JPH1112210A - クエルシトールの製造方法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 光学純度の高いクエルシトールを効率よく安
価に製造する方法を提供する。特に従来単離報告例のな
い（＋）−エピ−クエルシトールを提供する。また、ク
エルシトールを有効成分とする、安全で副作用がなく効
果が高い血圧降下剤及びそれを含有する健康薬を提供す
る。 【解決手段】 ミオ−イノシトールにアグロバクテリウ
ム属又はサルモネラ属に属する微生物を作用させて、前
記ミオ−イノシトールをクエルシトール（（＋）−プロ
ト−クエルシトール、（−）−ビボ−クエルシトール、
及び（＋）−エピ−クエルシトールからなる群から選ば
れるもの）へ変換させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はアグロバクテリウム
属又はサルモネラ属に属する微生物を利用し、安価なミ
オ−イノシトール（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を原料
として、経済価値の高い（＋）−プロト−クエルシトー
ル（（＋）−ｐｒｏｔｏ−ｑｕｅｒｃｉｔｏｌ）、
（−）−ビボ−クエルシトール（（−）−ｖｉｖｏ−ｑ
ｕｅｒｃｉｔｏｌ）、および新規な（＋）−エピ−クエ
ルシトール（（＋）−ｅｐｉ−ｑｕｅｒｃｉｔｏｌ）等
のクエルシトールを製造する方法、及びそれらの血糖降
下作用を有する健康薬としての用途に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】クエルシトールは、狭義には（＋）−プ
ロト−クエルシトールをさすが、広義にはシクロヘキサ
ンペントールの総称であり、理論的には４種類のメソ体
と６対の光学異性体、計１６種類の異性体があり得る。
そのうち次の３種類、すなわち（＋）−プロト−クエル
シトール（ドングリなど広く植物界に存在する）、
（−）−プロト−クエルシトール（ユーカリの葉に存在
する）、（−）−ビボ−クエルシトール（ガガイモ科の
葉から単離）が植物界から見出されている。その他、１
０種の光学活性体、４種のラセミ体が化学的に合成され
ている。

【０００３】クエルシトールの薬理作用としては、肺結
核患者の心臓障害改善（Probl. Tuberk. (USSR) 64/12,
35-38, 1986）あるいは抗結核剤の心毒作用の改善（Pa
to1.Fizio1. Eksp. Ter. (USSR) 30/2, 68-71, 1986）
などが報告されている。また、水酸遊離基補足作用を有
する（Proc. Soc. Edinburgh, 102B, 269-272, 1994）
との報告がある。

【０００４】ビボ−クエルシトールは、各種の農医薬の
合成用中間体として有用性が期待されるデオキシイノサ
ミンあるいはデオキシイノサミジンの合成原料（Bull.
Chem. Soc. Jpn. 39, 1931, 1966、及び、Bull. Chem.
Soc. Jpn. 44, 2804-2807, 1971）として知られてい
る。

【０００５】（＋）−プロト−クエルシトールは、アカ
ガシの幹に含まれるジ−Ｏ−ガロイル−（＋）−プロト
−クエルシトールの構成成分であり、ジ−Ｏ−ガロイル
−（＋）−プロト−クエルシトールは各種細菌に抗菌作
用を示すことが知られている（Chem. Pharm. Bull. 32,
1741-1749, 1984、及び Agric. Biol. Chem. 55, 19-2
3, 1991）。

【０００６】このように、クエルシトールは各種の農医
薬の合成に用いる合成原料として有用であり、またそれ
自体も各種の生物学的活性を有することが知られてい
る。一方、（＋）−プロト−クエルシトールを得る方法
としては次の（ａ）及び（ｂ）が知られている。

【０００７】（ａ）ドングリやヤシの葉に微量に含まれ
ている（＋）−プロト−クエルシトールを抽出精製する
方法（Ann. Chim. Phys. 27, 392, 1849）。 （ｂ）ハロベンゼン又はシス（１ｓ，２ｓ）−１，２−
ジヒドロ−３−ハロカテコールを出発原料として合成す
る方法（Biochem. 9, 1626, 1970、J. Chem. Soc. Per.
Tra. I., 2907, 1991、及び Synlett, 899, 1994）。

【０００８】（＋）−プロト−クエルシトールの光学異
性体である（−）−プロト−クエルシトールの合成法と
しては、ユーカリの葉から抽出する方法（Compt. Rend.
253, 3047, 1961）、クエブラキトール又はＬ−キロ−
イノシトールを出発原料とする方法（Carbohyd. Res.
4, 516, 1967、及び J. Org. Chem. 33, 4220, 1968）
があり、またラセミ体である（±）−プロト−クエルシ
トールについてはコンズリトール−Ａ−テトラメチルエ
ーテル（Aust. J. Chem. 43, 1597-1602, 1990）、シク
ロヘキサジエン（Syn1ett, 609-610, 1993）、あるいは
Ｄ，Ｌ−キロ−イノシトールを出発原料として合成する
方法（Bu11. Chem. Soc. Jpn., 3226-3227, 1972）など
が知られている。

【０００９】また、（−）−ビボ−クエルシトールを得
る方法としては、次の（ｃ）が知られている。 （ｃ）ガガイモ科等の植物の葉に微量に含まれている
（−）−ビボ−クエルシトールを抽出精製する方法（J.
Chem. Soc., 85, 624, 1904、J. Pharm. Chim.,26, 38
5, 1937）。

【００１０】（−）−ビボ−クエルシトールの光学異性
体である（＋）−ビボ−クエルシトールの合成には、Ｌ
−ミオ−イノソースを出発原料とする方法（Helv. Chi
m. Acta, 33, 1594. 1950）があり、ラセミ体である
（±）−ビボ−クエルシトールについてはミオ−イノシ
トールを出発原料として合成する方法が知られている
（J.Am. Chem. Soc., 75, 402O-4026, 1953）。

【００１１】また、（＋）−エピ−クエルシトールにつ
いてはこれまで抽出精製法および合成法は全く報告され
ていない。しかし、（＋）−エピ−クエルシトールの光
学異性体である（−）−エピ−クエルシトールについて
は、エピ−イノシトールをアセトバクター・サブオキシ
ダンス（Acetobactor suboxydans）によって酸化して得
たｌ−エピ−イノソースを化学的に還元して合成する方
法が知られている（J.Am. Chem. Soc., 74, 2618-2621,
1952）。ラセミ体である（±）−エピ−クエルシトー
ルについては、（±）−エピ−イノソースのオキシム体
を還元して合成する方法（J. Org. Chem., 14, 1137-11
40, 1949）が知られている。

【００１２】しかしながら、上述した（ａ）〜（ｃ）の
クエルシトール光学活性体を製造する方法は、いずれも
工業的規模で製造する方法としては必ずしも満足しうる
ものではない。例えば、植物から（＋）−プロト−クエ
ルシトール、（−）−ビボ−クエルシトールを抽出する
前述の方法は、植物体中における含有量が少ないため、
抽出と精製が困難であり、収率も低い。また、（ｂ）記
載の（＋）−プロト−クエルシトールを化学合成する方
法は操作が煩雑であり、コスト面でも問題がある。

【００１３】アグロバクテリウム属又はサルモネラ属の
微生物を用い、ミオ−イノシトールから光学純度の高い
（＋）−プロト−クエルシトール、（−）−ビボ−クエ
ルシトール、及び（＋）−エピ−クエルシトールを製造
する方法については知られていない。さらに、これらの
なかでも（＋）−エピ−クエルシトールは、これまで単
離されていなかった化合物である。

【００１４】ところで、糖尿病はインスリン依存性糖尿
病と非インスリン依存性糖尿病に大別できる。現在、糖
尿病の治療には、インスリン製剤と経口糖尿病薬が用い
られているが、その副作用としてインスリン製剤ではイ
ンスリン過量化、不適当なカロリー摂取により低血糖と
なり、患者がグルコースで処置されなければ、昏睡、致
死となる。また、経口糖尿病薬としては、スルホニル尿
素が代表的な薬物であるが、この系統の薬剤は胃腸管障
害と皮膚反応を示す例が極めて多く、また低血糖と低血
糖性昏睡が誘発されるという副作用を有する。したがっ
て、高血糖傾向の人に対して安全で、副作用が少なく、
効果の高い血糖降下作用を有する物質の開発が望まれて
いる。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題の第１
は、それ自体が生物学的活性を有し、また医農薬の合成
に用いる原料として有用であるクエルシトールを安価に
製造する方法を提供することである。すなわち、医農薬
合成原料として用いるためには純度の高い光学活性体が
必要であり、高光学活性のクエルシトールが工業生産レ
ベルで供給されることが望まれている。

【００１６】本発明の課題の第２は、これまで単離報告
例がない（＋）−エピ−クエルシトールを提供すること
である。本発明の課題の第３は、高血糖傾向の人に対し
て安全で、副作用が少なく、効果の高い血糖降下作用を
有する物質及びそれを含む健康薬を提供することにあ
る。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意検討を重ねてきた。その結果、
アグロバクテリウム属に属する微生物又はサルモネラ属
に属する微生物をミオ−イノシトールに作用させると、
光学純度の高いクエルシトール、特に（＋）−プロト−
クエルシトール及び（−）−ビボ−クエルシトール、並
びにこれまで単離報告例がない（＋）−エピ−クエルシ
トールが効率よく生成されることを見出した。また、こ
れらのクエルシトール立体異性体が血糖降下作用を有す
ることを見出した。

【００１８】すなわち、本発明のクエルシトールの製造
方法は、ミオ−イノシトールにアグロバクテリウム属又
はサルモネラ属に属する微生物を作用させて、前記ミオ
−イノシトールをクエルシトールへ変換させることを特
徴とする。

【００１９】本発明の製造方法は、具体的には以下に示
す（Ａ）及び（Ｂ）２つの方法を挙げることができる。
製造方法（Ａ）は、アグロバクテリウム属又はサルモネ
ラ属に属する微生物を、ミオ−イノシトールを含有する
液体培地で培養し、培養液中にクエルシトールを生成蓄
積させる工程を含む方法である。

【００２０】製造方法（Ｂ）は、アグロバクテリウム属
又はサルモネラ属に属する微生物を培養して得られる菌
体を、ミオ−イノシトールを含む溶液中で前記ミオ−イ
ノシトールと反応させ、前記溶液中にクエルシトールを
生成させる工程を含む方法である。

【００２１】本発明の方法で製造されるクエルシトール
は、好ましくは、包含される数種の立体異性体のうち、
下記一般式（Ｉ−ａ）で表される（＋）−プロト−クエ
ルシトール、（Ｉ−ｂ）で表される（−）−ビボ−クエ
ルシトール、及び（Ｉ−ｃ）で表される（＋）−エピ−
クエルシトールからなる群から選ばれるものである（以
下、これらの立体異性体を単に「クエルシトール立体異
性体」と言うことがある）。

【００２２】

【化４】

【００２３】また、本発明は、下記式（Ｉ−ｃ）で表さ
れる（＋）−エピ−クエルシトールを提供する。

【００２４】

【化５】

【００２５】また、本発明の血糖降下剤は、クエルシト
ールを有効成分とする。好ましくは、前記クエルシトー
ルは下記一般式（Ｉ−ａ）で表される（＋）−プロト−
クエルシトール、（Ｉ−ｂ）で表される（−）−ビボ−
クエルシトール、及び（Ｉ−ｃ）で表される（＋）−エ
ピ−クエルシトールからなる群から選ばれるものであ
る。

【００２６】

【化６】

【００２７】また、本発明の健康薬は、前記血糖降下剤
を含有する。

【００２８】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を説
明する。 （１）クエルシトールの製造方法 本発明の製造原料であるミオ−イノシトールは、動植物
および微生物に広く分布している。特に、穀物中に六燐
酸エステルのＣａ、Ｍｇ塩であるフィチン酸として多量
に存在しており、公知の方法により米糠等をアルカリ加
水分解し、精製して得ることができる。

【００２９】本発明において使用する微生物は、アグロ
バクテリウム属又はサルモネラ属に属し、ミオ−イノシ
トールをクエルシトールに変換する能力を有する微生物
であればいずれの菌株でもよい。

【００３０】具体的に例示すると、アグロバクテリウム
属に属する微生物としては、アグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロ
バクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiob
acter）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacte
rium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ルビ（Agrob
acterium rubi）など（以下、特に断らない限り「アグ
ロバクテリウム属細菌」と総称する。）が挙げられる。

【００３１】サルモネラ属に属する微生物としては、サ
ルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimuriu
m）、サルモネラ・エンテリティジス（Salmonella ente
ritidis）、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnes
ota）、サルモネラ・プロラム（Salmonella pullorum）
など（以下、特に断らない限り「サルモネラ属細菌」と
総称する。）が挙げられる。

【００３２】これらはＡＴＣＣ（アメリカンタイプカル
チャーコレクション）、ＩＦＯ（（財）発酵研究所）、
ＩＡＭ（（財）応用微生物研究奨励会）などにより入手
することができる。

【００３３】本発明の方法で製造されるクエルシトール
は、好ましくは、包含される数種の立体異性体のうち、
（＋）−プロト−クエルシトール、（−）−ビボ−クエ
ルシトール、及び（＋）−エピ−クエルシトールからな
る群から選ばれるクエルシトール立体異性体である。

【００３４】本発明のクエルシトールの製造方法として
は、具体的には上述した製造方法（Ａ）および製造方法
（Ｂ）の二つの方法が挙げられる。これらを以下に順次
説明する。

【００３５】［製造方法（Ａ）］ミオ−イノシトールを
含む液体培地に、アグロバクテリウム属又はサルモネラ
属に属する微生物を接種して好気的に培養することによ
り、クエルシトールを生成蓄積させることができる。

【００３６】液体培地の組成は、目的に達する限り何等
特別の制限はなく、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機
塩類等を含有する培地であればよく、合成培地・天然培
地のいずれも使用できる。炭素源としては、ミオ−イノ
シトールを０．１〜１０％、好ましくは２〜５％添加
し、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、あるいは尿素等を０．０１％
〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．５％添加するの
が望ましい。有機栄養源としては、酵母エキス、ペプト
ン、カザミノ酸を適量（０．００５〜１．０％）添加す
ると、菌株によっては有効な場合がある。

【００３７】その他必要に応じ、ナトリウム、カリウ
ム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、
亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸等のイオンを
生成することができる無機塩類を培地中に添加すること
が有効である。培養液の水素イオン濃度はｐＨ６〜１
０、好ましくはｐＨ７〜９に調整し培養すると、効率よ
くクエルシトールを得ることができる。

【００３８】培養条件は、菌株や培地の種類によっても
異なるが、培養温度は５〜４０℃、好ましくは２０〜３
５℃であり、培養期間は通常１〜７日、好ましくは２〜
５日である。また、培養は液体培地を振とうしたり、液
体培地中に空気を吹き込むなどして好気的に行えばよ
い。

【００３９】培養液から目的物を採取する方法は、通常
の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用す
ることができる。すなわち、培養液を活性炭やイオン交
換樹脂などで処理することにより、クエルシトール以外
の不純物のほとんどを除くことができる。その後、イオ
ン交換樹脂のカラムクロマトグラフィーを用いる方法お
よび再結晶法等の方法を組み合わせて用いることによ
り、目的物を単離することができる。

【００４０】カラムクロマトグラフィーを用いる方法と
しては、カーボハイドレイト リサーチ（Carbohydrate
Research）第１６６巻、第１７１頁〜第１８０頁（１
９８７年）や、ジヤーナル オブ アメリカン ケミカ
ル ソサイアティー（J.Am.Chem.Soc.）第７３巻、第２
３９９頁〜第２３４０頁（１９５１）に記載されている
強塩基性イオン交換樹脂をホウ酸型にしてカラムにつ
め、ホウ酸の濃度を徐々に高めて流すことにより、クエ
ルシトールの各成分を分離する方法を応用することが有
効である。

【００４１】このカラムを用いて、（＋）−プロト−ク
エルシトール、（−）−ビボ−クエルシトール、及び
（＋）−エピ−クエルシトールを含むクエルシトール立
体異性体の混合物をカラムに供すると、（＋）−プロト
−クエルシトール及び（−）−ビボ−クエルシトールは
樹脂に保持されることなくカラムを素通りし、（＋）−
エピ−クエルシトールは、０．５Ｍ程度のホウ酸溶液を
流すことにより溶出する。

【００４２】また、強塩基性陰イオン交換樹脂（ＯＨ^-
型）にしてカラムにつめ、イオン交換水を流して分離す
る方法もクエルシトール分離に有効である。例えば、
（＋）−プロト−クエルシトール及び（−）−ビボ−ク
エルシトールの混合溶液を本カラムに供すると、まず、
（−）−ビボ−クエルシトールが溶出し、次いで、
（＋）−プロト−クエルシトールが溶出する。

【００４３】このようにしてカラムクロマトグラフィー
で得られる溶出液を任意に分画し、カラムクロマトグラ
フィーを幾度か繰り返すか、または組み合わせることに
より、純粋な物質を得ることができる。

【００４４】再結晶法に関しては、クエルシトールを水
に溶解し、低級アルコールを任意の量加えて混合溶媒系
中で容易に結晶化することができる。生じた結晶は、ガ
ラスフィルターや濾紙で母液より分離することができ
る。

【００４５】生成するクエルシトール立体異性体の量お
よび存在比は、菌の種類や培養日数により異なるが、上
述した分離方法を単独あるいは組み合わせて、必要に応
じて繰り返し用いることにより、培養液又は反応液から
クエルシトール立体異性体を適宣純粋な物質として単離
することができる。製造法（Ａ）による製造方法の例
を、後記実施例１に示した。

【００４６】［製造方法（Ｂ）］製造方法（Ｂ）は、ア
グロバクテリウム属又はサルモネラ属に属する微生物を
培養して得られる菌体を、ミオ−イノシトールを含む溶
液中で前記ミオ−イノシトールと反応させ、前記溶液中
にクエルシトールを生成させるものである。

【００４７】菌体としては、製造方法（Ａ）により得た
培養液から分離して集めた菌体を用いてもよく、また、
前記微生物を別途適当な培養条件で培養して得たものを
用いてもよい。集菌は、培養液から遠心分離、濾過など
公知の方法により行えばよい。

【００４８】ミオ−イノシトールを含む溶液としては、
液体培地、緩衝液等が用いられる。液体培地としては、
製造方法（Ａ）におけるのと同様のものを用いてもよ
く、また別途前記微生物を培養した液体培地をそのまま
用いてもよい。緩衝液としてはリン酸緩衝液、トリス緩
衝液、グッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）のＣＨＥＳ緩衝液などを
１０〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭの濃度
で用いればよい。溶液中のミオ−イノシトールの濃度は
０．１〜５％程度とするのが好ましい。

【００４９】反応条件は、菌株や培地、緩衝液の種類に
よって異なるが、反応温度は１５〜６０℃、好ましくは
２５〜５５℃であり、反応時間は１〜５０時間、好まし
くは３〜４８時間であり、液体培地または緩衝液のｐＨ
は６〜１０、好ましくは７〜９である。

【００５０】反応終了後の反応液からの目的物を単離す
る方法は製造方法（Ａ）と同様に行えばよい。製造方法
（Ｂ）による製造方法の一例を後記実施例２に示した。

【００５１】本発明の製造方法によれば、医農薬合成原
料として有用な純度の高いクエルシトールの光学活性体
を工業生産レベルで安価に製造することができる。

【００５２】（２）（＋）−エピ−クエルシトール 本発明のクエルシトールの製造方法によれば、これまで
単離報告例がない（＋）−エピ−クエルシトールが効率
よく生成される。

【００５３】（＋）−エピ−クエルシトールは下記の物
理化学的性状を有する。 (1)外観：無色結晶 (2)融点：１９０〜１９２℃ (3)分子式：Ｃ₆Ｈ₁₂Ｏ₅ (4)分子量：１６４ (5)比旋光度：＋５°（ｃ；１．０、Ｈ₂Ｏ、２３℃） (6)赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ）：添付図面の図１に
示す。 (7)¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ₂Ｏ、３００．４ＭＨ
ｚ）：添付図面の図２に示す。 (8)¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ₂Ｏ、７５．４５ＭＨ
ｚ）：添付図面の図３に示す。 (9)溶解性：水、ＤＭＳＯに易溶、低級アルコールに僅
かに溶解、アセトンに不溶。 (10)液体クロマトグラフィー溶出時間：６．４分 カラム：Wakosil５ＮＨ₂、４．６×２５０ｍｍ カラム温度：４０℃ 検出器：ＲＩ・ＤＥＴＥＣＯＲ・ＥＲＣ−７５１５Ａ
（ＥＲＭＡ ＣＲ．ＩＮＣ）溶媒：アセトニトリル−水
＝４：１

【００５４】（３）血糖降下剤及び健康薬 本発明の血糖降下剤は、クエルシトールを有効成分とす
る。クエルシトール、特に上記式（Ｉ−ａ）〜（Ｉ−
ｃ）で表されるクエルシトール立体異性体は、安全で、
副作用が少なく、効果の高い血糖降下作用を有する。本
発明の上記製造方法で得られるクエルシトールは純度が
高く、血糖降下剤として好ましく用いられる。

【００５５】本発明の血糖降下剤の投与方法は経皮、経
口等いずれであってもよい。好ましい投与量は、投与方
法等にもよるが、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ程度である。
本発明の健康薬は、クエルシトールを有効成分とする前
記血糖降下剤を含む。健康薬の剤形としては、具体的に
は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、ドリン
ク剤等が挙げられる。

【００５６】本発明の健康薬におけるクエルシトールの
好ましい含有量は、健康薬全体に対し１〜５０重量％で
あり、より好ましくは５〜２０重量％である。本発明の
健康薬は、クエルシトール立体異性体以外に、通常用い
られている任意成分を含有することができる。このよう
な任意成分としては、デンプン、デキストリン、乳糖、
コーンスターチ、無機塩類等が挙げられる。

【００５７】これらの任意成分とクエルシトール立体異
性体とを常法に従って処理することにより、本発明の健
康薬を製造することができる。

【００５８】

【実施例】以下に本発明の実施例を説明する。

【００５９】

【実施例１】 ＜製造方法（Ａ）によるクエルシトールの製造例＞ （１）クエルシトール立体異性体の生成 ミオ−イノシトール４．０％（４００ｇ）、酵母エキス
０．４％、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄０．１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄０．
７％、ＫＨ₂ＰＯ₄０．２％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０
１％を含むｐＨ７の液体培地１０リットルを、１００ｍ
ｌずつ５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注
し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにサ
ルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）
ＩＦＯ１３２４５株（（財）発酵研究所より購入）を接
種し、２７℃で３日間振とう培養した。培養液を遠心分
離（８０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を培養上清液
とした。

【００６０】この培養上清液を高速液体クロマトグラフ
ィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清
液中には（＋）−プロト−クエルシトール２．１ｍｇ／
ｍｌ（反応収率５．８％）、（−）−ビボ−クエルシト
ール１３．０ｍｇ／ｍｌ（反応収率３５．７％）、
（＋）−エピ−クエルシトール４．３ｍｇ／ｍｌ（反応
収率１１．９％）が生成していることがわかった。

【００６１】なお、上記の各クエルシトールの反応収率
は、次式により求めた。

【００６２】

【数１】

【００６３】高速液体クロマトグラフィ−の分析条件は
以下の通りである。 カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ・５ＮＨ₂：４．６×２５０ｍ
ｍ カラム温度：４０℃ 検出器：ＲＩ・ＤＥＴＥＣＴＯＲ・ＥＲＣ−７５１５Ａ
（ＥＲＭＡ ＣＲ．ＩＮＣ） 注入量：２０μｌ 溶媒：アセトニトリル−水＝４：１ 溶出時間：（＋）−プロト−クエルシトール；５．４分 （−）−ビボ−クエルシトール；６．２分 （＋）−エピ−クエルシトール；６．４分

【００６４】（２）立体異性体の単離 培養上清液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登
録商標）Ｃ−２０（Ｈ ⁺型）１０００ｍｌを充填したカ
ラム（内径７ｃｍ、長さ２６ｃｍ）に通過させ、その後
このカラムに２０００ｍｌのイオン交換水を通過させて
洗浄した。この通過液および洗浄液を、強塩基性陰イオ
ン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３ＰＬＵ
Ｓ（ＯＨ^-）１５００ｍｌを充填したカラム（内径７ｃ
ｍ、長さ３９ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに３
０００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。

【００６５】こうして得られた通過液および水洗浄液中
には上記クエルシトール立体異性体以外の不純物はほと
んど存在していなかった。

【００６６】（−）−ビボ−クエルシトールの単離 上記により得た水溶液を減圧下で１リットルまで濃縮
し、エタノールを２倍量加え５℃で一晩放置したとこ
ろ、ほぼ純粋な（−）−ビボ−クエルシトールの結晶１
０３ｇを得た。

【００６７】この結晶を１リットルの蒸留水に溶解さ
せ、２倍量のエタノールを加え、５℃で一晩放置し再結
晶した結果、純粋な（−）−ビボ−クエルシトールの無
色結晶を７３ｇ（収率５６％）得た。

【００６８】なお、上記（−）−ビボ−クエルシトール
の収率は次式により求めた。さらに、以下の、にお
いても各クエルシトールの収率は、次式により求めたも
のである。

【００６９】

【数２】

【００７０】（＋）−エピ−クエルシトールの単離 上記の１回目の（−）−ビボ−クエルシトール結晶母
液を５００ｍｌまで濃縮し、この濃縮液を強塩基性陰イ
オン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３ＰＬ
ＵＳ（ホウ酸型）１０００ｍｌを充填したカラム（内径
７ｃｍ、長さ２６ｃｍ）に通過させ、イオン交換水２０
００ｍｌ、０．５Ｍホウ酸水溶液２０００ｍｌの順で流
し、溶出液を分画した。成分の分析は高速液体クロマト
グラフィーで行った。素通りした画分およびイオン交換
水で溶出した画分には（＋）−プロト−クエルシトール
および（−）−ビボ−クエルシトールが含まれていた。
０．５Ｍホウ酸水溶液での溶出液中には（＋）−エピ−
クエルシトールが含まれていた。

【００７１】（＋）−エピ−クエルシトールを含むホウ
酸水溶液を減圧下で濃縮乾固し、メタノールを加えてホ
ウ酸を共沸除去した。この操作を数回繰り返し得られた
白色粉未を５０ｍｌの蒸留水に溶解させ、この水溶液に
３倍量のエタノールを加え５℃で一晩放置したところ、
（＋）−エピ−クエルシトールの純粋な無色結晶３４ｇ
（収率７９％）を得た。

【００７２】（＋）−プロト−クエルシトール又は
（−）−ビボ−クエルシトールの単離 上記において（＋）−プロト−クエルシトールおよび
（−）−ビボ−クエルシトールを含む通過液および水溶
出液を合わせ５００ｍｌまで減圧下で濃縮し、この濃縮
液を１００ｍｌずつ、強塩基性陰イオン交換樹脂アンバ
ーライト（登録商標）ＣＧ−４００（ＯＨ^-型）１００
０ｍｌを充填したカラム（内径６ｃｍ、長さ３５ｃｍ）
に供しイオン交換水で溶出した。

【００７３】この際、溶出液を２０ｍｌずつ分画した。
このカラムクロマトグラフィーで、まず最初に（−）−
ビボ−クエルシトールが溶出し、次いで（＋）−プロト
−クエルシトールが溶出した。（−）−ビボ−クエルシ
トール溶出画分を合わせ濃縮し、エタノール水中で結晶
化させて純粋な（−）−ビボ−クエルシトールの結晶１
９ｇ（収率１４％）を得た。また、（＋）−プロト−ク
エルシトール溶出画分を合わせ、同様に結晶化させて純
粋な（＋）−プロト−クエルシトールの無色結晶を１
３．７ｇ（収率６５％）得た。

【００７４】

【実施例２】 ＜製造方法（Ｂ）によるクエルシトールの製造例＞ （１）菌体の生産 ミオ−イノシトール０．５％（１５ｇ）、（ＮＨ₄）₂Ｓ
Ｏ₄０．１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄０．７％、ＫＨ₂ＰＯ₄０．２
％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０１％を含むｐＨ７の液体
培地２リットルを、１２５ｍｌずつ５００ｍｌ容のバッ
フル付き三角フラスコに分注し、アグロバクテリウム・
ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＩＡ
Ｍ１０３７株（財団法人応用微生物学奨励会より購入）
を接種し、２５℃で３日間振とう培養した。この培養液
（４２５０ｍｌ）を遠心分離して得られた菌体を、蒸留
水２００ｍｌで洗浄後、再度遠心分離し、洗浄した菌体
を得た。

【００７５】（２）クエルシトールの製造 上記により得た洗浄菌体１３ｇを、ミオ−イノシトール
２ｇを含有した０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
４００ｍｌ（ミオ−イノシトール濃度５ｍｇ／ｍｌ）中
に加え、５０℃、４８時間緩やかにスターラーで撹拌し
ながら反応させた。反応終了後、反応液を液体クロマト
グラフィーにより分析したところ、（＋）−プロト−ク
エルシトール９３μｇ／ｍｌ（反応収率２．０％）、
（−）−ビボ−クエルシトール５０μｇ／ｍｌ（反応収
率１．１％）、（＋）−エピ−クエルシトール２７μｇ
／ｍｌ（反応収率０．６％）が蓄積していた。反応液か
らのクエルシトール立体異性体の各成分の単離方法は、
実施例１に記載の方法に準じて行い、それぞれ結晶とし
て、（＋）−プロト−クエルシトール２４ｍｇ（収率６
５％）、（−）−ビボ−クエルシトール１２ｍｇ（収率
６０％）、（＋）−エピ−クエルシトール５ｍｇ（収率
４６％）を得た。

【００７６】なお、上記の各クエルシトールの反応収率
は、上記実施例１に準じて求め、収率は次式により求め
た。

【００７７】

【数３】

【００７８】

【実施例３】本実施例では、クエルシトール立体異性体
が、グルコース高負荷マウスの高血糖に対して血糖降下
作用を有することが示された。 ＜血糖降下活性＞６週令のＩＣＲ系雄性マウスを一晩絶
食の後、表１に示す各クエルシトールを０．０５Ｍリン
酸緩衝液に溶解させ、１．０５ｍｇ／０．２５ｍｌ／マ
ウス（３０ｍｇ／ｋｇ）の投与量で経口投与した。その
２時間後、グルコースを０．０５Ｍリン酸緩衝液に溶解
させ、１４０ｍｇ／０．２５ｍｌ／マウス（４０００ｍ
ｇ／ｋｇ）の投与量で経口投与した。対照群としては、
グルコースのみを経口投与した。実施例１あるいは２で
得た化合物の経口投与直前、３０分後、１時間後、１時
間３０分後、及び２時間後に採血し、各時間の血糖値を
測定した。なお、採血および測定方法は以下のように行
った。

【００７９】すなわち、マウスの眼底静脈叢からキャピ
ラリーチューブ（ドルモント社製、長さ７０ｍｍ）で血
液を５０μｌ採取し、（株）コクサンヘマトクリット遠
心機Ｈ−１２００Ｂで８０００ｒｐｍ、６分間遠心分離
した。得られた血漿のグルコース濃度を、グルコース量
測定キット（グルコースＢ−テストワコー）で発色させ
て日立光度計Ｕ−２０００を用い、定量した。

【００８０】血糖値の統計処理のため、試験群全てのグ
ルコース投与直前の血糖値をグルコース投与後の血糖値
から差し引き得られた血糖増加値を基に、各群の血漿中
糖時間曲線下面積（ＡＵＣ＝Area Under Concentration
-time curve）を算出して対照群との比較を行った。実
験は３回行った。その結果を表１に示した。

【００８１】

【表１】

【００８２】表１に示すように、明らかに各クエルシト
ール立体異性体に血糖降下作用が認められた。

【００８３】

【発明の効果】本発明の製造方法によれば、光学純度の
高いクエルシトールを効率よく安価に製造することがで
きる。また、これまでに単離報告例がない（＋）−エピ
−クエルシトールを高純度で生産することができる。こ
のようなクエルシトール立体異性体は医農薬の原料とし
て有用であり、特に、高い血糖降下作用が認められるこ
とから、安全で副作用がなく効果が高い血圧降下剤及び
それを含有する健康薬として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】（＋）−エピ−クエルシトールの赤外吸収スペ
クトル図（ＫＢｒ）である。

【図２】（＋）−エピ−クエルシトールの¹Ｈ−ＮＭＲ
スペクトル図である。

【図３】（＋）−エピ−クエルシトールの¹³Ｃ−ＮＭＲ
スペクトル図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:42） (72)発明者 平沢 清 神奈川県厚木市森の里３−８ (72)発明者 佐藤 聖 神奈川県秦野市東田原200番地96

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ミオ−イノシトールにアグロバクテリウ
   ム属又はサルモネラ属に属する微生物を作用させて、前
   記ミオ−イノシトールをクエルシトールへ変換させるこ
   とを特徴とする、クエルシトールの製造方法。
2. 【請求項２】 アグロバクテリウム属又はサルモネラ属
   に属する微生物を、ミオ−イノシトールを含有する液体
   培地で培養し、培養液中にクエルシトールを生成蓄積さ
   せる工程を含む、請求項１記載のクエルシトールの製造
   方法。
3. 【請求項３】 アグロバクテリウム属又はサルモネラ属
   に属する微生物を培養して得られる菌体を、ミオ−イノ
   シトールを含む溶液中で前記ミオ−イノシトールと反応
   させ、前記溶液中にクエルシトールを生成させる工程を
   含む、請求項１記載のクエルシトールの製造方法。
4. 【請求項４】 前記クエルシトールが、下記一般式（Ｉ
   −ａ）で表される（＋）−プロト−クエルシトール、
   （Ｉ−ｂ）で表される（−）−ビボ−クエルシトール、
   及び（Ｉ−ｃ）で表される（＋）−エピ−クエルシトー
   ルからなる群から選ばれるものである、請求項１〜３の
   いずれかに記載の製造方法。 【化１】
5. 【請求項５】 下記式（Ｉ−ｃ）で表される（＋）−エ
   ピ−クエルシトール。 【化２】
6. 【請求項６】 クエルシトールを有効成分とする血糖降
   下剤。
7. 【請求項７】 前記クエルシトールが、下記一般式（Ｉ
   −ａ）で表される（＋）−プロト−クエルシトール、
   （Ｉ−ｂ）で表される（−）−ビボ−クエルシトール、
   及び（Ｉ−ｃ）で表される（＋）−エピ−クエルシトー
   ルからなる群から選ばれるものである、請求項６記載の
   血糖降下剤。 【化３】
8. 【請求項８】 請求項６又は７記載の血糖降下剤を含有
   する健康薬。