JPH03240491A - セルラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はセルラーゼ遺伝子に関するものであり、特に、
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）屑線菌由来であり、酸性
側ρ■領領域於いて最適の活性を示し、且つ中性領域で
殆ど作用しないセルラーゼをコードする遺伝子、並びに
当該遺伝子を含むＤＮＡ分子、更には当該ＤＮＡ分子を
含有する微生物に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕一般に
、セルラーゼはセルロースをグルコース、又はセロビオ
ース、或いはセロオリゴ糖まで分解する酵素反応を触媒
する複雑な酵素群として理解されており、その作用機構
により、Ｃ１酵素、Ｃｘ酵素とβ−グルコシダーゼ、或
いはエキソ−βグルカナーゼ、エンド−β−グルカナー
ゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ばれる酵素を含有する
と言われる。過去数十年のセルラーゼの研究は、バイオ
マス資源の有効利用、醸造業に於ける麦芽の糖化などの
観点から、例えばトリコデルマ属、アスペルギルス属、
アクレモニウム属、フミコーラ属、イルペックス属など
の糸状菌類、或いは、クロストリジウム属、シュードモ
ナス属、ルミノコッカス属、セルロモナス属等の細菌類
などにその供給源を求めてきた（村尾沢夫ら「セルラー
ゼ」、講談社（１９８７））。また最近、セルラーゼの
新規産業的用途として、衣料用洗浄剤組成物に関するも
のがあり、バチルス属、セルロモナス属及びストレプト
マイセス属細菌の生産するアルカリセルラーゼが注目さ
れている（特公昭５０−２８５１５号公報、特開昭５８
−２２４６８６号公報、ｆｌｏｒｉｋｏｓｈｉ　ら、遺
伝子、具体的には、トリコデルマ属、クロストリジウム
属、セルロモナス属、バチルス属、ストレプトマイセス
属及びルミノコッカス属等の遺伝子が遺伝子操作技術を
用いて単離されている。こうした試みは、蛋白工学の手
法によるセルラーゼの機能及び特性の改良等を考慮した
場合、極めて意義のあることである。しかしながら、一
般のセルラーゼは、その立体構造や活性中心に関する知
見が殆ど皆無であり、従って、前述の目的を達成する為
には、機能や特性が異なるセルラーゼをコードしており
、且つそのヌクレオチド配列が明らかとなっている、よ
り多くのセルラーゼ遺伝子が必要とされている。ところ
が、これまでに、塩基配列が決定された遺伝子としては
、トリコデルマリイゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅ
ｅｓｅｉ（Ｐｅｎｔｔｉｌａら、　　Ｇｅｎｅ。

４５巻、２５３頁、　（１９８６））、クロストリジウ
ム　ザー特開昭６１−２８０２７６号公報、特開昭６３
（０９７７１号公報、特開昭６３−２４０７８５号公報
など）。

一方、近年になって、微生物由来のセルラーゼＪ、　　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　１６２巻、１０２頁、　（
１９８５）　、Ｊｏｌｉｆｆら、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　　１４巻、　　８６０５頁、
　（１９８６）１７９１頁、（１９８６）））　、セル
ロモナス　フィミ頁、　（１９８６））、セルロモナス
　ラダ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ（１９８６）））、
枯草菌（バチルス　ズブチリス１６９巻、　’２０１７
頁、　（１９８７）））　、及び３種の好アルカリ性バ
チルス属細菌（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ　ら、　Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、。

１６８巻、４７９頁、　（１９８６）　、Ｆｕｋｕｍｏ
ｒｉら、　　Ｊ、　　Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏ＋、、　１３２巻、　２３２９頁、　
（１９８６）及び特公平１−２８１０９０）　、並びに
好アルカリ性ストレプトマイ２２９頁、　（１９８８）
）等の各微生物由来のものに限られていることから、決
して充分とは言えず、セルラーゼの改良に関する成功例
は知られていない。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実情において本発明者は、バチルス属細菌の染色
体ＤＮＡから新規なセルラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片
を得べく、遺伝子操作の手法を用いてセルラーゼを生産
する組換えエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属
菌株を潤製した。次いで、当該菌株よりセルラーゼ遺伝
子を含む約３、ＩＫｂのＤＮＡ断片を単離し、更に当該
ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定し、これをこれま
でに知られている他のセルラーゼ遺伝子のヌクレオチド
配列と比較した結果、本発明のＤＮＡ断片が独自のヌク
レオチド配列を有していることを見出し、本発明を完成
した。

従って、本発明はセルラーゼ遺伝子を提供するものであ
り、更に当該遺伝子を含むＤＮＡ分子を提供するもので
ある。また、本発明はセルラーゼ遺伝子を含有する微生
物を提供するものである。

本発明に於いて、セルラーゼ遺伝子の供与体となる微生
物としては、例えば本発明者らが、菌体外に著量のセル
ラーゼを生産する菌株として栃木県真岡市の土壌より分
離したバチルス属細菌の一種、バチルスエスピー（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）ＫＳＭ−３３０が挙げられる。

このＫＳＭ−３３０株の分類学的性質は、以下の通りで
ある。

尚、菌株の分類に用いた培地は次の培地Ａ　−Ｌの１２
種類である。

１、　使用した培地の組成（表示は重量％）培地Ａ：バ
クトニュートリエント　アガー、指示量 培地Ｂ：バクトニュ−１−Ｕエンド　ブロース、指示量 培地Ｃ：バクトニュートリエント　ブロース、指示量；
食塩７．０ 培地Ｄ：ポリベプトン、１．０；肉エキス２０．３ＫＮ
Ｏ，、０，１ 培地Ｅ：ポリペプ）・ン、０，７．グルコース、０．５
；食塩、０．５ 培地Ｆ：ポリベブトン、１．１］　　；肉エキス、０．
４；乳糖、１．０．蔗糖、１．０；グルコース。

１．０；食塩＋０．にチオ硫酸ナトリウム。

０．００８；亜硫酸ナトリウム、　０．０４　；硫酸第
一鉄、　０．０２　；フェノール・レッド。

０．００２　；バクト寒天、１，５ 培地Ｇ：ポリベプトン、］、、５．酵母エキス、０４５
；可溶性澱粉、　２，０　；　Ｋ２１１ＰＯ，、０，１
；バクト寒天、　１．５　：　Ｍｇ５Ｌ・７）１２［１
１，０，０２（削減菌） 培地Ｈ：食塩、　０，５　；　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，
０，０２（Ｎ）１４）２ＨＰＤ４．０．１　；　Ｋ２１
１ＰＤ４．０．１　；クエン酸すトリウム、０．２ 培地Ｉ：肉エキス、１．０；ポリペプトン、１．０食塩
、０．５ ＋１ＪＷ種５１、流動パラフィン−ワセリン１：１を上
部約５　ｃｍ重層、固化 培地Ｊ　：　）　ＩＪプトン（デイフコ社製）、０．２
；食塩、　０．５　；　Ｋ２１（ＰＯ，、０，０３；ブ
ロモチモールブルー、　０．００８　；糖類、１．０（
濾過滅菌） 培地に：酵母エキス、０．５．グルコース、１．０（削
減菌ＩＫ２ＨＰ口４＋　　０．１　　；　　ＭｇＳ口、
・　７１１゜田０．０２＜削減菌）；バクト寒天ｉ、５
；脱脂粉乳、１０．０（削減菌） 培地Ｌ：下層：肉汁寒天培地（栄研）１指示量上層：肉
汁培地（栄研）、指示量；ゼラチン、２５と肉汁寒天培
地、指示量の １：１０混合物 （菌学的観察結果） （ａ）　　顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、０．９〜１．０ｑｍ　Ｘ　２．５〜３
．０ｐｍの桿菌であり、菌体内に中立乃至準端立芽胞（
１，０〜１，３μｍ８１．５〜２．０μｍ）を形成する
。又、周鞭毛を有して運動性があり、ダラム染色では陽
性を示した。

（ｂ）　　各種培地における生育状態 ■　肉汁寒天培地（培地Ａ） 集落の形状は円形であり、集落の表面は偏平である。又
、集落の色調は白色乃至淡黄色の不透間であり、光沢が
ない。

■　肉汁液体培地（培地Ｂ） 生育し、混濁する。

■　７％食塩肉汁液体培地（培地Ｃ） 生育し、混濁する。

（Ｃ）　　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元（培地Ｄ） 硝酸還元する。

■　ＭＲテスト（培地Ｅ） 陽性。

■　ＶＰテスト（培地Ｅ） 陽性。

■　インドールの生成（培地Ｄ） 蓚酸紙を用いる試験により、陰性。

■　硫化水素の生成（培地Ｆ、培地Ｄ）培地Ｆを黒変せ
ず、また酢酸鉛試験紙により、陰性。

■　澱粉の加水分解（培地Ｇ） ヨウ素反応による検出法により、陰性。

■　クエン酸の利用（培地Ｈ） クエン酸を利用し、生育する。

■　カタラーゼ 陽性 ■　生育温度範囲（培地Ｂ） １０℃から５０℃の範囲で生育する。

■　嫌気条件下での生育（培地Ｉ） 生育せず。

■　グルコースからガスの生育（培地Ｊ）陰性 ■　糖類からの酸の生成（培地Ｊ） グルコース　：陽性 アラビノース；陰性 キシロース　；陰性 マンニトール；陰性 ■　カゼインの加水分解（培地Ｋ） 平板培地上に生育し、集落周辺にカゼインの加水分解に
よる透明帯を形成。

■　ゼラチンの液化（培地Ｌ） 平板培地上に生育し、集落周辺のゼラチンを液化する。

以上の菌学的性質についてバーシーズ・マニュアル・オ
ブ・ディターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版及びザ・
ジーナス・バチルス（”Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ”　Ｒｕｔｈ、　Ｂ、　Ｇｏｒｄｏｎ八ｇｒｉ
ｃへｌｔｕｒｅ　　Ｈａｎｄ−ｂｏｏｋ　　Ｎｏ、　　
４２７．　　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃ
ｈ　５ｅｒｖｉｃｅ、　　Ｕ、Ｓ、　　Ｄｅｐａｒｔｍ
ｅｎｔ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｕｅ　Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ　Ｄ、　Ｃ，、（１９７３））を参照した結果
、本菌は有胞子桿菌であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）属の一種であると認められた。更に、当該菌株を他の
バチルス属の菌株と比較すると、最も類縁の菌種として
、バチルス　プミルスしかしながら、いずれの菌株との
比較に於いてもアラビノース、キシロース及びマンニト
ールからの酸の生成の有無の点で異なり、また、バチル
スプミルスとは硝酸塩の還元能の有無、更に、枯草菌と
は澱粉の加水分解能の有無の点でそれぞれ異なった性質
を有していることから、本菌株を新菌株であると判断し
、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１
２２３号として寄託した。

斯かる供与菌株から染色体ＤＮＡを得る方法としては、
例えば、マーマーの方法（Ｍａｒｍｕｒ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、　３巻、２０８頁、　（１９６１））や斉
藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ａｃｔａ、　　７２巻、６１９頁。

（１９６３））等が挙げられるが、他の類似な方法を用
１ いることもできる。斯くして得られた染色体ＤＮＡを制
限酵素で切断することによって、本発明のセルラーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片を調製することができる。ここで
用いる制限酵素の種類としては、当該遺伝子を分断しな
いものであれば、如何なるものでも使用でき、このよう
な制限酵素の例としては、）Ｉｉｎｄｌｌ［、ＢｃｏＲ
Ｉ或いはＢａｍＨＩ等の制限酵素が挙げられる。また、
用いる制限酵素が当該遺伝子上の酵素活性発現に必須な
領域を分断しないものであれば、当該遺伝子の一部を含
むＤＮＡ断片を調製できる。更に、当該遺伝子或いは活
性必須領域を切断する制限酵素を用いる場合においても
、通常の部分切断の条件を用いることによって当該遺伝
子の全領域を含むＤＮＡ断片を調製することが可能であ
る。

一方、用いる宿主・ベクター系としては、宿主菌株が本
発明のセルラーゼ遺伝子を発現させることができ、また
組換えＤＮＡ分子が宿主菌中で複製可能であり、組み込
んだ当該遺伝子を安定に保持できるものであれば、如何
なるものも使用する２ ことができる。例えば、大腸菌（エシェリヒア主とする
Ｂｌ、ｌ系等が挙げられるが、遺伝学的に最もよく研究
されており、ベクターの種類が豊富であるＢＫ系を用い
ると良い結果が得られる。宿主菌株の具体例としては、
ＢＫ系ではＩＩ　Ｂ　１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０
９株等が、８Ｍ系では３０１７０株、Ｍ　Ｉ　１．１２
株等が挙げられる。ベクターとしては、染色体ＤＮＡを
切断した制限酵素によって唯一ケ所で切断されるプラス
ミドベクターを用いれば、染色体ＤＮＡ断片との結合の
際に便利である。具体的には、供与菌株の染色体ＤＮＡ
を旧ｎｄｌｌＩで切断した場合、ＩＥＫ系ではｐ［］Ｒ
３２２やｐＨｃ１２　、ｐＵｃ１８等のベクター、また
８Ｍ系ではｐｃ１９４やｐＢ［］８等のベクターを用い
ることができる。また、供与染色体ＤＮＡを切断する制
限酵素が、用いるベクターを切断しない場合についても
、合成リンカ−を用いる方法やホモポリマー結合法（Ｎ
ｅｌｓｏｎａ　Ｂｒｕｔｌａｇ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ［！ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　　６８巻、４１頁、八ｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　　ＮｅｗＹｏｒｋ、　　
（１９８０））等を用いることによって、実施すること
ができる。

次いで、上述の染色体ＤＮＡ断片と制限酵素によって切
断したベクターＤＮＡ分子を結合することにより、組換
えＤＮＡ分子を作製するが、結合の方法としては、例え
ばＤＮＡ’Ｊガーゼを使用する方法やホモポリマー結合
法等を用いることができる。

組換えＤＮＡ分子による宿主菌株の形質転換の方法は特
に限定されないが、例えばＢＫ系宿主菌株の場合には、
塩化カルシウム法（Ｍａｎｄｅ＋と旧ｇａ。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　５３巻、１５９頁、　
（１９７０））や塩化ルビジウム法（Ｂｏｌｉｖａｒと
３ａｃｋｍａｎ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
、ｏｇｙ、　　６８巻、２５３頁、八ｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ（１９７９））等を、またＢＭ系宿主菌株の
場合には、コンブテント・セル法（Ｃｏｎｔｅｎｔｅと
Ｄａｂｎａｕ、　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇａｎｅｔ、、　１７７巻、４５９頁、　（
１９７９））やプロト子上にコードされている抗生物質
耐性等の形質のうち、外来染色体ＤＮＡ断片の挿入によ
って失活しない形質を指標として、ベクター由来のＤＮ
Ａ断片を含むＤＮＡ分子によって形質転換されたものを
一次選択する。具体的には、例えばベクターとしてＢＫ
系のｐＢＲ３２２を用い、この旧ｎｄＩ［［切断部位に
染色体ＤＮＡの）ｌｉｎｄｅｎ断片を挿入した場合には
、テトラサイクリン耐性遺伝子が失活するので、遺伝子
中にＨｉｎｄ１ｍ切断部位を持たないアンピシリン耐性
を指標として一次選択を行えば良い。

次にこれを適当な寒天プレートにレプリカ法等によって
移植して、培養によって集落を出現させた後、カルボキ
シメチルセルロース（ＣＭ　Ｃ）とりゾチームを含み、
適当な緩衝液によってｐＨを５付近に潤整した寒天（４
５℃乃至５０℃）を重層し、固化後、更に培養を継続す
る。この後、例えばコンゴ−・レッド法（Ｔｅａｔｈｅ
ｒと１ｌｌＯｏｄ、　Ａｐｐ＋。

１６８巻、１１１頁、　（１９７ｇ））等を用いること
ができる。

組換え微生物の選択は、先ずベクターＤＮＡ分によって
集落周辺のＣＭＣを分解した菌株を目的の組換え微生物
として選択することができる。

５ 斯くして得られた組換え微生物が保持する組換えＤＮＡ
分子は、通常のプラスミド調製法或いはファージＤＮＡ
調製法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ｔｌａ
ｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　ＮｅｗＹｏｒ
ｋ、　　（１９８２）等）を用いて抽出でき、更に各種
制限酵素による切断パターンを電気泳動法等によって解
析することによって、組換えＤＮＡ分子がベクターＤＮ
Ａ分子とセルラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が結合した
ものであることを確認できる。本発明に於けるセルラー
ゼ遺伝子は第２図に示した制限地図を有する約３．１Ｋ
ｂのＤＮＡ断片に含まれて」６す、太線で示した約１．
８Ｋｂの部分に存在している。

この約１．８Ｋｂ断片は第３図に示したヌクレオトド配
列を有している。本配列は第２図に太線で示した約１．
８Ｋｂ断片の右側から左側に向けての配列を５′から３
′の方向に示したものである。本配列中にヌクレオチド
番号１番のＡＴＧから翻訳を開始し、第１図に記載のア
ミノ酸４６３残基から成る配列をコードするオープン・
リーディング・フレーム６ が認められる。オープン・リーディング・フレムの１２
ベース（ｂ）上流に枯草菌の１６８　’ＪボゾームＲＮ
Ａの３′末端の配列（Ｍ　ｃ　Ｌ　ａ　ｕ　ｇ、　ｈ　
Ｉ　ｉ　ｎら、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２５６巻、　１１２８３頁、　（１９８
１））と相補性が高いＧＧＡＧＡＴＧ八配列が存在へ、
更に上流には、ヌク１／オチド番号−１９１以降にσ４
３型プロモーターの共通（１９８５）等）と相同性の高
いＴΔＧＡＡ八　　１９１］ＴＡＴＡＴＴ配列が存在す
る。また、ヌクレオチド番号１３９０〜１３９２番の翻
訳終止コドンＴＡＡの下流には転写ターミネータ−と思
われるインバーチイツト・リピート配列が２箇所に存在
する（ヌクレオチド番号１４０２〜１４２６及び１４６
６〜１５０６）。

本発明のセルラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定
されるセルラーゼのアミノ酸配列をこれまでに知られて
いるセルラーゼと比較したところ、本遺伝子は独自のヌ
クレオチド配列を有しており、且つコードされるアミノ
酸の配列も他のセルラーゼのものとは異なっており新規
なものであった。

本発明のセルラーゼ遺伝子の全領域を含む組換えＤＮＡ
分子の好適な例として、プラスミドｐＫｃ３３０　（第
４図）等が挙げられる。本プラスミドはベクタープラス
ミドｐＢＲ３２２の旧ｎｄＩ］Ｉ切断部位にバチルス　
エスピーＫＳＭ−３３０（ＰＢＲＭ　Ｐ−１１２２３）
株由来であり、第２図に示す約３．１ＫｂのＤＮＡ断片
を挿入したものである。尚、この約３．　ＩＫｂの旧ｎ
ｄ■断片がＫＳＭ−３３０株由来であることは、プラス
ミドｐＫｃ３３０より単離した当該ＤＮＡ断片をプロー
ブとしたサザン・ハイブリダイゼーション実験によって
確認されている（第５図）。また、ＫＳＭ−３３０株の
培養液から精製したセルラーゼ　ＫＣ−Ｉのアミノ末端
側２０残基のアミノ酸配列は、当該プラスミドｐＫｃ３
３０より単離したＤＮＡ断片中のヌクレオチド配列から
推定されるアミノ酸配列（第１図）の５６番以降の配列
と一致した。

組換えＤＮＡ分子を含有する組換え微生物の好適な例と
しては、大腸菌ＨＢＩＯＩ　（ｐＫｃ３３０）株が挙げ
られる。この菌株は組換えプラスミドｐＫｃ３３Ｇを大
腸菌１１８１０１株に通常の形質転換法を用いて導入し
たものであり、エシェリヒア属細菌の培養に通常用いら
れる培地で培養することにより菌体内にセルラーゼを生
産する。生産された当該酵素の最適反応ｐｕは５〜５．
５であり、遺伝子の供与菌株であるバチルスエスピーＫ
ＳＭ−３３０（ＦＢＲＭ　Ｐ−１１２２３）が生産する
セルラーゼの値と良く一致する（第６図）。

上記の組換えプラスミドからセルラーゼ遺伝子の全領域
或いは活性必須領域を含むＤＮＡ断片を単離する方法と
しては、組換えプラスミドを制限酵素Ｈｉｎｄ］ＩＩに
よって切断した後、アガロースゲル電気泳動法によって
、ＤＮＡ断片を分離し、ゲルより抽出・精製することに
よって実施できる。ゲルからＤＮＡ断片を抽出・精製す
る方法としては、電気溶出法（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、
　Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　、　１１０巻。

１１９頁、　（１９７７＞）や低融点アガロースゲルを
用いる頁、　（１９７９＞）などが挙げられる。

〔発明の効果〕

本発明によれば酸性側ｐＨ領域において最適の活性を示
すセルラーゼの遺伝子及びこれを含有する９ 微生物が得られ、これらを利用すれば当該セルラーゼの
生産が可能である。

〔実施例〕

以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

尚、本発明においてセルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は
以下の様に測定した。即ち、２．５％ＣＭＣ（両隅国策
パルプ社製　ザンローズＡＯＩＭＣ）０．４ｍｌ、０．
５Ｍクエン酸緩衝液（ｐｆ１５．２）　０．２−及び脱
イオン水０．３ｍｆ！、からなる基質溶液に酵素液０．
１−を加え、４０℃で反応した後、生成した還元糖を３
．５−ジニトロ−サリチル酸（３，５ｄｉｎｉｔｒｏ−
ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　　ａｃｉｄ（ＤＮＳ））法（Ｓｕ
ｍｎｅｒとＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　八ｃａｄｅｍｉｃ
　　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、　　３４頁
。

（１９４４））によって定量した。酵素力価は、上記の
条件下で１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還
元糖を生成する酵素量を１単位とした。また、蛋白定量
はバイオ・ラド　プロティン　アッセイキット（バイオ
・ラド社製）を用いて行い、牛血０ 漿アルブミンを標準蛋白として算出した。

実施例１ セルラーゼを生産するバチルス　エスピーＫＳＭ３３０
（ＦＢＲＭ　Ｐ−１１２２３）を５ｍｆ！、のＰ培地（
ポリペプトン（大五栄養化学社製）１．０％、酵母エキ
ス（デイフコ社製）０．５％、ＫＨ２Ｐ０．０１％、Ｎ
ａ２■ＰＯ＜　・１２Ｈ，ＯＯ，２５％、Ｍｇ５Ｏ＜・
７Ｈ，Ｇ　Ｏ，０２％）に接種し、３０℃で２４時間振
盪培養を行った後、この１ｍｌを１００−の同培地に接
種して３０℃で更に１２時間振盪培養した。この後、遠
心分離によって菌Ａｃｔａ、　７２巻、６１９頁、　（
１９６３））に従って約５（ｌμｇの精製染色体ＤＮＡ
を得た。

実施例２ 実施例１で得られた染色体ＤＮＡ１０〃ｇを制限酵素反
応液（１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１
０ｍＭ　ＭｇＣｊ２２．５０ｍＭ　Ｎａｌ、　１ｍＭジ
チオスレイトール）に溶解し、これに制限酵素旧ｎｃｌ
ＩＴＪ　（ベーリンガー　マンハイム社製）１０単位を
加えて３７℃で２時間インキュベーションし、染色体Ｄ
ＮＡの切断を行った。フェノール処理によって制限酵素
を除去したのち、同じ＜　Ｈｉｎｄｌｌｌで切断したベ
クタープラスミドｐＢＲ３２２（ベーリンガーマンハイ
ム社製）１μｇを加え、エタノール沈澱を行った。得ら
れたＤＮＡの沈澱をリガーゼ反応液（２０ｍＭ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣＬ　、１０
　ｍＭジチオス１／イトール、１ｍＭＡＴＰ）　５０μ
ｌに溶解した。これにＴ、ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ
ー　マンハイム社製）２単位を加え、１６℃で１２時間
反応を行い、染色体ＤＮＡ断片とベクタープラスミドを
結合させて組換えプラスミドを作製した。

実施例３ 実施例２で作製した組換えプラスミドによる大腸菌の形
質転換は市販のＥ、　ｃａｄｉ　１１８１０１コンピテ
ントセル（宝酒造社製）を用いて行った。形質転換処理
を行った菌懸濁液をアンピシリン（すトリウム塩、シグ
マ社製）５０．＃ｇ／ｍを含むｌ、Ｂ寒天プレート培地
（トリプトン（デイフコ社製）１．０％、酵母エキス（
デイフコ社製）０．５％、ＮａＣβ１．０％、バクト寒
天（デイフコ社製）１．５％）に塗抹し３７℃で１２時
間培養した。出現した形質転換体の各集落を、それぞれ
、２枚のＬ［］寒天プレート培地（アンピシリンを含む
）に１ノブリカ法によって移植し、更に３７℃で２４時
間培養した。培養後、ＣＭ　Ｃ０，５％、リゾチーム（
シグマ社！り１ｍｇ　／　ｍｌを含み、１００ｍＭのク
エン酸緩衝液によってＰＨを５に調整した１０％寒天液
（加熱溶解後４５℃〜５０℃に保温）を重層して固化後
、更に培養を継続した。この結果、集落周辺のＣＭＣを
分解した菌株をコンゴ−・レッド法＜Ｔｅａ付ｅｒ７７
７頁、　（１９Ｂ２））を用いて選択し、目的の組換え
微生物１株を分離した。

実施例４ 実施例３で得られた組換え微生物を、アンピシリン（５
０塊／−）を含む５ｍのＬＢ培地（トリプトン（デイフ
コ社製）１，０％、酵母エキス（デイフコ社製）０．５
％、ＮａＣｊ？１．０％）にそれぞれ接種し、３７℃で
一夜静置培養した後、これを３ ５００　ｍｆノＭ９ｃＡ培地（Ｎａ２１（ＰＯａ　０．
６　％、Ｋｌｌ、Ｐｏ。

０．３％、ＮａＣｊ！　０．０５％、ＮＨ４１０，１％
、カザミノ酸（デイフコ社製）０．２％、Ｍｇ５０４２
　ｍＭ　ｆ別滅菌）　、ＣａＣｊ！　２０．　］、ｍＭ
（別滅菌）、グルコースｏ２％（別滅菌）、アンピシリ
ン５Ｄ、／７ｇ／ｗｄｌ（除菌））に移植し、３７℃で
約５時間振盪培養した。これにクロラムフェニコール（
シグマ？ｆＭ）　　１７０　ｍｇを添加し、更に３７℃
で１５時間振盪培養した。

この培養液より遠心分離によって菌体を集め、常Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　（１
９８２））に従って、組換えプラスミド約５００μｇを
調製した。得られた組換えプラスミドの制限酵素切断地
図を作製したところ、第２図に示した約３．　ＩＫｂの
１ｌｉｎｄｌＩＩ断片が含まれていることが明らかにな
り、これをプラスミドρＫＣ３３０と命名した。また、
ｐＫｃ３３０によって形質転換された大腸菌Ｈ８１０１
株をＩＩＢＩＯＩ　（ｐＫｃ３３０）と命名した。

実施例５ ．１ｉ１１換えフラスミ）’　ｐＫｃ３３Ｑ　］、＋＆
ｇを１０ｍＭ酢酸７グ４ ネシウム、６６ｍＭ酢酸カリウム及び０．５ｍＭジチオ
スレイト−ルを含む３３ｍＭ１・リス酢酸緩衝液（ｐＨ
７，９）５０μｌに溶解し、制限酵素ＨｐａＩ（ベーリ
ンガー　マンハイム社！り２２単を加えて３７℃で２時
間反応させた。反応後フェノール処理によって１１ρａ
Ｉを除去し、エタノール沈澱を行った後、沈澱をリガー
ゼ反応液（２０ｍＭｌリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
、１０ｍＭ　ＭｇＣｆｆ１２．１０ｍＭジチオスレイト
ール、１　ｍＭ　ＡＴＰ）　　２０μｌに溶解した。こ
れにＴ、ＤＮＡリガーゼ２単位を加え、１　［ｉ　ｔ：
で１２時間の結合反応を行った。この後、実施例３の方
法に従って大腸菌ＨＢ　１０　］株の形質転換を行い、
得られた形質転換株のセルラーゼ生産性の有無を調べた
。また、形質転換株から、アルカリ溶菌法によってプラ
スミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片がベクタープラスミ
ドｐＢＲ３２２に挿入されていることを確認した。この
結果、第１図に示した約３．］、ＫｂのＤＮＡ断片から
約１．　ＯＫｂのＨｐａｌ断片が欠失した組換えプラス
ミドを有する組換え微生物が得られ、この微生物がセル
ラーゼを生産するこ七から、セルラーゼ遺伝子は第２図
に示した制限地図に於いて左端の旧ｎｄｌｌＩ切断点か
らＨｐａＩ切断点（２箇所のうち、左側）に至る約１．
８Ｋｂの領域に存在する事が示唆された。

実施例６ ５彪のＬＢ培地で一晩静置培養したＨＢＩＯＩ　（ρＫ
Ｃ３３０）株の培養液１ｍを１００−の１，８培地（ア
ンピシリン５０μｇ／ｍ！、を含む）に接種し、３７℃
で２４時間振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離し
、沈澱した菌体を１０ｄのリン酸緩衝液（ｐＨ１７，０
）に懸濁後、超音波破砕を行った。再度、遠心分離によ
って不溶物を沈澱として取り除き、得られた上清液のＣ
ＭＣアーゼ活性の作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨを求め
たところ（第６図）、本酵素はｐＨ４，５〜６．５の範
囲で作用し、ｐＨ５，０〜５．５に最適作用１１Ｈを有
することが明らかとなり、セルラーゼ遺伝子の供与体で
あるバチルス　エスピーＫＳＭ３３０（ＦＯＲＭ　Ｐ−
１１２２３）株が生産するセルラーゼの性質と良く一致
した。

実施例７ 約５ρｇのｐＫｃ３３０を制限酵素ｔｌｉｎｄＩＩＩに
よって切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルか
ら電気溶出法（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、　ＪｏＭｏｌ、
　Ｂｉｏｌｌ、　　１１０巻１１９頁、　（１９７７）
）によって、約３．　ＩＫｂの１ＩｉｎｄＩＩＩ断片約
０．５＃ｇを単離した。この旧ｎｄｌＴＩ断片をＤＮＡ
ラベリング＆デイテクション　キット　（ベーリンガマ
ンハイム社製）を用いてラベル化することによって、プ
ローブＤＮＡを調製した。一方、Ｈｉｎｃｌｌｌｌによ
って切断したバチルス　エスピーＫＳＭ：３３０（ＦＢ
ＲＭ　Ｐ−１１２２３）株由来の染色体ＤＮＡ　（各３
μｇ）をアガロースゲル電気泳動後、ＤＮＡバンドをエ
レクトロ　ブロッティング装置（バイオ・ラド社製）を
用いて、ゼータ・プローブ膜（バイオ・ラド社製）に移
した後、ＤＮＡラベリング＆デイテクション　キットを
用いてプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行
った。

この結果、第５図に示したように、ＫＳＭ−３３０株由
来の染色体ＤＮＡの旧ｎｄＩＩＩ切断物中には、用いた
プローブＤＮＡとハイブリダイズする約３．　ＩＫｂの
ＤＮＡ断片が存在することがδ忍められ、この結７ 果、プラスミドｐＫｃ３３０に含まれる約３．　ＩＫｂ
の旧ｎｄ■断片は、バチルス　エスピーＫＳＭ−３３０
（ＰＢＲＭ　Ｐ１１２２３）株の染色体ＤＮＡ由来であ
る事が確８忍された。

実施例８ 第２図に示した約１．８Ｋｂ断片をＳｐｅ　Ｉ、３ｃａ
　ｌ或いはＨｐａ　Ｉの各制限酵素或いはＫｐｎ　Ｉと
１ｌｐａＩの２種類の制限酵素によって切断することに
より、１、０Ｋｂ〜１．７Ｋｂの小断片を調製し、これ
らをＭ１３１０１巻、２０頁、　（１９８３））の１種
ｍｐ１８及びｍｐ１９（ヘーリンガー　マンハイム社製
）のマルチプルクローニング部位に挿入し、市販の３．
ｃｏｌｉＪＭ１０９コンピテントセルを用いて形質転換
を行った。これを３−のＬＢ軟寒天培地（バクト寒天０
．８％、他はＬＢ寒天培地と同組成、加熱溶解後、４５
℃〜５０℃に保温）に加え、更に指示菌としてＪＭ１０
９株の対数増殖後期の培養液０．２ｍｌを加えてＬＢ寒
天プレート培地上に重層し、固化後、３７℃で一夜培養
した。出現したプラークから爪楊枝に８ よってファージを釣り上げ、対数増殖初期のＪＭ１０９
株を含む３艷の２ＸＹＴ培地（トリプトン（デイフコ社
製）１．６％、酵母エキス（デイフコ社製）１．０％、
ＮａＣｊ？　　０．５％）に接種して３７℃で５〜６時
間振盪培養した。培養液を遠心分離して得られた菌体か
らアルカリ溶菌法によって２本領の複製型（ＲＦ）ファ
ージＤＮＡを抽出し、制限酵素による切断パターンから
、目的のＤＮＡ小断片が含まれていることを確認した。

一方、培養」二清液１−に０．２艶の２０％ポリエチレ
ングリコール（シグマ社製、分子生物用、平均分子量的
８０００）＝ＩＭ　ＮａＣｊ！溶液を加えて室温で１５
分間放置後、遠心分離によって凝集沈澱したファージを
分離し、フェノール抽出によって目的の小断片を含む１
本ｔＪ　Ｄ　Ｎ　Ａを調製し、これをヌクレオチド配列
決定用の試料とした。ヌクレオチド配列の決定は蛍光プ
ライマーを用いる方法（Ｓｍｉｔｈら、　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　　１３巻、　２３９９頁、
　（１９８５））に従って、アプライド　バイオ　シス
テム社製のモチ゛ル３７〇八ＤＮＡシークエンサーを用
いて行った。更に、市販のキロシーフェンス用デレージ
ョンキット　（宝酒造社製）と適当な２種類の制限酵素
を用いて、各小断片を含むＲＦファージＤＮＡの欠失型
変異ＤＮＡを作製し、これらを、ＪＭ１０９株へ導入し
て１本領ＤＮへを調製し、同様にヌクレオチド配列を決
定した。各１本領ＤＮＡ試料から得られた約３００〜４
５０ｂのヌクレオチド配列を重ね合わせる事によって、
セルラーゼ遺伝子を含む全１８１６ｂの配列を決定した
（第３図）。

参考例１ 栃木県真岡市の土壌１ｇを滅菌生理食塩水１０−に懸濁
し、８０℃で３０分間加熱処理した。この熱処理液を適
当に希釈してＰ寒天プレート培地（ポリペプトン１．０
％、酵母エキス０．５％、ＫＨ２Ｐ０４０．１　％、　
Ｎａ　２１１ＰＯ−・　１２８２０　０．２５　％、　
Ｍｇ５Ｏｎ・７Ｈ２００，０２％、バクト寒天）に塗抹
し３０℃で３日間培養し、集落を形成させた。レプリカ
法により、マスタープｌノートと同じ組成の培地に２％
ＣＭＣを加えた滅菌寒天培地に移植し、３０℃で３〜４
日間培養して集落を形成させた後、コンゴ−・レッド法
によって、集落周辺のＣＭＣを分解する能力のある菌株
を検出した。該当する集落をマスタープレートより選択
しセルラーゼ生産菌を分離した。

上述の手法により、バチルス　エスピーＫＳＭ３３０（
ＦＢＲＭ　Ｐ−１１２２３）を取得した。

参考例２ １０ｍ１ｌ！のＰ培地中、３０℃で２４時間振盪培養し
たバチルス　エスピーＫＳＭ−３３０（ＦＥＲＭ　Ｐ−
］、１．２２３）を１．０％の麦芽糖を含むＰ培地に接
種し、３０℃で２４時間振盪培養した。その培養］二清
液１１を限外濾過（ホローファイバー　Ｈ］、　Ｐ　３
−２０　、アミコン社製）によって約５倍に濃縮後、］
、　ＯｍＭ　リン酸緩衝液（ｐｉｆ７．２）に対して透
析し、これを粗酵素溶液とした。

粗酵素溶液約１５０艶をＣＭ　Ｃ−バイオ・ゲルＡ　カ
ラム＜３．２Ｘ　２　［］　ｃｍ）に通し、非吸着画分
を３５０ｍｆの１［］ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，２
）によって洗浄後、ＮａＣＩ！の直線濃度勾配（０〜０
．２Ｍ）による溶出を行うことによって、２種のセルラ
ーゼ１ （ＫＣＩ及びＫｃａｌ）が分画された。両酵素はレーム
リの方法（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　
２２７巻、６８０頁＜１９７０））に従ってドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い
、ゲルを電気泳動用銀染色キット（関東化学社製）を用
いて染色したところ、いずれも単一のバンドを与えた。

得られた２種類の精製セルラーゼの構成仕（ＫＣＩ　：
　ＫＣＩＩ　）は約１４：１であり、生産されるセルラ
ーゼの主成分はＫＣ−１であることが認められた。

バチルス　エスピーＫＳＭ−３３０（ＦＢＲＩ、ｌ　Ｐ
−１１２２３＞が生産するセルラーゼの物理化学的性質
は次の通りである。

（酵素学的性質） １、　作用 セルロース類に作用し、これらを加水分解してセロビオ
ース等の還元糖を生成する（ＫＣ−１及びＫＣ−Ｕ）。

２、　基質特異性 ＫＣ−ＩはＣＭＣに対する活性を主活性として有２ する他に、リン酸膨潤セルロース（ＣＭＣに対して約７
％）、アビセル（同約５％）、セルロース粉末（同約１
％）に対する活性を有している。

方、ｐ−ニトロフェニルセロビオシＦ　（ＰＩＩＰＣ）
、及びｐ−二ｌ・ロフェニルグルコシド（ＰＮＰＧ）に
対しては殆ど作用しない。

３、　作用ｐＨ及び至適作用ｐ　１ｆ ＫＣ−１、ＫＣ−ＩＩ共に作用ｐ　Ｉｔは４．５〜６，
５、最適作用ｐ＋＋は５．０〜５．５にδ忍められる。

４、　安定ｐＨ領域 ｐ　Ｉｆの異なる緩衝液の下、５℃で２４時間放置した
時の安定ｐ　ｉｆ領領域Ｋ［：ｌ−１、ＫＣ−ＩＩいず
れもｐ　ＩＩ３．０〜１１．０の範囲である。

５、　作用温度範囲及び作用至適温度 ＫＣ−Ｉ及びＫＣ−ＩＩは１０℃から６０℃の広い範囲
で作用するが、作用至適温度は４５℃にδ忍められる。

６、　熱安定性 ＫＣ−Ｉ、ＫＣ−ＩＩいずれも、クエン酸緩衝液（ｐ］
］５）の下で、各温度で１０分間加熱処理した場合、５
０℃以下で殆ど失活せず、５５℃で約５０％の残存活性
を有するが、６０℃ではほぼ完全に失活する。

７、　分子量 バイオゲル　Ｐ−１００（バイオ・ラド社製）を用いた
ゲル濾過法により約３９０００±３０００、ドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｓ
Ｏ８−ＰＡＧＢ）により約４２０００±３０００と推定
される（ＫＣ−Ｉ及びＫＣ−ＩＩ　）。

８、　ＵＶ吸収スペクトル ＫＣ−ＩとＫＣ−ＩＩの１ｖ吸収スペクトルはいずれも
約２８０　ｎｍに最大吸収を示し、また、約２９０ｎｍ
に肩吸収の存在が認められる。

９、　金属による影響（ＫＣ−Ｉ　） 酵素反応液中に各種の金属イオンを共存させた場合、水
、銀イオン（１ｍＭ）による酵素活性の阻害が認められ
る。一方、酵素活性はコバルトイオン（１ｍＭ）によっ
て若干活性化される。第２表に示した他の金属イオンは
１ｍＭ（ナトリウム、カリウムは５０ｒｎＭ）の濃度で
酵素活性に殆ど影響しない。

１０、　　各種薬剤の影響（ＫＣ−Ｉ及びＫＣ−ＩＩ　
）３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰ
Ｓ）−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）中でＮブ
ロモコハク酸イミド（１ｍＭ）による処理（３０℃、２
０分間）を行った場合、酵素の失活が認められる。第３
表に示した他の薬剤（１ｍＭ）は同条件下で活性に殆ど
影響しない。

【図面の簡単な説明】

第１図はセルラーゼのアミノ酸配列を示す図面である。 第２図はセルラーゼ遺伝子を含む約３．　ＩＫｂのＤＮ
Ａ断片の制限地図である。太線部分にアルカリセルラー
ゼ遺伝子が含まれる。 第３図はセルラーゼ遺伝子を含む約３．　ＩＫｂの断片
のヌクレオチド配列である。 第４図は組換えプラスミドρＫ［ｌ：３３０の制限地図
であり、細線部分はベクターｐＢ［１３２２由来、太線
部分はバチルス　エスピーＫＳＭ−３３０株由来のＤＮ
Ａ断片を示している。 第５図はプラスミドｐＫｃ３３０由来の約３．　ＩＫｂ
の５ ｆｌｉｎｄＩ［［断片をプローブとしたサザンハイブリ
ダイゼーション実験の結果である。 第６図はＨＢＩＯＩ　（ｐＫｃ３３０）株が菌体内に生
産するアルカリセルラーゼの作用ｐ）Ｉ範囲及び最適作
用ｐＨを示すグラフである。・はＨＢＩＯＩ　（ｐＫｃ
３３０）由来のセルラーゼ、○はバチルス　エスピーＫ
ＳＭ−３３０ｍ由来のセルラーゼ（粗酵素）、△はＫＣ
Ｉ、ムはＫＣｎのデーターである。 以上 ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図に示すアミノ酸配列を有するセルラーゼをコ
   ードするＤＮＡ断片。 ２、請求項１記載のアミノ酸配列の一部の領域が欠失し
   た配列を有するセルラーゼをコードするＤＮＡ断片。 ３、欠失したアミノ酸配列の領域がアミノ酸番号１〜５
   ５までの領域である請求項２記載のＤＮＡ断片。 ４、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミノ酸配列
   を分子内の一部に含むセルラーゼをコードするＤＮＡ断
   片。 ５、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアミノ酸配列
   に対して、アミノ酸の置換、欠失、逆位、及び挿入など
   によって関連づけられており、且つセルラーゼ活性を有
   する蛋白をコードする天然、合成、或いは半合成のＤＮ
   Ａ断片。 ６、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片が
   、遺伝子の発現調節の為のＤＮＡ配列を含有することを
   特徴とするＤＮＡ断片。 ７、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片を
   分子内に含むことを特徴とするＤＮＡ分子。 ８、請求項７記載のＤＮＡ分子を含有する微生物。