JP4081663B2 - Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物の製造方法およびそれによって得られるプロダクト - Google Patents
Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物の製造方法およびそれによって得られるプロダクト Download PDFInfo
- Publication number
- JP4081663B2 JP4081663B2 JP2002268194A JP2002268194A JP4081663B2 JP 4081663 B2 JP4081663 B2 JP 4081663B2 JP 2002268194 A JP2002268194 A JP 2002268194A JP 2002268194 A JP2002268194 A JP 2002268194A JP 4081663 B2 JP4081663 B2 JP 4081663B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- culture
- growth
- camphorata
- tumor
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 32
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 claims description 28
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims description 28
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 26
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 13
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 12
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 11
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 11
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 11
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 11
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 claims description 11
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 10
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 8
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 claims description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 230000009894 physiological stress Effects 0.000 claims description 4
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 claims 7
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 claims 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 20
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 18
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 16
- 241001486992 Taiwanofungus camphoratus Species 0.000 description 15
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 11
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 7
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical class C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 2
- 229930009674 sesquiterpene lactone Natural products 0.000 description 2
- 150000002107 sesquiterpene lactone derivatives Chemical class 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FTZIQBGFCYJWKA-UHFFFAOYSA-N 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Chemical compound S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 FTZIQBGFCYJWKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000123370 Antrodia Species 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000723347 Cinnamomum Species 0.000 description 1
- 241000386860 Cinnamomum micranthum Species 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 description 1
- 102100035729 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Human genes 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N Thapsigargin Natural products CCCCCCCC(=O)OC1C(OC(O)C(=C/C)C)C(=C2C3OC(=O)C(C)(O)C3(O)C(CC(C)(OC(=O)C)C12)OC(=O)CCC)C HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000017803 cinnamon Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002079 cooperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000816 effect on animals Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- -1 flavinoids Chemical class 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 229940124600 folk medicine Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- NIFIFKQPDTWWGU-UHFFFAOYSA-N pyrite Chemical compound [Fe+2].[S-][S-] NIFIFKQPDTWWGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052683 pyrite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011028 pyrite Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００２年３月２９日に出願された米国特許出願シリアル番号１０／１１３，９０３からの優先権を主張し、この開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、特に培養の間に攪拌速度および／またはｐＨ値を最適化することによる、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物からの薬理学的に活性な濾液の大規模製造に好適である培養条件の確立に関する。本発明はまた、一連の分画によって、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から薬理学的に活性な組成物を得るための方法に関する。本発明は、更に、医薬組成物の製造における上記組成物の使用に向けられる。
【０００３】
関連技術の説明
台湾で“ｎｉｕ−ｃｈａｎｇ−ｃｈｉｈ”または“ｎｉｕ−ｃｈａｎｇ−ｋｕ”としても公知である、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ［（Ｚａｎｇ＆Ｓｕ）Ｓ．−Ｈ．Ｗｕ，Ｒｙｖａｒｄｅｎ＆Ｔ．Ｔ．Ｃｈａｎｇ］は、最近、子実体に見られる円柱形状のその担子胞子、弱いアミロイド骨格菌糸、苦味およびピリエート担子器果に逆向したライトシナモン、ならびに純粋な培養物中の厚膜胞子および分節型分生子（arthroconidia）を特徴とする新規の真菌として報告された。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの詳細な特徴付けおよび分類学的位置は、Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｔ．ら、Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ ｓｐ．ｎｏｖ．ｏｎ Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋａｎｅｈｉｒａｉ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ，Ｍｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．９９（６）：７５６−７５８（１９９５）およびＷｕ，Ｓ．−Ｈ．ら、Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ（“ｎｉｕ−ｃｈａｎｇ−ｃｈｉｈ”），Ｎｅｗ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｆｕｎｇｕｓ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ，Ｂｏｔ．Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．３８：２７３−２７５（１９９７）に記載され、この全開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０００４】
台湾の民間薬において、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、中毒、下痢、腹痛、高血圧、皮癬(skin itches)および肝臓癌によって引き起こされる症状に対してある種の医療効果を有すると考えられている。しかし、厳しい宿主特異性および自然における珍しさのために、並びに人工培養の失敗のために、“niu-chang-chin”は、地元市場において非常に高価である。明らかに、大規模でのこの真菌の人工培養についての費用効果的プロセスを開発することに大きな産業的価値が存在する。
【０００５】
最近、本発明者らは、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、液内発酵に供される場合、所望の薬理学的活性、特に抗腫瘍活性を示すことを見出した。USSN 09/566,834に開示されるように、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、天然培地（即ち、ポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ））、および主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地において、小規模で、首尾よく培養された。得られた培養物は、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ座標系を使用して測定されるような赤色指数ａ≧３を有する深い暗赤色の色外観を呈し、これは、特定の腫瘍細胞株の増殖に対する有意な抑制効果と同時に起こることが示された。より重要なことには、腫瘍細胞へ作用する活性物質は、同定されていないが、真菌菌糸体から培養物の液相へ分泌されることが見出され、その結果、薬理学的に活性な組成物が、産業使用のために、培養物から容易に収穫され得る。
【０００６】
従って、このような有利な方法が、該真菌培養の大規模産生のために最適化されるならば、望ましいであろう。より好ましくは、粗濾液は、所望の活性に富んだ有用な組成物を得るために、所望の薬理学的活性について更に分画される。
【０００７】
発明の要旨
広範な研究が、上述の産業要件を満たすために行われてきた。ここで、驚くべきことに、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの工業的規模の培養のために最適な条件が、特定の範囲内に特定のパラメータを注意深く設定することによって達成され得ることが見出された。この発明において、ｐＨ値および攪拌速度が、培養の間、非常に重要であることがわかった。
【０００８】
従って、本発明の第１局面は、薬理学的活性を有するＡｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物の製造方法であって、
（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株(isolate)の菌糸体接種原(mycelial inoculum)を、該分離株の増殖に好適な培地に接種して、第１培養物を生じさせること；
（ｂ）工程（ａ）から培養された第１培養物を、該接種された分離株の更なる増殖を可能にする第１期間の間および第１所定速度に設定される第１段階の攪拌に供して、菌糸体を有する第２培養物増殖を得ること；および
（ｃ）工程（ｂ）から得られた第２培養物を、第１所定速度とは異なる第２所定速度に設定される第２段階の攪拌へ供して、生理学的ストレス下に該分離株を供すること、
を含む方法を提供することである。
【０００９】
本発明の第２局面によれば、薬理学的活性を有するＡｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物の製造方法であって、
（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；および
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を、工程（ｂ）の間中、４．５〜５．４の範囲へ該培養物のｐＨ値を調節することによって培養すること、
を含む方法を提供することである。
【００１０】
好ましくは、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物のｐＨ値は、工程（ｂ）の間中、４．６〜５．３、そしてより好ましくは４．７〜５．２の範囲内に調節される。
【００１１】
本発明はまた、所望の薬理学的活性（例えば、抗腫瘍活性）についてＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａから分離される、一連の液体フラクションを得るための方法を提供する。従って、本発明の第３局面は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から薬理学的に活性な組成物を得るための方法であって、
（ａ）Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を培養すること；
（ｃ）該培養物から不溶性物質の大部分を除去し、それによって薬理学的に活性な溶液を収穫(harvest)すること；および
（ｄ）工程（ｃ）からの溶液を処理して、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する薬理学的に活性な組成物を得ること、
を含む方法を提供することである。
【００１２】
好ましくは、得られる組成物は、約３ｋＤａ以下、より好ましくは約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する。
【００１３】
本発明の第４局面は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から薬理学的に活性な組成物を得るための方法であって、
（ａ）Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を培養すること；
（ｃ）該培養物から不溶性物質の大部分を除去し、それによって水溶液を収穫すること；
（ｄ）工程（ｃ）からの水溶液を処理して、約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有するフラクションを得ること；および
（ｅ）工程（ｄ）からのフラクションを水非混和性相に通過させ、ここから薬理学的に活性な組成物を得ること、
を含む方法を提供することである。
【００１４】
上記工程（ｅ）からの水非混和性相は、好ましくは、疎水性真菌分子を選択的に吸着し得る有効量の吸着剤を含有する固定相である。固定相は、薬理学的に活性なフラクションが得られるように、溶出される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、工程（ｅ）からの溶出液は、薬理学的活性を有する多数のフラクションを得るために、更に逆相分配クロマトグラフィー（例えば、Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラム（Ｍｅｒｃｋ））へ供される。
【００１６】
本発明は、更に、本発明の方法のいずれか１つから得られるプロダクトを含む、癌または腫瘍疾患の処置のための医薬組成物を提供する。
【００１７】
本発明は、更に、癌または腫瘍疾患の処置が必要である患者における癌または腫瘍疾患の処置方法であって、本発明に従う方法のいずれか１つから得られるプロダクトを含有する組成物を該患者に処方することによる方法を提供する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、一般的に、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物からの薬理学的に活性なフラクションの大規模製造に好適である培養条件の確立に関する。本発明によれば、真菌Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、菌糸体状態でのその栄養増殖を維持しそしてその薬理学的活性を促進するに好適な液体培地において培養される。
【００１９】
用語“好適な培地”は、本明細書中で使用される場合、その薬理学的活性を維持しながらＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの増殖に好適な人工的環境を提供する任意の培地を指す。好ましくは、本発明に使用される培地は、菌糸体における薬理学的に活性な物質（単数または複数）の産生を促進し、そして環境中へのその分泌を促進するに好適である。
【００２０】
本発明における使用に好適な培地としては、“ポテトデキストロースブロス”と呼ばれる天然培地、および主要炭素源としてフルクトースを含む任意の合成培地が挙げられる。ポテトデキストロースブロスは、例えば３００．０ｇの角切りポテト、２０．０ｇのデキストロースおよび１．０Ｌの蒸留水の混合物をオートクレーブすることによって実験室で調製され得るか、または市販源（例えば、ＤＩＦＣＯ）から購入され得る。最も好ましいのは、主要炭素源としてフルクトースを含む合成培地である。必要であれば、他の炭素源、例えばグルコース、スクロース、ガラクトース、フルクトース、コーンスターチ、麦芽抽出物およびその組み合わせが、補助として合成培地に含まれ得る。好ましくは、炭素源は、合成培地の総容量に基づいて、１．５〜２．５重量％、そしてより好ましくは１．５〜２重量％の範囲で存在する。
【００２１】
炭素源に加えて、合成培地は、窒素源、無機塩のような微量元素、および必要に応じてビタミンまたは他の増殖因子を含み得る。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、カザミノ酸、イースト抽出物、ペプトン、トリプトン、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明によれば、合成培地は、窒素源としてイースト抽出物を含有する。窒素源は、好ましくは、合成培地の総容量に基づいて、０．２〜２．０重量％の範囲で、そしてより好ましくは０．５重量％の量で存在する。
【００２２】
Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの任意の利用可能な分離株が、使用される微生物が検出可能な量の薬理学的に活性な代謝物を産生する能力を保有する限り、本発明に従う培養方法において使用され得る。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの有用な分離株としては、ＣＣＲＣ ３５３９６（１９９４年１２月１日に、ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ）のｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＣＲＣ），Ｈｓｉｎｃｈｕ， Ｔａｉｗａｎ， Ｒ．Ｏ．Ｃ．に寄託された）、３５３９８（１９９４年１２月１日）、３５７１６（２０００年５月３日）、３６４０１（２０００年１月２７日）、３６７９５（２０００年１月２７日）および９３００３２（２０００年１月２７日）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態によれば、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２（これはまた、特許手続のために、受託番号ＰＴＡ−１２３３で、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ （ＡＴＣＣ）に寄託されている）が、培養濾液の調製のために使用された。
【００２３】
腫瘍細胞の増殖を抑制することにおける能力を評価するために、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの粗濾液およびそのフラクションを、ＭＴＴ比色分析アッセイに供した。
【００２４】
“ＭＴＴ−テトラゾリウムアッセイ”としても公知である用語“ＭＴＴ比色分析アッセイ”は、本明細書で使用される場合、Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔによって１９８０年代に確立された抗癌薬スクリーニングスキームを指す（例えば、Alley,M.C.ら、Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.Cancer Res.48:589-601,1988;Scudiero,D. A.ら、Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res.48:4827-4833,1988;Vistica,D.T.ら、Tetrazolium-based assays for cellular viability:a critical examination of selected parameters affecting formazan.Cancer Res.51:2515-2520,1991；およびMonks, A.ら、Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines.J.Nat.Cancer Inst.83:757-766,1991を参照のこと）。
【００２５】
アッセイにおいて、植物または微生物から（この場合、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａから）誘導される潜在的な抗癌薬物または天然産物を、各々がヒト悪性腫瘍の主要な臨床的カテゴリーを示す細胞株パネルのグループに対する能力について試験した。１ウェル当たりの生存細胞数は、ホルマザンの産生に直接比例し、これは可溶化による分光光度法で測定され得る。原則として、生物学的に活性な物質または該物質を含有する天然産物は、細胞増殖を抑制または停止さえし得、そして結果としてほとんどホルマザンが形成されない。
【００２６】
ＭＴＴ比色分析アッセイを使用して、真菌培養において重要なパラメータ、即ち攪拌速度およびｐＨ値を、培養時間にわたってＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの薬理学的活性に対するそれらの効果について評価した。
【００２７】
実験の第１セットにおいて、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物を二重にして、それぞれ２つの異なる過程の攪拌を経験させる。ここで、一方の過程は、真菌に一定のしかし激しい攪拌を与えるように行われ、そして他方は、穏やかから激しい２段階攪拌に関する。比較において、本発明に従う２段階攪拌は、薬理学的活性の早期生成を生じる。より早い段階での穏やかな攪拌は、接種された真菌の栄養増殖（nutritious growth）を可能にするために与えられ、その結果、菌糸体が増殖された培養物得られ得る。培養の終わりに収穫される増大されたサイズの菌糸体ペレットは、穏やかな攪拌段階での成功を示す。穏やかから激しい攪拌速度の移行のための適当なタイミングは、選択される真菌分離株に依存して、広範に変化し得る。通常、真菌分離株が培養物の最終容量に基づいて１０％ｖ／ｖで接種される場合、穏やかな攪拌は約３日間（即ち、約７２時間）続き、そしてその後攪拌速度が上昇される。より遅い段階での激しい攪拌は、生理学的ストレス下に真菌を置くために提供される。このようなストレス下で、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、構成的様式で発現されない二次代謝物の産生を促進することを含む、応答における複数の生理学的変化を経る。薬理学的活性のいくつかの真菌分子は、この方法によって“ストレスアウト（stressed out）”され得ると考えられる。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａへ生理学的ストレスを与えるために適用可能な他の培養パラメータ（例えば、曝気速度、栄養改変および熱的ストレス）がまた、単独でまたは本発明に従う攪拌速度のパラメータと組み合わせて使用され得る。好適な攪拌速度は、上述のように経験的に決定され得るか、または例えばPauline M.Doranにより編集され、Academic Press Ltd.により出版されたBioprocess Engineering Principles、(1995)、p.150-151に記載される式に従って、以下に提供される実験に基づいて、概算され得る。いくつかの場合において、2段階攪拌が好適に適用される場合、真菌培養物は、第６日に赤くなるようである。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、２段階攪拌は、３Ｌの培地が予めロードされた５Ｌ発酵槽（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）において行われ、ここで攪拌は、最初、約３００ｒｐｍ以下、好ましくは約２００ｒｐｍ以下の速度で設定され、そしてその後約４００ｒｐｍ以上、好ましくは約５００ｒｐｍ以上の速度へ上昇された。本発明の別の好ましい実施形態において、２段階攪拌は、１６０Ｌの培地が予めロードされた２５０Ｌ発酵槽（Ｂｉｏ−Ｔｏｐ）において行われ、ここで攪拌速度は、最初、約４０ｒｐｍに設定され、そしてその後約１５０ｒｐｍへ上昇された。
【００２９】
実験の第２セットにおいて、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物が三重にされ(triplicated)、そしてそれぞれ、培養の全期間にわたって、３つの異なる間隔で調整されたｐＨ値で培養される。比較において、ｐＨ４．５〜５．４で行われる培養は、薬理学的活性の早期産生を生じることがわかる。好ましくは、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物のｐＨ値は、培養の全期間にわたって、４．６〜５．３、そしてより好ましくは４．７〜５．２の範囲内に調節される。
【００３０】
上述のような攪拌およびｐＨ値に関する有用なパラメータを利用して、本発明に従うＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養方法が、真菌から誘導される所望の薬理学的活性を維持しながら、１６０リットル容量まで首尾よくスケールアップされる。
【００３１】
本発明の方法によれば、種々の産業用途に利用可能なＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａからの薬理学的に活性な濾液が、経済的、効率的および時間節約的な様式で得られ得る。
【００３２】
本発明はまた、有効な精製方法の確立に関し、これによって、薬理学的に活性な物質に富むものの新規の組成物が、種々の医療用途に利用可能である。本発明によれば、該精製方法は、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの粗濾液を選択的に分離して、約１０ｋＤａ以下、好ましくは約３ｋＤａ以下、そしてより好ましくは約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有するフラクションを得ることによって行われる。該分離方法は、分子量に基づいて分子を分離し得る任意の慣用方法（即ち、モレキュラーシーブとして作用する）によって行われ得る、この例としては、ゲル濾過、密度勾配精製、限外濾過、超遠心分離および当該分野において公知の方法が挙げられる。
【００３３】
本発明によれば、約１ｋＤａ以下の分子量を有する分子を含有するフラクションは、更に極性に基づいて分画されて、水非混和性相を得、ここから薬理学的に活性なフラクションが得られる。水非混和性相は、水と非混和性の有機相または不溶性固相であり得る。本発明の好ましい実施形態において、≦１ｋＤａフラクションは、疎水性真菌分子を選択的に吸着し得る有効量の吸着剤を含有する固定相を通過される。引き続いて、固定相は、所望の薬理学的活性を有するフラクションを得るために溶出される。手短に言えば、固定相は、≦１ｋＤａフラクションから、所望の薬理学的に活性な物質を恐らく含有する疎水性溶質を選択的に吸着しそして濃縮し、その結果、通過物（flow through）に存在する不活性な物質が容易に除去され得る。固定相に含まれる好適な吸着剤は、移動相から疎水性物質を捕獲するように適応された官能基を備える任意の吸着剤であり得る。吸着剤の例は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（Ｓｉｇｍａ）およびその等価物である。分画は、吸着剤の表面上に保持される薬理学的に活性な物質の量が十分である限り、任意の慣用様式によって、例えば１バッチの吸着剤と共に≦１ｋＤａフラクションをインキュベートすること、または吸着剤が充填されたクロマトグラフィーカラムに≦１ｋＤａフラクションを通過させることによって行われ得る。固定相から結合された物質を溶出するために好適な溶出液は、当業者に周知であり、そして従って当業者によって容易に選択され得る。好ましくは、溶出液は、水よりも低い極性、そしてより好ましくはメタノールよりも低い極性を有する有機溶媒である。最も好ましい溶出液としては、酢酸エチルおよびエタノールが挙げられる。
【００３４】
所望の薬理学的活性を示す溶出液は、いくつかの他の物理学的、化学的または生物学的特徴に基づいて、更なる精製手順に供され得る。本発明の好ましい実施形態において、溶出液は、更に疎水性の度合いに基づいて分離され、そしてより好ましくは、分離は、例えばＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラム（Ｍｅｒｃｋ）などにおいて行われる。このように得られる多数のフラクションは、薬理学的に活性であるとわかる。
【００３５】
上記知見は、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａにおける薬理学的活性は、主に１ｋＤａ以下の分子量を有する疎水性化合物から誘導されることを強く示唆する。これは、５００〜２，０００ｋＤａの平均分子量を有する多糖類が、キノコによって保有される抗腫瘍活性の主要源とみなす（Ｍｉｚｕｎｏら、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ−ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｖ．Ｉｎｔｌ．１１（１）：２３−６１）、以前の仮説に反する。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、トリテルペノイド、フラビノイド（flavinoids）、フラボノイド、ステロイド、セスキテルペンラクトン、ならびにフェニルおよびビフェニル化合物のような、低分子量物質に富むと報告される(Chang、前出；Cherngら、Triterpenoids from Antrodia cinnamomea. Pytochem. 41(1) :263-267(1996);Chiangら、A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea.Pytochem.39(1):613-616(1995)；およびYangら、Steroids and Triterpenoids of Antrodia cinnamomea - a fungus parasitic on Cinnamomum Micranthum.Pytochem.41(5):1389-1392 (1996))が、これらの物質と真菌種の薬理学的活性とを結びつける教示は報告されていない。
【００３６】
本発明に従う精製方法は、活性物質が濃縮されそして不活性物質が広範に除去されている多数の組成物を提供する。組成物は、明らかに、ヒトまたは動物の被験体に対して増強された薬理学的効果を有し、そして従って種々の産業応用（例えば、医薬組成物または栄養補助剤の製造）に好適である。従って、本発明はまた、このような処置の必要があるヒトまたは動物患者における疾患（特に癌または腫瘍疾患）を処置するための医薬としての、または例えば食品、飲料および／または飼料の形態で処方される栄養補助剤としての、新規の組成物の使用に関する。
【００３７】
【実施例】
本発明を実施するための好ましい実施形態
以下の実施例は、例示のみのために与えられ、そして本発明の範囲を限定する意図はない。
【００３８】
実施例１：Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの液体培養物の調製
Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２のストック培養物を、−８０℃で維持し、これから小アリコートの真菌をピックアップし、そしてポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ、ＤＩＦＣＯから購入した）のプレートへ配置した。回収後、次いで培養物をポテトデキストロース寒天のスラントチューブ（slant tube）へ移した。スラント培養物を２５℃でインキュベートし、そして２ヶ月ごとに継代培養した。スラント培養物を、仕込み培養物（working cultures）として使用した。菌糸体接種原の調製のために、ＰＤＡプレートに、ＰＤＡスラントからの培養物を接種し、そして２８℃で１５〜２０日間インキュベートした。
【００３９】
菌糸体接種原の調製
インキュベーションを、１５〜３０ｍｍの直径を有する菌糸体コロニーが観察されるまで行った。次いで、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの菌糸体特徴を、汚染が生じていないことを確実にするために、光学顕微鏡下で研究した。全菌糸体を細かい断片へ切断し、次いで３０秒間ホモジナイザー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ）中で５０ｍｌの滅菌水で無菌的にホモジナイズした。菌糸体懸濁液のアリコートを、液内振盪培養（submerged shake cultures）のための接種原として使用した。接種原を、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに予めロードした合成培地（２％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ１：９の容量比で添加した。液内培養物を、一定の攪拌（Ｈｏｔｅｃｈから購入したオービタルロータリーシェイカー(orbital rotary shaker)において５０ｒｐｍで）で、５日間３０℃でインキュベートした。得られた培養物を、引き続いての大規模培養のための接種原として使用した。
【００４０】
実施例２：真菌濾液の薬理学的活性に対する攪拌速度の効果
実施例１で調製したＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２接種原を、５Ｌ発酵槽（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）に予めロードした２．７リットルの合成培地（２％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ ＢＲＬ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ、１：９の容量比で添加した。培養物を、０．６Ｌ／分の曝気速度で３０℃でインキュベートした。培養物のための攪拌速度を、最初、約２００ｒｐｍに設定し、そして７４時間インキュベーション後に約５００ｒｐｍへ上昇させた。試料を、菌糸体接種後の４８、１１３、１７０、２１７および２５９時間で培養物からサンプルし、次いで不溶性物質の大部分を除去するために、吸引濾過漏斗、フラスコおよび真空機のシンプルな濾過アセンブリを通過させた。このように収穫した濾液を、ＮＨ4ＯＨでｐＨ７へ調節して、そしてオートクレービングによって滅菌した。得られたサンプルを、引き続いてのＭＴＴ比色分析アッセイのために４℃で保存した。
【００４１】
非接種培地を、ＭＴＴアッセイについてのネガティブコントロールとして使用した。
【００４２】
ＨｅｐＧ２腫瘍細胞株を、ＭＴＴ比色分析アッセイのために選択した。アッセイの準備として、細胞を、ちょうどＡＴＣＣ培地のように、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足した、α−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中のストックとして維持した。腫瘍細胞株を、細胞培養フラスコから細胞を分離するために、トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を使用して１週間に１または２回継代させた。腫瘍細胞を収穫し、カウントし、そして１ウェル当たり３，０００細胞の濃度で９６−ウェルマイクロタイタープレートへ接種した。各ウェル中の細胞培養培地の総容量を１８０μｌとし、そしてインキュベーションを、５％ＣＯ2で曝気されたインキュベーター中３７℃で一晩行った。
【００４３】
２０μｌアリコートのサンプルを、培養ウェルへ３重で適用し、そして得られた培養物を、上述のインキュベーション条件で７２時間インキュベートした。引き続いて、ＰＢＳ溶液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中５ｍｇ／ｍｌで予め調製した２０μｌのＭＴＴストック溶液（Ｍｅｒｃｋ）を、各ウェルに添加した。
【００４４】
ＣＯ2インキュベーター中３７℃で更に４時間インキュベーションした後、上澄みを各ウェルから除去し、そしてＭＴＴ−ホルマザン生成物を溶解するために、１００μｌの１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａから入手可能）を添加した。メカニカルプレートミキサーで徹底的に混合した後、５４０ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダー（ＭＲＸ、Ｄｙｎｅｘ）で測定した。試験濾液中の腫瘍細胞の相対的生存率は、各実験サンプルの吸光度を対応の非接種化コントロールのそれで除算することによって算出された。
【００４５】
比較例１：
実施例２を、真菌培養物を培養の全期間にわたって約５００ｒｐｍの一定速度でインキュベートしたことを除いて、繰り返した。
【００４６】
実施例２および比較例１からの濾液の処理後の腫瘍細胞の相対的生存率を、表１および図１において比較する。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１において、示される時点でサンプルされた濾液を、Ｈｅｐ Ｇ２腫瘍細胞に対する抑制効果について比較する。菌糸体接種後第１７０時間でピックアップした濾液について、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２は、２００ｒｐｍから５００ｒｐｍへの２段階攪拌を経験した場合、ＭＴＴアッセイにおいて１６％の相対的生存率を提供することがわかり得、これは、３５％のより高い相対生存率が観察される５００ｒｐｍの一定速度で培養した培養物よりも遥かに効果が高い。実施例２および比較例１の抗腫瘍活性は、より遅い時点（第２１７および２５９時間で）でより近く、より遅い段階でのより速い攪拌速度と組み合わせてのより遅い速度での初期攪拌は、培養培地における薬理学的に活性な物質（単数または複数）の早い産生を達成することを示唆する。
【００４９】
首尾一貫した結果が、ＭＴＴアッセイにおいてＡＧＳ、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７腫瘍細胞株を使用する対応実験において観察された（データは示されない）。
【００５０】
実施例３：真菌濾液の薬理学的活性に対するｐＨ値の効果
３つのバッチの合成培地（１．５％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ ＢＲＬ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））を、それぞれ、約４．５（試験Ａ）、５．０（試験Ｂ）および５．５（試験Ｃ）の初期ｐＨを有するように調製し、これへ実施例１で調製した接種原を１：９の比で添加した。得られた培養物を、各培養物のｐＨ値を所定の時点でモニターしそしてＮａＯＨ溶液の添加によって初期ｐＨ値付近へ注意深く調節したことを除いて、実施例２で記載されるように培養した（表２）。培養は３３６時間継続した。ＮａＯＨ溶液の添加についてのタイミングは、選択されたｐＨ値に依存して変化した。例えば、試験Ｂおよび試験Ｃは、それぞれ約４．９〜５．１および約５．４〜５．６の間のｐＨ値を維持するために、第１９２および第１６８時間からＮａＯＨ溶液のアリコートが添加され、一方ＮａＯＨ溶液は、第２４０時間まで試験Ａへ添加されなかった。
【００５１】
【表２】
【００５２】
試料を、菌糸体接種後第９６、１４４、１９２、２４０、２８８および３３６時間での培養物からサンプルし、次いで不溶性物質の大部分を除去するために、吸引濾過漏斗、フラスコおよび真空機のシンプルな濾過アセンブリを通過させた。このように収穫した濾液を、ＮＨ4ＯＨによってｐＨ７へ調節し、そしてオートクレービングによって滅菌した。得られたサンプルを、実施例２に示されるように、ＭＴＴ比色分析アッセイへ供した。非接種培地を、ＭＴＴアッセイのためのネガティブコントロールとして使用した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
表３に示されるように、示される時点でサンプルしたＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液を、Ｈｅｐ Ｇ２腫瘍細胞に対する抑制効果について比較する。菌糸体接種後第１９２時間でピックアップした濾液について、試験Ａおよび試験Ｂにおいて培養したＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２は、試験Ｃにおいて観察されるものよりも低い相対的生存率を生じることがわかる。抗腫瘍効果におけるこのような差異は、第２４０時間で最大となり、そしてより遅い時点で徐々に減少し、ｐＨ４．５〜５．４、好ましくは４．６〜５．３、そしてより好ましくは４．７〜５．２で行われた培養は、培養培地において薬理学的に活性な物質（単数または複数）の早い産生を達成することを示唆する。
【００５５】
首尾一貫した結果が、ＭＴＴアッセイにおいてＡＧＳ、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７腫瘍細胞株を使用する対応実験において観察された（データは示されない）。
【００５６】
実施例４：２５０Ｌ 発酵槽中のＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａのスケールアップ（ scaled-up ）培養
実施例１で調製したＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２を、２５０Ｌ発酵槽（Ｂｉｏ−Ｔｏｐ）に予めロードした１６０リットルの合成培地（１．５％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯＢＲＬ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ、１：９の容量比で添加した。培養物を、０．６Ｌ／分の曝気速度で３０℃でインキュベートした。培養物のための攪拌速度を、最初、約４０ｒｐｍに設定し、そして７０時間インキュベーション後に約１５０ｒｐｍへ上昇させた。培養物のｐＨ値を、培養の全期間にわたって４．９〜５．１の範囲内に調節した。
【００５７】
試料を、菌糸体接種後第９６、１４４、１６８、１８６．５、２４４、および２８４時間で培養物からサンプルし、次いで不溶性物質の大部分を除去するために、慣用方法で濾過した。このように収穫した濾液を、ＮＨ4ＯＨでｐＨ７へ調節して、そしてオートクレービングによって滅菌した。得られたサンプルを、ＭＴＴ比色分析アッセイへ供し、ここでＨｅＬａ、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２およびＭＣＦ−７細胞を、１ウェル当たり１，０００、３，０００、３，０００および３，０００細胞の開始濃度で試験した。非接種培地を、ＭＴＴアッセイについてのネガティブコントロールとして使用した。結果を表４および図４に示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】
表４および図４は、本発明に従うＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養プロセスが、実施例２および３に記載されるような所望の範囲内に攪拌速度およびｐＨ値を設定することによって、１６０リットル容量まで首尾よくスケールアップされることを示す。
【００６０】
実施例５：合成培地中のＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養濾液の調製
ＰＤＡプレートにおいて培養されたＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２の全菌糸体を細かい断片へ切断し、次いで３０秒間ホモジナイザー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ）において５０ｍｌの滅菌水で無菌的にホモジナイズし、その結果、菌糸体懸濁液を得た。１Ｌ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに予めロードされた２００ｍｌの合成培地（２％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ、２０ｍｌの菌糸体懸濁液を添加した。液内培養物を、一定の攪拌（Ｈｏｔｅｃｈから購入したオービタルロータリーシェイカーにおいて７５ｒｐｍで）で、１４日間３０℃でインキュベートした。インキュベーション後、真菌培養物を、吸引濾過漏斗、フラスコおよび真空機のシンプルな濾過アセンブリを通過させた。粗濾液を引き続いての分析のために使用した。
【００６１】
実施例６：Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液からの活性フラクションの調製および分析
実施例５（Ｆ０）からの粗濾液を、製造業者によって提供されるプロトコルに従って、低速度での遠心分離によって、Ｃｅｒｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ １０（１０ｋＤａの分子量カットオフ値を有する、Ａｍｉｃｏｎから購入した市販のミニカラム）を通過させた。一次通過溶液を、フラクションＦ１と称する。次いで、カラムを脱イオン水で再充填し、そして遠心分離を繰り返して二次通過溶液Ｆ２を回収した。カラムに保持された真菌分子を収穫し、そしてＦ３と呼ぶ。
【００６２】
Ｆ１を、３ｋＤａの分子量カットオフ値を有するＣｅｒｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ３ミニカラム（Ａｍｉｃｏｎ）によって更に分画し、その結果、一次通過物（Ｆ４）、二次通過物（Ｆ５）、およびミニカラムに保持されたフラクション（Ｆ６）を上述のように得た。精製スキームを図５に示す。
【００６３】
得られたフラクションを、ＭＴＴ比色分析アッセイへ供し、腫瘍細胞の増殖を抑制する際の能力を評価した。この場合、ＨｅＬａ細胞を、１ウェル当たり１５００細胞の開始濃度で試験し、一方、ＭＲＣ−５、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２およびＭＣＦ−７細胞を１ウェル当たり３，０００細胞を有するように最初にロードした。図６に明らかに実証されるように、Ｆ１およびＦ４の両方によって示される抗腫瘍活性は、粗濾液（Ｆ０）のそれと匹敵する。濾液に存在する薬理学的に活性な物質のほとんどは、全部ではないにしても、低分子量、特に約３ｋＤａ以下の分子量であることを示唆する。
【００６４】
実施例５からの粗濾液（Ｆ０）をまた一連のメンブレンフィルターで分画し、そして、１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有するフラクション（Ｆ７）を得た。抗腫瘍活性がＦ７と共分画されるという事実（図７、最も左のパネル）は、薬理学的に活性な物質の見かけの分子量は約１ｋＤａ以下へ下がり得ることを示す。
【００６５】
上述のＭＴＴアッセイにおいて、減少した生存率が、濾液処理ＭＲＣ−５細胞（正常肺線維芽細胞）において観察され、真菌濾液およびその活性フラクションは、正常な細胞に対して特定の抑制効果を示し得ることを示す。しかし、ＭＲＣ−５細胞は、例えば１ウェル当たり１０，０００細胞まで接種される場合、抑制効果は劇的に減少する。比較として、真菌濾液およびその活性フラクションの有効性は、増加量の腫瘍細胞によって、遥かに少ない影響しか受けなかった（データは示さず）。このインビトロ観察は、本発明に従う組成物は、生存する被験体へ投与されると、正常組織に対して薬理学的に好都合であるが、同時に腫瘍に対しては過酷な影響を与えるであろうという推定に至る。
【００６６】
実施例７：Ａｍｂｅｒｉｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４樹脂におけるＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液の分離
実施例６からのフラクションＦ７を、穏やかに攪拌しながら、１バッチのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。インキュベーションの完了後、樹脂ビーズを遠心分離によって沈殿させた。吸着されていない物質を含有する上澄みおよび樹脂ビーズを、別々に収穫した。その後、ビーズを、等容量の脱イオン水、メタノールおよび酢酸エチルで連続して溶出し、そして３溶出工程からの溶出液を別々に回収した。メタノール溶出液および酢酸エチル溶出液を、減圧下で蒸発乾固させ、そして少量のエタノールに再溶解させた。このように得られたエタノール溶液を、好適な量の滅菌水と共に加えて、続くＭＴＴ比色分析アッセイにおけるエタノールの最終濃度を０．５％以下へ調節した。ＭＴＴ比色分析アッセイを、ネガティブコントロールとして、非接種培地または水中０．５％エタノールを使用して、実施例６に記載されるように行った。結果を図７に示す。
【００６７】
図７において、酢酸エチル溶出液は、全ての５つのタイプの細胞に対して優れた抗腫瘍活性を有することが示され、一方、水およびメタノール溶出液は、細胞に対して有意な効果を示さない。残存する抗腫瘍活性が、上澄み部分において観察され、これは、樹脂による疎水性物質の不完全な吸着から生じると考えられる。結果は、濾液中に存在する薬理学的活性は、主に、約１ｋＤａ以下の分子量の疎水性物質に由来することを示唆する。
【００６８】
実施例８：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ ＲＰ １８カラムにおけるＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液の分離
実施例７からの酢酸エチル溶出液を、更に、Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラム（Ｈｉｂａｒ、予め充填されたカラムＲＴ ２５０−２５；７μｍ；Ｍｅｒｃｋから購入）において分離した。勾配溶出を、５．７ｍｌ／分の流速で、２００分にわたって、４０％〜１００％のアセトニトリル割合を含むアセトニトリル／水の溶出液を使用して行った。２５４ｎｍでの吸光度を、測定しそして図８にプロットする。１２ｍｌのフラクションを回収し、表５に示されるように、いくつかのフラクションへ合わせた。
【００６９】
【表５】
【００７０】
フラクションを減圧下で蒸発乾固させ、そして実施例７に記載されるように、作用溶液に調製した。ＭＴＴ比色分析アッセイを、実施例６に記載されるように行った。結果を図９〜１１に示した。
【００７１】
図９〜１１に実証されるように、フラクションＧ、ＫおよびＬは、ＡＧＳ細胞に対して有意な抑制効果を示し、一方、隣接フラクションＧおよびＨは、ＨｅｐＧ２細胞の生存率を５０％未満のレベルへ抑制する。ＭＣＦ−７細胞は、フラクションＢ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ＬおよびＲによって抑制されるブロードスペクトルを有する。しかし、酢酸エチル溶出液中に見られるＨｅＬａ細胞に対する抑制活性は、逆相分配クロマトグラフィーにおける精製の間にほとんど排除され、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液におけるいくらかの薬理学的活性は、種々の分子の協同作用から生じ得、そしてこの協同は、激しい精製に対して相当に攻撃を受けやすい。
【００７２】
本発明は、上記の特定の実施形態を参照して記載されたが、当業者に明らかであろう種々の改変および変形が、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに成され得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
本発明の上記および他の主題および特徴は、添付の図面と関連してなされる好ましい実施形態の上述の説明を参照して明らかとなるであろう。
【図１】図１は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物から誘導される濾液の抗腫瘍活性を実証するダイヤグラムであり、ここでＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、２つの異なる攪拌条件下で培養される。
【図２】図２は、培養時間にわたる３つのＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物のｐＨ変動を実証するダイヤグラムである。
【図３】図３は、図２に記載されるＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物から誘導された濾液の抗腫瘍活性を実証するダイヤグラムであり、ここでＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、３つの異なる間隔で制御されたｐＨ値で培養される。
【図４】図４は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの大規模（scaled-up）培養物から誘導された濾液の抗腫瘍活性を実証するダイヤグラムである。
【図５】分子量に基づいてＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液についての精製スキームを例示するフローチャートである。
【図６】図６は、図５に従って分離された培養濾液の抗腫瘍活性を実証する棒グラフであり、ここで試験された細胞株は、ＭＲＣ−５、ＨｅＬａ、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２、およびＭＣＦ−７を含む。
【図７】図７は、１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する濾液フラクションからＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を比較する棒グラフであり、ここで試験された細胞株は、、ＭＲＣ−５、ＨｅＬａ、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２、およびＭＣＦ−７を含む。
【図８】図８は、Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラムにおいて分画された図７の酢酸エチル溶出液のスペクトルプロフィールである。
【図９】図９〜１１は、図８において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を実証する。
【図１０】図９〜１１は、図８において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を実証する。
【図１１】図９〜１１は、図８において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を実証する。
関連出願の相互参照
本出願は、２００２年３月２９日に出願された米国特許出願シリアル番号１０／１１３，９０３からの優先権を主張し、この開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、特に培養の間に攪拌速度および／またはｐＨ値を最適化することによる、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物からの薬理学的に活性な濾液の大規模製造に好適である培養条件の確立に関する。本発明はまた、一連の分画によって、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から薬理学的に活性な組成物を得るための方法に関する。本発明は、更に、医薬組成物の製造における上記組成物の使用に向けられる。
【０００３】
関連技術の説明
台湾で“ｎｉｕ−ｃｈａｎｇ−ｃｈｉｈ”または“ｎｉｕ−ｃｈａｎｇ−ｋｕ”としても公知である、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ［（Ｚａｎｇ＆Ｓｕ）Ｓ．−Ｈ．Ｗｕ，Ｒｙｖａｒｄｅｎ＆Ｔ．Ｔ．Ｃｈａｎｇ］は、最近、子実体に見られる円柱形状のその担子胞子、弱いアミロイド骨格菌糸、苦味およびピリエート担子器果に逆向したライトシナモン、ならびに純粋な培養物中の厚膜胞子および分節型分生子（arthroconidia）を特徴とする新規の真菌として報告された。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの詳細な特徴付けおよび分類学的位置は、Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｔ．ら、Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ ｓｐ．ｎｏｖ．ｏｎ Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋａｎｅｈｉｒａｉ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ，Ｍｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．９９（６）：７５６−７５８（１９９５）およびＷｕ，Ｓ．−Ｈ．ら、Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ（“ｎｉｕ−ｃｈａｎｇ−ｃｈｉｈ”），Ｎｅｗ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｆｕｎｇｕｓ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ，Ｂｏｔ．Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．３８：２７３−２７５（１９９７）に記載され、この全開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０００４】
台湾の民間薬において、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、中毒、下痢、腹痛、高血圧、皮癬(skin itches)および肝臓癌によって引き起こされる症状に対してある種の医療効果を有すると考えられている。しかし、厳しい宿主特異性および自然における珍しさのために、並びに人工培養の失敗のために、“niu-chang-chin”は、地元市場において非常に高価である。明らかに、大規模でのこの真菌の人工培養についての費用効果的プロセスを開発することに大きな産業的価値が存在する。
【０００５】
最近、本発明者らは、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、液内発酵に供される場合、所望の薬理学的活性、特に抗腫瘍活性を示すことを見出した。USSN 09/566,834に開示されるように、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、天然培地（即ち、ポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ））、および主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地において、小規模で、首尾よく培養された。得られた培養物は、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ座標系を使用して測定されるような赤色指数ａ≧３を有する深い暗赤色の色外観を呈し、これは、特定の腫瘍細胞株の増殖に対する有意な抑制効果と同時に起こることが示された。より重要なことには、腫瘍細胞へ作用する活性物質は、同定されていないが、真菌菌糸体から培養物の液相へ分泌されることが見出され、その結果、薬理学的に活性な組成物が、産業使用のために、培養物から容易に収穫され得る。
【０００６】
従って、このような有利な方法が、該真菌培養の大規模産生のために最適化されるならば、望ましいであろう。より好ましくは、粗濾液は、所望の活性に富んだ有用な組成物を得るために、所望の薬理学的活性について更に分画される。
【０００７】
発明の要旨
広範な研究が、上述の産業要件を満たすために行われてきた。ここで、驚くべきことに、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの工業的規模の培養のために最適な条件が、特定の範囲内に特定のパラメータを注意深く設定することによって達成され得ることが見出された。この発明において、ｐＨ値および攪拌速度が、培養の間、非常に重要であることがわかった。
【０００８】
従って、本発明の第１局面は、薬理学的活性を有するＡｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物の製造方法であって、
（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株(isolate)の菌糸体接種原(mycelial inoculum)を、該分離株の増殖に好適な培地に接種して、第１培養物を生じさせること；
（ｂ）工程（ａ）から培養された第１培養物を、該接種された分離株の更なる増殖を可能にする第１期間の間および第１所定速度に設定される第１段階の攪拌に供して、菌糸体を有する第２培養物増殖を得ること；および
（ｃ）工程（ｂ）から得られた第２培養物を、第１所定速度とは異なる第２所定速度に設定される第２段階の攪拌へ供して、生理学的ストレス下に該分離株を供すること、
を含む方法を提供することである。
【０００９】
本発明の第２局面によれば、薬理学的活性を有するＡｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物の製造方法であって、
（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；および
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を、工程（ｂ）の間中、４．５〜５．４の範囲へ該培養物のｐＨ値を調節することによって培養すること、
を含む方法を提供することである。
【００１０】
好ましくは、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物のｐＨ値は、工程（ｂ）の間中、４．６〜５．３、そしてより好ましくは４．７〜５．２の範囲内に調節される。
【００１１】
本発明はまた、所望の薬理学的活性（例えば、抗腫瘍活性）についてＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａから分離される、一連の液体フラクションを得るための方法を提供する。従って、本発明の第３局面は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から薬理学的に活性な組成物を得るための方法であって、
（ａ）Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を培養すること；
（ｃ）該培養物から不溶性物質の大部分を除去し、それによって薬理学的に活性な溶液を収穫(harvest)すること；および
（ｄ）工程（ｃ）からの溶液を処理して、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する薬理学的に活性な組成物を得ること、
を含む方法を提供することである。
【００１２】
好ましくは、得られる組成物は、約３ｋＤａ以下、より好ましくは約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する。
【００１３】
本発明の第４局面は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から薬理学的に活性な組成物を得るための方法であって、
（ａ）Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を培養すること；
（ｃ）該培養物から不溶性物質の大部分を除去し、それによって水溶液を収穫すること；
（ｄ）工程（ｃ）からの水溶液を処理して、約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有するフラクションを得ること；および
（ｅ）工程（ｄ）からのフラクションを水非混和性相に通過させ、ここから薬理学的に活性な組成物を得ること、
を含む方法を提供することである。
【００１４】
上記工程（ｅ）からの水非混和性相は、好ましくは、疎水性真菌分子を選択的に吸着し得る有効量の吸着剤を含有する固定相である。固定相は、薬理学的に活性なフラクションが得られるように、溶出される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、工程（ｅ）からの溶出液は、薬理学的活性を有する多数のフラクションを得るために、更に逆相分配クロマトグラフィー（例えば、Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラム（Ｍｅｒｃｋ））へ供される。
【００１６】
本発明は、更に、本発明の方法のいずれか１つから得られるプロダクトを含む、癌または腫瘍疾患の処置のための医薬組成物を提供する。
【００１７】
本発明は、更に、癌または腫瘍疾患の処置が必要である患者における癌または腫瘍疾患の処置方法であって、本発明に従う方法のいずれか１つから得られるプロダクトを含有する組成物を該患者に処方することによる方法を提供する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、一般的に、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物からの薬理学的に活性なフラクションの大規模製造に好適である培養条件の確立に関する。本発明によれば、真菌Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、菌糸体状態でのその栄養増殖を維持しそしてその薬理学的活性を促進するに好適な液体培地において培養される。
【００１９】
用語“好適な培地”は、本明細書中で使用される場合、その薬理学的活性を維持しながらＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの増殖に好適な人工的環境を提供する任意の培地を指す。好ましくは、本発明に使用される培地は、菌糸体における薬理学的に活性な物質（単数または複数）の産生を促進し、そして環境中へのその分泌を促進するに好適である。
【００２０】
本発明における使用に好適な培地としては、“ポテトデキストロースブロス”と呼ばれる天然培地、および主要炭素源としてフルクトースを含む任意の合成培地が挙げられる。ポテトデキストロースブロスは、例えば３００．０ｇの角切りポテト、２０．０ｇのデキストロースおよび１．０Ｌの蒸留水の混合物をオートクレーブすることによって実験室で調製され得るか、または市販源（例えば、ＤＩＦＣＯ）から購入され得る。最も好ましいのは、主要炭素源としてフルクトースを含む合成培地である。必要であれば、他の炭素源、例えばグルコース、スクロース、ガラクトース、フルクトース、コーンスターチ、麦芽抽出物およびその組み合わせが、補助として合成培地に含まれ得る。好ましくは、炭素源は、合成培地の総容量に基づいて、１．５〜２．５重量％、そしてより好ましくは１．５〜２重量％の範囲で存在する。
【００２１】
炭素源に加えて、合成培地は、窒素源、無機塩のような微量元素、および必要に応じてビタミンまたは他の増殖因子を含み得る。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、カザミノ酸、イースト抽出物、ペプトン、トリプトン、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明によれば、合成培地は、窒素源としてイースト抽出物を含有する。窒素源は、好ましくは、合成培地の総容量に基づいて、０．２〜２．０重量％の範囲で、そしてより好ましくは０．５重量％の量で存在する。
【００２２】
Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの任意の利用可能な分離株が、使用される微生物が検出可能な量の薬理学的に活性な代謝物を産生する能力を保有する限り、本発明に従う培養方法において使用され得る。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの有用な分離株としては、ＣＣＲＣ ３５３９６（１９９４年１２月１日に、ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ）のｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＣＲＣ），Ｈｓｉｎｃｈｕ， Ｔａｉｗａｎ， Ｒ．Ｏ．Ｃ．に寄託された）、３５３９８（１９９４年１２月１日）、３５７１６（２０００年５月３日）、３６４０１（２０００年１月２７日）、３６７９５（２０００年１月２７日）および９３００３２（２０００年１月２７日）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態によれば、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２（これはまた、特許手続のために、受託番号ＰＴＡ−１２３３で、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ （ＡＴＣＣ）に寄託されている）が、培養濾液の調製のために使用された。
【００２３】
腫瘍細胞の増殖を抑制することにおける能力を評価するために、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの粗濾液およびそのフラクションを、ＭＴＴ比色分析アッセイに供した。
【００２４】
“ＭＴＴ−テトラゾリウムアッセイ”としても公知である用語“ＭＴＴ比色分析アッセイ”は、本明細書で使用される場合、Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔによって１９８０年代に確立された抗癌薬スクリーニングスキームを指す（例えば、Alley,M.C.ら、Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.Cancer Res.48:589-601,1988;Scudiero,D. A.ら、Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res.48:4827-4833,1988;Vistica,D.T.ら、Tetrazolium-based assays for cellular viability:a critical examination of selected parameters affecting formazan.Cancer Res.51:2515-2520,1991；およびMonks, A.ら、Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines.J.Nat.Cancer Inst.83:757-766,1991を参照のこと）。
【００２５】
アッセイにおいて、植物または微生物から（この場合、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａから）誘導される潜在的な抗癌薬物または天然産物を、各々がヒト悪性腫瘍の主要な臨床的カテゴリーを示す細胞株パネルのグループに対する能力について試験した。１ウェル当たりの生存細胞数は、ホルマザンの産生に直接比例し、これは可溶化による分光光度法で測定され得る。原則として、生物学的に活性な物質または該物質を含有する天然産物は、細胞増殖を抑制または停止さえし得、そして結果としてほとんどホルマザンが形成されない。
【００２６】
ＭＴＴ比色分析アッセイを使用して、真菌培養において重要なパラメータ、即ち攪拌速度およびｐＨ値を、培養時間にわたってＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの薬理学的活性に対するそれらの効果について評価した。
【００２７】
実験の第１セットにおいて、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物を二重にして、それぞれ２つの異なる過程の攪拌を経験させる。ここで、一方の過程は、真菌に一定のしかし激しい攪拌を与えるように行われ、そして他方は、穏やかから激しい２段階攪拌に関する。比較において、本発明に従う２段階攪拌は、薬理学的活性の早期生成を生じる。より早い段階での穏やかな攪拌は、接種された真菌の栄養増殖（nutritious growth）を可能にするために与えられ、その結果、菌糸体が増殖された培養物得られ得る。培養の終わりに収穫される増大されたサイズの菌糸体ペレットは、穏やかな攪拌段階での成功を示す。穏やかから激しい攪拌速度の移行のための適当なタイミングは、選択される真菌分離株に依存して、広範に変化し得る。通常、真菌分離株が培養物の最終容量に基づいて１０％ｖ／ｖで接種される場合、穏やかな攪拌は約３日間（即ち、約７２時間）続き、そしてその後攪拌速度が上昇される。より遅い段階での激しい攪拌は、生理学的ストレス下に真菌を置くために提供される。このようなストレス下で、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、構成的様式で発現されない二次代謝物の産生を促進することを含む、応答における複数の生理学的変化を経る。薬理学的活性のいくつかの真菌分子は、この方法によって“ストレスアウト（stressed out）”され得ると考えられる。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａへ生理学的ストレスを与えるために適用可能な他の培養パラメータ（例えば、曝気速度、栄養改変および熱的ストレス）がまた、単独でまたは本発明に従う攪拌速度のパラメータと組み合わせて使用され得る。好適な攪拌速度は、上述のように経験的に決定され得るか、または例えばPauline M.Doranにより編集され、Academic Press Ltd.により出版されたBioprocess Engineering Principles、(1995)、p.150-151に記載される式に従って、以下に提供される実験に基づいて、概算され得る。いくつかの場合において、2段階攪拌が好適に適用される場合、真菌培養物は、第６日に赤くなるようである。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、２段階攪拌は、３Ｌの培地が予めロードされた５Ｌ発酵槽（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）において行われ、ここで攪拌は、最初、約３００ｒｐｍ以下、好ましくは約２００ｒｐｍ以下の速度で設定され、そしてその後約４００ｒｐｍ以上、好ましくは約５００ｒｐｍ以上の速度へ上昇された。本発明の別の好ましい実施形態において、２段階攪拌は、１６０Ｌの培地が予めロードされた２５０Ｌ発酵槽（Ｂｉｏ−Ｔｏｐ）において行われ、ここで攪拌速度は、最初、約４０ｒｐｍに設定され、そしてその後約１５０ｒｐｍへ上昇された。
【００２９】
実験の第２セットにおいて、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物が三重にされ(triplicated)、そしてそれぞれ、培養の全期間にわたって、３つの異なる間隔で調整されたｐＨ値で培養される。比較において、ｐＨ４．５〜５．４で行われる培養は、薬理学的活性の早期産生を生じることがわかる。好ましくは、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物のｐＨ値は、培養の全期間にわたって、４．６〜５．３、そしてより好ましくは４．７〜５．２の範囲内に調節される。
【００３０】
上述のような攪拌およびｐＨ値に関する有用なパラメータを利用して、本発明に従うＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養方法が、真菌から誘導される所望の薬理学的活性を維持しながら、１６０リットル容量まで首尾よくスケールアップされる。
【００３１】
本発明の方法によれば、種々の産業用途に利用可能なＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａからの薬理学的に活性な濾液が、経済的、効率的および時間節約的な様式で得られ得る。
【００３２】
本発明はまた、有効な精製方法の確立に関し、これによって、薬理学的に活性な物質に富むものの新規の組成物が、種々の医療用途に利用可能である。本発明によれば、該精製方法は、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの粗濾液を選択的に分離して、約１０ｋＤａ以下、好ましくは約３ｋＤａ以下、そしてより好ましくは約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有するフラクションを得ることによって行われる。該分離方法は、分子量に基づいて分子を分離し得る任意の慣用方法（即ち、モレキュラーシーブとして作用する）によって行われ得る、この例としては、ゲル濾過、密度勾配精製、限外濾過、超遠心分離および当該分野において公知の方法が挙げられる。
【００３３】
本発明によれば、約１ｋＤａ以下の分子量を有する分子を含有するフラクションは、更に極性に基づいて分画されて、水非混和性相を得、ここから薬理学的に活性なフラクションが得られる。水非混和性相は、水と非混和性の有機相または不溶性固相であり得る。本発明の好ましい実施形態において、≦１ｋＤａフラクションは、疎水性真菌分子を選択的に吸着し得る有効量の吸着剤を含有する固定相を通過される。引き続いて、固定相は、所望の薬理学的活性を有するフラクションを得るために溶出される。手短に言えば、固定相は、≦１ｋＤａフラクションから、所望の薬理学的に活性な物質を恐らく含有する疎水性溶質を選択的に吸着しそして濃縮し、その結果、通過物（flow through）に存在する不活性な物質が容易に除去され得る。固定相に含まれる好適な吸着剤は、移動相から疎水性物質を捕獲するように適応された官能基を備える任意の吸着剤であり得る。吸着剤の例は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（Ｓｉｇｍａ）およびその等価物である。分画は、吸着剤の表面上に保持される薬理学的に活性な物質の量が十分である限り、任意の慣用様式によって、例えば１バッチの吸着剤と共に≦１ｋＤａフラクションをインキュベートすること、または吸着剤が充填されたクロマトグラフィーカラムに≦１ｋＤａフラクションを通過させることによって行われ得る。固定相から結合された物質を溶出するために好適な溶出液は、当業者に周知であり、そして従って当業者によって容易に選択され得る。好ましくは、溶出液は、水よりも低い極性、そしてより好ましくはメタノールよりも低い極性を有する有機溶媒である。最も好ましい溶出液としては、酢酸エチルおよびエタノールが挙げられる。
【００３４】
所望の薬理学的活性を示す溶出液は、いくつかの他の物理学的、化学的または生物学的特徴に基づいて、更なる精製手順に供され得る。本発明の好ましい実施形態において、溶出液は、更に疎水性の度合いに基づいて分離され、そしてより好ましくは、分離は、例えばＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラム（Ｍｅｒｃｋ）などにおいて行われる。このように得られる多数のフラクションは、薬理学的に活性であるとわかる。
【００３５】
上記知見は、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａにおける薬理学的活性は、主に１ｋＤａ以下の分子量を有する疎水性化合物から誘導されることを強く示唆する。これは、５００〜２，０００ｋＤａの平均分子量を有する多糖類が、キノコによって保有される抗腫瘍活性の主要源とみなす（Ｍｉｚｕｎｏら、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ−ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｖ．Ｉｎｔｌ．１１（１）：２３−６１）、以前の仮説に反する。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、トリテルペノイド、フラビノイド（flavinoids）、フラボノイド、ステロイド、セスキテルペンラクトン、ならびにフェニルおよびビフェニル化合物のような、低分子量物質に富むと報告される(Chang、前出；Cherngら、Triterpenoids from Antrodia cinnamomea. Pytochem. 41(1) :263-267(1996);Chiangら、A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea.Pytochem.39(1):613-616(1995)；およびYangら、Steroids and Triterpenoids of Antrodia cinnamomea - a fungus parasitic on Cinnamomum Micranthum.Pytochem.41(5):1389-1392 (1996))が、これらの物質と真菌種の薬理学的活性とを結びつける教示は報告されていない。
【００３６】
本発明に従う精製方法は、活性物質が濃縮されそして不活性物質が広範に除去されている多数の組成物を提供する。組成物は、明らかに、ヒトまたは動物の被験体に対して増強された薬理学的効果を有し、そして従って種々の産業応用（例えば、医薬組成物または栄養補助剤の製造）に好適である。従って、本発明はまた、このような処置の必要があるヒトまたは動物患者における疾患（特に癌または腫瘍疾患）を処置するための医薬としての、または例えば食品、飲料および／または飼料の形態で処方される栄養補助剤としての、新規の組成物の使用に関する。
【００３７】
【実施例】
本発明を実施するための好ましい実施形態
以下の実施例は、例示のみのために与えられ、そして本発明の範囲を限定する意図はない。
【００３８】
実施例１：Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの液体培養物の調製
Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２のストック培養物を、−８０℃で維持し、これから小アリコートの真菌をピックアップし、そしてポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ、ＤＩＦＣＯから購入した）のプレートへ配置した。回収後、次いで培養物をポテトデキストロース寒天のスラントチューブ（slant tube）へ移した。スラント培養物を２５℃でインキュベートし、そして２ヶ月ごとに継代培養した。スラント培養物を、仕込み培養物（working cultures）として使用した。菌糸体接種原の調製のために、ＰＤＡプレートに、ＰＤＡスラントからの培養物を接種し、そして２８℃で１５〜２０日間インキュベートした。
【００３９】
菌糸体接種原の調製
インキュベーションを、１５〜３０ｍｍの直径を有する菌糸体コロニーが観察されるまで行った。次いで、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの菌糸体特徴を、汚染が生じていないことを確実にするために、光学顕微鏡下で研究した。全菌糸体を細かい断片へ切断し、次いで３０秒間ホモジナイザー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ）中で５０ｍｌの滅菌水で無菌的にホモジナイズした。菌糸体懸濁液のアリコートを、液内振盪培養（submerged shake cultures）のための接種原として使用した。接種原を、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに予めロードした合成培地（２％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ１：９の容量比で添加した。液内培養物を、一定の攪拌（Ｈｏｔｅｃｈから購入したオービタルロータリーシェイカー(orbital rotary shaker)において５０ｒｐｍで）で、５日間３０℃でインキュベートした。得られた培養物を、引き続いての大規模培養のための接種原として使用した。
【００４０】
実施例２：真菌濾液の薬理学的活性に対する攪拌速度の効果
実施例１で調製したＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２接種原を、５Ｌ発酵槽（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）に予めロードした２．７リットルの合成培地（２％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ ＢＲＬ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ、１：９の容量比で添加した。培養物を、０．６Ｌ／分の曝気速度で３０℃でインキュベートした。培養物のための攪拌速度を、最初、約２００ｒｐｍに設定し、そして７４時間インキュベーション後に約５００ｒｐｍへ上昇させた。試料を、菌糸体接種後の４８、１１３、１７０、２１７および２５９時間で培養物からサンプルし、次いで不溶性物質の大部分を除去するために、吸引濾過漏斗、フラスコおよび真空機のシンプルな濾過アセンブリを通過させた。このように収穫した濾液を、ＮＨ4ＯＨでｐＨ７へ調節して、そしてオートクレービングによって滅菌した。得られたサンプルを、引き続いてのＭＴＴ比色分析アッセイのために４℃で保存した。
【００４１】
非接種培地を、ＭＴＴアッセイについてのネガティブコントロールとして使用した。
【００４２】
ＨｅｐＧ２腫瘍細胞株を、ＭＴＴ比色分析アッセイのために選択した。アッセイの準備として、細胞を、ちょうどＡＴＣＣ培地のように、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足した、α−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中のストックとして維持した。腫瘍細胞株を、細胞培養フラスコから細胞を分離するために、トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を使用して１週間に１または２回継代させた。腫瘍細胞を収穫し、カウントし、そして１ウェル当たり３，０００細胞の濃度で９６−ウェルマイクロタイタープレートへ接種した。各ウェル中の細胞培養培地の総容量を１８０μｌとし、そしてインキュベーションを、５％ＣＯ2で曝気されたインキュベーター中３７℃で一晩行った。
【００４３】
２０μｌアリコートのサンプルを、培養ウェルへ３重で適用し、そして得られた培養物を、上述のインキュベーション条件で７２時間インキュベートした。引き続いて、ＰＢＳ溶液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中５ｍｇ／ｍｌで予め調製した２０μｌのＭＴＴストック溶液（Ｍｅｒｃｋ）を、各ウェルに添加した。
【００４４】
ＣＯ2インキュベーター中３７℃で更に４時間インキュベーションした後、上澄みを各ウェルから除去し、そしてＭＴＴ−ホルマザン生成物を溶解するために、１００μｌの１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａから入手可能）を添加した。メカニカルプレートミキサーで徹底的に混合した後、５４０ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダー（ＭＲＸ、Ｄｙｎｅｘ）で測定した。試験濾液中の腫瘍細胞の相対的生存率は、各実験サンプルの吸光度を対応の非接種化コントロールのそれで除算することによって算出された。
【００４５】
比較例１：
実施例２を、真菌培養物を培養の全期間にわたって約５００ｒｐｍの一定速度でインキュベートしたことを除いて、繰り返した。
【００４６】
実施例２および比較例１からの濾液の処理後の腫瘍細胞の相対的生存率を、表１および図１において比較する。
【００４７】
【表１】
表１において、示される時点でサンプルされた濾液を、Ｈｅｐ Ｇ２腫瘍細胞に対する抑制効果について比較する。菌糸体接種後第１７０時間でピックアップした濾液について、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２は、２００ｒｐｍから５００ｒｐｍへの２段階攪拌を経験した場合、ＭＴＴアッセイにおいて１６％の相対的生存率を提供することがわかり得、これは、３５％のより高い相対生存率が観察される５００ｒｐｍの一定速度で培養した培養物よりも遥かに効果が高い。実施例２および比較例１の抗腫瘍活性は、より遅い時点（第２１７および２５９時間で）でより近く、より遅い段階でのより速い攪拌速度と組み合わせてのより遅い速度での初期攪拌は、培養培地における薬理学的に活性な物質（単数または複数）の早い産生を達成することを示唆する。
【００４９】
首尾一貫した結果が、ＭＴＴアッセイにおいてＡＧＳ、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７腫瘍細胞株を使用する対応実験において観察された（データは示されない）。
【００５０】
実施例３：真菌濾液の薬理学的活性に対するｐＨ値の効果
３つのバッチの合成培地（１．５％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ ＢＲＬ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））を、それぞれ、約４．５（試験Ａ）、５．０（試験Ｂ）および５．５（試験Ｃ）の初期ｐＨを有するように調製し、これへ実施例１で調製した接種原を１：９の比で添加した。得られた培養物を、各培養物のｐＨ値を所定の時点でモニターしそしてＮａＯＨ溶液の添加によって初期ｐＨ値付近へ注意深く調節したことを除いて、実施例２で記載されるように培養した（表２）。培養は３３６時間継続した。ＮａＯＨ溶液の添加についてのタイミングは、選択されたｐＨ値に依存して変化した。例えば、試験Ｂおよび試験Ｃは、それぞれ約４．９〜５．１および約５．４〜５．６の間のｐＨ値を維持するために、第１９２および第１６８時間からＮａＯＨ溶液のアリコートが添加され、一方ＮａＯＨ溶液は、第２４０時間まで試験Ａへ添加されなかった。
【００５１】
【表２】
試料を、菌糸体接種後第９６、１４４、１９２、２４０、２８８および３３６時間での培養物からサンプルし、次いで不溶性物質の大部分を除去するために、吸引濾過漏斗、フラスコおよび真空機のシンプルな濾過アセンブリを通過させた。このように収穫した濾液を、ＮＨ4ＯＨによってｐＨ７へ調節し、そしてオートクレービングによって滅菌した。得られたサンプルを、実施例２に示されるように、ＭＴＴ比色分析アッセイへ供した。非接種培地を、ＭＴＴアッセイのためのネガティブコントロールとして使用した。
【００５３】
【表３】
表３に示されるように、示される時点でサンプルしたＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液を、Ｈｅｐ Ｇ２腫瘍細胞に対する抑制効果について比較する。菌糸体接種後第１９２時間でピックアップした濾液について、試験Ａおよび試験Ｂにおいて培養したＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２は、試験Ｃにおいて観察されるものよりも低い相対的生存率を生じることがわかる。抗腫瘍効果におけるこのような差異は、第２４０時間で最大となり、そしてより遅い時点で徐々に減少し、ｐＨ４．５〜５．４、好ましくは４．６〜５．３、そしてより好ましくは４．７〜５．２で行われた培養は、培養培地において薬理学的に活性な物質（単数または複数）の早い産生を達成することを示唆する。
【００５５】
首尾一貫した結果が、ＭＴＴアッセイにおいてＡＧＳ、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７腫瘍細胞株を使用する対応実験において観察された（データは示されない）。
【００５６】
実施例４：２５０Ｌ 発酵槽中のＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａのスケールアップ（ scaled-up ）培養
実施例１で調製したＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２を、２５０Ｌ発酵槽（Ｂｉｏ−Ｔｏｐ）に予めロードした１６０リットルの合成培地（１．５％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯＢＲＬ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ、１：９の容量比で添加した。培養物を、０．６Ｌ／分の曝気速度で３０℃でインキュベートした。培養物のための攪拌速度を、最初、約４０ｒｐｍに設定し、そして７０時間インキュベーション後に約１５０ｒｐｍへ上昇させた。培養物のｐＨ値を、培養の全期間にわたって４．９〜５．１の範囲内に調節した。
【００５７】
試料を、菌糸体接種後第９６、１４４、１６８、１８６．５、２４４、および２８４時間で培養物からサンプルし、次いで不溶性物質の大部分を除去するために、慣用方法で濾過した。このように収穫した濾液を、ＮＨ4ＯＨでｐＨ７へ調節して、そしてオートクレービングによって滅菌した。得られたサンプルを、ＭＴＴ比色分析アッセイへ供し、ここでＨｅＬａ、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２およびＭＣＦ−７細胞を、１ウェル当たり１，０００、３，０００、３，０００および３，０００細胞の開始濃度で試験した。非接種培地を、ＭＴＴアッセイについてのネガティブコントロールとして使用した。結果を表４および図４に示す。
【００５８】
【表４】
表４および図４は、本発明に従うＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養プロセスが、実施例２および３に記載されるような所望の範囲内に攪拌速度およびｐＨ値を設定することによって、１６０リットル容量まで首尾よくスケールアップされることを示す。
【００６０】
実施例５：合成培地中のＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養濾液の調製
ＰＤＡプレートにおいて培養されたＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ ＣＣＲＣ ９３００３２の全菌糸体を細かい断片へ切断し、次いで３０秒間ホモジナイザー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ）において５０ｍｌの滅菌水で無菌的にホモジナイズし、その結果、菌糸体懸濁液を得た。１Ｌ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに予めロードされた２００ｍｌの合成培地（２％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ、２０ｍｌの菌糸体懸濁液を添加した。液内培養物を、一定の攪拌（Ｈｏｔｅｃｈから購入したオービタルロータリーシェイカーにおいて７５ｒｐｍで）で、１４日間３０℃でインキュベートした。インキュベーション後、真菌培養物を、吸引濾過漏斗、フラスコおよび真空機のシンプルな濾過アセンブリを通過させた。粗濾液を引き続いての分析のために使用した。
【００６１】
実施例６：Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液からの活性フラクションの調製および分析
実施例５（Ｆ０）からの粗濾液を、製造業者によって提供されるプロトコルに従って、低速度での遠心分離によって、Ｃｅｒｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ １０（１０ｋＤａの分子量カットオフ値を有する、Ａｍｉｃｏｎから購入した市販のミニカラム）を通過させた。一次通過溶液を、フラクションＦ１と称する。次いで、カラムを脱イオン水で再充填し、そして遠心分離を繰り返して二次通過溶液Ｆ２を回収した。カラムに保持された真菌分子を収穫し、そしてＦ３と呼ぶ。
【００６２】
Ｆ１を、３ｋＤａの分子量カットオフ値を有するＣｅｒｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ３ミニカラム（Ａｍｉｃｏｎ）によって更に分画し、その結果、一次通過物（Ｆ４）、二次通過物（Ｆ５）、およびミニカラムに保持されたフラクション（Ｆ６）を上述のように得た。精製スキームを図５に示す。
【００６３】
得られたフラクションを、ＭＴＴ比色分析アッセイへ供し、腫瘍細胞の増殖を抑制する際の能力を評価した。この場合、ＨｅＬａ細胞を、１ウェル当たり１５００細胞の開始濃度で試験し、一方、ＭＲＣ−５、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２およびＭＣＦ−７細胞を１ウェル当たり３，０００細胞を有するように最初にロードした。図６に明らかに実証されるように、Ｆ１およびＦ４の両方によって示される抗腫瘍活性は、粗濾液（Ｆ０）のそれと匹敵する。濾液に存在する薬理学的に活性な物質のほとんどは、全部ではないにしても、低分子量、特に約３ｋＤａ以下の分子量であることを示唆する。
【００６４】
実施例５からの粗濾液（Ｆ０）をまた一連のメンブレンフィルターで分画し、そして、１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有するフラクション（Ｆ７）を得た。抗腫瘍活性がＦ７と共分画されるという事実（図７、最も左のパネル）は、薬理学的に活性な物質の見かけの分子量は約１ｋＤａ以下へ下がり得ることを示す。
【００６５】
上述のＭＴＴアッセイにおいて、減少した生存率が、濾液処理ＭＲＣ−５細胞（正常肺線維芽細胞）において観察され、真菌濾液およびその活性フラクションは、正常な細胞に対して特定の抑制効果を示し得ることを示す。しかし、ＭＲＣ−５細胞は、例えば１ウェル当たり１０，０００細胞まで接種される場合、抑制効果は劇的に減少する。比較として、真菌濾液およびその活性フラクションの有効性は、増加量の腫瘍細胞によって、遥かに少ない影響しか受けなかった（データは示さず）。このインビトロ観察は、本発明に従う組成物は、生存する被験体へ投与されると、正常組織に対して薬理学的に好都合であるが、同時に腫瘍に対しては過酷な影響を与えるであろうという推定に至る。
【００６６】
実施例７：Ａｍｂｅｒｉｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４樹脂におけるＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液の分離
実施例６からのフラクションＦ７を、穏やかに攪拌しながら、１バッチのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。インキュベーションの完了後、樹脂ビーズを遠心分離によって沈殿させた。吸着されていない物質を含有する上澄みおよび樹脂ビーズを、別々に収穫した。その後、ビーズを、等容量の脱イオン水、メタノールおよび酢酸エチルで連続して溶出し、そして３溶出工程からの溶出液を別々に回収した。メタノール溶出液および酢酸エチル溶出液を、減圧下で蒸発乾固させ、そして少量のエタノールに再溶解させた。このように得られたエタノール溶液を、好適な量の滅菌水と共に加えて、続くＭＴＴ比色分析アッセイにおけるエタノールの最終濃度を０．５％以下へ調節した。ＭＴＴ比色分析アッセイを、ネガティブコントロールとして、非接種培地または水中０．５％エタノールを使用して、実施例６に記載されるように行った。結果を図７に示す。
【００６７】
図７において、酢酸エチル溶出液は、全ての５つのタイプの細胞に対して優れた抗腫瘍活性を有することが示され、一方、水およびメタノール溶出液は、細胞に対して有意な効果を示さない。残存する抗腫瘍活性が、上澄み部分において観察され、これは、樹脂による疎水性物質の不完全な吸着から生じると考えられる。結果は、濾液中に存在する薬理学的活性は、主に、約１ｋＤａ以下の分子量の疎水性物質に由来することを示唆する。
【００６８】
実施例８：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ ＲＰ １８カラムにおけるＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液の分離
実施例７からの酢酸エチル溶出液を、更に、Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラム（Ｈｉｂａｒ、予め充填されたカラムＲＴ ２５０−２５；７μｍ；Ｍｅｒｃｋから購入）において分離した。勾配溶出を、５．７ｍｌ／分の流速で、２００分にわたって、４０％〜１００％のアセトニトリル割合を含むアセトニトリル／水の溶出液を使用して行った。２５４ｎｍでの吸光度を、測定しそして図８にプロットする。１２ｍｌのフラクションを回収し、表５に示されるように、いくつかのフラクションへ合わせた。
【００６９】
【表５】
フラクションを減圧下で蒸発乾固させ、そして実施例７に記載されるように、作用溶液に調製した。ＭＴＴ比色分析アッセイを、実施例６に記載されるように行った。結果を図９〜１１に示した。
【００７１】
図９〜１１に実証されるように、フラクションＧ、ＫおよびＬは、ＡＧＳ細胞に対して有意な抑制効果を示し、一方、隣接フラクションＧおよびＨは、ＨｅｐＧ２細胞の生存率を５０％未満のレベルへ抑制する。ＭＣＦ−７細胞は、フラクションＢ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ＬおよびＲによって抑制されるブロードスペクトルを有する。しかし、酢酸エチル溶出液中に見られるＨｅＬａ細胞に対する抑制活性は、逆相分配クロマトグラフィーにおける精製の間にほとんど排除され、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液におけるいくらかの薬理学的活性は、種々の分子の協同作用から生じ得、そしてこの協同は、激しい精製に対して相当に攻撃を受けやすい。
【００７２】
本発明は、上記の特定の実施形態を参照して記載されたが、当業者に明らかであろう種々の改変および変形が、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに成され得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
本発明の上記および他の主題および特徴は、添付の図面と関連してなされる好ましい実施形態の上述の説明を参照して明らかとなるであろう。
【図１】図１は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物から誘導される濾液の抗腫瘍活性を実証するダイヤグラムであり、ここでＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、２つの異なる攪拌条件下で培養される。
【図２】図２は、培養時間にわたる３つのＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物のｐＨ変動を実証するダイヤグラムである。
【図３】図３は、図２に記載されるＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物から誘導された濾液の抗腫瘍活性を実証するダイヤグラムであり、ここでＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、３つの異なる間隔で制御されたｐＨ値で培養される。
【図４】図４は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの大規模（scaled-up）培養物から誘導された濾液の抗腫瘍活性を実証するダイヤグラムである。
【図５】分子量に基づいてＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液についての精製スキームを例示するフローチャートである。
【図６】図６は、図５に従って分離された培養濾液の抗腫瘍活性を実証する棒グラフであり、ここで試験された細胞株は、ＭＲＣ−５、ＨｅＬａ、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２、およびＭＣＦ−７を含む。
【図７】図７は、１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する濾液フラクションからＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を比較する棒グラフであり、ここで試験された細胞株は、、ＭＲＣ−５、ＨｅＬａ、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２、およびＭＣＦ−７を含む。
【図８】図８は、Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラムにおいて分画された図７の酢酸エチル溶出液のスペクトルプロフィールである。
【図９】図９〜１１は、図８において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を実証する。
【図１０】図９〜１１は、図８において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を実証する。
【図１１】図９〜１１は、図８において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を実証する。
Claims (19)
- Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から腫瘍又は癌細胞の増殖を抑制する活性を有する組成物を得るための方法であって、以下：
（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な液体培地に接種して、第１培養物を生じさせること；
（ｂ）工程（ａ）からの第１培養物を培養すること；
（ｃ）工程（ｂ）の培養物から不溶性物質の大部分を除去することによって腫瘍又は癌細胞の生育を抑制する活性を有する溶液を収穫すること；および
（ｄ）工程（ｃ）からの溶液を、分子量に基づいて選択的に分離して、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する真菌により産生された物質を含有する腫瘍又は癌細胞の増殖を抑制する活性を有する組成物を得ること；
を含む、方法。 - 工程（ｄ）で得られる組成物が、約３ｋＤａ以下の分子量を有する真菌によって産生された物質を含有する、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｄ）で得られる組成物が、約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌によって産生された物質を含有する、請求項１に記載の方法。
- Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から腫瘍又は癌細胞の生育を抑制する活性を有する組成物を得るための方法であって；
（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な液体培地に接種することによって、第１培養物を生じさせること；
（ｂ）工程（ａ）からの第１培養物を培養すること；
（ｃ）工程（ｂ）の培養物から不溶性物質の大部分を除去することによって腫瘍又は癌細胞の生育を抑制する活性を有する溶液を収穫すること；および
（ｄ）工程（ｃ）から得られた溶液を、分子量に基づいて選択的に分離して、約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌により産生された物質を含有するフラクションを得ること；
（ｅ）工程（ｄ）から得られたフラクションを、極性に基づくクロマトグラフィー分離に供して、疎水性である真菌によって産生される物質を含む腫瘍又は癌細胞の生育を抑制する活性を有する組成物を得ること；
を含む、方法。 - クロマトグラフィー分離工程（ｅ）が、疎水性の真菌によって産生される物質を選択的に吸着し得る有効量の吸着剤を含有する水非混和性固定相を用いて行われ、そして有機溶媒を用いて該水非混和性固定相を溶出して該腫瘍又は癌細胞の生育を抑制する活性を有する組成物を得る、請求項４に記載の方法。
- 該水非混和性固定相が、吸着剤としてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４樹脂を含む、請求項４に記載の方法。
- 該選択的分離工程（ｅ）において、水よりも低い極性を有する有機溶媒が水非混和性固定相を溶出させるために使用される、請求項５に記載の方法。
- 該有機溶媒が、メタノールよりも低い極性を有する、請求項７に記載の方法。
- 該有機溶媒が、酢酸エチルおよびエタノールからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
- 更に；
（ｆ）工程（ｅ）において得られる組成物を逆相分配クロマトグラフィーに供し、腫瘍又は癌細胞の生育を抑制する活性を有するフラクションを得ること；
を含む、請求項４に記載の方法。 - 培養工程（ｂ）が、以下のサブ工程；
（ｉ） 工程（ａ）において得られる第１培養物を、該接種された分離株の増殖を可能にする第１の期間および第１の所定速度に設定される第１段階の攪拌に供して、増殖した菌糸体を有する第２の培養物を得ること；および
（ｉｉ） サブ工程（ｉ）から得られる第２の培養物を、第１所定速度よりも速い第２所定速度に設定される第２段階の攪拌に供して、該第２培養物中の増殖した該分離株を生理学的ストレス下で培養すること；
を含む、請求項１又は４記載の方法。 - サブ工程（ｉ）および（ｉｉ）において、工程（ａ）からの第１培養物およびサブ工程（ｉ）から得られた第２培養物が、４．５〜５．４の範囲に調整されたｐＨ値で各々培養される、請求項１１に記載の方法。
- 工程（ａ）から得られた第１培養物およびサブ工程（ｉ）から得られた第２培養物が、４．６〜５．３の範囲に調整されたｐＨ値で各々培養される、請求項１２に記載の方法。
- 工程（ａ）からの第１培養物およびサブ工程（ｉ）からの第２培養物が、４．７〜５．２の範囲に調整されたｐＨ値で培養される、請求項１３に記載の方法。
- Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株がＣＣＲＣ ９３００３２（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１２３３）、ＣＣＲＣ ３５３９６、ＣＣＲＣ ３５３９８およびＣＣＲＣ ３５７１６からなる群から選択される、請求項１又は４に記載の方法。
- 工程（ａ）で使用される培地が、ポテトデキストロースブロス、および主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地からなる群から選択される、請求項１又は４に記載の方法。
- 工程（ａ）で使用される培地が、主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地である、請求項１６に記載の方法。
- 請求項１又は４に記載の方法から得られるプロダクト。
- 請求項１又は４に記載の方法から得られるプロダクトを含有する、腫瘍又は癌疾患を治療するための医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10/113,903 US6767543B2 (en) | 2000-02-17 | 2002-03-29 | Process for producing a culture of Antrodia camphorata and product obtained thereby |
| US10/113,903 | 2002-03-29 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006195298A Division JP4203771B2 (ja) | 2002-03-29 | 2006-07-18 | Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物の製造方法およびそれによって得られるプロダクト |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003289892A JP2003289892A (ja) | 2003-10-14 |
| JP4081663B2 true JP4081663B2 (ja) | 2008-04-30 |
Family
ID=28789789
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002268194A Expired - Fee Related JP4081663B2 (ja) | 2002-03-29 | 2002-09-13 | Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物の製造方法およびそれによって得られるプロダクト |
| JP2006195298A Expired - Fee Related JP4203771B2 (ja) | 2002-03-29 | 2006-07-18 | Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物の製造方法およびそれによって得られるプロダクト |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006195298A Expired - Fee Related JP4203771B2 (ja) | 2002-03-29 | 2006-07-18 | Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物の製造方法およびそれによって得られるプロダクト |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JP4081663B2 (ja) |
| CN (2) | CN1247767C (ja) |
| TW (2) | TWI279439B (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5403844B2 (ja) * | 2004-03-02 | 2014-01-29 | 善笙生物科技股▲分▼有限公司 | ＡｎｔｒｏｄｉａＣａｍｐｈｏｒａｔａの菌糸体から得た新規な混合物及び化合物、並びにその使用 |
| JP4921754B2 (ja) * | 2005-09-16 | 2012-04-25 | 株式会社ノエビア | メラニン産生促進剤及び中性脂肪蓄積抑制剤 |
| CN100371450C (zh) * | 2005-09-28 | 2008-02-27 | 莱阳农学院 | 樟芝菌丝体中脂肪酸提取物及其应用 |
| TW200819041A (en) * | 2006-10-27 | 2008-05-01 | Da-Ming Tsai | Method for cultivating Antrodia camphorate |
| CN101785402B (zh) * | 2009-01-23 | 2012-05-30 | 伟诚生物科技有限公司 | 具备高多醣体及三萜类含量的樟芝的培养方法 |
| TWI389699B (zh) | 2009-02-13 | 2013-03-21 | 高雄醫學大學 | 用於誘導細胞凋亡之樟芝子實體乙醇萃取物及其製備方法 |
| TWI448294B (zh) | 2009-03-04 | 2014-08-11 | 高雄醫學大學 | 增強免疫活性之樟芝子實體水萃取物及其製備方法 |
| ES2574606T3 (es) * | 2009-11-26 | 2016-06-21 | National Taiwan University | Una sustancia activa contra el cáncer de Antrodia camphorata, método de preparación de la misma y uso de la misma |
| CN102232940B (zh) * | 2010-05-06 | 2013-03-27 | 国鼎生物科技股份有限公司 | 用于抑制大肠癌肿瘤细胞生长的牛樟芝环己烯酮化合物 |
| CN102232943B (zh) * | 2010-05-06 | 2013-03-20 | 国鼎生物科技股份有限公司 | 用于抑制皮肤癌肿瘤细胞生长的牛樟芝环己烯酮化合物 |
| TWI454301B (zh) | 2011-01-10 | 2014-10-01 | Univ Kaohsiung Medical | 樟芝子實體苯類化合物、製備與分析方法 |
| WO2014148132A1 (ja) * | 2013-03-19 | 2014-09-25 | オリジンバイオテクノロジー株式会社 | 深部培養法を用いた担子菌又は子嚢菌による有用物質製造方法及び製造装置 |
-
2002
- 2002-08-26 TW TW94110464A patent/TWI279439B/zh not_active IP Right Cessation
- 2002-08-26 TW TW091119289A patent/TWI241344B/zh not_active IP Right Cessation
- 2002-09-13 JP JP2002268194A patent/JP4081663B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-02 CN CN 02154843 patent/CN1247767C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-02 CN CN 200510056384 patent/CN1679911A/zh active Pending
-
2006
- 2006-07-18 JP JP2006195298A patent/JP4203771B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1679911A (zh) | 2005-10-12 |
| TW200526241A (en) | 2005-08-16 |
| JP2006288405A (ja) | 2006-10-26 |
| CN1448501A (zh) | 2003-10-15 |
| TWI241344B (en) | 2005-10-11 |
| CN1247767C (zh) | 2006-03-29 |
| TWI279439B (en) | 2007-04-21 |
| JP2003289892A (ja) | 2003-10-14 |
| HK1056746A1 (en) | 2004-02-27 |
| JP4203771B2 (ja) | 2009-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3111470B2 (ja) | 新規ポリペプチド化合物およびその製造法 | |
| JP4081663B2 (ja) | Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物の製造方法およびそれによって得られるプロダクト | |
| US6767543B2 (en) | Process for producing a culture of Antrodia camphorata and product obtained thereby | |
| CN110551764B (zh) | 一种提高功能性红曲开环洛伐他汀含量的培养基及发酵方法 | |
| CN1352990A (zh) | 樟芝菌丝体生物活性物质其制备法及含其组成物 | |
| JP2001231545A (ja) | アントロディアカンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株、その培養物の生産方法、及びそれにより得られる産生物 | |
| WO1998056755A1 (en) | Physiologically active substances tkr2449, process for producing the same, and microorganism | |
| EP0846699A1 (en) | Substance wf16616, process for production thereof, and use thereof | |
| CN108251490B (zh) | 一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸a的发酵培养基及发酵方法 | |
| JP2646707B2 (ja) | 新規化合物ｗｆ２０１５ａおよびｂ、それらの製造法ならびにそれらを含有する組成物 | |
| HK1080729A (en) | Process for producing a culture of anthrodia camphorata and product obtained thereby | |
| HK1056746B (en) | Process for producing a culture of antrodia camphorata and product obtained thereby | |
| EP0525361A1 (en) | Novel antibiotics NK374186A, NK374186B, NK374186B3 and NK374186C3, process for producing the same, and use of the same | |
| JPH07506332A (ja) | 医薬としての複素環化合物のリン酸エステル | |
| JPH05194571A (ja) | 新規抗生物質ｎｋ３７４１８６ａ、ｎｋ３７４１８６ｂ、ｎｋ３７４１８６ｂ３及びｎｋ３７４１８６ｃ３、その製造法及びその用途 | |
| JPS591427A (ja) | 喘息病治療剤 | |
| JPH09309859A (ja) | 新規化合物ａｍ６８９８及びその製法 | |
| JPH11290087A (ja) | 新規生理活性物質ｎｆ０７５１１、その製造法及びその用途 | |
| JPH0259596A (ja) | 新規物質、その使用および製造 | |
| JPH0347120A (ja) | Ｆｒ１２５７５６物質および／またはｆｒ１２５０３５物質を含有する血管新生阻害剤およびその製造法 | |
| JPH05221867A (ja) | Ｉｌ−６誘導剤 | |
| JPH08231407A (ja) | 抗ホルモン療法剤ｗｋ４０２８ａ、ｂ、ｃ及びｄ並びにその製造法 | |
| JPH11116577A (ja) | 新規化合物ａｍ６８９８ｅ及びその製法 | |
| HK1038381A1 (zh) | 樟芝分離株、製備樟芝培養物的方法及所得的產物 | |
| JPH10139771A (ja) | 新規化合物ａｍ６９２７及びその製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060215 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20060510 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20060515 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060718 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060809 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060718 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20061107 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20061110 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070124 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20061221 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070411 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080109 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080129 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4081663 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110222 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110222 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120222 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120222 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130222 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140222 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |