CN1159432C - 樟芝分离株、制备樟芝培养物的方法及所得的产物 - Google Patents
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Abstract
一种用于培养樟芝(Antrodia camphorata)分离株的方法，以提供一种供用于医学及给养领域的产物。另外也涉及一种樟芝分离株，该分离株能生长于一适当的人工培养基内，并展现出所欲的药理活性，特别是抗肿瘤活性。利用马铃薯右旋糖培养液或含有果糖作为主要碳源的合成培养基能致使樟芝培养物的药理活性显著地增加。
Description
本发明涉及一种用于培养樟芝(Antrodia camphorata)分离株的方法，以提供一种用于医学及给养领域的产物。本发明也涉及一种新的樟芝分离株，当该分离株生长于一适当的培养基内时，其培养物能展出现药理活性。
樟芝(Antrodia camphorata)[(Zang & Su)S.-H，Wu，Ryvarden &T.T.Chang]，在台湾也被称为“牛樟芝”或“牛樟菇”，近来已被报导成为一个新的真菌物种，其特征在于出现在子实体(fruit bodies)上的圆柱状担孢子、微呈淀粉状的基干菌丝、苦味、淡肉桂色扁平状至伞状的担子果，以及在纯质培养基中的厚壁孢子与关节孢子(anthroconidia)。这种真菌的生长极为缓慢，且限于台湾地方所特有的树种—牛樟(Cinnamomum kanehirai Hay(Lauraceae))—作为唯一宿主。樟芝的详细特性与分类地位被叙述于Chang，T，T，et al.，Antrodiacinnamomea sp.nov.on Cinnamomum kanehirai in Taiwan，Mycol，Res.99(6)：756-758(1995)and Wu，S.-H.，et al.，Antrodiacinnamomea(“niu-chang-chih”)，New combination of a medicinal fungusin Taiwan，Bot.Bull.Acad.Sin.38：273-275(1997)，该等文献的全部揭露内容是被纳入于此作为参考资料。
在台湾民俗医学上，樟芝的子实体被认为具有某些医药功效。依据以往的方法，该子实体是被磨成干燥粉末或与其他药草共同熬煮以供口服，来治疗因中毒、腹泻、腹痛、高血压、皮肤搔养及肝癌所引起的症状。然而，至今仍没有任何药理或临床研究出现在文献中。由于严苛的宿主专一性与在自然界中的稀有性，以及在人工栽培上的失败，所以“牛樟芝”在台湾极为昂贵。近年来，品质良好的真菌子实体甚至可以在市面上卖到每公斤约15,000美元。
因此，业界对于建构出一种用以将樟芝大量培养于适当的人工环境并维持其药理活性的方法存有需求。业界也对于获取一种被培养于适当人工环境时能展现出有用药学活性的樟芝分离株存有需求。
本发明的一目的在于提供一种适用于培养樟芝分离株的方法，该等分离株在接受深层发酵培养时，可在菌丝体状态下良好生长。为此，我们已测试了食品工业发展研究所(FIRDI；位于台湾新竹市)中所收集的五个樟芝分离株。我们更意外地发现到，所获得的一个分离株的培养物能展现出所欲的药理活性，特别是抗肿瘤的活性。依据本发明的较佳实施方案，培养基中的碳源，通常是一种糖类，可能对于获致一用以培养樟芝的最佳环境非常重要。
本发明的另一目的在于提供一种樟芝分离株，当生长在一适当的人工环境中时，该分离株会具有一个所欲的药理活性，特别是一种抗肿瘤活性，该分离株能在菌丝体状态下良好生长，且所生长的培养物显现出极佳的药理活性。
因此，本发明是提供一种用以制备一具有药理活性的樟芝培养物的方法，其包含有下列步骤：
(a)将一樟芝分离株的菌丝体接种源接种在一适于该分离株生长的培养基中；
(b)将步骤(a)所得的培养物予以培养；以及
(c)当该培养物具有一利用杭特氏座标系(Hunter’s coordinatesystem)所测得的红色度指标a≥3时，获取该培养物。
本发明的另一目的在于提供一种含有得自于前述方法的产物的药学组合物或营养补充品。
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明：
图1是显示肿瘤细胞的生长受培养基滤出物所影响的情形，该培养基滤出物是源自于樟芝CCRC 930032在马铃薯右旋糖培养液中的摇瓶培养物，其中受测细胞株包括有Hela、ES-2、Hep 3B、MCF-7、AGS、COLO 205、COLO 320HSR及Caco-2细胞。
图2是显示肿瘤细胞的生长受培养基滤出物所影响的情形，该培养基滤出物是源自于樟芝CCRC 930032在合成培养基中的摇瓶培养物，其中受测细胞株包括有Hela、AGS、COLO 320HSR、Hep G2及MCF-7细胞。
图3是显示在不同取样时间点所获得的樟芝CCRC 930032摇瓶培养基滤出物对于肿瘤细胞的生长的抑制效应，其中受测细胞株包括有Hela、AGS、Hep 3B2.1-7及MCF-7细胞。
图4是显示肿瘤细胞的生长受源自于樟芝CCRC 930032的5-、10-及50-倍稀释培养基滤出物所影响的情形，其中受测细胞株包括Hela、ES-2、Hep 3B、MCF-7、AGS、COLO 205、COLO 320HSR及Caco-2细胞。
图5是显示肿瘤细胞的生长受源自于五株樟芝分离株(也就是CCRC 35396、35398、36401、36795及930032)摇瓶培养基滤出物所影响的情形，其中受测细胞株包括有ES-2、AGS、Hep 3B2.1-7及MCF-7细胞。
根据本发明，我们在台湾台东县分离出一个樟芝分离株，且该分离株与其他四个分离株均被成功地培养在一天然培养基或一合成培养基中。该等分离株分别以CCRC 35396(于1995年12月1日)、35398(于1995年12月1日)、36401、36795及930032(于2000年1月27日)的保藏号，保藏于食品工业发展研究所(台湾新竹市)的菌种保存及研究中心(CCRC)。
使用于此的用语“天然培养基”是采用其对于熟习此项技术者的一般性意义，且是指一主要由天然生成材料所组成的培养基。依据本发明，在市面上可得自于GIBCO的马铃薯右旋糖培养液为较佳者。
使用于此处的用语“合成培养基”是指一由具有明确化学结构的各种组分，以及任选的一或多种源自于天然材料的粗制成分的人工混合物。通常，一种合成培养基包含一碳源、氮源、微量元素(诸如一无机盐)，以及任选的维生素或其他生长因子。
碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、玉米淀粉及麦芽萃出物，以及此等的组合。以所要达成的功效的角度来说，该合成培养基优选为含有果糖作为主要碳源，且任选地补充以麦芽萃出物或葡萄糖。以该合成培养基的总体积为基准，该碳源较佳是位在1.5至2.5重量％的范围内，且更佳是呈一为2.5重量％的含量。
氮源包括但不限于硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、酪蛋白氨基酸、酵母萃出物、蛋白胨及胰化胨以及此等的组合。较佳地，依据本发明，该合成培养基是含有酵母萃出物作为氮源。以该合成培养基的总体积为基准，该氮源较佳是位在0.2至2.0重量％的范围内，且更佳是呈一为0.5重量％的含量。
相较于诸如研磨及熬煮真菌子实体本身等用以处理“牛樟芝”的以往方法，本发明的方法显然具有操作简单，且易于在生药业界大量生产该真菌的优点。
此五株分离株被测试其在医药用途的潜力，特别是其在抑制肿瘤或癌细胞生长上的能力。为了评估这些分离株在抑制肿瘤细胞生长的能力，将在天然及合成培养基中的樟芝培养物的水相部分进行MTT比色分析。
使用于此处的用语“MTT比色分析”或“MTT-四唑鎓分析(MTT-tetrazolium assay)”是指在1980年代，由美国国家癌症研究所癌症治疗部门的发展性治疗计划所构建的一个抗癌药剂筛选流程(请参见诸如Alley，M.C.，et al.，Feasibility of drug screening with panels ofhuman tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay，CancerRes.48：589-601，1988；Scudiero，D.A.，et al.，Evaluation of a solubletetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in cultureusing human and other tumor cell lines.Cancer Res.48：4827-4833，1988；Vistica，D.T.，et al.，tetrazolium-based assays for cellular viability：acritical examination of selected parameters affecting formazan，CancerRes.51：2515-2520，1991；Monks，A.，et al.，Feasiblity of a high-fluxanticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor celllines.J.Nat.Cancer Inst.83：757-766，1991)。在此分析中，具潜力的抗癌药剂抑或源自植物或微生物的天然产物(在此例中，即为源自于该五个樟芝分离株)被测试其对抗数组细胞株的能力，各组细胞株是代表人类恶性肿瘤的一种主要临床分类。每个孔的活细胞数目是与甲(formazan)的生成量成正比，甲可经由溶解化而被光谱仪所测量。原则上，生物活性物质或含有此等物质的天然产物可以抑制或甚至停止细胞生长，因而仅形成少量的甲。
在该五个分离株中，樟芝CCRC 930032被发现具有优越的药理活性，其也根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约而在2000年1月27日以保藏号PTA-1233保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。特别是，MTT比色分析的结果显示出，当生长在经设计的培养条件下(也就是在马铃薯右旋糖培养液或含有果糖作为主要碳源的合成培养基内)，樟芝(CCRC930032具有最为优异的抗肿瘤活性。或许，如果给予一个合适的环境，例如培养基中的特定组成，则源自于菌丝体并作用在靶肿瘤细胞的该(等)未知活性物质会被生成并分泌至培养物的液相中。
因此，吾人未经预期的发现令人联想到，一种藉由经最佳化的大量发酵来生产樟芝的可行方法，以及一种从该方法所衍生出的培养物来制造有用材料(诸如健康食品)的应用。因此，本发明有助于樟芝在药草工业上的产业利用性。本发明也对于将本案方法所得的医药产品应用于治疗癌症或肿瘤疾病的病患上开启了一扇门。
下列实施例是供用于例示本发明，而非限制本发明的范围。
实施例1：在天然培养基中制备樟芝CCRC 930032的液体培养物培养物的维持
在25℃下，保藏在菌种保存及研究中心(CCRC)的樟芝分离株CCRC 930032的原始培养物是被维持在马铃薯右旋糖琼脂(PDA，购自于Difco)斜面培养基上，并每二个月进行继代培养一次。由该斜面培养基转移接种，而得位在PDA平盘培养基上的操作用培养物，并在28℃下培育15至20天。
菌丝接种源的制备
15至20天的培育期之后，在一光学显微镜下检试樟芝CCRC930032的菌丝体特征，以确保其未被污染。将整个菌丝体切成小块，随着在无菌状态下，于一具均质机(Osterizer)中，利用50ml的无菌水将菌丝体予以均质化，历时30秒。10ml分量的菌丝体悬浮液可供用作为后续实验的接种源。
深层摇瓶培养
马铃薯右旋糖培养液(PDB，购自于Difco)是依据制造商所提供的指南来制备。在500ml的厄氏锥瓶(Erlenmeyer flasks)内，将10ml的樟芝的CCRC 930032接种源加入100ml天然培养基中。在30℃下，将该浸没培养物予以培育14天，并施以恒定振荡(在得自于Hotech的旋转式振荡机上以50rpm的速率进行振荡)。在培育结束时，令该真菌培养物通过一由过滤漏斗、锥瓶与抽气装置所构成的简单过滤器总成。该等滤出物是供用于后续的MTT比色分析。在60℃下，将过滤漏斗上所得的沉淀烤焙7天，并计算细胞质量的总干重。此实验被重覆三次。
实施例2：在合成培养基中制备樟芝CCRC 930032的液体培养物
重覆实施例1，除了以合成培养基来取代天然培养基以外，各个合成培养基中含有0.5％(w/v)的酵母萃出物(Difco)、0.1％(w/v)的KH2PO4(Merck)与0.05％(w/v)的MgSO4·7H2O(Merck)，以及25％(w/v)的一种特定糖类，也就是果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽萃出物或玉米淀粉，作为主要碳源。此实验被重覆三次。
实施例1与2的结果示于表1。
表1.生长在不同培养基中的樟芝CCRC 930032菌丝体的干重(固定培养条件：30℃，50rpm及培育14天)
| 培养基 | 菌丝体干重(g/L) | 培养物色泽 |
| 马铃薯右旋糖培养液：2.4克悬浮于100ml无菌水中合成培养基：0.5％酵母菌萃出物(Difco)、0.1％KH2PO4(Merck)及0.05％MgSO4·7H2O(Merck)，并搭配25％的下列不同碳源：(1)果糖(2)葡萄糖(3)麦芽萃出物(4)玉米淀粉 | 2.7763.5263.6615.025.384 | 深暗红色暗红色黄色棕色淡黄色 |
如表1所示，具有最高干重的菌丝体是获自于以玉米淀粉或麦芽萃出物作为碳源的合成培养基中。菌丝球的平均尺寸均相当地小，直径通常为约1至3毫米。所得培养物的色泽似依培养基所含组成不同而有许多变化。举例而言，源自于马铃薯右旋糖培养液的培养物呈深暗红色，类似的色泽也在添加果糖作为主要碳源的合成培养基所得的培养物中观察到。另一方面，其余培养物中所显现的色泽则大为不同。在培育结束时，以葡萄糖或玉米淀粉作为碳源的合成培养基所得的培养物转变成黄色，而源自于具有麦芽萃出物的合成培养基的培养物则呈棕色。
实施例3：MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓)比色分析
制备用于MTT分析的样品
实施例1及2中所收集的樟芝培养基滤出物(实验组样品)以及未经接种的培养基(对照组样品)被用于进行MTT分析。以氨水(NH4OH)将培养基滤出物与培养基的pH值调整至7，并进行湿热减菌。在进行分析前，将所得的样品保存于4℃下。
细胞株与培养物
包括MCF-7、Hela、AGS、COLO 320HSR及HepG2等肿瘤细胞株被选用于进行MTT比色分析。该等细胞株是维持在补充以10％小牛血清(Hyclone)及2mM L-谷氨酸(GIBCO BRL)的RPMI 1640(GIBCO BRL)中，以作为原始培养物。细胞培养物是利用胰蛋白酶-EDTA(GIBCO BRL)使细胞由细胞培养锥瓶上脱离，而每周被继代一或二次。
MTT-微培养四唑鎓分析
获取肿瘤细胞，经计数后，以适当浓度接种在-个96-孔微滴定盘中。例如，Hela细胞的起始浓度为1000个细胞/孔，而Hep3B2.1-7、HepG2、AGS、COLO 320HSR及MCF-7细胞为3000个细胞/孔。各孔中的细胞培养基总体积被补充至180μl，并于37℃下，在一含有5％CO2的培养箱中以培育至隔日。将三组各20μl分量的样品加入培养孔内，并在前述培育条件下将培育物予以培育3天。随后，将20μl以5mg/ml的浓度预先制备在PBS溶液(GIBCO BRL)中并贮存于4℃下的MTT(Merck)添加至各孔内。在37℃下另行培育4小时后，移除各孔中的上清液，并添加100μl的100％DMSO(二甲亚砜，可得自于Sigma)，以溶解MTT-甲产物。以一机械式平盘混合机充分混合后，利用一微平盘读取机(MRX，Dynex)来测量540nm下的吸光值。因此，樟芝培养基滤出物的肿瘤细胞生长抑制率可藉由将各个实验组样品的吸光值除以对应对照组样品的吸光值而得出。该等结果是显示在图1及2中。
图1中，马铃薯右旋糖培养液被选用作为培养基，并在30℃、50rpm及10％接种体积的条件下进行樟芝分离株CCRC 930032的培育，历时14天。如前所述，由经此培育过程的培养物中获得一培养基滤出物，并在MTT-四唑鎓分析中针对数种典型肿瘤细胞株(包括Hela、ES2、Hep3B、MCF-7、AGS、COLO205、COLO320HSR及Caco-2细胞)进行测试。
图1显示出，相较于由对照组样品所得的结果，肿瘤细胞株的生长速率因添加樟芝分离株CCRC 930032在马铃薯右旋糖培养液中的培养基滤出物，而显著地降低。举例而言，以对应对照组的生长速率为基准，经由实施例1的培养基滤出物所处理的MCF-7细胞具有8％的生长速率，而经此处理的COLO 320HSR与AGS细胞只具有4％的生长速率。
图2是使用表1中所列示的合成培养基组成，并在30℃、50rpm及10％接种体积的条件予以培育历时14天。Hela、MCF-7、AGS、COLO320HSR及MCF-7细胞等五个肿瘤细胞株被用于MTT-四唑鎓分析。如图2所示，在利用以果糖作为主要碳源的合成培养基所得的培养基滤出物的情形下，可观察到对于肿瘤细胞生长的显著抑制效应，在COLO 320HSR与MCF-7细胞株中，生长速率被降至低于20％。令人意外地，当樟芝分离株CCRC 930032被培养在分别以葡萄糖、麦芽萃出物与玉米沉粉作为主要碳源的相同合成培养基时，其无法显著地抑制肿瘤细胞株的生长。再者，当培养物有时候因某种未知因素而无法显现出暗红色时，樟芝分离株CCRC 930032的抑制能力就会骤降，且局限于AGS与MCF-7肿瘤细胞株。
因此，源自于马铃薯右旋糖培养液以及含果糖合成培养基的培养基滤出物的暗红色外观暗示着，培养物所显现的色泽可能与其对于肿瘤细胞所观察到的抑制效应相关。在实施例4中，此一假设被进一步检验。
实施例4：樟芝滤出物的抑制效应与色泽外观的同步现象
在此实例中，分离株CCRC 930032被培养在一个5公升的发酵槽中。在接种后的第143、167、216、239、263、287及311小时，从培养物中移出样品，以供用于MTT-四唑鎓分析。利用LovibondThintometer PFX990来检测所收集到的样品，并利用杭特氏(Hunter’s)座标系中的“L”、“a”与“b”等数值来表示该等样品的色泽外观，在该座标系中，“L”值愈大是代表亮度愈高，“a”的正值愈大是代表红色度愈高，“b”的正值愈大是代表黄色度愈高。起始培养基被用作为背景对照组。其结果示于图3与下表2。
表2在菌丝体接种后的第143、167、216、239、263、287及311小时，从培养物中所移出的樟芝CCRC 930032滤出物样品的比色分析
| 取样时间(小时) | L | a | b |
| 143 | 63.12 | 3.71 | 18.03 |
| 167 | 79.09 | 4.04 | 20.56 |
| 216 | 76.04 | 8.62 | 25.60 |
| 239 | 76.50 | 10.67 | 24.34 |
| 263 | 75.34 | 12.91 | 27.30 |
| 287 | 74.47 | 13.94 | 29.74 |
| 311 | 73.26 | 14.94 | 33.42 |
由以上数据可见，肿瘤细胞的生长速率是随着滤出物的“a”值(也就是红色度)的陡升而显著地下降。虽然在培养基滤出物的“a”值大于3时，即能针对受测肿瘤细胞显现出约20％的抑制效果，但藉由内插法估计，所欲的滤出物(也就是说，对于肿瘤细胞具有较高抑制效应的滤出物)具有一大于7的“a”值，而在此数值下，可以肉眼观察到红色度。
在不欲被理论所限制下，相较于其他四个分离株，分离株CCRC930032可能具有一种有利的遗传背景，从而包含诸如一组能在特定培养基中促进该(等)活性物质的生成及/或分泌的酶。该等代谢物以及培养基中的环境会导致培养物呈黄色至暗红色的色泽变化。或许，该等活性物质本身具有共轭双键，诸如萜类，因而将暗红色泽赋予其所泌入的液体培养基中。因此，培养物的色泽外观可能是一种用以肉眼估计培养物的抑制活性的有用指标。
实施例5：经稀释的培养基滤出物对于肿瘤细胞生长的抑制效应
为了测定樟芝分离株CCRC 930032对抗肿瘤细胞生长的抑制强度，将由该微生物在马铃薯右旋糖培养液中的培养物所得的培养基滤出物予以稀释5-、10-及50-倍，并进行MTT-四唑鎓分析。图4所绘示的结果显示出，随着稀释倍数的增加，培养基滤出物对于肿瘤细胞的抑制效应是呈一剂量依赖性形式而逐渐降低。然而，利用5-倍稀释滤出物仍能观察到对于Hep3B、AGS、ES-2及COLO 320HSR细胞株的生长的显著抑制。相较于未经处理的细胞，经50-倍稀释的滤出物所处理的ES-2与COLO 320HSR细胞的生长速率仍能被抑制至低于40％。
实施例6：不同樟芝分离株的培养物对于肿瘤细胞的抑制效应
除了分别以其他四个分离株CCRC 35396，35398，36401和36795来取代樟芝分离株CCRC 930032以外，重覆实施例1与3。培育结束时，源自于该四个分离株的滤出物均呈黄色。如图5所示，其结果显示出，在抑制肿瘤细胞生长的活性上，分离株CCRC 930032较其他四个分离株更为优越。因此，在药学组合物或营养补充品的制造上，樟芝分离株CCRC 930032应值得期待。
Claims (18)
1、一种樟芝(Antrodia camphorata)分离株，其以CCRC 930032的保藏号保藏在台湾食品工业发展研究所，并以PTA-1233的保藏号保藏在美国典型培养物保藏中心。
2、一种用以制备一具有药理活性的樟芝培养物的方法，其特征在于包含以下步骤：
(a)将一樟芝分离株的菌丝体接种源接种在一适于该分离株生长的培养基中；
(b)将步骤(a)所得的培养物予以培养；及
(c)当该培养物具有一利用杭特氏座标系所得的红色度指标a≥7时，获取该培养物。
3、如权利要求2所述的方法，其特征在于权利要求1的分离株被使用于接种步骤(a)中。
4、如权利要求2所述的方法，其特征在于该培养基是选自于由马铃薯右旋糖培养液与一含有果糖作为主要碳源的合成培养基所构成的组中。
5、如权利要求4所述的方法，其特征在于该合成培养基含有酵母萃出物作为氮源。
6、如权利要求4所述的方法，其特征在于该合成培养基任选地含有麦芽萃出物或葡萄糖。
7、如权利要求2所述的方法，其特征在于该药理活性为一对抗肿瘤或癌细胞的抑制活性。
8、一种用以产生一具有药理活性的樟芝培养物的方法，其特征在于包含将一源自于樟芝分离株的菌丝体接种源培养在马铃薯右旋糖培养液中，并于当该培养物具有一以杭特氏座标系所测得的红色度指标a≥7时，获取该培养物。
9、如权利要求8所述的方法，其特征在于该分离株为以CCRC930032的保藏号保藏在台湾食品工业发展研究所内，并以PTA-1233的保藏号保藏在美国典型培养物保藏中心内的分离株。
10、如权利要求8所述的方法，其特征在于该药理活性为一对抗肿瘤或癌细胞的抑制活性。
11、一种用以产生一具有药理活性的樟芝培养物的方法，其特征在于包含将一源自于樟芝分离株的菌丝体接种源培养在含有果糖作为主要碳源的合成培养基中，并于该培养物具有一以杭特氏座标系所测得的红色度指标a≥7时，获取该培养物。
12、如权利要求11所述的方法，其特征在于该分离株为以CCRC930032的保藏号保藏在台湾食品工业发展研究所内，并以PTA-1233的保藏号保藏在美国典型培养物保藏中心内的分离株。
13、如权利要求11所述的方法，其特征在于该药理活性为一对抗肿瘤或癌细胞的抑制活性。
14、如权利要求11所述的方法，其特征在于该合成培养基含有酵母萃出物作为氮源。
15、如权利要求11所述的方法，其特征在于该合成培养基任选地含有麦芽萃出物或葡萄糖。
16、一种产物，其是得自于如权利要求2至15项中任一项的方法。
17、一种供用于治疗癌症或肿瘤疾病的药学组合物，其含有一经由权利要求2至15项中任一项的方法所得的产物。
18、经由权利要求2至15项中任一项的方法所得的产物在制备治疗癌症或肿瘤疾病的药物中的应用。
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