion Labeling System）〔デュポン（Du Pont社製〕等
の方法により標識したのち、該DNAをプローブとして、
プラーク・ハイブリダイゼーション法〔Current Protoc
ols in Molecular Biology〕によりファージベクターEM
BL3〔ストラタジーン（STRATAGENE社製）〕をベクター
として作成した染色体DNAライブラリーより完全なＮ−
アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片
を得ることができる。
素遺伝子DNAを、例えば〔α−P32〕dCTP（アマシャム
ジャパンより購入）とランダム・プライマー・エクステ
ンション・ラベリング・システム（Ramdom Primer Exte
ntion Labeling System）〔デュポン（Du Pont社製〕等
の方法により標識したのち、該DNAをプローブとして、
プラーク・ハイブリダイゼーション法〔Current Protoc
ols in Molecular Biology〕によりファージベクターEM
BL3〔ストラタジーン（STRATAGENE社製）〕をベクター
として作成した染色体DNAライブラリーより完全なＮ−
アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片
を得ることができる。
このようにして得たDNA断片を、例えば通常のアガロ
ースゲル電気泳動法によりDNA断片を得、更に例えばフ
ェノール抽出等の精製手段により精製し、また更に例え
ばエタノール沈澱法等の濃縮手段により濃縮し、純化さ
れたＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を含有
するDNA断片を得ることができる。
ースゲル電気泳動法によりDNA断片を得、更に例えばフ
ェノール抽出等の精製手段により精製し、また更に例え
ばエタノール沈澱法等の濃縮手段により濃縮し、純化さ
れたＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を含有
するDNA断片を得ることができる。
一方、本発明の組み換え体DNAにおいて用いることの
できるベクターDNAとしては、如何なるものでもよく、
例えばプラスミドベクターDNA、バクテリオファージベ
クターDNA等が挙げられるが、具体的には例えばプラス
ミドpUC19 DNA（宝酒造社製）等が好ましい。
できるベクターDNAとしては、如何なるものでもよく、
例えばプラスミドベクターDNA、バクテリオファージベ
クターDNA等が挙げられるが、具体的には例えばプラス
ミドpUC19 DNA（宝酒造社製）等が好ましい。
上記ベクターDNAに、突出末端を生じさせる制限酵
素、例えばBamH I（宝酒造社製）を、温度30℃以上、好
ましくは37℃、酵素濃度10〜1000ユニット/mlで１時間
以上、好ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断さ
れたベクターDNAを得る。
素、例えばBamH I（宝酒造社製）を、温度30℃以上、好
ましくは37℃、酵素濃度10〜1000ユニット/mlで１時間
以上、好ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断さ
れたベクターDNAを得る。
次いで、上記のようにして得たフラボバクテリウム属
菌例えばフラボバクテリウムsp.No.141−８株由来で、
Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を含有する
DNA断片と、切断されたベクターDNAを混合し、これに例
えば大腸菌DNAリガーゼ（ニュー・イングランド・ハイ
オ・ラブス社製）、T4DNAリガーゼ（ベーリンガ・マン
ハイム社製）など、好ましくはT4DNAリガーゼを、温度
４〜37℃、好ましくは４〜16℃、酵素濃度１〜100ユニ
ット/mlで１時間以上、好ましくは６〜24時間作用させ
て組み換え体DNAを得る。更にこのようにして得た組み
換え体DNAに突出末端を生じさせる制限酵素、例えばPst
I及びXba I（いずれも宝酒造社製）を温度30℃以上、
好ましくは37℃、酵素濃度10〜100ユニット/mlで１時間
以上、好ましくは１〜３時間作用させて消化したのち、
キロ・シークエンシング用デレーションキット（宝酒造
社製）等を用いてDNA欠失させ、完全なＮ−アセチルマ
ンノサミン脱水素酵素遺伝子を含む領域を更に限定した
組み換え体DNAを得る。
菌例えばフラボバクテリウムsp.No.141−８株由来で、
Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を含有する
DNA断片と、切断されたベクターDNAを混合し、これに例
えば大腸菌DNAリガーゼ（ニュー・イングランド・ハイ
オ・ラブス社製）、T4DNAリガーゼ（ベーリンガ・マン
ハイム社製）など、好ましくはT4DNAリガーゼを、温度
４〜37℃、好ましくは４〜16℃、酵素濃度１〜100ユニ
ット/mlで１時間以上、好ましくは６〜24時間作用させ
て組み換え体DNAを得る。更にこのようにして得た組み
換え体DNAに突出末端を生じさせる制限酵素、例えばPst
I及びXba I（いずれも宝酒造社製）を温度30℃以上、
好ましくは37℃、酵素濃度10〜100ユニット/mlで１時間
以上、好ましくは１〜３時間作用させて消化したのち、
キロ・シークエンシング用デレーションキット（宝酒造
社製）等を用いてDNA欠失させ、完全なＮ−アセチルマ
ンノサミン脱水素酵素遺伝子を含む領域を更に限定した
組み換え体DNAを得る。
この組み換え体DNAを用いて例えば大腸菌Ｋ−12、好
ましくは大腸菌JM109（宝酒造（株）より入手）、大腸
菌HB 101（ATCC 33694）、大腸菌DHI（ATCC 33849）、
大腸菌ｘ−1776（ATCC 31244）などを形質転換あるいは
形質導入して夫々の菌株を得る。この形質転換はディー
・エム・モーリソン（D.M.Morrison）の方法〔メソヅ・
イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第6
8巻、第326〜331頁（1979年）〕により行うことができ
る。また形質導入はビー・ホーン（B.Hohn）の方法〔メ
ソヅ・イン・エンザイモロジー第68巻、第299〜309頁
（1979年）〕によって行うことができる。
ましくは大腸菌JM109（宝酒造（株）より入手）、大腸
菌HB 101（ATCC 33694）、大腸菌DHI（ATCC 33849）、
大腸菌ｘ−1776（ATCC 31244）などを形質転換あるいは
形質導入して夫々の菌株を得る。この形質転換はディー
・エム・モーリソン（D.M.Morrison）の方法〔メソヅ・
イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第6
8巻、第326〜331頁（1979年）〕により行うことができ
る。また形質導入はビー・ホーン（B.Hohn）の方法〔メ
ソヅ・イン・エンザイモロジー第68巻、第299〜309頁
（1979年）〕によって行うことができる。
そして、上記菌株よりＮ−アセチルマンノサミン脱水
素酵素生産能を有する菌株をスクリーニングすることに
より、Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を含
有するDNAをベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含
み、Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素生産能を有す
るエッシェリシア属に属する菌株を得ることができる。
素酵素生産能を有する菌株をスクリーニングすることに
より、Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を含
有するDNAをベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含
み、Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素生産能を有す
るエッシェリシア属に属する菌株を得ることができる。
このようにして得られた菌株より純化された新規な組
み換え体DNAを得るには、例えばピー・グーリー（P.Gue
rry）等の方法〔ジェイ・バクテリオロジー（J.Bacteri
ology）第116巻、第1064〜1066頁（1973年）〕、デー・
ビー・クレウェル（D.B.Clewell）の方法〔ジェー・バ
クテリオロジー第110巻、第667〜676頁（1972年）〕な
どにより得ることができる。
み換え体DNAを得るには、例えばピー・グーリー（P.Gue
rry）等の方法〔ジェイ・バクテリオロジー（J.Bacteri
ology）第116巻、第1064〜1066頁（1973年）〕、デー・
ビー・クレウェル（D.B.Clewell）の方法〔ジェー・バ
クテリオロジー第110巻、第667〜676頁（1972年）〕な
どにより得ることができる。
上記Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を含
有するDNAを用いて、実施例の項目（６）に示すような
方法によって、Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺
伝子のみの全塩基配列の解析を行い（第３図参照）、次
いで前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポ
リペプタイドのアミノ酸配列を確定する（第４図参
照）。
有するDNAを用いて、実施例の項目（６）に示すような
方法によって、Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺
伝子のみの全塩基配列の解析を行い（第３図参照）、次
いで前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポ
リペプタイドのアミノ酸配列を確定する（第４図参
照）。
このようにして確定されたアミノ酸配列をコードする
遺伝子が本発明のＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素
遺伝子である。
遺伝子が本発明のＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素
遺伝子である。
次に、上記のようにして得られたＮ−アセチルマンノ
サミン脱水素酵素遺伝子を含有するDNAをベクターDNAに
挿入した組み換え体DNAを含み、Ｎ−アセチルマンノサ
ミン脱水素酵素生産能を有するエッシェリシア属に属す
る菌株を用いてＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素を
生産するには、下記のように培養し、培養物を得る。
サミン脱水素酵素遺伝子を含有するDNAをベクターDNAに
挿入した組み換え体DNAを含み、Ｎ−アセチルマンノサ
ミン脱水素酵素生産能を有するエッシェリシア属に属す
る菌株を用いてＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素を
生産するには、下記のように培養し、培養物を得る。
上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養
してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養する
のが好ましい。
してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養する
のが好ましい。
また、上記微生物を培養する培地としては、例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスィープリカー
あるいは大豆もしくは小麦麺の浸出液等の１種以上の窒
素源に、例えばリン酸第１カリウム、リン酸第２カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシ
ウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等
の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原
料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスィープリカー
あるいは大豆もしくは小麦麺の浸出液等の１種以上の窒
素源に、例えばリン酸第１カリウム、リン酸第２カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシ
ウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等
の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原
料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発pHは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で４〜
24時間、好ましくは６〜24時間、通気撹拌深部培養、振
盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
ある。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で４〜
24時間、好ましくは６〜24時間、通気撹拌深部培養、振
盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
培養終了後、該培養物よりＮ−アセチルマンノサミン
脱水素酵素を採取し、分離精製するには、特開昭63−14
1583号公報記載の方法と全く同様の方法で行うことがで
きる。
脱水素酵素を採取し、分離精製するには、特開昭63−14
1583号公報記載の方法と全く同様の方法で行うことがで
きる。
以上の如くして得られたＮ−アセチルマンノサミン脱
水素酵素の理化学的性質は、特開昭63−141583号公報記
載のものと同様である。
水素酵素の理化学的性質は、特開昭63−141583号公報記
載のものと同様である。
上述したことから明らかな如く、本発明Ｎ−アセチル
マンノサミン脱水素酵素遺伝子の組み込まれた組み換え
体DNAを含むエッシェリシア属に属する菌株を培地に培
養すると、高価なＮ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセ
チルグルコサミン等を添加使用することなく、Ｎ−アセ
チルマンノサミン脱水素酵素を効率よく得ることができ
るので、本発明は、産業上極めて有用である。
マンノサミン脱水素酵素遺伝子の組み込まれた組み換え
体DNAを含むエッシェリシア属に属する菌株を培地に培
養すると、高価なＮ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセ
チルグルコサミン等を添加使用することなく、Ｎ−アセ
チルマンノサミン脱水素酵素を効率よく得ることができ
るので、本発明は、産業上極めて有用である。
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明す
る。
る。
（１）染色体DNAの調製 フラボバクテリウムsp.No.141−８株（FERM BP−122
2）を、培地〔0.75％ グルコース、0.2％バクト・イー
スト・エキストラクト（ディフコ社製）、0.9％ Nutri
ent Broth（ディフコ社製）及び0.1％ KH2PO4（pH8.
0）〕１に接種し、温度30℃,2日間振盪培養して、培
養物を得た。この培養物を8,000rpmで10分間遠心分離処
理した後、該菌体からカレント・プロトコールズ・イン
・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in
Molecular Biology）unit2.4.3（John Willey ＆ Son
s.Inc.1987）記載の方法により、染色体DNA90μｇを抽
出した。
2）を、培地〔0.75％ グルコース、0.2％バクト・イー
スト・エキストラクト（ディフコ社製）、0.9％ Nutri
ent Broth（ディフコ社製）及び0.1％ KH2PO4（pH8.
0）〕１に接種し、温度30℃,2日間振盪培養して、培
養物を得た。この培養物を8,000rpmで10分間遠心分離処
理した後、該菌体からカレント・プロトコールズ・イン
・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in
Molecular Biology）unit2.4.3（John Willey ＆ Son
s.Inc.1987）記載の方法により、染色体DNA90μｇを抽
出した。
（２）組み換え体バクテリオファージλgt11−NAM6DNA
の作製 項目（１）で得た染色体DNA90μｇ並びに制限酵素Acc
I、Alu I及びHae III（いずれも宝酒造社製）夫々２ユ
ニットを、10mM MgCl2、1mM ジチオスレイトールを含有
するトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、（以下、Ｌ−バッフ
ァーと略称する。）に夫々混合し、温度37℃で30分間反
応させた。反応終了液を常法により、0.7％（W/V）アガ
ロースゲル（宝酒造）電気泳動処理したものより、0.5
〜2.5kbの大きさのDNA断片をR.C.A.Yangらの方法〔メソ
ズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y）第68巻、第176〜182頁（1979年）〕により溶出し
て、溶出物を得、常法によりフェノール抽出及びエタノ
ール沈澱処理して、Acc I、Alu I及びHae IIIで消化さ
れたフラボバクテリウムsp.No.141−８株の染色体DNA断
片15μｇを得た。
の作製 項目（１）で得た染色体DNA90μｇ並びに制限酵素Acc
I、Alu I及びHae III（いずれも宝酒造社製）夫々２ユ
ニットを、10mM MgCl2、1mM ジチオスレイトールを含有
するトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、（以下、Ｌ−バッフ
ァーと略称する。）に夫々混合し、温度37℃で30分間反
応させた。反応終了液を常法により、0.7％（W/V）アガ
ロースゲル（宝酒造）電気泳動処理したものより、0.5
〜2.5kbの大きさのDNA断片をR.C.A.Yangらの方法〔メソ
ズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y）第68巻、第176〜182頁（1979年）〕により溶出し
て、溶出物を得、常法によりフェノール抽出及びエタノ
ール沈澱処理して、Acc I、Alu I及びHae IIIで消化さ
れたフラボバクテリウムsp.No.141−８株の染色体DNA断
片15μｇを得た。
このようにして得たDNA断片15μｇをファージベクタ
ーλgt11arm DNAとアマシャム社“cDNAクローニング・
システム（Cloning System）−λgt11の方法に従い連結
した。
ーλgt11arm DNAとアマシャム社“cDNAクローニング・
システム（Cloning System）−λgt11の方法に従い連結
した。
次いで、該DNAをイン・ビトロ・パッケージング法に
より、バクテリオファージの被膜蛋白質で包み、バクテ
リオファージ粒子を作製した。このようにして得たバク
テリオファージ粒子を大腸菌Ｙ−1090（アマシャム社よ
り入手）を指示菌として25μg/mlアンピシリン（シグマ
社）、0.25mM IPTG（和光純薬）、0.005％ X−gal（シ
グマ社）を含むＴ−Ｙ寒天培地上に撒き、温度42℃で16
時間培養したのち、約7.4×105個のプラークを得、これ
をライブラリーとして使用した。このようにして作製し
たライブラリーについてプロメガ・バイオテク社（Prom
ega Bictec）カタログ記載（sec5 p.8）の方法に従い、
抗Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素血清による検索
を行い、Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子の
一部を有する組み換え体バクテリオファージλgt11−NA
M6DNAを得た。
より、バクテリオファージの被膜蛋白質で包み、バクテ
リオファージ粒子を作製した。このようにして得たバク
テリオファージ粒子を大腸菌Ｙ−1090（アマシャム社よ
り入手）を指示菌として25μg/mlアンピシリン（シグマ
社）、0.25mM IPTG（和光純薬）、0.005％ X−gal（シ
グマ社）を含むＴ−Ｙ寒天培地上に撒き、温度42℃で16
時間培養したのち、約7.4×105個のプラークを得、これ
をライブラリーとして使用した。このようにして作製し
たライブラリーについてプロメガ・バイオテク社（Prom
ega Bictec）カタログ記載（sec5 p.8）の方法に従い、
抗Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素血清による検索
を行い、Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子の
一部を有する組み換え体バクテリオファージλgt11−NA
M6DNAを得た。
（３）組み換え体プラスミドpNAM106DNAの作製及び組み
換え体プラスミドpNAM106DNA制限酵素地図の作製 項目（２）で得た組み換え体バクテリオファージλgt
11−NAM6DNAをモレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）、第371〜372頁、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）（1982）記載の方法に従い精製して得たDNA2μｇ及
び制限酵素EcoR I（宝酒造社製）10ユニットを10mM MgC
l2、1mM ジチオスレイトール及び100mM NaClを含有す
るトリス塩酸緩衝液（pH7.5）（以下、Ｈ−バッファー
と略称する）に夫々混合し、温度37℃で16時間反応させ
た。
換え体プラスミドpNAM106DNA制限酵素地図の作製 項目（２）で得た組み換え体バクテリオファージλgt
11−NAM6DNAをモレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）、第371〜372頁、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）（1982）記載の方法に従い精製して得たDNA2μｇ及
び制限酵素EcoR I（宝酒造社製）10ユニットを10mM MgC
l2、1mM ジチオスレイトール及び100mM NaClを含有す
るトリス塩酸緩衝液（pH7.5）（以下、Ｈ−バッファー
と略称する）に夫々混合し、温度37℃で16時間反応させ
た。
反応終了液を常法により0.7％（W/V）アガロースゲル
（宝酒造社製）電気泳動で分離したのち、組み換え体バ
クテリオファージλgt11−NAM6DNA中の2.0kbpEcoR I−E
coR I DNA断片を含むゲル部分をゲルより切り出して、
「ダイア・ヤトロン DNAプレッブ」（DIA−IATRON DNA
PREPC）の方法によりDNAを回収した。
（宝酒造社製）電気泳動で分離したのち、組み換え体バ
クテリオファージλgt11−NAM6DNA中の2.0kbpEcoR I−E
coR I DNA断片を含むゲル部分をゲルより切り出して、
「ダイア・ヤトロン DNAプレッブ」（DIA−IATRON DNA
PREPC）の方法によりDNAを回収した。
次いで、プラスミドpUC19DNA（宝酒造社製）0.5μｇ
及び制限酵素EcoR I（宝酒造社製）10ユニットを、Ｈ−
バッファーに夫々混合し、温度37℃で２時間反応させた
のち、常法に従いフェノール抽出及びエタノール沈澱処
理してEcoR Iで消化されたプラスミドpUC19DNAを得た。
及び制限酵素EcoR I（宝酒造社製）10ユニットを、Ｈ−
バッファーに夫々混合し、温度37℃で２時間反応させた
のち、常法に従いフェノール抽出及びエタノール沈澱処
理してEcoR Iで消化されたプラスミドpUC19DNAを得た。
上記のようにして得た組み換え体バクテリオファージ
λgt11−NAM6DNAの2.0kbpのEcoR I−EcoR I断片0.5μ
ｇ、EcoR Iで消化したプラスミドpUC19DNA0.5μｇ及び
１ユニットのT4DNAリガーゼ〔ベーリンガー マンハイ
ム（Boeringer Manheim）社製〕を66mM MgCl2,10mM ジ
チオスレイトール及び10mM ATPを含有する66mMトリス塩
酸緩衝液（pH7.5）に添加し、温度16℃で16時間反応
し、DNAを連結させた。この反応液を用い、ディー・エ
ム・モーリソン（D.M.Morrison）の方法〔メソズ・イン
・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第68
巻、第326〜331頁〕（1979年）〕記載の形質転換法によ
り大腸菌JM109株（宝酒造（株）より入手）を形質転換
し、薬剤耐性（アンピシリン耐性）及びβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を検討し、形質転換株を得、その株の含有す
る組み換え体プラスミドDNAをpNAM106と命名した。
λgt11−NAM6DNAの2.0kbpのEcoR I−EcoR I断片0.5μ
ｇ、EcoR Iで消化したプラスミドpUC19DNA0.5μｇ及び
１ユニットのT4DNAリガーゼ〔ベーリンガー マンハイ
ム（Boeringer Manheim）社製〕を66mM MgCl2,10mM ジ
チオスレイトール及び10mM ATPを含有する66mMトリス塩
酸緩衝液（pH7.5）に添加し、温度16℃で16時間反応
し、DNAを連結させた。この反応液を用い、ディー・エ
ム・モーリソン（D.M.Morrison）の方法〔メソズ・イン
・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第68
巻、第326〜331頁〕（1979年）〕記載の形質転換法によ
り大腸菌JM109株（宝酒造（株）より入手）を形質転換
し、薬剤耐性（アンピシリン耐性）及びβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を検討し、形質転換株を得、その株の含有す
る組み換え体プラスミドDNAをpNAM106と命名した。
トリプトン１％（W/V）、酵母エキス0.5％（W/V）及
びNaCl0.5％（W/V）からなる培地１に、該培地を用
い、温度37℃で16時間培養して得た大腸菌JM109（pNAM1
06）の培養液20mlを接種し、温度37℃で３時間振盪培養
したのち、培養液にクロラムフェニコール0.2gを添加
し、更に同一温度で20時間培養し、培養液を得た。
びNaCl0.5％（W/V）からなる培地１に、該培地を用
い、温度37℃で16時間培養して得た大腸菌JM109（pNAM1
06）の培養液20mlを接種し、温度37℃で３時間振盪培養
したのち、培養液にクロラムフェニコール0.2gを添加
し、更に同一温度で20時間培養し、培養液を得た。
次いで、この培養液を、常法により10,000rpmで10分
間遠心分離して湿潤菌体を得、これを20mlの25％（W/
V）ショ糖を含有する50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0）
に懸濁したのち、更にこれにリゾチーム10mg、0.25M ED
TA溶液（pH8.0）8ml及び20％（W/V）ドデシル硫酸ナト
リウム溶液8mlを夫々添加し、温度60℃で30分間保温し
て溶菌し、溶菌液を得た。
間遠心分離して湿潤菌体を得、これを20mlの25％（W/
V）ショ糖を含有する50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0）
に懸濁したのち、更にこれにリゾチーム10mg、0.25M ED
TA溶液（pH8.0）8ml及び20％（W/V）ドデシル硫酸ナト
リウム溶液8mlを夫々添加し、温度60℃で30分間保温し
て溶菌し、溶菌液を得た。
この溶菌液に、5M NaCl溶液13mlを添加し、温度４℃
で16時間処理したものを常法により15,000rpmで30分間
遠心分離して抽出液を得、常法によりフェノール抽出処
理したのちエタノール沈澱処理し、沈澱物を得た。
で16時間処理したものを常法により15,000rpmで30分間
遠心分離して抽出液を得、常法によりフェノール抽出処
理したのちエタノール沈澱処理し、沈澱物を得た。
次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したもの
を、1mM EDTAを含有する10mM トリス塩酸緩衝液6ml（p
H7.5）に溶解し、更にこれに塩化セシウム6g及び10mg/m
lエチジウムブロマイド0.2mlを添加したものを常法によ
り39,000rpmで42時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾
配遠心処理を行い、組み換え体プラスミドpNAM106DNAを
単離し、また更にノルマルブタノールを使用してエチジ
ウムブロマイドを除去したのち、1mM EDTAを含有する1
0mM トリス塩酸緩衝液（pH7.5）に対して透析を行い、
純化された組み換え体プラスミドpNAM106DNA800μｇを
得た。
を、1mM EDTAを含有する10mM トリス塩酸緩衝液6ml（p
H7.5）に溶解し、更にこれに塩化セシウム6g及び10mg/m
lエチジウムブロマイド0.2mlを添加したものを常法によ
り39,000rpmで42時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾
配遠心処理を行い、組み換え体プラスミドpNAM106DNAを
単離し、また更にノルマルブタノールを使用してエチジ
ウムブロマイドを除去したのち、1mM EDTAを含有する1
0mM トリス塩酸緩衝液（pH7.5）に対して透析を行い、
純化された組み換え体プラスミドpNAM106DNA800μｇを
得た。
該組み換え体プラスミドpNAM106DNAを制限酵素AatII
及びEcoR I（いずれも宝酒造社製）を用い、単一消化及
び二重消化して得られたDNA断片を、アガロースゲル電
気泳動法により移動度パターンを分析し、得られた移動
度パターンとバクテリオファージλDNA（宝酒造社製）
をHind IIIにより消化して得られたDNA断片の標準移動
度パターンとを対比することにより制限酵素開裂地図を
作製し、第１図に示した。
及びEcoR I（いずれも宝酒造社製）を用い、単一消化及
び二重消化して得られたDNA断片を、アガロースゲル電
気泳動法により移動度パターンを分析し、得られた移動
度パターンとバクテリオファージλDNA（宝酒造社製）
をHind IIIにより消化して得られたDNA断片の標準移動
度パターンとを対比することにより制限酵素開裂地図を
作製し、第１図に示した。
（４）組換え体プラスミドpNAM301DNAの作製 項目（１）の方法に従い、フラボバクテリウムsp.No.
141−８株の染色体DNAを抽出し、この染色体DNA60μｇ
及び制限酵素Sau3A I（宝酒造社製）50ユニットを10mM
MgCl2、1mM ジチオスレイトール及び50mM NaClを含有
するトリス塩酸緩衝液（pH7.5）（以下、Ｍ−バッファ
ーと略称する。）に夫々混合し、温度37℃で１時間反応
させた。反応終了液を常法によりフェノール抽出処理
し、エタノール沈澱処理したのち、アガロースゲル電気
泳動を行い９〜20kpbの大きさのDNA断片を項目（２）記
載のアール・シー・エー・ヤング（R.C.A.Yang）らの方
法により溶出して溶出物を得、これから常法によりフェ
ノール抽出及びエタノール沈澱してSau3A Iで消化され
たフラボバクテリウムsp.No.141−８株の染色体DNA断片
５μｇを得た。
141−８株の染色体DNAを抽出し、この染色体DNA60μｇ
及び制限酵素Sau3A I（宝酒造社製）50ユニットを10mM
MgCl2、1mM ジチオスレイトール及び50mM NaClを含有
するトリス塩酸緩衝液（pH7.5）（以下、Ｍ−バッファ
ーと略称する。）に夫々混合し、温度37℃で１時間反応
させた。反応終了液を常法によりフェノール抽出処理
し、エタノール沈澱処理したのち、アガロースゲル電気
泳動を行い９〜20kpbの大きさのDNA断片を項目（２）記
載のアール・シー・エー・ヤング（R.C.A.Yang）らの方
法により溶出して溶出物を得、これから常法によりフェ
ノール抽出及びエタノール沈澱してSau3A Iで消化され
たフラボバクテリウムsp.No.141−８株の染色体DNA断片
５μｇを得た。
次いで、EMBL3 バクテリオファージ・ベクターDNAの
BamH I消化物〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕１
μｇと上記により得られたSau3A Iで消化されたフラボ
バクテリウムsp.No.141−８株の染色体DNA断片１μｇ及
び２ユニットのT4DNAリガーゼ〔ベーリンガー・マンハ
イム（Boeringer Manheim）社製〕を66mM MgCl2、10mM
ジチオスレイトール及び10mM ATPを含有する66mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.5）に添加し、温度16℃で16時間反応
し、DNAを連結させた。
BamH I消化物〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕１
μｇと上記により得られたSau3A Iで消化されたフラボ
バクテリウムsp.No.141−８株の染色体DNA断片１μｇ及
び２ユニットのT4DNAリガーゼ〔ベーリンガー・マンハ
イム（Boeringer Manheim）社製〕を66mM MgCl2、10mM
ジチオスレイトール及び10mM ATPを含有する66mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.5）に添加し、温度16℃で16時間反応
し、DNAを連結させた。
次いで、該DNA混合物を、イン・ビトロ・パッケージ
ング（in vitro packaging）法〔メソズ・イン・エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology）第68巻、第281〜
298頁（1979年）〕によりバクテリオファージの被膜蛋
白質で包み、バクテリオファージ粒子を調製した。次い
で、このようにして得たバクテリオファージ粒子を大腸
菌P2392（ストラタジーン社より入手）を指示菌とし
て、トリプトン寒天培地〔トリプトン（Difco社製）１
％、NaCl 0.25％、寒天1.2％〕上に撒き、温度37℃で1
6時間培養したのち、約4000個のプラークを得、これを
ライブラリーとして使用した。
ング（in vitro packaging）法〔メソズ・イン・エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology）第68巻、第281〜
298頁（1979年）〕によりバクテリオファージの被膜蛋
白質で包み、バクテリオファージ粒子を調製した。次い
で、このようにして得たバクテリオファージ粒子を大腸
菌P2392（ストラタジーン社より入手）を指示菌とし
て、トリプトン寒天培地〔トリプトン（Difco社製）１
％、NaCl 0.25％、寒天1.2％〕上に撒き、温度37℃で1
6時間培養したのち、約4000個のプラークを得、これを
ライブラリーとして使用した。
項目（３）で得た組み換え体プラスミドpNAM106DNA2
μｇ及び制限酵素Aat II〔ベーリンガー・マンハイム
（Boeringer Mannheim）社製〕をＭ−バッファーに混合
し、温度37℃で２時間反応させた。反応終了液を0.7％
（W/V）アガロースゲル電気泳動で分離したのち組み換
え体プラスミドpNAM106DNA中の0.9kbpのAat II−Aat II
DNA断片を含むゲル部分をゲルより切り出して、ダイア
・ヤトロンDNAプレップ（DIA−IATROM DNA PREP）の方
法によりDNAを回収した。得られた0.9kb Aat II−Aat I
I DNA断片0.1μｇから、〔α−P32〕dCTP（アマシャム
ジャパンより購入、3000ci/n mol）とランダム・プライ
マー・エクステンション・ラベリング・システム（Ramd
om Primer Extention Labeling System）〔デュポン（D
u Pont）社製〕により、放射性プローブを作製した。
μｇ及び制限酵素Aat II〔ベーリンガー・マンハイム
（Boeringer Mannheim）社製〕をＭ−バッファーに混合
し、温度37℃で２時間反応させた。反応終了液を0.7％
（W/V）アガロースゲル電気泳動で分離したのち組み換
え体プラスミドpNAM106DNA中の0.9kbpのAat II−Aat II
DNA断片を含むゲル部分をゲルより切り出して、ダイア
・ヤトロンDNAプレップ（DIA−IATROM DNA PREP）の方
法によりDNAを回収した。得られた0.9kb Aat II−Aat I
I DNA断片0.1μｇから、〔α−P32〕dCTP（アマシャム
ジャパンより購入、3000ci/n mol）とランダム・プライ
マー・エクステンション・ラベリング・システム（Ramd
om Primer Extention Labeling System）〔デュポン（D
u Pont）社製〕により、放射性プローブを作製した。
この放射性プローブを用いてカレント・プロトコール
ズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Prot
ocols in Molecular Biology）（John Wiley ＆ Sons）
記載の方法に従い、前述のEMBL3ファージベクターで作
製したライブラリーとプラークハイブリダイゼーション
を行った。その結果、４コのポジティブ・クローンを得
た。これら組み換え体ファージを大腸菌LE392（ストラ
タージン社より入手）を指示菌として増殖し、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning）（T.Maniati
sら）記載の方法でDNAを抽出した。これらファージDNA
のBamH I消化物を0.7％アガロースゲル電気泳動し、ニ
トロセルロースフィルターに転写し、前記の0.9kb Aat
II−Aat II DNA断片から作製した放射性プローブを使
い、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・
バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biolo
gy）（John Wiley ＆ Sons）記載の方法に従い、サザン
ブロットハイブリダイゼーションを行った。その結果、
3.9kb BamH I−BamH I DNA断片が４株に共通してプロー
ブとハイブリダイズしたので、この3.9kb BamH I−BamH
I DNA断片を含むゲル部分をゲルより切り出して「ダイ
ヤ・ヤトロンDNAプレップ」（DIA−IATRON DNA PREP）
の方法によりDNAを回収した。
ズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Prot
ocols in Molecular Biology）（John Wiley ＆ Sons）
記載の方法に従い、前述のEMBL3ファージベクターで作
製したライブラリーとプラークハイブリダイゼーション
を行った。その結果、４コのポジティブ・クローンを得
た。これら組み換え体ファージを大腸菌LE392（ストラ
タージン社より入手）を指示菌として増殖し、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning）（T.Maniati
sら）記載の方法でDNAを抽出した。これらファージDNA
のBamH I消化物を0.7％アガロースゲル電気泳動し、ニ
トロセルロースフィルターに転写し、前記の0.9kb Aat
II−Aat II DNA断片から作製した放射性プローブを使
い、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・
バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biolo
gy）（John Wiley ＆ Sons）記載の方法に従い、サザン
ブロットハイブリダイゼーションを行った。その結果、
3.9kb BamH I−BamH I DNA断片が４株に共通してプロー
ブとハイブリダイズしたので、この3.9kb BamH I−BamH
I DNA断片を含むゲル部分をゲルより切り出して「ダイ
ヤ・ヤトロンDNAプレップ」（DIA−IATRON DNA PREP）
の方法によりDNAを回収した。
次いで、プラスミドpUC19DNA（宝酒造社製）0.5μｇ
及び制限酵素BamH I（宝酒造社製）10ユニットをＨ−バ
ッファーに夫々混合し、温度37℃で２時間反応させたの
ち、常法に従いフェノール抽出及びエタノール沈澱処理
してBamH Iで消化されたプラスミドpUC19DNAを得た。上
記のように得た3.9kb BamH I−BamH I DNA断片0.5μｇ
をBamH Iで消化したプラスミドpUC19DNA0.5μｇを項目
（３）記載の方法で連結して組み換え体プラスミドpNAM
301DNAを得た。更に、大腸菌JM109（pNAM301）を項目
（３）記載の方法で培養し、この株が含有するプラスミ
ドを精製して純化された組み換え体プラスミドpNAM301D
NA800μｇを得た。
及び制限酵素BamH I（宝酒造社製）10ユニットをＨ−バ
ッファーに夫々混合し、温度37℃で２時間反応させたの
ち、常法に従いフェノール抽出及びエタノール沈澱処理
してBamH Iで消化されたプラスミドpUC19DNAを得た。上
記のように得た3.9kb BamH I−BamH I DNA断片0.5μｇ
をBamH Iで消化したプラスミドpUC19DNA0.5μｇを項目
（３）記載の方法で連結して組み換え体プラスミドpNAM
301DNAを得た。更に、大腸菌JM109（pNAM301）を項目
（３）記載の方法で培養し、この株が含有するプラスミ
ドを精製して純化された組み換え体プラスミドpNAM301D
NA800μｇを得た。
該組み換え体プラスミドpNAM301DNAを制限酵素Aat I
I、BamH I、Bgl II、Sal I及びSph I（いずれも宝酒造
社製）を用い、単一消化及び二重消化して得られたDNA
断片を、アガロースゲル電気泳動法により移動度パター
ンを分析し、得られた移動度パターンとバクテリオファ
ージλDNA（宝酒造社製）をHind IIIにより消化して得
られたDNA断片の標準移動度パターンとを対比すること
により制限酵素開裂地図を作製し、第２図に示した。
I、BamH I、Bgl II、Sal I及びSph I（いずれも宝酒造
社製）を用い、単一消化及び二重消化して得られたDNA
断片を、アガロースゲル電気泳動法により移動度パター
ンを分析し、得られた移動度パターンとバクテリオファ
ージλDNA（宝酒造社製）をHind IIIにより消化して得
られたDNA断片の標準移動度パターンとを対比すること
により制限酵素開裂地図を作製し、第２図に示した。
（５）組み換え体プラスミドpNAM305DNAの作製 項目（４）で得た組み換え体プラスミドpNAM301DNA2
μｇ、制限酵素BamH I及びBgl II（いずれも宝酒造社
製）各10ユニットをＨ−バッファーに夫々混合し、温度
37℃で２時間反応させた。反応終了液を0.7％（W/V）ア
ガロースゲル電気泳動で分離した後、組み換え体プラス
ミドpNAM301DNA中の2.4kbのBamH I−Bgl II DNA断片を
含むゲル部分をゲルより切り出して「ダイヤ・ヤトロン
DNAプレップ」（DIA−IATRON DNA PREP）の方法により
２μｇのDNAを回収した。
μｇ、制限酵素BamH I及びBgl II（いずれも宝酒造社
製）各10ユニットをＨ−バッファーに夫々混合し、温度
37℃で２時間反応させた。反応終了液を0.7％（W/V）ア
ガロースゲル電気泳動で分離した後、組み換え体プラス
ミドpNAM301DNA中の2.4kbのBamH I−Bgl II DNA断片を
含むゲル部分をゲルより切り出して「ダイヤ・ヤトロン
DNAプレップ」（DIA−IATRON DNA PREP）の方法により
２μｇのDNAを回収した。
次いで、プラスミドpUC19DNA（宝酒造社製）0.5μｇ
を項目（４）と同様の方法でBamH Iで消化し、このプラ
スミドpUC19DNABamH Iで消化物と上記の組み換え体プラ
スミドpNAM301BamH I−Bgl II2.4kb DNA断片を項目
（３）記載の方法で連結して組み換え体プラスミドpNAM
304DNAを得た。更に大腸菌JM109（pNAM304）を項目
（３）記載の方法で培養し、この株が含有するプラスミ
ドを精製して純化された組み換え体プラスミドpNAM304D
NA800μｇを得た。
を項目（４）と同様の方法でBamH Iで消化し、このプラ
スミドpUC19DNABamH Iで消化物と上記の組み換え体プラ
スミドpNAM301BamH I−Bgl II2.4kb DNA断片を項目
（３）記載の方法で連結して組み換え体プラスミドpNAM
304DNAを得た。更に大腸菌JM109（pNAM304）を項目
（３）記載の方法で培養し、この株が含有するプラスミ
ドを精製して純化された組み換え体プラスミドpNAM304D
NA800μｇを得た。
上記のようにして得た組み換え体プラスミドpNAM304D
NA15μｇ及び制限酵素Pst I及びXba I（いずれも宝酒造
社製）をＨ−バッファーに夫々混合し、温度37℃で２時
間反応させたのち、常法に従い、フェノール抽出及びエ
タノール沈澱処理して、Pst I及びXba Iで消化されたpN
AM304DNAを得た。上記のようにして得たDNAをキロ・シ
ークエンス用デレーション・キット（宝酒造社製）によ
り処理してDNAを欠失させ、組み換え体プラスミドpNAM3
04DNAの挿入断片のうちXba Iから0.4kb欠失した挿入断
片を持つ組み換え体プラスミドpNAM305DNAを得た。
NA15μｇ及び制限酵素Pst I及びXba I（いずれも宝酒造
社製）をＨ−バッファーに夫々混合し、温度37℃で２時
間反応させたのち、常法に従い、フェノール抽出及びエ
タノール沈澱処理して、Pst I及びXba Iで消化されたpN
AM304DNAを得た。上記のようにして得たDNAをキロ・シ
ークエンス用デレーション・キット（宝酒造社製）によ
り処理してDNAを欠失させ、組み換え体プラスミドpNAM3
04DNAの挿入断片のうちXba Iから0.4kb欠失した挿入断
片を持つ組み換え体プラスミドpNAM305DNAを得た。
大腸菌JM109（宝酒造（株）より入手）を、ディー・
エム・モーリソン（D.M.Morrison）の方法〔メソヅ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、第6
8巻、第326〜331頁（1979年）〕により組み換え体プラ
スミドpNAM305DNAを用いて形質転換した形質転換株大腸
菌E.coli JM109（pNAM305）（該形質転換株は、工業技
術院微生物工業技術研究所にFERM BP−2692として寄託
されている。）を1mM IPTG含むTY培地〔トリプトン１％
（W/V）、酵母エキス0.5％（W/V）及びNaCl0.5％（W/
P）〕10ml中で温度37℃で８時間振盪培養したのち、遠
心分離により集菌し、超音波破砕して得た粗酵素液のＮ
−アセチルマンノサミン脱水素酵素活性は、0.12U/mlで
あった。
エム・モーリソン（D.M.Morrison）の方法〔メソヅ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、第6
8巻、第326〜331頁（1979年）〕により組み換え体プラ
スミドpNAM305DNAを用いて形質転換した形質転換株大腸
菌E.coli JM109（pNAM305）（該形質転換株は、工業技
術院微生物工業技術研究所にFERM BP−2692として寄託
されている。）を1mM IPTG含むTY培地〔トリプトン１％
（W/V）、酵母エキス0.5％（W/V）及びNaCl0.5％（W/
P）〕10ml中で温度37℃で８時間振盪培養したのち、遠
心分離により集菌し、超音波破砕して得た粗酵素液のＮ
−アセチルマンノサミン脱水素酵素活性は、0.12U/mlで
あった。
なお、比較のため、プラスミドpUC19（宝酒造社製）
を有する大腸菌JM109（宝酒造（株）より入手）を用い
る以外は、上記と同様にしてＮ−アセチルマンノサミン
脱水素酵素活性を測定した結果は、検出できなかった。
を有する大腸菌JM109（宝酒造（株）より入手）を用い
る以外は、上記と同様にしてＮ−アセチルマンノサミン
脱水素酵素活性を測定した結果は、検出できなかった。
（６）Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子を含
有するDNAの塩基配列の解析 組み換え体プラスミドpNAM305のシークエンシングは
シーケネースキット（東洋紡社製）により行った。ま
た、プライマーは、システム１プラスDNA合成機（ベッ
クマン社製）を用いて合成した。
有するDNAの塩基配列の解析 組み換え体プラスミドpNAM305のシークエンシングは
シーケネースキット（東洋紡社製）により行った。ま
た、プライマーは、システム１プラスDNA合成機（ベッ
クマン社製）を用いて合成した。
更に、塩基配列の解析のためのゲル電気泳動は、８％
（W/V）ポリアクリルアミドゲル（富士写真フィルム社
製）を用いて行った。
（W/V）ポリアクリルアミドゲル（富士写真フィルム社
製）を用いて行った。
得られたＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子
のみの全塩基配列を第３図に、また、該遺伝子から翻訳
されるポリペプチドのアミノ酸配列を第４図に夫々示し
た。
のみの全塩基配列を第３図に、また、該遺伝子から翻訳
されるポリペプチドのアミノ酸配列を第４図に夫々示し
た。
第１図は、組み換え体プラスミドpNAM106DNAの制限酵素
開裂地図を示す図であり、第２図は、組み換え体プラス
ミドpNAM301DNAの制限酵素開裂地図を示す図であり、第
３図は、Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子の
全塩基配列を示す図であり、また、第４図は、Ｎ−アセ
チルマンノサミン脱水素酵素遺伝子から翻訳されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
開裂地図を示す図であり、第２図は、組み換え体プラス
ミドpNAM301DNAの制限酵素開裂地図を示す図であり、第
３図は、Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子の
全塩基配列を示す図であり、また、第４図は、Ｎ−アセ
チルマンノサミン脱水素酵素遺伝子から翻訳されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 中野 衛一 埼玉県岩槻市府内２丁目22―17
Claims (3)
- 【請求項１】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子。 - 【請求項２】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子をベクター
DNAに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体DNA。 - 【請求項３】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子をベクター
DNAに挿入した新規な組み換え体DNAを含み、Ｎ−アセチ
ルマンノサミン脱水素酵素生産能を有するエッシェリシ
ア属に属する微生物を培地に培養し、培養物よりＮ−ア
セチルマンノサミン脱水素酵素を採取することを特徴と
するＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素の製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1338267A JP2589287B2 (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | Ｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、及びｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素の製造法 |
| US07/637,865 US5942427A (en) | 1989-12-28 | 1990-12-27 | N-acetylmannosamine dehydrogenase gene and novel recombinant DNA as well as a method for production of N-acetylmannosamine dehydrogenase |
| DE4042160A DE4042160C2 (de) | 1989-12-28 | 1990-12-28 | N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase-Gen und neue rekombinante DNA sowie ein Verfahren zur Herstellung von N-Acetylmannosamin-Dehydrogenase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1338267A JP2589287B2 (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | Ｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、及びｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03201988A JPH03201988A (ja) | 1991-09-03 |
| JP2589287B2 true JP2589287B2 (ja) | 1997-03-12 |
Family
ID=18316515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1338267A Expired - Lifetime JP2589287B2 (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | Ｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、及びｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素の製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5942427A (ja) |
| JP (1) | JP2589287B2 (ja) |
| DE (1) | DE4042160C2 (ja) |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4788135A (en) * | 1983-03-07 | 1988-11-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford, Jr. University | System for efficient isolation of genes using probes |
| US4721671A (en) * | 1984-12-26 | 1988-01-26 | Repligen Corporation | Efficient prokaryotic expression system using portions of the E. coli .beta. |
| US4768592A (en) * | 1986-04-23 | 1988-09-06 | Atlantic Richfield Company | Enhanced oil recovery process |
| US4960701A (en) * | 1986-12-04 | 1990-10-02 | Noda Institute For Scientific Research | N-acetylmannosamine dehydrogenase, process for its production, method for quantitatively analyzing N-acetylmannosamine or sialic acid, and kit for the quantitative analysis |
| US5110908A (en) * | 1986-12-31 | 1992-05-05 | Praxis Biologics, Inc. | Haemophilus influenzae peptides and proteins |
| US5026636A (en) * | 1987-11-10 | 1991-06-25 | The University Of Texas Board Of Regents | Methods and compositions for production of mycoplasmal adhesins |
| JPH0669399B2 (ja) * | 1988-03-15 | 1994-09-07 | 三菱化成株式会社 | カルボキシル末端ペプチドの分取方法 |
| US5021342A (en) * | 1988-06-30 | 1991-06-04 | University Hospitals Of Cleveland | Expression cDNA clones encoding antigens of onchocerca volvulus |
-
1989
- 1989-12-28 JP JP1338267A patent/JP2589287B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-12-27 US US07/637,865 patent/US5942427A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-28 DE DE4042160A patent/DE4042160C2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4042160A1 (de) | 1991-07-04 |
| DE4042160C2 (de) | 1999-02-25 |
| US5942427A (en) | 1999-08-24 |
| JPH03201988A (ja) | 1991-09-03 |
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