TWI279439B - Processes for producing an antrodia camphorata culture having pharmacological activity, processes for obtaining a pharmacologically active composition from a culture of a. camphorata, products produced thereby and pharmaceutical compositions for the... - Google Patents

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1279439 九、發明說明： 相關申請案之交叉參照 本案主張於2002年3月29日提出申請之美國專利申請 案第10/113,903號作為優先權文件，該文件之揭露内容係被 5 納入於此作為參考。 C 明所屬《^技領】 發明領域 本發明係關於建立一種適於從一樟芝 培養物中大規模地製造出具藥理活性之濾出物 10的培養條件，特定言之，該培養條件係藉由令培養期間的 振盪速率及/或pH值最佳化來建立。本發明亦關於一種經由 一糸列部分分球過程而從一掉芝培養物中獲得具藥理活性 之組成物的方法。本發明亦關於利用前述組成物來製備藥 學組成物。 15 發明背景 棒芝（Antrodia camphorata) [(Zmg & Su) S —H Wu Ryvarden & T.T.Chang]，在臺灣亦被稱為「牛樟芝」或「牛 樟菇」’近來已被報導成為一個新的真菌物種，其特徵在於 20出現在子實體（fruit bodies)上的圓柱狀擔孢子 (basidiospores)、微呈澱粉狀之基幹菌絲、苦味、淡肉桂色 扁平狀至傘狀之擔子果(basidiocarps)，以及在純質培養基 中之厚壁孢子（chlamydospores)與關節孢子 (arthroconidia)。此種真菌之生長極為緩慢，且限於臺灣地 1279439 方所特有的樹種-牛棒（Cinnamomum kanehircii Hay (Lauraceae))-作為唯一的宿主。樟芝之詳細特性與分類地位 被敘述於Chang，Τ. Τ. Μ α/.，如加办7 cinnamomea sp. nov. on Cinnamomum kanehirai in Taiwan, MycoL Res. 99(6): 5 756-758 (1995) and Wu? S.-H., et aL, Antrodia cinnamomea (niu-chang-chih New combination of a medicinal fungus in Taiwan，jc沉?· 67/7· 38:273-275 (1997)，該等文 獻之全部揭露内容係被納入於此作為參考資料。 在臺灣民俗醫學上，樟芝的子實體被認為對於中毒、 10腹瀉、腹痛、高血壓、皮膚搔痿及肝癌所引起的症狀具有 某種醫藥功效。然而，由於嚴苛的宿主專一性（h〇st specificity)與在自然界中的稀有性，以及在人工栽培上的失 敗，所以「牛樟芝」在市面上極為昂貴。無疑地，發展出 大規模人工培養此種真菌的低成本製法是極具產業價值 15 的。 目前，本案發明人已發現樟芝於沈浸式發酵培養時可 展現出所欲的藥理活性，特別是抗腫瘤活性。如美國專利 申請案第〇9/566,834號所揭露者，樟芝已被成功地小規模培 養於諸如馬龄薯右旋糖培養液(PDB)以及含有果糖作為主 20要碳源的合成培養基内。利用抗特氏座標系伽咖，s 曝di她system)進行測量，所得培養物顯現出紅色度指標 為G3的暗紅色外觀，而此色澤與對於某些腫瘤細胞品系 之生長的顯著抑制效應相關。更重要的是，作用於腫瘤細 胞的活性組份雖然仍未被鏗定出，但已被發現能從真菌菌 1279439 絲體分泌至培養物之液相中，而使得從培養物中能輕易地 獲取具藥理活性之組成物，以供產業利用。 因此，若此一有利之方法能被最佳化以供用於大量製 造真菌培養物，當是極為所欲的。更佳為針對一所欲藥理 5 活性來部分分離粗製濾出物，俾以獲得增富有所欲活性的 有用組成物。 【發明内容】 發明概要

為符合前述產業需求，本案發明人已進行延伸性的研 10 發工作。現已未經預期地發現到，可藉由審慎地將某些參 數設定於特定範圍内而獲致一種供用於在工業規模上培養 樟芝的最佳條件。本發明發現到，pH值與振盈速率為培養 期間的關鍵因素。 因此，本發明之第一態樣係提供一種用以製造具有藥 15 理活性之樟芝培養物的方法，其包含： (a) 將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適於該 分離株生長的培養基中，以獲得第一培養物； (b) 令從步驟(a)培養而得之第一培養物接受被設定在 第一預定速率下的第一振盪階段，歷時一段可令 20 被接種之分離株進一步生長的時間，俾以獲得一 增殖有菌絲體的第二培養物；以及 (c) 令得自於步驟(b)之第二培養物接受被設定在不同 於第一預定速率之第二預定速率下的第二振盪階 段，俾令該分離株處於生理壓力下。 1279439 依據本發明之第二態樣，其係提供一種用以用以製造 具有藥理活性之樟芝培養物的方法，其包含： (a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適於該 分離株生長的培養基中；以及 5 (b)將得自於步驟(a)之培養物予以培養，藉由在整個 步驟(b)期間將培養物之pH值調整至一位在4.5至 5.4的範圍内。 較佳地，樟芝培養物的pH值在整個步驟(b)期間被調整 至一位在4.6至5.3之範圍内，且更佳為位在4.7至5.2之範圍 10 内。 本發明亦提供一種用以獲得一系列液態分離部分的方 法，該等分離部分係針對一諸如抗腫瘤活性的所欲藥理活 性而從樟芝培養物中分離出。因此，本發明之第三態樣係 提供一種用以從樟芝培養物獲得一具有藥理活性之組成物 15 的方法，其包含： (a) 將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適於該 分離株生長的培養基中； (b) 將步驟(a)所得之培養物予以培養；以及 (c) 從該培養物中移除大部分的不溶性物質，從而獲 20 取一具有藥理活性的溶液；以及 (d) 將步驟(c)所得之溶液予以處理，俾以獲得一含有 具分子量不超過約10 kDa之真菌分子的藥理活性 組成物。 較佳地，所獲得之組成物含有具分子量不超過約3 kDa 1279439 且更佳為不超過約1 kDa之真菌分子。 本發明之第四態樣係提供一種用以從樟立 一呈有華王¥、本> λ i ^ 物獲得 ，、有桌理活性之組成物的方法，其包含： $ (a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在—適於兮 5 分離株生長的培養基中； (b)將步驟(a)所得之培養物予以培養； (勻從該培養物中移除大部分的不溶性物質，從而莽 φ 取一具有藥理活性的溶液； 又 1 ⑷*步驟⑷所得之溶液予以處理，俾以獲得一含有 10 具分子量不超過約1 kDa之真菌分子的分離部 分；以及 ()7步驟⑷所得之分離部分通過_水不混溶相，並 ' 從該水不混溶相獲得該具藥理活性的組成物。 前述步驟(e)中之水不混溶相係較佳為一含有有效量之 15吸附劑的固定相，該吸附劑能選擇性地吸附疏水性真菌分 Φ 口疋相予以冲&，以獲得具有藥理活性的分離部 分。 在本發明之—較佳諸财，令倾⑷麟之沖提物 進一步接受逆相分配層析.，諸如在Lichrosorb® RP-18管柱 2〇 (Merck)中進行者’以獲得數個具有藥理活性的分離部分。 本發明更提供數種藥學組成物，以供治療癌症或腫瘤 疾病，5亥等藥學組成物含有一依據本發明之任一方法所得 的產物。 本發明更提供-種用以在需治療之病人體内治療癌症 1279439 或腫瘤疾病的方法，該方法係藉由將—個含有一依據本發 明之任-方法所得之產物的組成物處方給該病人。 圖式簡單說明

絰由下列較佳實施例的敘述並參照所附圖式，本發明 5之前述與其他目的以及技術特徵將變得顯明，其中：X 弟1圖顯不出源自於樟芝培養物之渡出物的抗腫瘤活 性，其中樟芝被培養在兩種不同的振盪條件下； 第2圖顯示出三個樟芝培養物在培養期間内的pH值傲 動； 又 1〇 第3圖頒不出源自於第2圖所示樟芝培養物之濾出物的 抗腫瘤活性，其中樟芝係培養在被控制於三個不同區段内 的pH值下； 第4圖顯示出源自於放大規模樟芝培養物之濾出物的 抗腫瘤活性； 15 第5圖為一流程圖，其顯示出一樟芝濾出物針對分子量 進行純化的流程； 第6圖為一柱狀圖，其顯示依據第5圖所分離出之培養 物濾出物的抗腫瘤活性，其中受測細胞株包括有MRC_5、

HeLa、AGS、Hep G2 以及MCF-7 ; 2〇 第7圖為一柱狀圖，其將以Ambedite® XAD-4從一濾出 物分離部分所分離出之分離部分的抗腫瘤活性予以比較， 該濾出物分離部分含有具分子量不超過約1 kDa之真菌分 子，其中受測細胞株包括有MRC-5、HeLa、AGS、Hep G2 以及MCF-7 ; 10 ⑧ 1279439 .第8圖為第7圖之乙酸乙酯沖提物在—個Licfb@ RP-18管柱中進行部分分離的光譜曲線；以及 _ 第9至11圖顯示第8圖中所分離出數個分離部分的抗腫 瘤活性。 5 【實施方式】 較佳實施例之詳細說明 本發明係大致關於建立-種適於從—掉芝培養物中大 • 城地製造出具藥理活性之分離部分的培養條件。依據本 發明’樟之此種真菌被培養在一適合之液態培養基内，以 10維持其在®絲體«下進行⑽纽，並促進錢理活性。 在本案發明制書中，「適合之培養基」此用語係意指 - 的可以提供適鱗芝生長之人卫環境並_其藥理活性 _養基。健地，本發明所使用之培養基適於促使菌絲 體中生成具藥理活性之物質，並促使該（等）物質分泌 15界。 鲁 、，仙於本發明之料基包純稱「馬鈐薯右旋糖培 養液(potato dextrose broth)」的天然培養基，以及任何含有 果糖作為主要碳源的合成培養基。馬鈴薯右旋糖培養液可 藉由諸如將-由·〇克切成丁狀之馬鈐薯、2〇〇克右旋糖 2〇與L〇升療館水所構成的摻合物予以濕熱滅菌，而在實驗室 中衣備’抑或是購自於諸如DIFC〇等商業來源。最佳之培 養基為任何含有果糖作為主要碳源的合成培養基。若有需 要，葡萄糖、蔑糖、半乳糖、果糖、玉米澱粉及麥芽萃出 物等其他碳源以及此等之組合亦可被囊括於合成培養基 11 1279439 中’以作為助劑。較佳地，以該合成培養基之總體積為基 準，該碳源係較佳為位在1.5至2.5重量％之範圍内，且更佳 為呈一為1.5至2重量％之含量。 除了碳源以外，合成培養基可包含有氮源、微量元素 5 (諸如-無機鹽），以及任擇之維生素或其他生長因子。該氮 源包括但不限於硫酸銨、硝酸錄、硝酸納、赂蛋白胺基酸 (casammo aC1d)、酵母菌萃出物、蛋白腺(卿㈣)及騰化腺 (tryPt〇ne)，以及此等之組合。較佳地，依據本發明，該合 成培養基係含有酵母菌萃出物作為氮源。以該合成培養基 10之總體積為基準，該氮源係較佳為位在〇·2至Μ重量％之範 圍内，且更佳為呈一為〇·5重量。之含量。 依據本發明，任何可得之樟芝分離株均可供用於培養 方法中，只要所使用之微生物具有生成可伯測量之具藥理 活性代謝物的能力。可供使用之棒芝分離株包括有但不限 I5於CCRC 35396(199^^丨日被寄存於食品工業發展研究 所（中華民國台灣新竹市)之菌種保存及研究中心（ccrc)、 35398(1994年 12月 1 日）、35716(2_年5月 3 日）、遍ι(2_ 年1月27日）、36795(2000年1月27日）以及9綱32(2麵年u 27日）。依據本發明之_較佳具體例，樟芝⑽⑽難被 20用以製備培養物濾、出物，該分離株亦以寄存編號pm% 被寄存在美國典㈣種保存中心(ATcc)，以作為專利程序 之用。 為評估對於腫瘤細胞生長的抑制能力，令樟芝之粗製 濾出物及其分離部分接受MTT比色分析。 12 1279439 使用於本案發明說明書之用語「MTT比色分析(ΜΤΤ colorimetric assay)」或「ΜΤΤ-四嗤鍇分析（MTT-tetrazolium assay)」係指在1980年代，由美國國家癌症研究所癌症治療 部門之發展性治療計劃所構建的一個抗癌藥劑篩選流程 5 (請參見諸如 Alley，M· C·，d a/·，Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Scudiero, D. A.? et al^ Evaluation of a soluble tetrazolium /formazan • assay for cell growth and drug sensitivity in culture using 10 human and other tumor cell lines. Cancer Res. 48: 4827-4833, 1988; Vistica, D. T.5 et al.^ tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan. Cancer Res· 51: 2515-2520, 1991; Monks, A.? et aL, Feasibility of a high-flux anticancer 15 drug screen using a diverse panel of cultured human tumor • cell lines· 施ί· CVmcer//wi. 83: 757-766，1991) o 在此分析中，具潛力之抗癌藥劑抑或源自於植物或微 生物的天然產物(在此例中，即為源自於該五個樟芝分離株 者)被測試其對抗數組細胞株的能力，各組細胞株係代表人 2〇 類惡性腫瘤的一種主要臨床分類。每個井(well)的活細胞數 目係與曱腊(formazan)的生成量成正比，甲腊可經由溶解化 而被光譜儀所測量。原則上，生物活性物質或含有此等物 質的天然產物可以抑制或甚至停止細胞生長，因而僅形成 少量的曱腊。 13 利用MTT比色分析，可檢視諸如振盪速率及pH值等在 真菌培養上之重要參數，以評估此等參數在培養期間對於 樟芝之藥理活性的效應。 在第一組實驗中，將一樟芝培養物分成兩份，並令之 分別經歷二個不同的振盪流程，其中一流程係被實行來將 一恒定且劇烈的振盪施加至真菌，而另一流程則關於從溫 和至劇烈的兩階段振盪。經比較後，依據本發明之兩階段 振盪可致使樂理活性的早期產生。提供第一階段的溫和振 盪係為獲致被接種之真菌的營養生殖，以獲得培養生殖之 菌絲體。培養結束時所獲取之菌絲體團球(mycelid pdl你） 的增大尺寸可用以指出溫和振盪階段的成功與否。將振盪 速率從溫和轉換為劇烈的適當時機會依據選定之真菌分離 株而定’而在廣泛之範圍變化。—般而言，當依據培養物 之最終體積為基準而以10% v/v之量來接種一真菌分離株 時，溫和振盪可持續進行約3天（或約72小時），隨後再升高 振盡速率。提供後續階段的劇烈振m係令真菌處於生理= 力下。在此-壓力下’會迫使樟芝加以因應而進行 该變=包括促料⑽定方式表現之二次代 成。咸相信，某些具有纽活性之料分 的生 法被「壓迫而產出」。可將生理壓力施加至樟/此種方 參數’諸如通氣料、營翻整及熱壓力等，^他培養 遽用或舆本發明之振m速率此參數合併運用’亦可單獨地 速率可參照前述内容進行實驗而測得，^當的㈣ 據而依據諸如1995年由Pauline M : = 土於後逑數

Qn所編纂並由 1279439

Academic Press Ltd Φ ^ ^ r,. t Bioprocess Engineering 尸細咖此㈣ls㈤柯巾所述方程絲進行估計。在 某些情形下’當妥適地施加兩階段振堡時，錢培養物會 在第6天時轉變為紅色。

10 在本發明之-較佳具體例中，兩階段振盡係在一具預 置有3升培養基的5升發酵槽(BBraun)中進行，其中振盈於 開始時係被設定在—為不超過約綱啊且較佳為約細 rpm之速率下’隨後升高至_為不超過約彻—且較佳為 約·啊之速率下。在本發明之另—較佳具體例，兩階 段振盛係在—具預置有16G升培4基之25G升發酵槽 (B1〇-Top)中進行，其中該振盈速率於開始時被設定在約仙 rpm下，隨後升高至約15〇卬〇1。

在第二組實驗中，將一樟芝培養物分成三份，並於整 個培養期間分別培養在被控制於三個不同區段内的p Η值 b下。經比較後’發現於pH 4 5至5 4下戶斤進行之培養可致使 藥理活性的早期產生。較佳地，樟芝培養物的pH值係在整 個培養期間内被調整在__位於46至53且較佳為4·7至5·2之 範圍内。 藉由前述關於振盈及pH值等有用參數，依據本發明之 20樟芝培養法可成功地被擴大規模至16〇升之體積，並同時維 持由該真&所衍生出之所欲藥理活性。 依據本發明之方法，一可供各種產業用途之具藥理活 性遽出物能以-經濟、有效率且省時之方式從棒芝獲得。 本^明亦關於建立一種可操作的純化方法，藉此，可 15 1279439 獲得數種被增富有具藥理活性物質的新穎組成物，以供各 種醫藥用途。依據本發明，該純化方法係藉由將一棒芝之 粗製濾出物選擇性地加以分離來進行，以獲得一含有具分 子量不超過約10 kDa、較佳為不超過約3 kDa且更佳為不超 5 過約1 kDa之真菌分子的分離部分。該分離方法可藉由以分 子量為基礎來分離分子（即分子篩）的任何習用方法來進 行’該種方法的例子包括凝膠過濾法、密度梯度純化法、 超過濾法、超南速離心法以及其他類似的習用方法。

依據本發明，含有具分子量不超過約1 kDa之分子的分 10 離部分係以極性為基礎而被進一步部分分離，俾以獲得一 水不混溶相，並從之獲得具藥理活性之分離部分。該水不 混溶相可為一不溶性固相或一不與水混溶之有機相。在本 發明之一較佳具體例中，令該kDa分離部分通過一含有 有效量之吸附劑的固定相，該吸附劑能選擇性地吸附疏水 15性真菌分子。隨後，將該固定相予以沖提，以獲得一具有 所欲藥理活性之分離部分。簡言之，該固定相從該kDa 分離部分中選擇性地獲取並濃縮據信含有所欲之具藥理活 f生物貝的疏水性溶質，以使得位於流經液(打〇w through)内 的不具活性物質能被移除。適於含納於固定相中之吸附劑 2〇可為帶有適於從一泳動相中捕集疏水性物質之官能基的任 何吸附劑。該種吸附劑之例子為Amberlite(D XAD-4 (Sigma) 與其等效物。該部分分離可藉由任何習用方式來運作，諸 如將該^ 1 kDa分離部分與一批料之吸附劑共同培育，抑或 疋令該kDa分離部分流經一填充有吸附劑的層析管 16 1279439 柱，只要具藥理活性物質被留置於吸附劑表面之含量是令 人滿意的。用以從固定相中沖提出被結合物質的適當沖提 劑(du㈣係為本項技藝所熟悉者，因而可被熟習本項技藝 人士所容易地選定。較佳地，該沖提劑為一具有低於水之 5極性的有機溶劑，且更佳為具有一低於甲醇之極性者。最 佳之沖提劑包括乙酸乙酯及乙醇。 可令展現出所欲藥理活性之沖提物(d她)接受以其他 .物理、化學或生物特性為基礎的額外純化程序。在本發明 之一較佳具體例中，沖提物係以疏水性程度為基礎被進一 10步分離，更佳為該分離係實施於一諸如Lichrosorb® RP_18 官柱(Merck)及其等效物中。所得之數個分離部分被發現具 有藥理活性。 鈿述發現強烈地暗示著’樟芝之藥理活性主要源自於 具有分子量不超過1 kDa之疏水性化合物。此發現恰與先前 15的一個假說相反，在該假說中，具有一為500至2,000 kDa 之平均分子量的多醣被認定為蕈類所擁有之抗腫瘤活性的 主要來ί原（Mizuno，a/·，Antitumor-active substances from mushrooms. Food Rev. Inti. 11(1): 23-61)。雖然樟芝經報導 為富含有諸如三辟、flavinoids、類固醇、sesquiterpene 20 lactones以及苯基與phenyl and biphenyl compounds等低分 子量物質（Chang，supra; Cherng，α/·，Triterpenoids from Antrodia cinnamomea. Pytochem. 41(1): 263-267 (1996)； Chiang? et aL, A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea. Pytochem. 39(1): 17 1279439 613-616 (1995);以及Yang，ei. α/·，Steroids and Triterpenoids of Antrodia cinnamomea —· a fungus parasitic on Cinnamomum Micranthum· Pytochem. 41(5): 1389-1392 (l9%)) ’但是，沒有任何經報導之教示内容資以將此等物 5 質與該真菌之藥理活性相連結。 依據本發明之純化方法提供數種組成物，其中活性物 質被濃縮且不具活性之物質被進一步移除。該等組成物顯 然對於人類或動物個體具有增進之藥理有效性，因而適供 用於諸如製造藥學組成物或營養補充品等各種產業用途。 10是以，本發明亦關於利用該等新穎組成物作為在需要接受 治療之人類或動物個體中治療疾病（特別是癌症或腫瘤疾 病）的藥物，抑或是作為一種被配製成諸如食品、飲料及/ 或動物飼料等形式之營養補充品。 較佳實施例之詳細說明 15 下列實例僅供用於例示本發明，而非意欲限制本發明 之範圍。 复盤1:樟窆液體培養物 樟芝分離株CCRC 930032之原始培養物係被維持在-80 C下，從該原始培養物移出少量真菌，置入馬龄箸右旋糠 瘦脂平盤培養基(PDA，貝薄自於Difc〇)上。待真菌恢復活力 後，將培養物移至馬鈐薯右旋糖瓊脂斜面培養基。將斜面 培養基培育在25 C下，並每二個月進行繼代培養一次。該 等斜面培養基係供用作為操作用培養物（w〇rking cultures)。為製備菌絲體接種源，將源自於？1)八斜面培養基 18 1279439 之培養物接種於PDA平盤上，並在28°C下培育15至20天。 菌絲體接種源之製備 將真菌予以培養，直至觀察到菌絲群落具有一為15至 3〇毫米之直徑為止。在一光學顯微鏡下檢驗樟芝的菌綠體 5 特徵，以確保其未被污染。將整個菌絲體切成小塊，隨後 在無菌狀態下，於一具均質機(Osterizer)中，利用5〇 ml之 無菌水將菌絲體予以均質化，歷時30秒。菌絲體懸浮液之 刀里可供用作為沈〉叉式搖瓶培養的接種源。在5〇〇mi之厄氏 錐瓶(Erie腿eyei* flasks)内中預先置入一合成培養基(2〇/〇果 10 糖、0·5% (w/v)之酵母萃出物(DIFCO)、0.1% (w/v)之κΗ2Ρ04 (Merck)以及0.05% (w/v)之MgS04 · 7H20 (Merck))，再將該 接種源以1:9之體積比加入該合成培基内。在3(rc下，將該 沈浸培養物予以培育5天，並施以恆定振盪（在一具可得自 於Hotech之旋轉式振盪機上以5〇 rpm之速率進行振盪）。所 15得之培養物係供用作為後續大規模培養的接種源。 31例2 :振盪速差真菌濾出物之藥理活性的截響 在一具5升發酵槽(B· Braun)内中預先置入2·7升之合成 培養基(2%果糖、〇.5% (w/v)之酵母萃出物(DIFc〇)、〇 ι% (w/v)之KH2P04 (Merck)以及㈣5% (w/v)之MgS〇4 · 7氏〇 2〇 (Merck)) ’再將實例丨中所製得之樟芝ccrc $湖2接種源 以1:9之體積比加人該合成培養基中。在机以及一為㈣ 升/分鐘之通氣速率下培育該培養物。培養物之振盪速率於 開始時被設定在約2〇0rpm下，經培育％小時後，再升高至 約500卬111。在接種菌絲體後的第48、113、17〇、爪及別 19 1279439 小時，從培養物取樣獲得數個樣品，隨後令該等樣品通過 一由過濾漏斗、錐瓶與抽氣裝置所構成的簡易過濾器總 成，以移除大部分之不溶性物質。以銨水(NH4〇H)將所獲 知之濾出物的pH值調整至7,並進行濕熱滅菌。將所得樣-品 5保存於4艺下，以供後續MTT比色分析之用。 利用未經接種之培養基來作為“丁丁分析之負對照組。 選定Hep G2腫瘤細胞來進RMT1^b色分析。進行分析 之月il，將細胞維持在補充有1〇%小牛血清(Hyd〇ne)之 MEM培養基(GIBCOBRL)，以作為原始培養物。該腫瘤細 10胞株係利用胰蛋白酶-EDTA (GIBCO BRL)使細胞由細胞培 養錐瓶上脫離，而每週被繼代一或二次。獲取腫瘤細胞， 經什數後，再以3,000個細胞/井之濃度接種在一個井微 滴疋盤中。將各井中之細胞培養基總體積補充至， 並於37 C下’在一充有5¾ C〇2之培育箱中予以培育至隔曰。 15 將三組各2〇//1分量之樣品加入培養井内，並在前述培 育條件下將培養物予以培育72小時。隨後，將2〇#u^ 5mg/ml之濃度預先製備在pBS溶液（GIBC〇 BRL)中之 MTT(Merck)原液添加至各井内。 在37C下’於C〇2培育箱中另行培育4小時後，移除各 20井中之上澄液，並添加10〇#1之100°/〇DMSO(二甲亞颯，可 得自於Sigma)，俾以溶解]^丁丁-甲臜產物。以一機械式平盤 混合機充分混合後，利用一具ELISA讀取機(MRX，Dynex) 來測量5 4 0n m下之吸光值。因此，受測濾出物的腫瘤細胞相 對存活率可藉由將各個實驗組樣品之吸光值除以對應未經 1279439 接種對照組之吸光值而得出。 比較例1: 將實例2予以重覆，除了將該真菌培養物於整個培養期 間培育在一為約500 rpm之丨亙定速率下以外。 經貫例2與比較例1所得之濾出物處理後的腫瘤細胞相 對存活率，係在表1及第1圖加以比較。 表1 取樣時間 Hep G2細胞之相對存活率^^一·— L小日寸） 比較例1 實例2 48 63 79 '~ 113 62 48 170 35 16 217 24 18 259 19 19 在表1中，針對在指定時間點取樣的濾出物對於Hep G2 腫瘤細胞的抑制效應進行比較。對於在菌絲體接種後的第 10 170小時所取得的渡出物而言，可見歷經200啊至500 — # 之兩階段振盪的樟芝CCRC 93〇〇32能於MTT分析中獲致一 為16%之相對存活率，此數值遠較在5〇〇rpm之恆定速率下 所培養的培養物更為有效，因為後者僅觀察到-為35%之 較南相對存活率。在後續的時間點（即第217與259小時），實 15例2與比較例1的抗腫瘤活性會漸趨靠近，此暗示著由初始 低速振蘯與後續階段的高速振益所構成之組合，將可致使 培養物中之具藥理活性物質的早期生成。 一利用AGS、HeLa及MCF-7等腫瘤細胞株進行對應實 &可在MTT分析巾觀察到—致性的結果(結果未示出）。 21 1279439 复金ILLpH值對於t菌濾出物之藥理活性的妗龐 製備三個具有分別為約4.5 (試驗A)、5.0 (試驗B)及5.5 (試驗C)之初始pH值的合成培養基批料（1.5%果糖、0.5% (w/v)之酵母萃出物（DIFCO)、0.1% (w/v)之KH2P〇4 (Merck) 5以及0.05% (w/v)之MgSCU · 7氏0 (Merck))，並將實例1所製 得之接種源以1:9之體積比加入該等合成培養基中。將所得 培養物依實例2所述方法進行培養，除了在預定時間點監控 φ 各個培養物之pH值，並藉由添加NaOH溶液謹慎地將之調整 至初始pH值附近(表2)以夕卜。培養程序持續336小時。添Γ口 10 Na〇H溶液的時機係依選定之pH值而定。例如，試驗β與試 I双C係分別從第192與168小時起添加Na〇H溶液，以將阳值 抽於、、勺4.9至5.1與約5·4至5·6，而試驗a則遲至第細小時 才加入NaOH溶液。 22 1279439 表2 取樣時間 (小時） ------— pH 試驗A 試驗B 試驗C 0 4·67 5.02 5.58 24 4.71 5.05 5.65 40 4.74 5.09 5.7 4.81 5.15 5.71 96 4.84 5.16 5.68 120 4.84 5.09 5.61 144 4.84 5.01 5.52 168^" 4.84 ~ 4.9 5.37 192^^ 4.85 — 4.81 5.4 209 4.86 4.9 5.4 240 4.86 4.9 5.4 264 4.8 4.9 5.4 288 4.66 4.9 5.4 312 4.52 4.9 5.4 336 4.37 4.9 5.39 在接種菌絲體後的第96、144、192、240、288及336小 從培養物取樣獲得數個樣品，隨後令該等樣品通過一 由過濾、漏斗、錐瓶與抽氣裝置所構成的簡易過濾器總成， 以移除大部分之不溶性物質。以銨水(NH4〇H)將所獲得之 濾出物的pH值調整至7，並進行濕熱滅菌。將所得樣品保存 於4°C下，以供後續MTT比色分析之用。依實例2所示，令 所待樣品接受MTT比色分析。利用未經接種之培養基來作， 為ΜΤΓ分析之負對照組。 23 1279439

如表3所示，在指定時間點所取樣之樟芝濾出物係咖 八對於Hep G2腫瘤細胞之抑制效應來進糾較。對 10 種菌絲體後的第192小時所取得之渡出物而言，可見試驗: 與試驗财培翻料咖c 9細2會觀減驗⑽綱 到者更低的減存活率。此種在抗«效應上之差異會名 弟240小時朗最南，而於後續的時間料漸降低，此暗六 著在pH4.5至5.4下、較佳為ρΗ Μ至Μ下且更佳為在阳4· 至5.2下在所進行之培養，將可致使培養物巾之具藥理活把 物質的早期生成。 利用AGS、HeLa及MCF-7等腫瘤細胞株進行對應實 驗，可在MTT分析中觀察到一致的結果(結果未示出）。 實例4 :樟芝在250升|酵槽中之擴大賴^^ 在一具250升發酵槽(Bi〇-Top)内中預先置入;[60升之合 15 成培養基（1·50/。果糖、0.5% (w/v)之酵母萃出物(pjFcO)、 0.1% (w/v)之KH2P〇4 (Merck)以及〇·〇5% (w/v)之MgS04· 7H20 (Merck))，再將實例1中所製得之樟芝ccRC 930032 接種源以1:9之體積比加入該合成培養基中。在3〇。〇以及一 24 1279439 為0·6升/分鐘之通氣速率下培育該培養物。培養物之振盪速 率於開始時被設定在約4〇 rpm下，經培育7〇小時後，再升 高至約150 rpm。培養物之？11值於整個培養期間均被調整在 一位於4.9至5.1的範圍内。 5 在接種菌絲體後的第96、144、168、186.5、244及284 小時，從培養物取樣獲得數個樣品，隨後藉由一習用方法 進行過渡，以移除大部分之不溶性物質。以錢水將所獲得 之濾出物的pH值調整至7,並進行濕熱滅菌。令所得樣品接 受MTT比色分析，其中HeLa、AGS、HepG2及mcm細皰 1〇係丨，000、3,000、3,〇〇〇及3,000個細胞/井之初始濃度下進^ 測試。利用未經接種之培養基來作為Μττ分析之負對照 組。結果示於4與第4圖中。 表4

G2細胞 < 相對存活率（％)

(小時） HeLa AGS Hep G2 MCF-7 96 89 83 91 ----^ 61 144 70 67 49 U丄 168 65 32 36 〇 Ή 186.5 ----—— 30 26 _13 1 22 244 23 34 42 — 284 25 η 43 u ^\J 表4與第4圖顯示出，經由將振盪速率&pH值設定於實 例2及3中所述之較佳範圍内，可將依據本發明之樟芝捭養 法成功地擴大規模至16〇升之體積。 25 15 1279439 复例5:在合成培養基中製備檍梦焙基物之诡屮铷 將被培養在PDA平盤培養基上之樟芝CCRC 930032的 整個菌絲體切成小塊，隨後在無菌狀態下，於一具均質機 (Ostedzer)中，利用50 ml之無菌水將菌絲體予以均質化， 5歷時30秒，以便獲得一菌絲懸浮液。在1升厄氏錐瓶内中預 先置入200 ml之合成培養基(2%果糖、〇·5% (w/v)之酵母萃 出物(DIFCO)、0.1% (w/v)之KH2P〇4 (Merck)以及0.05% (w/v) 之MgS〇4 · 7H2〇 (Merck))，再添加2〇 ml之菌絲懸浮液。在 3〇°C下，將該沈浸培養物予以培育14天，並施以恆定振盪 ° (在具可付自於H〇tech之旋轉式振蘯機上以75 rpm之速率 進行振盪）。培育結束後，令真菌培養物通過一由過滤漏 斗、錐瓶與抽氣裝置所構成的簡易過濾器總成。所得粗製 濾出物供後續分析之用。

依據製造商所提供的指南，藉由低速離心，令實例5所 • 得之粗製濾出物（F0)通過一個Certriprep⑧C()ncentrat()r i 〇 (種購自於Amicon的商用迷你管柱，其具有一為1〇 刀子i截邊值）。初次流經液被稱作為分離部分Μ。隨後以 去離子再次充填管柱並再次離心，以收集二次流經液F2。 2〇獲取仍留置於管柱内之真菌分子，並命名為F3。 藉由一具有3 kDa之分子量截留值的Certriprep® Concentrator 3迷你管柱(Amicon)，依前述方法將ρι進行部 :刀離’以便獲得初次流經液㈣、二次流經液㈣以及仍 留置於該迷你管柱内的分離部分(F6)。此純化流程係示出於 26 1279439 第5圖中。 令所得之分離部分接受MTT比色分析，以評估抑制腫 癌"、田胞生長的能力。在此例中，HeLa細胞係以1500個細胞/ • 井之初始濃度進行測試，而MRC-5、AGS、Hep G2及MCF-7 5細胞則具有3,000個細胞/井的初始載入量。第ό圖中清楚地 f，、、頁示出，F1與F4此二者所展現出之抗腫瘤活性係相當於粗 制濾出物(F0)所展現出者。此結果暗示著，濾出物中所存有 • 的大部分(若非為全部）藥理活性物質具有低分子量，特別是 具有不超過約3 kDa的分子量。 又，經由一系列膜組，將實例5所得之粗製濾出物(F〇) 予以邛为分離，俾以獲得一含有具分子量不超過丨kDa之真 菌刀子的分離部分(F7)。抗腫瘤活性與厂共存於相同分離 ' 部分（第7圖中之最左圖）此—事實指出，具藥理活性物質的 表觀分子量可能降至不超過約1 kDa。 5 述MTT分析中，於經濾出物處理之MRC-5細胞(正常 • 肺纖維細胞）中會觀察到降低的存活率，此指出真菌濾出物 乂及其活性分離部分可能會對於正常細胞展現出抑制效 j。然而，當接種諸如高達1〇5〇00個細胞細胞 時，該抑制效應會大幅降低。經比較，真菌渡出物以及其 1*生刀離分的有效性極不易被增量之腫瘤細胞所影響 (數據未示出）。經此一活體外之觀察可推測，當投藥至活體 内時，依據本發明之組成物對於正常細胞較為無害，但會 給予腫瘤嚴厲的打擊。 27 1279439 f例7 :樟芝瀘、出物在Amberlite⑧XAD-4樹脂上的公離 將實例6所得之濾出物F7與一批次之Amberlite® XAD-4 (Sigma)共同培育，並施予溫和振盪。培育結束後， 精由離心來沈殿樹脂粒。分別獲取含有未結合物賢之上澄 5 液以及樹脂粒。隨後’依序以相同體積之去離子水、甲醇 及乙酸乙酯來沖提樹脂粒，並分別收集源自於三個沖提流 程的沖提物。於低壓下，將曱醇沖提物與乙酸乙g旨沖提物 蒸發至乾，再溶入少量乙醇中。將適量無菌水加入所得乙 醇溶液中，以使得後續MTT比色分析中之乙醇最終濃度被 10調整至不超過〇·5%°ΜΤΤ比色分析係依實例6所述方法來進 行，並利用未經接種之培養基或0.5%乙醇水溶液作為負對 照組。結果示於第7圖。 第7圖顯示出，乙酸乙酯沖提物對於所有五種細胞均具 有優越的抗腫瘤活性，而水及甲醇沖提物則不會對該等細 15胞展現出顯著的效應。上澄液中可觀察到殘餘的抗腫瘤活 性，推測此係導因於疏水性物質未被樹脂所完全吸附。此 等結果暗示著，濾出物中所存有的藥理活性係主要源自於 分子量不超過約1 kDa的疏水性物質。 章芝濾出物在Lichrosorb RJP 18瞢和:中的全

20 在—個 Lichrosorb(i) RP_ 18 管柱（Hibar 預充填管柱 RT 250-25 ; 7 μπι;購自於Merck)中進一步分離實例7所得之乙 酸乙酯沖提物。利用乙腈/水所構成之沖提劑，以2⑼分鐘 期間從40%至1〇0%的乙腈百分率以及5·7毫升/分鐘的流速 下進行梯度沖提。測量254 nm處之吸光值，並將之繪示於 28 1279439 弟8圖中。脂1 μ 时歧積各為12-ml之分離部分予以收集，並如表5 所示組合成數個分離部分。

表5 分離部分收集管號分離部分 23 、 24 、 G N 25 > 26 收集管號 59、60 Ί\、12、 28 、 29 、 Η 30 、 31 Ρ

製備=例’於碰"f ’將鱗分離料蒸發至乾並 一 、☆夜MTT比色分析係依實例6所述方法來進 仃。結果示於第9^圖。 第9至11圖所顯示者，分離部分G、K及L對於AGS 胞展現出顯著的抑制效應，而相鄰分離部分G與Η則將η ⑽田胞的存活率壓抑至—低於卿。的位準7 泛地被分離部分b、e、f、g、h、k^: 乙㈣沖提物中對於— :: 29 10 1279439 逆相分配層析進行純化期 中之某些藥理活㈣」失殆4，此指出樟芝濾出物 ” ” ^ ^^自於許多分子的協同作用，而此 1同作用相#料受_烈純化程序的影響。 雖然本發明已被描述於前述之特定實施例中，惟應明 ，，對於熟習相關技藝者而言，許多的修改與變化是至為 頒明’而可在不偏離本發明之精神與所請範圍下完成。 【圖式簡單謂^明】 弟1圖頒不出源自於樟芝培養物之濾、出物的抗腫瘤活 性’其中樟芝被培養在兩種不同的缝條件下； 10 第2圖顯示出三個樟芝培養物在培養期間内的pH值變 動； .第3圖顯示出源自於第2圖所示掉芝培養物之渡出物的 抗腫瘤活(·生，其中;f早芝係培養在被控制於三個不同區段内 的pH值下； 15 第4圖顯示出源自於放大規模樟芝培養物之濾出物的 抗腫瘤活性； 第5圖為一流程圖，其顯示出一樟芝濾出物針對分子量 進行純化的流程； 第6圖為一柱狀圖，其顯示依據第5圖所分離出之培養 2〇 物渡出物的抗腫瘤活性，其中受測細胞株包括有]VIRC-5、 HeLa、AGS、Hep G2 以及MCF-7 ; 第7圖為一柱狀圖，其將以Amberlite®XAD-4從一濾出 物分離部分所分離出之分離部分的抗腫瘤活性予以比較， 該濾出物分離部分含有具分子量不超過約1 kDa之真菌分 30 1279439 子，其中受測細胞株包括有MRC-5、HeLa、AGS、Hep G2 以及MCF-7 ; 第8圖為第7圖之乙酸乙酯沖提物在一個Lichrosorb® RP-18管柱中進行部分分離的光譜曲線；以及 5 第9至11圖顯示第8圖中所分離出數個分離部分的抗腫 瘤活性。 【主要元件符號說明】 (無）

31

Claims (1)

1279439 I公舌尽 十、申請專利範圍： 1. 一種用以製造具有藥理活性之樟芝 培養物的方法，其包含： (a) 藉由將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種至一適 於該分離株生長的培養基内而獲得一第一培養物； (b) 令步驟⑷所得到的第一培養物接受一被設定在一 第一預定速率下的第一振盪階段並歷時一段時間 以讓被接種的分離株生長，藉此，一具有經增殖的 菌絲體的第二培養物被獲得；以及 (c) 令步驟(b)所得到的第二培養物接受一被設定在要 比該第一預定速率為高的第二預定速率下的第二 振盪階段，藉此，生長於該第二培養物内的該分離 株是處於生理壓力之下被培育。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟(a)所得到的該 第一培養物以及步驟(b)所得到的該第二培養物係藉由 將pH值調整至4.5至5.4之範圍内，而被分別地培養於步 驟(b)以及步驟(c)中。 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中步驟(a)所得到的該 第一培養物以及步驟(b)所得到的該第二培養物係藉由 將pH值調整至4.6至5.3之範圍内，而被分別地培養於步 驟(b)以及步驟(c)中。 4.如申請專利範圍第3項之方法，其中步驟(a)所得到的該 第一培養物以及步驟(b)所得到的該第二培養物係藉由 將pH值調整至4.7至5.2之範圍内，而被分別地培養於步

1279439 驟(b)以及步驟(c)中。 5.如申請專概圍第丨項之方法， 之培養基係選自於由馬铃箸右旋糖二=驟= 6，為主要碳源的合成培養基所構成= 及中：有 申請專鄉圍第5歡方法，其中被使心步驟⑷中 之培養基為一含有果糖作為主要碳源的合成培養基。 7·如申凊專利範圍第1項之方法，其中被使用於步驟(幻中 之該樟芝分離株係選自於由CCRC 93〇〇32 (ATCC

PTA-1233)、CCRC 35396、35398、35716、36401 與36795 所構成之群組中。 8.如申請專利範圍第1項之方法，其中從步驟⑷所得到的 經培育的培養物具有一抑制腫瘤或癌細胞生長的活性。