JPH09140388A - イノシトール立体異性体の製造方法 - Google Patents
イノシトール立体異性体の製造方法Info
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- JPH09140388A JPH09140388A JP32250595A JP32250595A JPH09140388A JP H09140388 A JPH09140388 A JP H09140388A JP 32250595 A JP32250595 A JP 32250595A JP 32250595 A JP32250595 A JP 32250595A JP H09140388 A JPH09140388 A JP H09140388A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ミオ−イノシトールを原料とし効率的にイノ
シトール異性体を得る製造方法を提供する。 【解決手段】 アグロバクテリウム属に属する微生物を
ミオ−イノシトールを含有する培地で培養して培養液中
にイノシトール立体異性体を生成させるか、又はこの培
養液より得たアグロバクテリウム属に属する微生物の菌
体または菌体処理物をミオ−イノシトールに作用させて
イノシトール立体異性体を生成させる製造方法。
シトール異性体を得る製造方法を提供する。 【解決手段】 アグロバクテリウム属に属する微生物を
ミオ−イノシトールを含有する培地で培養して培養液中
にイノシトール立体異性体を生成させるか、又はこの培
養液より得たアグロバクテリウム属に属する微生物の菌
体または菌体処理物をミオ−イノシトールに作用させて
イノシトール立体異性体を生成させる製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はアグロバクテリウム
属微生物を利用し、安価なミオ−イノシトール（myo-in
ositol）を原料として、付加価値の高いＤ−キロ−イノ
シトール（D-chiro-inositol）、Ｌ−キロ−イノシトー
ル（L-chiro-inositol）、シロ−イノシトール（scyllo
-inositol）、ネオ−イノシトール（neo-inositol）
（以下、これらを単に「イノシトール立体異性体」とい
う。）等のイノシトール立体異性体を製造する方法に関
する。
属微生物を利用し、安価なミオ−イノシトール（myo-in
ositol）を原料として、付加価値の高いＤ−キロ−イノ
シトール（D-chiro-inositol）、Ｌ−キロ−イノシトー
ル（L-chiro-inositol）、シロ−イノシトール（scyllo
-inositol）、ネオ−イノシトール（neo-inositol）
（以下、これらを単に「イノシトール立体異性体」とい
う。）等のイノシトール立体異性体を製造する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】イノシトールの立体異性体の生理作用に
ついてはいくつか知られている。例えば、Ｄ−キロ−イ
ノシトールは、インシュリン非依存性糖尿病の治療薬又
は予防薬として注目されている〔ダイアベイテス フロ
ンティア（Diabetes Frontier）第４巻，第６３７頁〜
第６３８頁，１９９３年〕。また、Ｌ−キロ−イノシト
ールは生体内における情報伝達作用に有用であることが
知られている〔バイオケミストリー（Biochemistry）第
３３巻，第８３６７頁〜第８３７４頁，１９９４年〕。
さらに、シロ−イノシトールは、脳肝症患者の脳中での
減少が報告され、発症との相関が注目されている〔ライ
フサイエンス（Life Sciences）第５４巻，第１５０７
頁〜第１５１２頁，１９９４年〕。また、Ｄ−キロ−イ
ノシトール、シロ−イノシトールは研究用試薬として使
用されている。
ついてはいくつか知られている。例えば、Ｄ−キロ−イ
ノシトールは、インシュリン非依存性糖尿病の治療薬又
は予防薬として注目されている〔ダイアベイテス フロ
ンティア（Diabetes Frontier）第４巻，第６３７頁〜
第６３８頁，１９９３年〕。また、Ｌ−キロ−イノシト
ールは生体内における情報伝達作用に有用であることが
知られている〔バイオケミストリー（Biochemistry）第
３３巻，第８３６７頁〜第８３７４頁，１９９４年〕。
さらに、シロ−イノシトールは、脳肝症患者の脳中での
減少が報告され、発症との相関が注目されている〔ライ
フサイエンス（Life Sciences）第５４巻，第１５０７
頁〜第１５１２頁，１９９４年〕。また、Ｄ−キロ−イ
ノシトール、シロ−イノシトールは研究用試薬として使
用されている。
【０００３】一方、Ｄ−キロ−イノシトールを得る方法
としては次の（ａ）〜（ｇ）などが知られている。 (ａ) ブーゲンビリアやサトウマツ（Sugar pine）、ア
メリカ杉等の植物から、これに含まれているピニトール
（pinitol）を適当な溶媒で抽出し、次にヨウ化水素酸
等で脱メチル化してＤ−キロ−イノシトールを得る方
法。 (ｂ) 大豆や白つめくさ等に微量含まれているＤ−キロ
−イノシトールを抽出精製する方法〔ジャーナル オブ
アグリカルチャー アンド フード ケミストリー (J. Ag
ric. Food Chem.）第３２巻, 第１２８９頁〜第１２９
１頁, １９８４年〕。
としては次の（ａ）〜（ｇ）などが知られている。 (ａ) ブーゲンビリアやサトウマツ（Sugar pine）、ア
メリカ杉等の植物から、これに含まれているピニトール
（pinitol）を適当な溶媒で抽出し、次にヨウ化水素酸
等で脱メチル化してＤ−キロ−イノシトールを得る方
法。 (ｂ) 大豆や白つめくさ等に微量含まれているＤ−キロ
−イノシトールを抽出精製する方法〔ジャーナル オブ
アグリカルチャー アンド フード ケミストリー (J. Ag
ric. Food Chem.）第３２巻, 第１２８９頁〜第１２９
１頁, １９８４年〕。
【０００４】(ｃ) クロレラの培養細胞を用いてミオ−
イノシトールをＤ−キロ−イノシトールへ変換する方法
〔モナシェフテ フュール ケミ−（Monatsh. Chem.）第
１０２巻, 第４５９頁〜第４６４頁, １９７１年〕。 (ｄ) ネズミ由来の細胞を用いてミオ−イノシトールか
らＤ−キロ−イノシトールへ変換する方法〔ザ ジャー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Ch
em.）第２６７巻, 第１６９０４頁〜第１６９１０頁,
１９９２年〕。
イノシトールをＤ−キロ−イノシトールへ変換する方法
〔モナシェフテ フュール ケミ−（Monatsh. Chem.）第
１０２巻, 第４５９頁〜第４６４頁, １９７１年〕。 (ｄ) ネズミ由来の細胞を用いてミオ−イノシトールか
らＤ−キロ−イノシトールへ変換する方法〔ザ ジャー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Ch
em.）第２６７巻, 第１６９０４頁〜第１６９１０頁,
１９９２年〕。
【０００５】(ｅ) カスガマイシンを強酸で加水分解し
て、その構成糖であるＤ−キロ−イノシトールを得る方
法（米国特許第５,０９１,５９６号明細書）。 (ｆ) 出発原料として１−クロロ−２,３−ジヒドロキ
シ−４,６−（１−クロロ−２,３−ジヒドロキシシクロ
ヘキサ−４,６−ジエン）を用い、Ｄ−キロ−イノシト
ールを合成する方法〔ジャーナル オブ オーガニック
ケミストリー（J.Org. Chem.）第５８巻, 第２３３１頁
〜第２３３３頁, １９９３年〕。 (ｇ) 出発原料としてハロゲノベンゼンを用い、数段階
の反応を経てＤ−キロ−イノシトールを得る方法〔ジャ
ーナル オブ ザ ケミカル ソサイアティ パーキン トラ
ンザクションズ (J. Chem. Soc. Perkin Transactions
1）第７４１頁〜７４３頁, １９９３年〕等がある。
て、その構成糖であるＤ−キロ−イノシトールを得る方
法（米国特許第５,０９１,５９６号明細書）。 (ｆ) 出発原料として１−クロロ−２,３−ジヒドロキ
シ−４,６−（１−クロロ−２,３−ジヒドロキシシクロ
ヘキサ−４,６−ジエン）を用い、Ｄ−キロ−イノシト
ールを合成する方法〔ジャーナル オブ オーガニック
ケミストリー（J.Org. Chem.）第５８巻, 第２３３１頁
〜第２３３３頁, １９９３年〕。 (ｇ) 出発原料としてハロゲノベンゼンを用い、数段階
の反応を経てＤ−キロ−イノシトールを得る方法〔ジャ
ーナル オブ ザ ケミカル ソサイアティ パーキン トラ
ンザクションズ (J. Chem. Soc. Perkin Transactions
1）第７４１頁〜７４３頁, １９９３年〕等がある。
【０００６】また、Ｌ−キロ−イノシトールを得る方法
としては次の（ｈ）、（ｉ）の方法が知られている。 (ｈ) 天然ゴム中に含まれているケブラチトール（Ｌ−
キロ−イノシトールのモノメチルエーテル体）を酸処理
により脱メチル化し、Ｌ−キロ−イノシトールを得る方
法。 (ｉ) 微生物は特定されていないが、土壌微生物により
ミオ−イノシトールからＬ−キロ−イノシトールに変換
する方法〔ソイル サイエンス ソサイアティーオブ ア
メリカ ジャーナル (Soil Sci. Soc. AM. J.）第４１
巻, 第７３３〜第７３６頁, １９７７年〕。
としては次の（ｈ）、（ｉ）の方法が知られている。 (ｈ) 天然ゴム中に含まれているケブラチトール（Ｌ−
キロ−イノシトールのモノメチルエーテル体）を酸処理
により脱メチル化し、Ｌ−キロ−イノシトールを得る方
法。 (ｉ) 微生物は特定されていないが、土壌微生物により
ミオ−イノシトールからＬ−キロ−イノシトールに変換
する方法〔ソイル サイエンス ソサイアティーオブ ア
メリカ ジャーナル (Soil Sci. Soc. AM. J.）第４１
巻, 第７３３〜第７３６頁, １９７７年〕。
【０００７】さらに、シロ−イノシトールを得る方法と
しては次の（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）などがある。 (ｊ) ウラジロガシ（Quercus stenophylla）等に含ま
れているシロ−イノシトールを抽出精製する方法〔薬学
雑誌, 第８９巻, 第１３０２頁〜第１３０５頁, １９６
９年〕。 (ｋ) ミオ−イノシトールを原料に４段階の反応により
化学合成する方法〔西ドイツ特許公開第３,４０５,６６
３号公報〕。 (ｌ) ミオ−イノシトールを原料に２段階の反応により
化学合成する方法〔リービッヒ アナーレン デール ケ
ミー（Liebigs Ann. Chem.）第８６６頁〜第８６８頁,
１９８５年〕。
しては次の（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）などがある。 (ｊ) ウラジロガシ（Quercus stenophylla）等に含ま
れているシロ−イノシトールを抽出精製する方法〔薬学
雑誌, 第８９巻, 第１３０２頁〜第１３０５頁, １９６
９年〕。 (ｋ) ミオ−イノシトールを原料に４段階の反応により
化学合成する方法〔西ドイツ特許公開第３,４０５,６６
３号公報〕。 (ｌ) ミオ−イノシトールを原料に２段階の反応により
化学合成する方法〔リービッヒ アナーレン デール ケ
ミー（Liebigs Ann. Chem.）第８６６頁〜第８６８頁,
１９８５年〕。
【０００８】また、イノシトール立体異性体が混合物と
して得られる方法としては次の(ｍ)、（ｎ）、（ｏ）な
どが知られている。 (ｍ) ミオ−イノシトールにラネイニッケルを触媒とし
て作用させ、立体異性体のシロ−イノシトール、キロ−
イノシトール、ネオ−イノシトール、ムコ−イノシトー
ル、アロ−イノシトール、エピ−イノシトールを得る方
法〔カーボハイドレイト リサーチ（Carbohydrate Rese
arch）第１６６巻, 第１７１頁〜第１８０頁, １９８７
年〕。 (ｎ) ゴキブリの脂肪体を用い、ミオ−イノシトールか
らＤ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトール、エピ
−イノシトール、ネオ−イノシトールへ変換する方法
〔バイオケミストリー（Biochemistry）第１２巻, 第４
７０５頁〜第４７１２頁, １９７３年〕。
して得られる方法としては次の(ｍ)、（ｎ）、（ｏ）な
どが知られている。 (ｍ) ミオ−イノシトールにラネイニッケルを触媒とし
て作用させ、立体異性体のシロ−イノシトール、キロ−
イノシトール、ネオ−イノシトール、ムコ−イノシトー
ル、アロ−イノシトール、エピ−イノシトールを得る方
法〔カーボハイドレイト リサーチ（Carbohydrate Rese
arch）第１６６巻, 第１７１頁〜第１８０頁, １９８７
年〕。 (ｎ) ゴキブリの脂肪体を用い、ミオ−イノシトールか
らＤ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトール、エピ
−イノシトール、ネオ−イノシトールへ変換する方法
〔バイオケミストリー（Biochemistry）第１２巻, 第４
７０５頁〜第４７１２頁, １９７３年〕。
【０００９】(ｏ) 牛の脳細胞より抽出した粗酵素液を
用い、ミオ−イノシトールからシロ−イノシトールおよ
びネオ−イノシトールへ変換する方法〔バイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーショ
ンズ (Biochemical and Biophysical Research Communi
cations）第７７巻, 第３４０頁〜第３４６頁, １９７
７年〕。 しかしながら、アグロバクテリウム属の微生物を用い、
ミオ−イノシトールを原料とし、Ｄ−キロ−イノシトー
ル、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトールおよ
びネオ−イノシトールを製造する方法については知られ
ていない。
用い、ミオ−イノシトールからシロ−イノシトールおよ
びネオ−イノシトールへ変換する方法〔バイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーショ
ンズ (Biochemical and Biophysical Research Communi
cations）第７７巻, 第３４０頁〜第３４６頁, １９７
７年〕。 しかしながら、アグロバクテリウム属の微生物を用い、
ミオ−イノシトールを原料とし、Ｄ−キロ−イノシトー
ル、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトールおよ
びネオ−イノシトールを製造する方法については知られ
ていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】前記の（ａ）から
（ｏ）のイノシトール立体異性体を製造する方法は、い
ずれも工業的規模で製造する方法としては必ずしも満足
しうるものではない。すなわち、植物からＤ−キロ−イ
ノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシト
ールを抽出する前述の（ａ）、（ｂ）、（ｈ）、（ｊ）
の方法は、植物体中における含有量が少ないため、抽出
と精製が困難であり、収率も低い。また、前記（ｃ）、
（ｄ）、（ｊ）、（ｎ）、（ｏ）に記載のクロレラ、ネ
ズミの細胞、土壌微生物、ゴキブリの脂肪体細胞、牛の
脳細胞などを用いてＤ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ
−イノシトール、シロ−イノシトール、ネオ−イノシト
ール、エピ−イノシトールなどを得る方法では、放射標
識した物質を検出する程度の反応であるため、収率が低
い。
（ｏ）のイノシトール立体異性体を製造する方法は、い
ずれも工業的規模で製造する方法としては必ずしも満足
しうるものではない。すなわち、植物からＤ−キロ−イ
ノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシト
ールを抽出する前述の（ａ）、（ｂ）、（ｈ）、（ｊ）
の方法は、植物体中における含有量が少ないため、抽出
と精製が困難であり、収率も低い。また、前記（ｃ）、
（ｄ）、（ｊ）、（ｎ）、（ｏ）に記載のクロレラ、ネ
ズミの細胞、土壌微生物、ゴキブリの脂肪体細胞、牛の
脳細胞などを用いてＤ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ
−イノシトール、シロ−イノシトール、ネオ−イノシト
ール、エピ−イノシトールなどを得る方法では、放射標
識した物質を検出する程度の反応であるため、収率が低
い。
【００１１】前記（ｅ）に記載のカスガマイシンを強酸
で加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法で
は、精製工程が煩雑である。また、前記（ｆ）、（ｇ）
に記載のＤ−キロ−イノシトールを化学合成する方法
は、立体特異的な合成が必要とされるため、反応収率が
低い。さらに、前記（ｋ）に記載のミオ−イノシトール
からシロ−イノシトールを化学合成する方法は、操作が
煩雑であり収率も低い。また、（ｌ）に記載の方法は酸
化白金を触媒として用いるので、コストの面で問題があ
る。
で加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法で
は、精製工程が煩雑である。また、前記（ｆ）、（ｇ）
に記載のＤ−キロ−イノシトールを化学合成する方法
は、立体特異的な合成が必要とされるため、反応収率が
低い。さらに、前記（ｋ）に記載のミオ−イノシトール
からシロ−イノシトールを化学合成する方法は、操作が
煩雑であり収率も低い。また、（ｌ）に記載の方法は酸
化白金を触媒として用いるので、コストの面で問題があ
る。
【００１２】また、前記（ｍ）に記載のラネイニッケル
を触媒として用い、シロ−イノシトール、キロ−イノシ
トール、ネオ−イノシトール、ムコ−イノシトール、ア
ロ−イノシトール、エピ−イノシトールを得る方法は、
１００℃で反応するため、加熱操作が必要であり副反応
が伴うこと、および反応液中に多成分のイノシトールが
同時に生成されるため、各成分の分離が困難であり、収
率も低い。本発明の目的は、従来法に比べて安価に、か
つ簡単な操作で効率よくＤ−キロ−イノシトール、Ｌ−
キロ−イノシトール、シロ−イノシトールおよびネオ−
イノシトールを得る製造方法を提供することにある。
を触媒として用い、シロ−イノシトール、キロ−イノシ
トール、ネオ−イノシトール、ムコ−イノシトール、ア
ロ−イノシトール、エピ−イノシトールを得る方法は、
１００℃で反応するため、加熱操作が必要であり副反応
が伴うこと、および反応液中に多成分のイノシトールが
同時に生成されるため、各成分の分離が困難であり、収
率も低い。本発明の目的は、従来法に比べて安価に、か
つ簡単な操作で効率よくＤ−キロ−イノシトール、Ｌ−
キロ−イノシトール、シロ−イノシトールおよびネオ−
イノシトールを得る製造方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意検討を重ねた。その結果、アグ
ロバクテリウム属に属する微生物をミオ−イノシトール
を含有する培地で培養すると、培養液中にＤ−キロ−イ
ノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシト
ールおよびネオ−イノシトールが効率よく生成するこ
と、また、この培養液より得たアグロバクテリウム属に
属する微生物の菌体または菌体処理物をミオ−イノシト
ールに作用させると、Ｄ−およびＬ−キロ−イノシトー
ル、シロ−イノシトールおよびネオ−イノシトールが簡
単な操作で効率よく生成することを見いだした。すなわ
ち、第１の本発明の要旨とするところは、アグロバクテ
リウム属に属する微生物をミオ−イノシトールを含有す
る液体培地で培養し、培地中にイノシトール立体異性体
を生成蓄積させることを特徴とする、イノシトール立体
異性体の製造方法にある。
的を達成するために鋭意検討を重ねた。その結果、アグ
ロバクテリウム属に属する微生物をミオ−イノシトール
を含有する培地で培養すると、培養液中にＤ−キロ−イ
ノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシト
ールおよびネオ−イノシトールが効率よく生成するこ
と、また、この培養液より得たアグロバクテリウム属に
属する微生物の菌体または菌体処理物をミオ−イノシト
ールに作用させると、Ｄ−およびＬ−キロ−イノシトー
ル、シロ−イノシトールおよびネオ−イノシトールが簡
単な操作で効率よく生成することを見いだした。すなわ
ち、第１の本発明の要旨とするところは、アグロバクテ
リウム属に属する微生物をミオ−イノシトールを含有す
る液体培地で培養し、培地中にイノシトール立体異性体
を生成蓄積させることを特徴とする、イノシトール立体
異性体の製造方法にある。
【００１４】また、第２の本発明の要旨とするところ
は、アグロバクテリウム属に属する微生物をミオ−イノ
シトールを含有する液体培地であらかじめ培養し、該培
養液から分離した菌体を液体培地又は緩衝液中でミオ−
イノシトールに作用させてイノシトール立体異性体を生
成蓄積させることを特徴とする、イノシトール立体異性
体の製造方法にある。さらに、第３の本発明の要旨とす
るところは、アグロバクテリウム属に属する微生物をミ
オ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、該培養
液から分離した菌体の菌体処理物を緩衝液中でミオ−イ
ノシトールに作用させてイノシトール立体異性体を生成
蓄積させることを特徴とする、イノシトール立体異性体
の製造方法にある。
は、アグロバクテリウム属に属する微生物をミオ−イノ
シトールを含有する液体培地であらかじめ培養し、該培
養液から分離した菌体を液体培地又は緩衝液中でミオ−
イノシトールに作用させてイノシトール立体異性体を生
成蓄積させることを特徴とする、イノシトール立体異性
体の製造方法にある。さらに、第３の本発明の要旨とす
るところは、アグロバクテリウム属に属する微生物をミ
オ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、該培養
液から分離した菌体の菌体処理物を緩衝液中でミオ−イ
ノシトールに作用させてイノシトール立体異性体を生成
蓄積させることを特徴とする、イノシトール立体異性体
の製造方法にある。
【００１５】
【発明の実施の形態】次に、本発明によるイノシトール
立体異性体の製造方法について具体的に説明する。本発
明の製造方法の原料であるミオ−イノシトールは動植物
及び微生物に広く分布している。特に、穀物中に六燐酸
エステルのＣａ、Ｍｇ塩であるフィチン酸として多量に
存在しており、公知の方法により米糠等をアルカリ加水
分解し、精製して得られる。
立体異性体の製造方法について具体的に説明する。本発
明の製造方法の原料であるミオ−イノシトールは動植物
及び微生物に広く分布している。特に、穀物中に六燐酸
エステルのＣａ、Ｍｇ塩であるフィチン酸として多量に
存在しており、公知の方法により米糠等をアルカリ加水
分解し、精製して得られる。
【００１６】本発明において使用する微生物は、アグロ
バクテリウム属に属し、ミオ−イノシトールをミオ−イ
ノシトール以外のイノシトール立体異性体に変換する能
力を有する微生物であればいずれの菌株でもよい。具体
的に例示すると、アグロバクテリウム・ツメファシエン
ス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウ
ム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter)、ア
グロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizog
enes)、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rub
i）など（以下、特に、ことわりのないかぎり「アグロ
バクテリウム」という。）があり、これらはＡＴＣＣ
（アメリカン タイプ カルチャー コレクション）、Ｉ
ＦＯ（(財)発酵研究所）、ＩＡＭ（(財)応用微生物研究
奨励会）などより入手できる。アグロバクテリウム属細
菌のある菌株は、植物に根頭癌腫病や毛根病を起こすこ
とが知られているが、同属には植物病原性がない菌株も
多く、バラの根頭癌腫病に対する拮抗微生物として培養
細菌が農業用に利用されている例もある。また、植物以
外への病原性は知られておらず、特に、人間を含めて動
物に対しては無害で安全性の高い微生物群である。
バクテリウム属に属し、ミオ−イノシトールをミオ−イ
ノシトール以外のイノシトール立体異性体に変換する能
力を有する微生物であればいずれの菌株でもよい。具体
的に例示すると、アグロバクテリウム・ツメファシエン
ス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウ
ム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter)、ア
グロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizog
enes)、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rub
i）など（以下、特に、ことわりのないかぎり「アグロ
バクテリウム」という。）があり、これらはＡＴＣＣ
（アメリカン タイプ カルチャー コレクション）、Ｉ
ＦＯ（(財)発酵研究所）、ＩＡＭ（(財)応用微生物研究
奨励会）などより入手できる。アグロバクテリウム属細
菌のある菌株は、植物に根頭癌腫病や毛根病を起こすこ
とが知られているが、同属には植物病原性がない菌株も
多く、バラの根頭癌腫病に対する拮抗微生物として培養
細菌が農業用に利用されている例もある。また、植物以
外への病原性は知られておらず、特に、人間を含めて動
物に対しては無害で安全性の高い微生物群である。
【００１７】本発明の製造方法は３つの方法に分けるこ
とができる。それらを製造方法(Ａ)、（Ｂ）、（Ｃ）と
して順次説明する。 製造方法（Ａ） ミオ−イノシトールを含む液体培地にアグロバクテリウ
ム属に属する微生物を接種して好気的に培養することに
より、イノシトール立体異性体を生成蓄積させることが
できる。液体培地は、目的を達する限り何等特別の制限
はなく、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含
有する培地であればよく、合成培地・天然培地のいずれ
も使用できる。炭素源としてはミオ−イノシトールを
０.１〜１.５％、好ましくは０.２〜０.８％添加し、窒
素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝
酸アンモニウムあるいは尿素等を０.０１〜１.０％、好
ましくは０.０５〜０.５％添加するのが望ましい。有機
栄養源としては酵母エキス、カザミノ酸等を極微量
（０.００５〜０.０５％程度）添加すると、菌株によっ
ては有効な場合がある。そのほか必要に応じ、ナトリウ
ム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、
マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸等
のイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添
加することが有効である。培養液の水素イオン濃度はpH
６〜１０、好ましくはpH７〜９に調製し培養すると、効
率よくイノシトール立体異性体を得ることができる。
とができる。それらを製造方法(Ａ)、（Ｂ）、（Ｃ）と
して順次説明する。 製造方法（Ａ） ミオ−イノシトールを含む液体培地にアグロバクテリウ
ム属に属する微生物を接種して好気的に培養することに
より、イノシトール立体異性体を生成蓄積させることが
できる。液体培地は、目的を達する限り何等特別の制限
はなく、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含
有する培地であればよく、合成培地・天然培地のいずれ
も使用できる。炭素源としてはミオ−イノシトールを
０.１〜１.５％、好ましくは０.２〜０.８％添加し、窒
素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝
酸アンモニウムあるいは尿素等を０.０１〜１.０％、好
ましくは０.０５〜０.５％添加するのが望ましい。有機
栄養源としては酵母エキス、カザミノ酸等を極微量
（０.００５〜０.０５％程度）添加すると、菌株によっ
ては有効な場合がある。そのほか必要に応じ、ナトリウ
ム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、
マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸等
のイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添
加することが有効である。培養液の水素イオン濃度はpH
６〜１０、好ましくはpH７〜９に調製し培養すると、効
率よくイノシトール立体異性体を得ることができる。
【００１８】培養条件としては菌株や培地の種類によっ
ても異なるが、培養温度は１５〜４０℃、好ましくは２
０〜３５℃である。培養期間は通常１〜７日、好ましく
は２〜５日である。また、培養は液体培地を振盪した
り、液体培地中に空気を吹き込むなどして好気的に行え
ばよい。培養液から目的物を採取する方法は、通常の水
溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用するこ
とができる。すなわち、培養液を活性炭やイオン交換樹
脂などで処理することにより、イノシトール立体異性体
以外の不純物のほとんどを除くことができる。その後、
イオン交換樹脂のカラムクロマトグラフィーを用いる方
法や溶液に対する溶解性の差を用いて分離する方法及び
再結晶法などの方法を適宜組み合わせて用いることによ
り、目的物を単離することができる。
ても異なるが、培養温度は１５〜４０℃、好ましくは２
０〜３５℃である。培養期間は通常１〜７日、好ましく
は２〜５日である。また、培養は液体培地を振盪した
り、液体培地中に空気を吹き込むなどして好気的に行え
ばよい。培養液から目的物を採取する方法は、通常の水
溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用するこ
とができる。すなわち、培養液を活性炭やイオン交換樹
脂などで処理することにより、イノシトール立体異性体
以外の不純物のほとんどを除くことができる。その後、
イオン交換樹脂のカラムクロマトグラフィーを用いる方
法や溶液に対する溶解性の差を用いて分離する方法及び
再結晶法などの方法を適宜組み合わせて用いることによ
り、目的物を単離することができる。
【００１９】カラムクロマトグラフィーを用いる方法と
しては、カーボハイドレイト リサーチ（Carbohydrate
Research）第１６６巻，第１７１頁〜第１８０頁（１９
８７年）やジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサ
イアティー（J. Am. Chem.Soc.）第７３巻，第２３９９
頁〜第２３４０頁（１９５１年）に記載されている強塩
基性イオン交換樹脂をホウ酸型にしてカラムにつめ、ホ
ウ酸の濃度を徐々に高めて流すことにより、イノシトー
ル立体異性体の各成分を分離する方法が有効である。こ
のカラムを用いて、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イ
ノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシト
ール及びネオ−イノシトールの混合物をカラムに供する
と、シロ−イノシトールは樹脂に保持されることなくカ
ラムを素通りし、他のイノシトール立体異性体は、０.
５Ｍ程度のホウ酸溶液を流すと、まずミオ−イノシトー
ルが溶出し、続いてＤ−キロ−イノシトールとＬ−キロ
−イノシトールが同時に溶出し、その後ネオ−イノシト
ールが溶出する。また、強塩基性イオン交換樹脂を（Ｏ
Ｈ-型）にしてカラムにつめ、イオン交換水を流して分
離する方法もイノシトールの分離に有効な方法である。
例えば、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトー
ル、Ｌ−キロ−イノシトール、ネオ−イノシトール混合
濃縮液を本方法のカラムに供すると、まず、ミオ−イノ
シトールとネオ−イノシトールがほとんど同時に溶出
し、ついで、Ｄ−キロ−イノシトールとＬ−キロ−イノ
シトールが同時に溶出する。さらに、フルクトースとグ
ルコースを工業的規模で分離する方法として知られてい
る、強酸性イオン交換樹脂（カルシウム型）をカラムに
つめ、水で展開して分離する方法も、前述と同様のイノ
シトール混合物の分離に有効である。すなわち、ミオ−
イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イ
ノシトール、ネオ−イノシトール混合濃縮液をこのカラ
ムで展開すると、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノ
シトール、Ｌ−キロ−イノシトールがほとんど同時に溶
出し、その後遅れてネオ−イノシトールが溶出する。こ
のようにしてカラムクロマトグラフィーで得られる溶出
液を任意に分画し、カラムクロマトグラフィーを幾度か
繰り返すか、又は組み合わせることにより、純粋な物質
を得ることができる。
しては、カーボハイドレイト リサーチ（Carbohydrate
Research）第１６６巻，第１７１頁〜第１８０頁（１９
８７年）やジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサ
イアティー（J. Am. Chem.Soc.）第７３巻，第２３９９
頁〜第２３４０頁（１９５１年）に記載されている強塩
基性イオン交換樹脂をホウ酸型にしてカラムにつめ、ホ
ウ酸の濃度を徐々に高めて流すことにより、イノシトー
ル立体異性体の各成分を分離する方法が有効である。こ
のカラムを用いて、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イ
ノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシト
ール及びネオ−イノシトールの混合物をカラムに供する
と、シロ−イノシトールは樹脂に保持されることなくカ
ラムを素通りし、他のイノシトール立体異性体は、０.
５Ｍ程度のホウ酸溶液を流すと、まずミオ−イノシトー
ルが溶出し、続いてＤ−キロ−イノシトールとＬ−キロ
−イノシトールが同時に溶出し、その後ネオ−イノシト
ールが溶出する。また、強塩基性イオン交換樹脂を（Ｏ
Ｈ-型）にしてカラムにつめ、イオン交換水を流して分
離する方法もイノシトールの分離に有効な方法である。
例えば、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトー
ル、Ｌ−キロ−イノシトール、ネオ−イノシトール混合
濃縮液を本方法のカラムに供すると、まず、ミオ−イノ
シトールとネオ−イノシトールがほとんど同時に溶出
し、ついで、Ｄ−キロ−イノシトールとＬ−キロ−イノ
シトールが同時に溶出する。さらに、フルクトースとグ
ルコースを工業的規模で分離する方法として知られてい
る、強酸性イオン交換樹脂（カルシウム型）をカラムに
つめ、水で展開して分離する方法も、前述と同様のイノ
シトール混合物の分離に有効である。すなわち、ミオ−
イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イ
ノシトール、ネオ−イノシトール混合濃縮液をこのカラ
ムで展開すると、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノ
シトール、Ｌ−キロ−イノシトールがほとんど同時に溶
出し、その後遅れてネオ−イノシトールが溶出する。こ
のようにしてカラムクロマトグラフィーで得られる溶出
液を任意に分画し、カラムクロマトグラフィーを幾度か
繰り返すか、又は組み合わせることにより、純粋な物質
を得ることができる。
【００２０】一方、溶液に対する溶解度の差を利用して
分離する方法としては、イノシトール立体異性体の水や
低級アルコールに対する溶解性の差を利用して、分離す
ることができる。例えば、シロ−イノシトールとネオ−
イノシトールは、水に対する溶解性が他のイノシトール
と比べて低いので、これらの物質が他のイノシトール立
体異性体と混在している分画においては、溶解しやすい
イノシトール立体異性体を最少必要量の水を加えて溶解
して、溶液として除き、シロ−イノシトール又はネオ−
イノシトールを固体として得ることができる。また、低
級アルコールに対する溶解性の差を利用して、Ｄ−キロ
−イノシトールとＬ−キロ−イノシトールの混合物を分
離することができる。すなわち、Ｄ−キロ−イノシトー
ルはＬ−キロ−イノシトールに比べてメタノールに対す
る溶解性が高いので、両者の混合物に適当量のメタノー
ルを加え、Ｄ−キロ−イノシトールを溶解し、Ｌ−キロ
−イノシトールを固体の状態に保ちガラスフィルターな
どで濾別する。この溶解と濾別の操作を数回繰り返すこ
とで純粋な物質を得ることができる。
分離する方法としては、イノシトール立体異性体の水や
低級アルコールに対する溶解性の差を利用して、分離す
ることができる。例えば、シロ−イノシトールとネオ−
イノシトールは、水に対する溶解性が他のイノシトール
と比べて低いので、これらの物質が他のイノシトール立
体異性体と混在している分画においては、溶解しやすい
イノシトール立体異性体を最少必要量の水を加えて溶解
して、溶液として除き、シロ−イノシトール又はネオ−
イノシトールを固体として得ることができる。また、低
級アルコールに対する溶解性の差を利用して、Ｄ−キロ
−イノシトールとＬ−キロ−イノシトールの混合物を分
離することができる。すなわち、Ｄ−キロ−イノシトー
ルはＬ−キロ−イノシトールに比べてメタノールに対す
る溶解性が高いので、両者の混合物に適当量のメタノー
ルを加え、Ｄ−キロ−イノシトールを溶解し、Ｌ−キロ
−イノシトールを固体の状態に保ちガラスフィルターな
どで濾別する。この溶解と濾別の操作を数回繰り返すこ
とで純粋な物質を得ることができる。
【００２１】再結晶法に関しては、イノシトールを水に
溶解し、低級アルコールを任意の量を加えて混合溶媒系
中で容易に結晶化することができる。生じた結晶は、ガ
ラスフィルターや濾紙で母液より分離することができ
る。菌株の種類や培養日数により、生成するイノシトー
ル立体異性体の量及び存在比は異なるが、以上述べた分
離方法を単独あるいは組み合わせて、必要に応じて繰り
返し用いることにより、培養液または反応液からイノシ
トール立体異性体を適宜純粋な物質として単離すること
ができる。製造方法（Ａ）による製造法を実施例１に示
した。
溶解し、低級アルコールを任意の量を加えて混合溶媒系
中で容易に結晶化することができる。生じた結晶は、ガ
ラスフィルターや濾紙で母液より分離することができ
る。菌株の種類や培養日数により、生成するイノシトー
ル立体異性体の量及び存在比は異なるが、以上述べた分
離方法を単独あるいは組み合わせて、必要に応じて繰り
返し用いることにより、培養液または反応液からイノシ
トール立体異性体を適宜純粋な物質として単離すること
ができる。製造方法（Ａ）による製造法を実施例１に示
した。
【００２２】製造方法（Ｂ） 製造方法（Ｂ）は、製造方法（Ａ）により得た培養液か
ら菌体を集め、これを液体培地又は緩衝液中でミオ−イ
ノシトールと反応させることにより、イノシトール立体
異性体を生成させるものである。菌体は、製造方法
（Ａ）により得た培養液を、遠心分離、濾過などにより
集菌したものを用いればよい。また、液体培地は製造方
法（Ａ）と同様のものを用いればよい。緩衝液としては
リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド（Good's）のＣＨ
ＥＳ緩衝液などを１０〜５００mM、好ましくは２０〜１
００mMの濃度で用いればよい。反応条件は、菌株や培
地、緩衝液の種類によって異なるが、反応温度は１５〜
６０℃、好ましくは２５〜５５℃であり、反応時間は１
〜５０時間、好ましくは３〜４８時間であり、液体培地
または緩衝液のpHは６〜１０、好ましくは７〜９であ
る。反応終了後の反応液からの目的物を単離する方法は
製造方法（Ａ）と同様に行えばよい。製造方法（Ｂ）に
よる製造法を実施例２に示した。
ら菌体を集め、これを液体培地又は緩衝液中でミオ−イ
ノシトールと反応させることにより、イノシトール立体
異性体を生成させるものである。菌体は、製造方法
（Ａ）により得た培養液を、遠心分離、濾過などにより
集菌したものを用いればよい。また、液体培地は製造方
法（Ａ）と同様のものを用いればよい。緩衝液としては
リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド（Good's）のＣＨ
ＥＳ緩衝液などを１０〜５００mM、好ましくは２０〜１
００mMの濃度で用いればよい。反応条件は、菌株や培
地、緩衝液の種類によって異なるが、反応温度は１５〜
６０℃、好ましくは２５〜５５℃であり、反応時間は１
〜５０時間、好ましくは３〜４８時間であり、液体培地
または緩衝液のpHは６〜１０、好ましくは７〜９であ
る。反応終了後の反応液からの目的物を単離する方法は
製造方法（Ａ）と同様に行えばよい。製造方法（Ｂ）に
よる製造法を実施例２に示した。
【００２３】製造方法（Ｃ） 製造方法（Ｃ）は製造方法（Ｂ）の菌体を菌体処理物に
代えて反応させる方法である。菌体処理物としては、菌
体を機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処
理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理などをしたも
の、又はこれらより得られる酵素画分、菌体及び菌体処
理物の固定化物などがある。上記の菌体を処理する工程
では緩衝液に還元剤としてメルカプタン、ジチオスレイ
トールなどを添加するのが好ましい。反応条件は、菌株
や緩衝液の種類によって異なるが、反応温度は１５〜６
０℃、好ましくは２５〜４５℃であり、反応時間は１〜
５０時間、好ましくは３〜４８時間であり、緩衝液のpH
は７〜１０である。緩衝液の種類と使用濃度は製造方法
（Ｂ）と同じである。また、緩衝液には補酵素としてβ
−ＮＡＤ+・３Ｈ2Ｏを原料のミオ−イノシトール１ｇに
対して１〜８ｇ、好ましくは２〜５ｇを添加する。反応
終了後の反応液から目的物を単離する方法は製造方法
（Ａ）と同様にして行えばよい。製造方法（Ｃ）による
製造法を実施例３に示した。
代えて反応させる方法である。菌体処理物としては、菌
体を機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処
理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理などをしたも
の、又はこれらより得られる酵素画分、菌体及び菌体処
理物の固定化物などがある。上記の菌体を処理する工程
では緩衝液に還元剤としてメルカプタン、ジチオスレイ
トールなどを添加するのが好ましい。反応条件は、菌株
や緩衝液の種類によって異なるが、反応温度は１５〜６
０℃、好ましくは２５〜４５℃であり、反応時間は１〜
５０時間、好ましくは３〜４８時間であり、緩衝液のpH
は７〜１０である。緩衝液の種類と使用濃度は製造方法
（Ｂ）と同じである。また、緩衝液には補酵素としてβ
−ＮＡＤ+・３Ｈ2Ｏを原料のミオ−イノシトール１ｇに
対して１〜８ｇ、好ましくは２〜５ｇを添加する。反応
終了後の反応液から目的物を単離する方法は製造方法
（Ａ）と同様にして行えばよい。製造方法（Ｃ）による
製造法を実施例３に示した。
【００２４】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 〔実施例１〕 製造方法（Ａ） (１) イノシトール立体異性体の生成 ミオ−イノシトール０.５％（１５ｇ）、(ＮＨ4)2ＳＯ4
０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4０.７％、ＫＨ2ＰＯ4 ０.２％、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０１％および水９８.４９％を
含むpH７の液体培地３０００mlを、１００mlずつ５００
ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレ
ーブ滅菌した。各々の三角フラスコにアグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)
ＩＡＭ １０３７株 (財団法人応用微生物学研究奨励会
より購入）を接種し、２７℃で３日間振盪培養した。培
養液を遠心分離（８０００rpm、１０分間）し、上清を
培養濾液とした。この培養濾液を高速液体クロマトグラ
フィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養濾
液中にはシロ−イノシトール０.８９mg／ml（反応収率
１７.８％）、キロ−イノシトール０.１５mg／ml（反応
収率３.０％）、ネオ−イノシトール０.０２mg／ml（反
応収率０.４％）が生成した。
る。 〔実施例１〕 製造方法（Ａ） (１) イノシトール立体異性体の生成 ミオ−イノシトール０.５％（１５ｇ）、(ＮＨ4)2ＳＯ4
０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4０.７％、ＫＨ2ＰＯ4 ０.２％、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０１％および水９８.４９％を
含むpH７の液体培地３０００mlを、１００mlずつ５００
ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレ
ーブ滅菌した。各々の三角フラスコにアグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)
ＩＡＭ １０３７株 (財団法人応用微生物学研究奨励会
より購入）を接種し、２７℃で３日間振盪培養した。培
養液を遠心分離（８０００rpm、１０分間）し、上清を
培養濾液とした。この培養濾液を高速液体クロマトグラ
フィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養濾
液中にはシロ−イノシトール０.８９mg／ml（反応収率
１７.８％）、キロ−イノシトール０.１５mg／ml（反応
収率３.０％）、ネオ−イノシトール０.０２mg／ml（反
応収率０.４％）が生成した。
【００２５】高速液体クロマトグラフィーの分析条件は
以下のとおりである。カラム Wakosil 5NH2 4.6×250mmカラム温度 ４０℃検出器 RI DETECTOR ERC-7515A (ERMA CR. INC)注入量 ２０μｌ溶 媒 アセトニトリル−水＝８０：２０溶出時間 キロ−イノシトール １０.３３分 ネオ−イノシトール １０.８２分 ミオ−イノシトール １３.４３分 シロ−イノシトール １４.０８分
以下のとおりである。カラム Wakosil 5NH2 4.6×250mmカラム温度 ４０℃検出器 RI DETECTOR ERC-7515A (ERMA CR. INC)注入量 ２０μｌ溶 媒 アセトニトリル−水＝８０：２０溶出時間 キロ−イノシトール １０.３３分 ネオ−イノシトール １０.８２分 ミオ−イノシトール １３.４３分 シロ−イノシトール １４.０８分
【００２６】(２) イノシトール立体異性体の単離 培養濾液を強酸性イオン交換樹脂デュオライト（登録商
標）Ｃ−２０(Ｈ+型）８００mlを充填したカラム（内径
６cm、長さ３０cm）に通過させ、その後このカラムを８
００mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。この溶出
液を、強塩基性イオン交換樹脂デュオライト（登録商
標）Ａ−１１３ ＰＬＵＳ（ＯＨ-型）８００mlを充填し
たカラム（内径６cm、長さ３０cm）に通過させ、その後
このカラムを１２００mlのイオン交換水で洗浄し、溶出
液を得た。このようにして得られた溶出液中にはイノシ
トール立体異性体以外の不純物はほとんど存在していな
かった。この溶液を強塩基性イオン交換樹脂デュオライ
ト（登録商標）Ａ−１１３ＰＬＵＳ（ホウ酸型）３００
mlを充填したカラム（内径３cm、長さ４３cm）に通過さ
せ、イオン交換水６００ml、０.２Ｍホウ酸溶液６００m
l、０.５Ｍホウ酸溶液１５００mlの順で流し、溶出液を
分画した。成分の分析は高速液体クロマトグラフィーで
行った。素通りした画分及びイオン交換水で溶出した画
分を濃縮し、水−エタノール（１：２）の混合溶媒中で
の結晶化により、純粋なシロ−イノシトールを１５１６
mg（収率１０.１％）得た。また、０.５Ｍホウ酸溶液で
の溶出画分にはまずミオ−イノシトールが溶出し、続い
てキロ−イノシトール（Ｄ−体とＬ−体の混合物）が同
時に溶出し、次にネオ−イノシトールが溶出した。分画
したフラクションのうち、キロ−イノシトールとネオ−
イノシトールを多く含む分画を別個に集め、それぞれ減
圧下濃縮した。それぞれ分画濃縮液を、強塩基性イオン
交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００（Ｏ
Ｈ-型）２００mlを充填したカラム（内径１.８cm、長さ
８０cm）に供しイオン交換水で溶出した。次に、この溶
出液を分画したものを集め、これを強酸性イオン交換樹
脂アンバーライト（登録商標）ＣＧ−１２０（カルシウ
ム型）２００mlを充填したカラム（内径１.８cm、長さ
８０cm）に供し、イオン交換水で溶出し、溶出液を分画
した。以上のカラムクロマトグラフィーで、キロ−イノ
シトールを高純度（９５％以上）に含む分画が得られ、
これらを濃縮し、水−エタノール（１：９）の混合溶媒
中で結晶化した。また、ネオ−イノシトールを高純度
（９５％以上）に含む分画を濃縮乾固し、蒸留水１０ml
を加え不純物を溶解し除き、水に対して溶解度の低いネ
オ−イノシトールを、白色結晶として得た。以上の操作
で純粋なキロ−イノシトールを３１５mg（収率２.１
％、比旋光度〔α〕D＋１０°（ｃ＝１.０，Ｈ2Ｏ）、
Ｄ−体とＬ−体の存在比Ｄ：Ｌ＝５８：４２）、ネオ−
イノシトールを２３mg（収率０.２％）単離した。
標）Ｃ−２０(Ｈ+型）８００mlを充填したカラム（内径
６cm、長さ３０cm）に通過させ、その後このカラムを８
００mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。この溶出
液を、強塩基性イオン交換樹脂デュオライト（登録商
標）Ａ−１１３ ＰＬＵＳ（ＯＨ-型）８００mlを充填し
たカラム（内径６cm、長さ３０cm）に通過させ、その後
このカラムを１２００mlのイオン交換水で洗浄し、溶出
液を得た。このようにして得られた溶出液中にはイノシ
トール立体異性体以外の不純物はほとんど存在していな
かった。この溶液を強塩基性イオン交換樹脂デュオライ
ト（登録商標）Ａ−１１３ＰＬＵＳ（ホウ酸型）３００
mlを充填したカラム（内径３cm、長さ４３cm）に通過さ
せ、イオン交換水６００ml、０.２Ｍホウ酸溶液６００m
l、０.５Ｍホウ酸溶液１５００mlの順で流し、溶出液を
分画した。成分の分析は高速液体クロマトグラフィーで
行った。素通りした画分及びイオン交換水で溶出した画
分を濃縮し、水−エタノール（１：２）の混合溶媒中で
の結晶化により、純粋なシロ−イノシトールを１５１６
mg（収率１０.１％）得た。また、０.５Ｍホウ酸溶液で
の溶出画分にはまずミオ−イノシトールが溶出し、続い
てキロ−イノシトール（Ｄ−体とＬ−体の混合物）が同
時に溶出し、次にネオ−イノシトールが溶出した。分画
したフラクションのうち、キロ−イノシトールとネオ−
イノシトールを多く含む分画を別個に集め、それぞれ減
圧下濃縮した。それぞれ分画濃縮液を、強塩基性イオン
交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００（Ｏ
Ｈ-型）２００mlを充填したカラム（内径１.８cm、長さ
８０cm）に供しイオン交換水で溶出した。次に、この溶
出液を分画したものを集め、これを強酸性イオン交換樹
脂アンバーライト（登録商標）ＣＧ−１２０（カルシウ
ム型）２００mlを充填したカラム（内径１.８cm、長さ
８０cm）に供し、イオン交換水で溶出し、溶出液を分画
した。以上のカラムクロマトグラフィーで、キロ−イノ
シトールを高純度（９５％以上）に含む分画が得られ、
これらを濃縮し、水−エタノール（１：９）の混合溶媒
中で結晶化した。また、ネオ−イノシトールを高純度
（９５％以上）に含む分画を濃縮乾固し、蒸留水１０ml
を加え不純物を溶解し除き、水に対して溶解度の低いネ
オ−イノシトールを、白色結晶として得た。以上の操作
で純粋なキロ−イノシトールを３１５mg（収率２.１
％、比旋光度〔α〕D＋１０°（ｃ＝１.０，Ｈ2Ｏ）、
Ｄ−体とＬ−体の存在比Ｄ：Ｌ＝５８：４２）、ネオ−
イノシトールを２３mg（収率０.２％）単離した。
【００２７】〔実施例２〕 製造方法（Ｂ） (１) 菌体の生産 実施例１の培養で得られたアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＩＡＭ １０
３７株の培養液を遠心分離して得られた菌体を、蒸留水
２００mlで洗浄後、再度遠心分離し、洗浄した菌体を得
た。
ァシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＩＡＭ １０
３７株の培養液を遠心分離して得られた菌体を、蒸留水
２００mlで洗浄後、再度遠心分離し、洗浄した菌体を得
た。
【００２８】(２) 異性化反応 上記により得た洗浄した菌体１５ｇを、ミオ−イノシト
ール２.５ｇを含有した０.０５Ｍリン酸緩衝液（pH７.
０）５００ml（ミオ−イノシトール濃度５mg／ml）中に
加え、５０℃、２０時間ゆるやかに撹拌しながら反応さ
せた。反応終了後、反応液を液体クロマトグラフィーに
より分析したところ、シロ−イノシトール１.２mg／ml
（反応収率２４.０％）、キロ−イノシトール（Ｄ−
体、Ｌ−体の混合物）０.１mg／ml（反応収率２.０
％）、ネオ−イノシトール０.１mg／ml（反応収率２.０
％）が蓄積していた。反応液からのイノシトール立体異
性体の各成分の単離方法は、実施例１に記載の方法に準
じて行い、シロ−イノシトール５２０mg（収率２０.８
％）、Ｄ−及びＬ−キロ−イノシトール３２mg（収率
１.３％）、ネオ−イノシトール２７mg（収率１.１％）
を得た。
ール２.５ｇを含有した０.０５Ｍリン酸緩衝液（pH７.
０）５００ml（ミオ−イノシトール濃度５mg／ml）中に
加え、５０℃、２０時間ゆるやかに撹拌しながら反応さ
せた。反応終了後、反応液を液体クロマトグラフィーに
より分析したところ、シロ−イノシトール１.２mg／ml
（反応収率２４.０％）、キロ−イノシトール（Ｄ−
体、Ｌ−体の混合物）０.１mg／ml（反応収率２.０
％）、ネオ−イノシトール０.１mg／ml（反応収率２.０
％）が蓄積していた。反応液からのイノシトール立体異
性体の各成分の単離方法は、実施例１に記載の方法に準
じて行い、シロ−イノシトール５２０mg（収率２０.８
％）、Ｄ−及びＬ−キロ−イノシトール３２mg（収率
１.３％）、ネオ−イノシトール２７mg（収率１.１％）
を得た。
【００２９】〔実施例３〕 製造方法（Ｃ） (１) 無細胞抽出液の調製 アグロバクテリウム ツメファシエンスＩＡＭ １０３７
株を実施例１と同様な培地１００mlで、２７℃、２０時
間振盪培養した。次いで、培養液を遠心分離（８０００
rpm、１０分間）して菌を集め、ジチオスレイトール０.
３mg／ml含む２０mMリン酸緩衝液（pH７.０）で洗浄し
たのち、再度遠心分離にて集菌を行い、これを同じ組成
のリン酸緩衝液２２mlに懸濁した。この菌懸濁液を超音
波破砕機（BRANSON社製、SONIFIER CELL DISRUPTOR 18
5）で処理し、菌体を破壊した後、１６０００rpm、１０
分間の遠心分離を行い、その上清として無細胞抽出液
（タンパク量として４mg／ml）を得た。この無細胞抽出
液を２０mMリン酸緩衝液（pH７.０）に対して透析し、
ミオ−イノシトールの異性化反応に供した。
株を実施例１と同様な培地１００mlで、２７℃、２０時
間振盪培養した。次いで、培養液を遠心分離（８０００
rpm、１０分間）して菌を集め、ジチオスレイトール０.
３mg／ml含む２０mMリン酸緩衝液（pH７.０）で洗浄し
たのち、再度遠心分離にて集菌を行い、これを同じ組成
のリン酸緩衝液２２mlに懸濁した。この菌懸濁液を超音
波破砕機（BRANSON社製、SONIFIER CELL DISRUPTOR 18
5）で処理し、菌体を破壊した後、１６０００rpm、１０
分間の遠心分離を行い、その上清として無細胞抽出液
（タンパク量として４mg／ml）を得た。この無細胞抽出
液を２０mMリン酸緩衝液（pH７.０）に対して透析し、
ミオ−イノシトールの異性化反応に供した。
【００３０】(２) ミオ−イノシトールの異性化反応 ミオ−イノシトール２mg／ml溶液を５０μｌ、β−ＮＡ
Ｄ+・３Ｈ2Ｏ ４０mg／ml溶液を１０μｌ、０.５Ｍグッ
ド（Good's）のＣＨＥＳ緩衝液（pH１０.０）を２０μ
ｌ及び無細胞抽出液（タンパク量として４mg／ml）を２
０μｌ含む総容量１００μｌの溶液を３７℃で３時間培
養した。反応後、それぞれの反応液２０μｌを高速液体
クロマトグラフィーで分析し、基質としたミオ−イノシ
トールから生成された異性体の同定を行った。
Ｄ+・３Ｈ2Ｏ ４０mg／ml溶液を１０μｌ、０.５Ｍグッ
ド（Good's）のＣＨＥＳ緩衝液（pH１０.０）を２０μ
ｌ及び無細胞抽出液（タンパク量として４mg／ml）を２
０μｌ含む総容量１００μｌの溶液を３７℃で３時間培
養した。反応後、それぞれの反応液２０μｌを高速液体
クロマトグラフィーで分析し、基質としたミオ−イノシ
トールから生成された異性体の同定を行った。
【００３１】その結果、基質としたミオ−イノシトール
(０.２９mg／ml)に加えて、シロ−イノシトール、キロ
−イノシトール(Ｄ−体とＬ−体の混合物)、ネオ−イノ
シトールがそれぞれ０.１６mg／ml（反応収率８.０
％）、０.０４mg／ml（反応収率２.０％）、０.０２mg
／ml（反応収率１.０％）の濃度で検出された。
(０.２９mg／ml)に加えて、シロ−イノシトール、キロ
−イノシトール(Ｄ−体とＬ−体の混合物)、ネオ−イノ
シトールがそれぞれ０.１６mg／ml（反応収率８.０
％）、０.０４mg／ml（反応収率２.０％）、０.０２mg
／ml（反応収率１.０％）の濃度で検出された。
【００３２】
【発明の効果】本発明の製造方法によれば、従来法に比
べて安価で、かつ簡単な操作でＤ−キロ−イノシトー
ル、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトール及び
ネオ−イノシトールが得られる。
べて安価で、かつ簡単な操作でＤ−キロ−イノシトー
ル、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトール及び
ネオ−イノシトールが得られる。
Claims (3)
- 【請求項１】 アグロバクテリウム属に属する微生物を
ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、培養
液中にイノシトール立体異性体を生成蓄積させることを
特徴とする、イノシトール立体異性体の製造方法。 - 【請求項２】 アグロバクテリウム属に属する微生物を
ミオ−イノシトールを含有する液体培地であらかじめ培
養し、該培養液から分離した菌体を液体培地又は緩衝液
中でミオ−イノシトールに作用させてイノシトール立体
異性体を生成蓄積させることを特徴とする、イノシトー
ル立体異性体の製造方法。 - 【請求項３】 アグロバクテリウム属に属する微生物を
ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、該培
養液から分離した菌体の菌体処理物を緩衝液中でミオ−
イノシトールに作用させてイノシトール立体異性体を生
成蓄積させることを特徴とする、イノシトール立体異性
体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32250595A JP3630344B2 (ja) | 1995-11-17 | 1995-11-17 | イノシトール立体異性体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32250595A JP3630344B2 (ja) | 1995-11-17 | 1995-11-17 | イノシトール立体異性体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09140388A true JPH09140388A (ja) | 1997-06-03 |
| JP3630344B2 JP3630344B2 (ja) | 2005-03-16 |
Family
ID=18144408
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32250595A Expired - Fee Related JP3630344B2 (ja) | 1995-11-17 | 1995-11-17 | イノシトール立体異性体の製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3630344B2 (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998057620A3 (en) * | 1997-06-16 | 1999-03-18 | Cedars Sinai Medical Center | Inositol for modulation of immune response |
| WO2002055715A1 (fr) * | 2001-01-15 | 2002-07-18 | Hokko Chemical Industry Co., Ltd. | Adn codant pour une d-myo-inositol 1-épimérase |
| WO2005035774A1 (ja) * | 2003-10-14 | 2005-04-21 | Hokko Chemical Industry Co., Ltd. | シロ−イノシトールの製造方法 |
| JP2006141216A (ja) * | 2004-11-16 | 2006-06-08 | Kobe Univ | Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法 |
| WO2010050231A1 (ja) * | 2008-10-31 | 2010-05-06 | 国立大学法人神戸大学 | シロ－イノシトール産生細胞および当該細胞を用いたシロ－イノシトール製造方法 |
| WO2013115012A1 (ja) | 2012-02-02 | 2013-08-08 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | シロ‐イノシトールの製造方法 |
| EP2656839A1 (en) | 2007-04-12 | 2013-10-30 | Waratah Pharmaceuticals, Inc. | Use of Cyclohexanehexol Derivatives in the Treatment of Ocular Diseases |
| WO2014098454A1 (ko) * | 2012-12-17 | 2014-06-26 | 솔젠트(주) | 마이오-이노시톨 및 d-카이로-이노시톨이 포함된 용액으로부터 d-카이로-이노시톨을 정제하는 방법 |
| US8859628B2 (en) | 2003-02-27 | 2014-10-14 | JoAnne McLaurin | Method for preventing, treating and diagnosing disorders of protein aggregation |
| WO2017029353A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Transition Therapeutics Ireland Limited | Treatment of behaviors in dementia patients |
-
1995
- 1995-11-17 JP JP32250595A patent/JP3630344B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP2058390A1 (en) | 2003-10-14 | 2009-05-13 | Hokko Chemical Industry Co., Ltd. | Method for producing scyllo-inositol |
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| US7745671B2 (en) | 2003-10-14 | 2010-06-29 | Hokko Chemical Industry Co., Ltd. | Method for producing scyllo-inositol |
| JP4526485B2 (ja) * | 2003-10-14 | 2010-08-18 | 北興化学工業株式会社 | シロ−イノシトールの製造方法 |
| US20100261238A1 (en) * | 2003-10-14 | 2010-10-14 | Hokko Chemical Industry Co., Ltd. | Method for producing scyllo-inositol |
| US8715974B2 (en) | 2003-10-14 | 2014-05-06 | Hokko Chemical Industry Co., Ltd. | Method for producing scyllo-inositol |
| KR101191675B1 (ko) | 2003-10-14 | 2012-10-17 | 혹꼬우 가가꾸 고오교오 가부시끼가이샤 | 실로-이노시톨의 제조방법 |
| JPWO2005035774A1 (ja) * | 2003-10-14 | 2006-12-21 | 北興化学工業株式会社 | シロ−イノシトールの製造方法 |
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| WO2013115012A1 (ja) | 2012-02-02 | 2013-08-08 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | シロ‐イノシトールの製造方法 |
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| WO2017029353A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Transition Therapeutics Ireland Limited | Treatment of behaviors in dementia patients |
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|---|---|
| JP3630344B2 (ja) | 2005-03-16 |
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