ES2574606T3

ES2574606T3 - Una sustancia activa contra el cáncer de Antrodia camphorata, método de preparación de la misma y uso de la misma

Info

Publication number: ES2574606T3
Application number: ES10192000.7T
Authority: ES
Inventors: Chiang Been-Huang; Lin Yu-Wei
Original assignee: National Taiwan University NTU
Current assignee: National Taiwan University NTU
Priority date: 2009-11-26
Filing date: 2010-11-22
Publication date: 2016-06-21
Anticipated expiration: 2030-11-22
Also published as: US20130129773A1; EP2329816A1; JP2011111457A; PL2329816T3; TWI421085B; TW201200144A; US9950021B2; MY161596A; EP2329816B1; JP5752925B2; US20110123562A1

Abstract

Un compuesto bioactivo purificado de Antrodia camphorata, en donde la purificación comprende las etapas de: etapa 1: proporcionar las pellas de micelio de Antrodia camphorata; etapa 2: extraer las pellas de micelio de Antrodia camphorata con etanol y luego liofilizar; etapa 3: disolver en agua el extracto de etanol de micelio liofilizado de la etapa 2 y extraer la suspensión con acetato de etilo; etapa 4: purificar el extracto de acetato de etilo de la etapa 3 por cromatografía en gel de sílice, en donde la fracción f se eluye con 80 % de hexano/20 % de acetato de etilo a 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo y la fracción g se eluye con 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo a 60 % de hexano/40 % de acetato de etilo; etapa 5: purificar la fracción g de la etapa 4 por cromatografía en gel de sílice usando gradiente de hexano/acetato de etilo como fase móvil, en donde la fracción E se eluye con 80 % de hexano/20 % de acetato de etilo a 75 % de hexano/25 % de acetato de etilo, y las fracciones F y G se eluyen con 75 % de hexano/25 % de acetato de etilo, y la fracción H se eluye con 75 % de hexano/25 % de acetato de etilo a 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo y la fracción I se eluye con 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo; etapa 6: purificar las fracciones E, F, G, H e I de la etapa 5 por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para obtener 4-acetilantroquinonol B; en donde el compuesto bioactivo está seleccionado del grupo que consiste en el extracto de acetato de etilo de la etapa 3, fracciones f y g de la etapa 4, fracciones E, F, G, H e I de la etapa 5.

Description

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DESCRIPCION

Una sustancia activa contra el cancer de Antrodia camphorata, metodo de preparacion de la misma y uso de la misma

Antecedentes de la invencion

1. Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a novedosos compuestos bioactivos, identificados en micelio de Antrodia camphorata, y aplicaciones de dichos compuestos para su uso en el tratamiento del cancer. Para ser mas especffico, el compuesto extrafdo es un compuesto contra el cancer bioactivo que puede inhibir la proliferacion de celulas cancerosas de hepatoma de hfgado y proporcionar proteccion contra cancer de hfgado. Tambien se desvelan metodos de cultivo.

2. Descripcion del estado de la tecnica

Antrodia camphorata es un hongo medicinal que crece dentro de Cinnamomum kanchirai Hayata, tronco de Lauraceae, un arbol de especie nativa encontrado en Taiwan. Se ha informado que Antrodia camphorata tiene muchas propiedades medicinales, que incluyen propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y anticancerfgenas (Chang y chou, 2004; Mau, Huang; Huang y Chen, 2004; Song y Yen; 2003; Hseu, Chang, Hseu, Lee, Yech, y Chen, 2002; Shen, Chou, Wang, Chen, Chou, y Lu, 2004; Ao et al., 2009). Este tipo de hongo particular se uso ampliamente como un farmaco de tratamiento para enfermedades asociadas al hfgado en la medicina tradicional. Recientemente, la actividad anticancerfgena de Antrodia camphorata, particularmente la actividad contra el cancer de hfgado, ha atrafdo gran interes.

Muchos compuestos identificados en Antrodia camphorata demostraron presentar actividades anticancerfgenas. Lien et al. han purificado 4,7-dimetoxi-5-metil-1,3-benzodioxol del cuerpo fructffero seco de Antrodia camphorata y descubierto que este compuesto puede inhibir la proliferacion de celulas epiteliales de colon humano (Lien et al., 2009). Ademas, se mostro que 24-metilenelanosta-7,9-(11)-dieno-3p,15a-diol-21-oico (MMH01), otro compuesto identificado en micelio de Antrodia camphorata, inhibfa el crecimiento de celulas de cancer de leucemia humana (U937) y celulas de cancer pancreatico (BxPC3) (Chen, Chou, y Chang, 2009). Aparte de sus actividades anticancerfgenas, algunos compuestos aislados de Antrodia camphorata tambien han mostrado actividades antiinflamatorias. Yang et al. (2009) purificaron 5 compuestos diferentes de Antrodia camphorata que incluyen antroquinonol B, 4-acetil-antroquinonol B, 2,3-(metilendioxi)-6-metil benceno-1,4-diol, 2,4-dimetoxi-6-metil-benceno- 1,3-diol y antrodina D, y encontraron que pueden inhibir eficazmente la produccion de NO y presentar ciertos efectos antiinflamatorios.

Debido al alto valor medicinal y la lenta velocidad de crecimiento de Antrodia camphorata, el cuerpo fructffero de Antrodia camphorata tiene una alta demanda hoy en dfa. Con el fin de cumplir con la demanda de mercado de este hongo raro, se han explorado muchos enfoques y se ha desarrollado la produccion a nivel industrial de micelio de Antrodia camphorata usando medio de cultivo lfquido (Shin, Pan, y Hsieh et al. 2006). Aunque los efectos medicinales de Antrodia camphorata han llamado mucho la atencion, estan disponibles estudios limitados en terminos de identificacion y caracterizacion de estos compuestos anticancerfgenos bioactivos encontrados en micelio. Nakamura et al. descubrieron cinco derivados de acido malico y acido succfnico de micelio de Antrodia camphorata, y demostraron que estos compuestos tienen efectos citotoxicos sobre la lfnea de celulas de cancer de pulmon LLC y las CE50 estan entre 3,6 y 20 pg/ml (Nakamure et al., 2004). Estudios realizados por Cheng, Huang, Chang, Wang y Lu han sugerido que los polisacaridos aislados de Antrodia camphorata pueden suprimir la angiogenesis regulando por disminucion la expresion de ciclina D1 mediante la inhibicion de la senalizacion del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (receptor de VEGF).

El hepatoma es la principal causa mortal de canceres malignos en China, Taiwan, Corea y el sur del Sahara en Africa (Seow, Liang, Leow y Chung, 2001; Kern, Breuhahn y Schirmacher, 2002). Estudios previos han mostrado que el micelio de Antrodia camphorata puede proteger el hfgado del dano producido por alcohol, CC14 y lipopolisacaridos (Dai et al., 2003; Lu et al., 2007; Hsiao et al., 2003; Song y Yen, 2003; Hattori y Sheu, 2006; Ao et al., 2009). Guo et al. tambien han revelado que el micelio de Antrodia camphorata puede invertir la fibrosis hepatica inducida por dimetilnitrosamina, DMN (Guo et al. 2002). Ademas, estudios in vitro han demostrado que el extracto de micelio de Antrodia camphorata puede inhibir la proliferacion de celulas cancerosas de hepatoma de hfgado y las CI50 de celulas HepG2 y Hep3B son 49,5 y 62,7 pg/ml, respectivamente (Song, Hsu y Yen, 2005). Pan et al. cultivaron Antrodia camphorata usando un fermentador de 5 toneladas y han demostrado que el extracto de micelio de Antrodia camphorata puede reducir significativamente las CI50 de celulas cancerosas HepG2 de hepatoma de hfgado a 4,25 pg/ml (Pan et al., 2008). Aunque las pruebas acumuladas han sugerido fuertemente las actividades anti-hepatoma de Antrodia camphorata, los compuestos anticancerfgenos bioactivos definitivos siguen sin estar claros. Por tanto, para identificar adicionalmente y caracterizar los compuestos anticancerfgenos bioactivos encontrados en Antrodia camphorata, el (los) inventor(es) han desarrollado satisfactoriamente 1) un nuevo enfoque para el cultivo y purificacion de Antrodia camphorata, 2) identificado el compuesto anticancerfgeno bioactivo

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definitivo y 3) verificado su uso para los tratamientos contra el cancer.

Referenda citada [Referenciado por]

Otra referencia

Ao, Z. H., Xu, Z. H., Lu, Z. M., Xu, H. Y., Zhang, X. M., y Dou, W. F. (2009). Niuchangchih (Antrodia camphorata) and its potential in treating liver diseases. J. Ethnopharm, 121, 194-212.

Chang, T. T., y Chou, W. N. (2004). Antrodia cinnamomea reconsidered and A. salmonea sp. nov. on Cunninghamia konishii in Taiwan. Botanical Bulletin Academia Sinica, 45, 347-352.

Chen, Y. J., Chou, C. J. y Chang, T. T. (2009). Compound MMH01 possesses toxicity against human leukemia and pancreatic cancer cells. Toxicology in vitro, 23, 418-424.

Cheng, J. J., Huang, N. K., Chang, T. T., Wang, D. L. y Lu, M. K. (2005). Study for anti-angiogenic activities of polysaccharides isolated from Antrodia cinnamomea in endothelial cells. Life Science, 76, 3029-3042.

Dai, Y. Y., Chuang, C. H., Tsai, C.C., Sio, H. M., Huang, S.C., Chen, J. C. y Hu, M. L. (2003). The protection of Antrodia camphorata against acute hepatotoxicity of alcohol in rats. Journal of Food and Drug Analysis, 11, 177185.

Hattori, M., y Sheu, C. C. (2006). Compounds from Antrodia camphorata having anti-inflammatory and anti-tumor activity. US 7109232.

Hseu, Y. C., Chang, W. C., Hseu, Y. T., Lee, C. Y., Yech, Y. J., y Chen, P. C. (2002). Protection of oxidative damage by aqueous extract from Antrodia camphorata mycelia in normal human erythrocytes. Life Science, 71, 469-482.

Hsiao, G., Shen, M. Y., Lin, K. H., Lan, M. H., Wu, L. Y., Chou, D. S., Lin, C. H., Su, C. H., y Sheu, J. R. (2003). Antioxidant and hepatoprotective effective of Antrodia camphorata extract. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 51, 3302-3308.

Kern, M. A., Breuhahn, K., y Schirmacher, P. (2002). Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma. Advances in Cancer Research, 86, 67-112.

Guo, S. Q. (2002). Ameliorative effects of Antrodia camphorata on liver fibrosis and gastrointestinal functions in rats. Master Thesis. China Medical College, Taiwan.

Lien, H. M., Lin, H. W., Wang, Y. J., Chen, L. C., Yang, D.Y., Lai, Y. Y, y Ho, Y. S. (2009). Inhibition of anchorage- independent proliferation and G0/G1 cell-cycle regulation in human colorectal carcinoma cells by 4,7-dimethoxy- 5-methyl-1,3-benzodioxole isolated from the fruiting body of Antrodia camphorata. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, (In process)

Lu, Z. M., Tao, W. Y., Zou, X. L., Fu, H. Z., Ao, Z. H. (2007). Protective effects of mycelia of Antrodia camphorate and Armillariella tabescens in submerged culture against ethanol-induced hepatic toxicity in rats. Journal of Ethnopharmcology, 110, 160-164.

Mau, J. L., Huang, P. N., Huang, S. J., y Chen, C. C. (2004). Antioxidant properties of methanolic extracts from two kinds of Antrodia camphorata mycelia. Food Chemistry, 86, 25-31.

Nakamure, N., Hirakawa, A., Gao, J. J., Kakuda, H., Shiro, M., Komatsu, Y., Sheu, C. C., y Hattori, M. (2004). Five new maleic and succinic acid derivatives from the mycelium of Antrodia camphorata and their cytotoxic effects on LLC tumor cell line. Journal of Natural Products, 67, 46-48.

Pan, J. H., Chen, Y. S., Sheen, L. Y., y Chiang, B. H. (2008). Large scale submerged fermentation of Antrodia cinnamomea for anti-hepatoma activity. Journal of The Science of Food and Agriculture, 88, 2223-2230 Seow, T. K., Liang, R. C., Leow, C. K., y Chung, M. C. (2001). Hepatocellular carcinoma: from bedside to proteomics. Proteomics, 10, 1249-1263.

Shen, Y. C., Chou, C. J., Wang, Y. H., Chen, C. F., Chou, Y. C., y Lu, M. K. (2004). Anti-inflammatory activity of the extracts from mycelia of Antrodia camphorata cultured with water-soluble fractions from five different Cinnamomum species. FEMS Microbiology Letters, 231, 137-143.

Shih, I. L., Pan, K., y Hsieh, C. (2006). Influence of nutritional components and oxygen supply on the mycelial growth and bioactive metabolites production in submerged culture of Antrodia cinnamomea. Process Biochemistry, 41, 1129-1135.

Yang, S. S., Wang, G. J., Wang, S. Y., Lin, Y. Y., Kuo, Y. H., Lee, T. H., (2009). New Constituents with iNOS Inhibitory Activity from Mycelium of Antrodia camphorata. Planta Med 2009, 75: 1-5.

Song, T. Y., y Yen, G. C. (2003). Protective Effects of Fermented Filtrate from Antrodia camphorata in Submerged Culture against CC14-Induced Hepatic Toxicity in Rats. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 51, 1571-1577.

Song, T. Y., Hsu, S. L., y Yen, G. C. (2005). Induction of apoptosis in human heptoma cells by mycelium of Antrodia camphorata in submerged culture. Journal of Ethnopharmacology, 100, 158-167.

Yang, S. S., Wang, G. J., Wang, S. J., Lin, Y. Y., Kuo, Y. H., y Lee, T. H. (2009). New constituents with iNOS inhibitory activity from mycelium of Antrodia camphorata. Planta Medica, 75, 512-516.

US 2008/0119565

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Sumario de la invencion

En un aspecto, la presente invencion proporciona novedosos compuestos bioactivos extrafdos de micelio de Antrodia camphorata segun la reivindicacion 1. Los compuestos bioactivos de la presente invencion tienen actividad anticancerfgena y pueden inhibir la proliferacion de celulas cancerosas de hepatoma de hfgado y pueden proteger contra cancer de hfgado.

Se desarrollo un enfoque novedoso para cultivo de Antrodia camphorata para mejorar el proceso de extraccion de los compuestos bioactivos.

En otro aspecto de la presente invencion se proporcionan compuestos bioactivos que pueden usarse como farmaco para tratar cancer(es).

Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere a un compuesto bioactivo purificado de Antrodia camphorata para su uso en el tratamiento de cancer segun la reivindicacion 7.

El metodo usado para producir el compuesto bioactivo de Antrodia camphorata comprende las siguientes etapas:

Etapa 1: Cultivo de Antrodia camphorata por fermentacion lfquida; Etapa 2: Extraccion de la pella de micelio con etanol para preparar el extracto de etanol; Etapa 3: Disolver el extracto de etanol de la etapa 2 en agua, y extraer con volumen igual de acetato de etilo para obtener el extracto de acetato de etilo;

Etapa 4: Purificacion del extracto de acetato de etilo obtenido de la etapa 3 por cromatograffa en columna de gel de sflice usando gradiente de hexano/acetato de etilo como fase movil (elucion en gradiente de hexano/acetato de etilo, las relaciones de hexano/acetato de etilo fueron de 100:0 a 0:100). Al final, se uso 100 % de metanol para eluir los residuos finales. Entonces, las fracciones recogidas (700 ml por fraccion) se purificaron adicionalmente por cromatograffa en capa fina. Las fracciones f y g se eluyeron con 80 % de hexano/20 % de acetato de etilo a 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo y 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo a 60 % de hexano/40 % de acetato de etilo, respectivamente.

Etapa 5: Purificacion de la fraccion g obtenida de la etapa 4 por cromatograffa en columna de gel de sflice usando gradiente de hexano/acetato de etilo como fase movil (elucion en gradiente de hexano/acetato de etilo, las relaciones de hexano/acetato de etilo fueron de 80:20 a 50:50) y finalmente eluir con 100 % de acetato de etilo. Recoger los eluatos (50 ml por fraccion) que contienen las fracciones E, F, G, H e I. La fraccion E se eluyo con 80 % de hexano/20 % de acetato de etilo a 75 % de hexano/ 25 % de acetato de etilo, las fracciones F y G estuvieron en el eluato de 75 % de hexano/ 25 % de acetato de etilo, y la fraccion H e I se eluyeron con 75 % de hexano/ 25 % de acetato de etilo a 70 % de hexano/ 30 % de acetato de etilo, y 70 % de hexano/ 30 % de acetato de etilo, respectivamente.

Etapa 6: Purificacion adicional de los eluatos que contienen las fracciones E, F, G, H e I obtenidas de la etapa 5 con metodos de purificacion apropiados y entonces se recogio 4-acetilantroquinonol B.

Los metodos de purificacion incluyen, pero no se limitan a, cromatograffa en columna de gel de sflice. El extracto de etanol en bruto, el extracto de acetato de etilo, la fraccion eluida f, la fraccion eluida g, las fracciones eluidas E, F, G, H, I y 4-acetilantroquinonol B son los compuestos bioactivos. Estos compuestos purificados pueden usarse 1) para tratar cancer directamente, 2) como uno de los farmacos de mezcla para la terapia del cancer, o 3) como constituyentes para otras aplicaciones apropiadas. El 4-acetilantroquinonol B esta previsto solo para uso en el tratamiento de cancer.

Los compuestos bioactivos descritos en la presente invencion se refieren al extracto de etanol en bruto, el extracto de acetato de etilo, el extracto de hexano/acetato de etilo, fraccion f, fraccion g, fracciones E, F, G, H, I y 4- acetilantroquinonol B de los mismos que se preparan por dicho metodo en la presente invencion. El 4- acetilantroquinonol B esta previsto solo para uso en el tratamiento de cancer.

En un ejemplo de la invencion, se obtuvo Antrodia camphorata (BCRC35716) de Biosources Collection and Research Center (BCRC) en Food industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan). Sin embargo, la preparacion de los compuestos bioactivos no se limita a estas especies particulares.

Segun la invencion, fermentacion lfquida se refiere a cultivar micelio de Antrodia camphorata en medio de fermentacion que contiene 2 % de glucosa y 2 % extracto de malta con pH ajustado a 4,5-5,0, cultivado a 20-25 °C, 20-100 rpm de agitacion y una aireacion de 0,5-1 wm en un fermentador de 5 toneladas durante 4 semanas.

En otra realizacion de la invencion, las etapas para la extraccion de etanol son mezclar el micelio seco con 90-99 % de etanol (las relaciones de micelio con respecto a etanol es 1:10 a 1:50 (g/ml)) y homogeneizar con un Polytron durante 12-48 h.

En un ejemplo de la invencion, el tamano de la columna de gel de sflice usada en la etapa 4 es 750-75 mm, 230-400 de malla.

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En otro ejemplo de la invencion, el tamano de la columna de gel de sflice usada en la etapa 5 es 420-25 mm, 230400 de malla.

En una realizacion de la presente invencion, la columna de gel de sflice usada en la etapa 6 es la columna Luna 5u Silica (2) 100 A (4,6 * 250 mm) y la fase movil es la mezcla de hexano/acetato de etilo en la relacion de 80 a 20.

Ademas, la presente invencion tambien describe un compuesto bioactivo que incluye la dosis eficaz de dicho compuesto y diluyentes, excipientes o vehfculos adecuados.

Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para su uso en inhibir la proliferacion de celulas cancerosas, que comprende el compuesto bioactivo de la reivindicacion 7 y excipientes farmaceuticos aceptables, en la que las celulas de cancer estan seleccionados preferentemente del grupo que consiste en celulas cancerosas de hepatoma de hfgado, celulas de cancer de colon, celulas de cancer de prostata y celulas de cancer de mama.

Ademas, tales mezclas de compuesto pueden inhibir la proliferacion de celulas cancerosas.

La presente invencion identifico adicionalmente una mezcla de farmacos anticancerfgenos que consiste en dosis eficaz de 4-acetilantroquinonol B y un vehfculo.

La presente invencion tambien proporciona una aplicacion novedosa para el 4-acetilantroquinonol B anterior en la que el compuesto puede usarse para el desarrollo de farmaco(s) anticancerfgeno(s) y tal(es) farmaco(s) pueden inhibir la proliferacion de celulas cancerosas.

Por consiguiente, la presente solicitud de patente tambien se refiere a 4-acetilantroquinonol B para su uso en el tratamiento de cancer y el uso de 4-acetilantroquinonol B en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de cancer.

Realizaciones preferidas de la presente invencion se mencionan en las reivindicaciones dependientes.

La presente invencion se describira ahora mas especfficamente con referencia a las siguientes realizaciones, que se proporcionan con el fin de demonstracion en vez de limitacion.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1 muestra actividades antiproliferativas de fracciones repartidas por diversos disolventes. Medias con diferentes letras (a~d) dentro de los tratamientos de 72 y 96 h son significativamente diferentes (P< 0,05).

La Fig. 2 muestra los perfiles de HPLC de las fracciones E, F, G, H e I despues de la segunda cromatograffa en columna de gel de sflice. 2A, 2B, 2C, 2D y 2E representan la fraccion E, F, G, H e I, respectivamente. Estas fracciones contienen todas un pico principal al mismo tiempo de retencion que se indica por las flechas.

La Fig. 3 muestra la actividad inhibitoria y citotoxica de 4-acetilantroquinonol B sobre la proliferacion de celulas HepG2.

La Fig. 4 muestra la estructura del compuesto bioactivo, 4-acetilantroquinonol B.

Descripcion detallada de la realizacion preferida

Los ejemplos a continuacion son simplemente representativos de diversos aspectos y caracterfsticas de la presente invencion y no son limitantes. A menos que se defina de otro modo, los materiales usados en la presente invencion estan todos comercialmente disponibles.

Ejemplo 1: Preparacion de caldo de fermentacion de Antrodia camphorata

Fuente de Antrodia camphorata

Antrodia camphorata (BCRC35716) usado en la presente invencion se obtuvo de Biosources Collection and Research Center (BCRC) en Food industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan). Sin embargo, la extraccion de los compuestos bioactivos descritos en la presente invencion no se limita a esta cepa particular.

Cultivo sumergido de Antrodia camphorata

Inocular micelio de Antrodia camphorata en medio de fermentacion que contiene 2 % de glucosa y 2 % de extracto de malta con pH ajustado a 5,0 y cultivar a 22 °C, 50 rpm de agitacion y una aireacion de 0,5 wm en un fermentador de 5 toneladas durante 4 semanas.

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Procesamiento del caldo de fermentacion despues del cultivo de Antrodia camphorata

Al final del cultivo de 4 semanas, el caldo de fermentacion se centrifugo para separar el micelio del filtrado de caldo. La pella de micelio se lavo dos veces con agua destilada para eliminar la traza de caldo y a continuacion liofilizar y guardar a 4 °C. Para el extracto de etanol, se mezclo pella de micelio seco con 95 % de etanol en la relacion de 1 g a 20 ml y se homogeneizo con Polytron de alta velocidad y se agito durante 24 h para extraer los compuestos solubles en etanol. El extracto se concentro adicionalmente con un evaporador rotatorio y se guardo a -80 °C para estudios adicionales.

Ejemplo 2: Purificacion de la sustancia bioactiva de Antrodia camphorata

Se suspendieron 857 g de extracto de etanol en bruto en 2 l de agua y a continuacion la suspension se extrajo con un volumen igual de acetato de etilo. A continuacion, la fase acuosa se extrajo tres veces con n-butanol saturado en agua. La fraccion en bruto, fraccion de acetato de etilo, fraccion de n-butanol y fraccion de agua se probaron entonces para la actividad antiproliferativa hacia celulas HepG2.

La fraccion que contiene la actividad inhibitoria mas potente se purifico entonces por cromatograffa en gel de sflice (750-75 mm, 230-400 de malla) y se eluyo con soluciones en gradiente de hexano/acetato de etilo (las relaciones de hexano/acetato de etilo varfan de 100:0 a 0:100). Finalmente, se uso 100 % de metanol para eliminar la traza de residuos. Se recogio cada fraccion (700 ml) y se analizo su patron de composicion por cromatograffa en capa fina (CCF, gel de sflice 60 F254, Merck Co., Darmstadt, Alemania) usando acetato de etilo/hexano (50/50; v/v) para el desarrollo. Se uso fluorescencia amarilla que ilumina UV a 254 nm para agrupar fracciones con esqueleto similar. Segun los resultados analizados de cromatograffa en capa fina, se recogieron 13 fracciones de los eluatos y se probaron para su actividad anticancerfgena.

Como se muestra en la Tabla 1, la fraccion f se obtuvo del lavado con hexano/acetato de etilo (variando las relaciones de hexano con respecto a acetato de etilo de 80/20 a 70/30) y los tubos de recogida estan en el numero 36 a 42 con el volumen final de 4,9 l. La fraccion g se obtuvo del lavado de hexano/acetato de etilo (variando las relaciones de hexano con respecto a acetato de etilo de 70/30-60/40) y los tubos de recogida estan en el numero 43 a 55 con el volumen final de 9,1 l.

Tabla 1 Las relaciones de hexano/acetato de etilo de los primeros tampones de elucion

Numero de tubo: Tampon de elucion (fase movil)

1-7: Hexano(100 %)

8-13: Hexano:Acetato de etilo (98:2)

14-21: Hexano:Acetato de etilo (95:5)

22-30: Hexano:Acetato de etilo (90:10)

31-40: Hexano:Acetato de etilo (80:20)

41-49: Hexano:Acetato de etilo (70:30)

50-58: Hexano:Acetato de etilo (60:40)

59-68: Hexano:Acetato de etilo (50:50)

69-78: Hexano:Acetato de etilo (40:60)

79-88: Hexano:Acetato de etilo (30:70)

89-98: Hexano:Acetato de etilo (20:80)

99-108: Hexano:Acetato de etilo (10:90)

109-120: Acetato de etilo (100 %)

121-128: Metanol (MeOH) (100 %)

El extracto anticancerfgeno mas eficaz recogido se purifico adicionalmente usando otra columna de gel de sflice (750-75 mm, 230-400 de malla) y se lavo con tampones hexano/acetato de etilo (las relaciones de hexano con respecto a acetato de etilo varfan de 80/20 a 50/50). A continuacion se uso acetato de etilo puro para la elucion final y se recogieron 12 fracciones. Los eluatos se recogieron cada 50 ml y la fraccion E se obtuvo del lavado 80/20-75/25 de hexano/acetato de etilo y los tubos de recogida son 44 a 56 con el final de 650 ml. Las fracciones F y G se obtuvieron del lavado de 75/25 de hexano/acetato de etilo, los tubos de recogida son 57 a 61 y 62 a 69 y los volumenes recogidos son 250 ml y 400 ml, respectivamente. La fraccion H se obtuvo del lavado con 75/25 a 70/30 de hexano/acetato de etilo, los tubos de recogida son 70 a 73 y el volumen final recogido es 200 ml. La fraccion I se obtuvo del lavado con 70/30 de hexano/acetato de etilo, los tubos de recogida son 74 a 84 y el volumen total recogido es 550 ml. Todas estas fracciones se probaron para su actividad anticancerfgena y la fraccion mas eficaz se purifico entonces adicionalmente.

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Tabla 2 Las relaciones de hexano/acetato de etilo de los segundos tampones de elucion

Numero de tubo: Tampon de elucion (fase movil)

1-47: Hexano:Acetato de etilo (80:20)

48-71: Hexano:Acetato de etilo (75:25)

72-97: Hexano:Acetato de etilo (70:30)

98-121: Hexano:Acetato de etilo (65:35)

122-145: Hexano:Acetato de etilo (60:40)

146-169: Hexano:Acetato de etilo (55:45)

170-191: Hexano:Acetato de etilo (50:50)

192-230: Hexano:Acetato de etilo (100 %)

Las fracciones recogidas se purificaron adicionalmente usando un sistema de cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC) equipado con un detector de absorbancia ajustable (modelo serie 1100, Agilent, EE.UU.). La elucion se llevo a cabo al caudal de 1 ml/min con una temperatura de columna a 25 °C y longitud de onda UV de 254 nm. La fraccion excepcional se separo por una columna de sflice (4,6 * 250 mm, columna Luna 5u Silica (2) 100 A) con hexano/acetato de etilo (80:20, v/v) como sistema de disolventes para obtener el compuesto bioactivo anticancengeno. La estructura del compuesto purificado se identifico adicionalmente por resonancia magnetica nuclear (RMN, Bruker AMX-400).

Ejemplo 3 Analisis de los efectos inhibidores de compuestos bioactivos de Antrodia camphorata sobre la proliferacion de celulas de hepatoma

Material

Se obtuvieron celulas HepG2 de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, ATCC, Rockville, Maryland, EE.UU. y se mantuvieron en medio E de Williams (WME), que contema 10 mM/l de HEPES, 5 pg/ml de insulina, 2 pg/ml de glucagon, 0,05 pg/ml de hidrocortisona y 5 % de suero bovino fetal (Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.). Las celulas de cancer de colon (CT26, BCRC 60443), celulas de cancer de prostata (LNCaP, BCRC 60088) y celulas de cancer de mama (MDA-MB-231, BCRC 60425) se obtuvieron de Biosources Collection and Research Center (BCRC) en Food industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan).

Metodo

Se cultivaron celulas HepG2 en WME sobre una placa de cultivo celular de 96 pocillos (2,5*104 celulas por pocillo) y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2. Despues de 4 horas de incubacion, sustituir el medio con diferentes concentraciones de extractos de muestra de Antrodia camphorata. Los extractos de Antrodia camphorata se disolvieron en 1 % de sulfoxido de dimetilo (DMSO) y se mezclaron con medio WME para preparar extractos a diferentes concentraciones y la concentracion final de DMSO se mantuvo por debajo del 1 %. Los cultivos de control solo contuvieron disolventes de extraccion, y los pocillos de blanco contuvieron 100 pl de medio de crecimiento sin celulas. Despues de 72 y 96 h de incubacion, la proliferacion celular se determino por ensayo MTS (ensayo de proliferacion celular de no radiactividad en CellTiter 96 basado en MTS, Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.) para examinar la actividad anti-hepatoma. MTS es un metodo colorimetrico que utiliza un reactivo de tetrazolio. La proliferacion celular se determino a las 72 y 96 h a partir de la lectura de absorbancia de MTS a 490 nm para cada concentracion en comparacion con el control. El valor de CC50 se determino como la concentracion citotoxica de una muestra que redujo la viabilidad celular al 50 % del control en 24 h. La CE50 de una muestra se define como la dosis media eficaz de una muestra (la concentracion de la muestra que produce el 50 % de viabilidad celular) despues de tratar las celulas de cancer durante un cierto periodo de tiempo. Se probaron al menos tres replicaciones de cada muestra para confirmar la proliferacion celular y citotoxicidad. El efecto selectivo sobre las celulas de cancer se expreso como el valor SI (mdice selectivo). El valor SI se determino como la relacion de CC50 frente a CE50 para una muestra probada.

Analisis estadfstico

El analisis estadfstico se realizo usando analisis unilateral de la varianza y prueba del rango multiple de Duncan (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.) para determinar diferencias significativas entre medias (P < 0,05).

Resultados

Actividades antiproliferativas de fracciones de extracto en bruto de micelio

Los pesos de la fraccion de acetato de etilo, fraccion de n-butanol y fraccion de agua del extracto de etanol de micelio fueron 574 g, 196 g y 87 g, respectivamente. Sus actividades antiproliferativas se muestran en la Fig. 1. La CE50 del extracto en bruto, fraccion de acetato de etilo, fraccion de n-butanol y fraccion de agua para antiproliferacion de celulas HepG2 durante 72 h de tratamiento fueron 5,59 ± 0,16, 2,83 ± 0,06, 18,26 ± 2,72 y >100

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|jg/ml, respectivamente. Las CE50 de estas fracciones durante 96 h de tratamiento fueron 2,76 ± 0,01, 1,94 ± 0,13, 5,3 ± 0,00 y 9,35 ± 0,32 jg/ml, respectivamente. Se encontro que la fraccion de acetato de etilo mostro la mejor actividad antiproliferativa entre todas las fracciones; asf, esta fraccion se purifico adicionalmente por la columna de gel de sflice abierta.

Actividades antiproliferativas de fracciones separadas por la primera columna de gel de sflice abierta

El extracto de acetato de etilo se separo en 13 fracciones por la columna de gel de sflice abierta, y las CE50 de estas fracciones se dan en la Fig. 3. Los resultados indicaron que las fracciones f y g tuvieron mejor actividad antiproliferativa. Sin embargo, solo se recuperaron 2,29 g de fraccion f en comparacion con los 13,25 g recuperados para la fraccion g. Como la fraccion g fue la principal porcion bioactiva cuantitativamente, se uso para estudio adicional.

Las CE50 de fraccion g hacia celulas HepG2 fueron 1,33 jg/ml y 0,82 jg/ml durante tratamientos de 72 h y 96 h, respectivamente. Ademas, el valor SI de la fraccion g fue 86 durante 96 h de tratamiento. Debido a los compuestos contaminados encontrados en la fraccion g basandose en el resultado de CCF, fue necesario usar una columna de gel de sflice abierta para purificar adicionalmente el compuesto bioactivo.

Tabla 3 Citotoxicidades (CC50) y actividades antiproliferativas (CE50) de fracciones aisladas de acetato de etilo por la primera columna de gel de sflice abierta contra celulas cancerosas de hepatoma de hfgado.

Celulas HepG2_______________________________________________________

Fraccion CC50 CE50 (jg/ml)_________________________________________

(jg/ml)__________ 72 horas________SI*_______ 96 horas_______SI*

a: >100 >100a — >100a —

b: >100 >100a — >100a —

c: >100 >100a — >100a —

d: >100 37,04 ± 1,20c >2,70 15,81 ± 1,41d >6,33

e: >100 13,21 ± 0,24f >7,57 3,42 ± 0,219 >29,24

f: 72,75 ± 1,70 2,35 ± 0,17h 30,96 1,59 ± 0,22h 45,75

g: 71,24 ± 3,88 1,33 ± 0,05h 53,56 0,82 ± 0,01h 86,88

h: >100 8,06 ± 0,58g >12,41 4,69 ± 0,26f >21,32

i: >100 19,81 ± 0,56e >5,05 8,60 ± 0,39e >11,63

j: 73,08 ± 1,35 7,74 ± 1,09g 9,44 3,59 ± 0,57g 20,36

k: >100 51,64 ± 2,20b >1,94 38,92 ± 0,68b >2,57

l: >100 29,55 ± 4,54d >3,38 22,98 ± 1,56c >4,35

m: >100 >100a — >100a —

*lndice selectivo (SI) = CC50/CE50.

a~h Medias con diferentes letras dentro de una columna son significativamente diferentes (P < 0,05).

Actividades antiproliferativas de fracciones separadas por la segunda columna de gel de sflice abierta

Se aislaron doce fracciones de la fraccion g y las CE50 de estas 12 fracciones se muestran en la Fig. 4. Los resultados indicaron que las fracciones F, G y H expresaron mejor actividad antiproliferativa con una CE50 de 0,5 jg/ml durante 72 h de tratamiento, y las CE50 de las fracciones E, F, G, H e I fueron aproximadamente 0,4 jg/ml durante 96 h de tratamiento.

Despues de la purificacion por la segunda columna de gel de sflice abierta, la CC50 de todas las fracciones en celulas HepG2 fue > 50 jg/ml. Los valores SI de estas fracciones oscilaron de 111 a 119 sugiriendo que estas fracciones fueron muy selectivas de celulas de hepatoma.

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Tabla 4 Citotoxicidades (CC50) y actividades antiproliferativas (CE50) de fracciones aisladas por la segunda columna

_________de gel de silice abierta contra celulas cancerosas HepG2 de hepatoma de higado_________

Celulas cancerosas HepG2 de hepatoma de higado_____________________________

Fracciones: CC50 (pg/ml) CE50 (pg/ml)

72 horas: SI* 96 horas SI*

A: >50 >50a — 38,28 ± 4,45a —

B: >50 9,94 ± 1,11d >5,03 10,26 ± 0,48c >4,87

C: >50 15,97 ± 1,85c >3,13 11,37 ± 0,07c >4,40

D: >50 4,74 ± 0,33e >10,55 2,89 ± 0,04d >17,30

E: >50 0,70 ± 0,12g >71,43 0,45 ± 0,01d >111,11

F: >50 0,50 ± 0,00g >100 0,45 ± 0,01d >111,11

G: >50 0,57 ± 0,00g >87,72 0,43 ± 0,00d >116,28

H: >50 0,55 ± 0,03g >90,91 0,42 ± 0,01d >119,05

I: >50 0,68 ± 0,02g >73,53 0,43 ± 0,02d >116,28

J: >50 3,20 ± 0,58f >15,63 0,99 ± 0,17d >50,51

K: >50 1,29 ± 0,10g >38,76 0,77 ± 0,01d >64,94

L: >50 20,40 ± 1,01b >2,45 16,62 ± 3,42b >3,01

*lndice selectivo (SI) = CC50/CE50.

Actividad antiproliferativa de fraccion purificada por HPLC

Las fracciones E, F, G, H e I se separaron adicionalmente por HPLC y todas las fracciones anteriores contienen un pico principal en el mismo tiempo de retencion (Fig. 2A-E). El eluato de este pico principal se recogio y se probo para su bioactividad y se uso para caracterizacion adicional. La Figura 3 muestra la actividad antiproliferativa de este compuesto. Las CE50 de este compuesto fueron 0,1 y 0,08 pg/ml para tratamientos de 72 y 96 h, respectivamente. Este compuesto mostro la mejor actividad antiproliferativa entre las fracciones obtenidas durante todo el proceso de separacion. En comparacion con el extracto en bruto, este compuesto mostro 50 veces la actividad antiproliferativa. La CC50 de este compuesto fue >10 pg/ml.

Ademas, la presente invencion tambien probo la actividad antiproliferativa de 4-acetilantroquinonol B contra otras celulas cancerosas. Como se muestra en la Tabla 5, las CI50 de este compuesto contra celulas de cancer de colon (CT26), cancer de prostata (LNCaP) y de cancer de mama (MDA-MB-231) son 48,12 ± 5,61, 16,841 ± 3,41 y 0,091 pg/ml, respectivamente, y la viabilidad celular de estas celulas de cancer probadas fue inferior al 50 %.

Por tanto, tal compuesto tambien pueden inhibir crecimiento de celulas de cancer de colon, prostata y de mama y puede usarse como tratamientos para estos canceres.

Tabla 5 Las actividades antiproliferativas (CI50) de 4-acetilantroquinonol B contra celulas cancerosas

: CI50 (pg/ml)

celulas de cancer de colon (CT26): 48,12 ± 5,61

celulas de cancer de prostata (LNCaP): 16,841 ± 3,41

celulas de cancer de mama (MDA-MB-231): 0,091

Estructura del compuesto bioactivo

El compuesto bioactivo se esclarecio por metodos espectroscopicos, que incluyen resonancia magnetica nuclear 1D y 2D (RMN) y analisis de espectros de masas. La estructura se muestra en la Fig. 4.

Espectrometna de masas por ionizacion electronica de 4-acetilantroquinonol B: EM-EI, m/z 485 [M + Na]+; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) 8 5,73 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-4), 5,28 (1H, t, J = 6,9 Hz, H-12), 5,14 (1H, t, J = 6,7 Hz, H-8), 4,69 (1H, m, H-15), 3,98 (3H, s, H-24), 3,61 (3H, s, H-23), 2,74 (1H, m, H-17), 2,50 (1H, m, H-6), 2,38 (1H, dd, J = 7,0, 13,8 Hz, H-14), 2,28 (2H, m, H-7), 2,27 (1H, m, H-14), 2,22 (2H, m, H-16), 2,17 (2H, m, H-11), 2,08 (3H, s, -OAc), 2,06 (2H, m, H-10), 1,93 (1H, m, H-5), 1,66 (3H, s, H-21), 1,57 (3H, s, H-20), 1,22 (3H, d, J = 7,3 Hz, H-19), 1,17 (3H, d, J = 6,9 Hz, H-22); RMN 13C (500 MHz, CD3OD) 8 199,0 (s, C-1), 182,7 (s, C-18), 171,4 (s, CH3CO-), 160,5 (s, C- 3), 138,7 (s, C9), 138,3 (s, C-2), 131,6 (s, C-13), 129,2 (d, C-12), 122,4 (d, C-8), 78,8 (d, C-15), 70,4 (d, C-4), 61,0 (q, C-23), 60,3 (q, C-24), 45,8 (t, C-14), 44,2 (d, C-5), 42,5 (d, C-6), 40,5 (t, C-10), 35,5 (t, C-16), 35,0 (d, C-17), 27,9 (t, C-7), 27,0 (t, C-11), 20,8 (CH3CO-), 16,4 (q, C-21), 16,2 (q, C-20), 15,9 (q, C-19), 13,0 (q, C-22).

La estructura de este compuesto bioactivo que tiene actividad anticancengena caracterizado en la presente invencion es identica a uno de los cinco compuestos antiinflamatorios, 4-acetilantroquinonol B, anteriormente informados por Yang et al. en 2009. Sin embargo, su investigacion no expuso los efectos de tal compuesto en la inhibicion del crecimiento de celulas de cancer y su aplicacion para tratar canceres de hngado, colon, prostata y mama (Yang et al., 2009). Asf, la presente invencion no solo proporciona varios compuestos bioactivos (fracciones

extrafdas diferentes) que tienen actividad anticancerfgena, sino tambien novedosas aplicaciones de 4- acetilantroquinonol B para terapia contra el cancer. Por tanto, en comparacion con hallazgos previos, la presente invencion ofrece ventajosos metodos de aislamiento y preparacion de los compuestos bioactivos, y novedosas aplicaciones para terapia contra el cancer.

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En la presente invencion, el compuesto anticancerfgeno se purifico a constituyente definido y se mostro que tenia efectos inhibidores sobre la proliferacion de celulas cancerosas a concentraciones muy bajas (por ejemplo, 0,1 pg/ml durante 72 horas o 0,08 pg/ml durante 96 horas). Tal compuesto no solo puede purificarse de micelio de Antrodia camphorata por fermentacion lfquida, sino que tambien puede producirse mediante sfntesis qufmica. Este proceso 10 novedoso pueden reducir significativamente el coste de preparacion y resolver la cuestion de alta demanda de la escasa Antrodia camphorata. Por otra parte, los compuestos obtenidos previamente por otros son extracto en bruto y sus constituciones no se determinaron. Tal extracto en bruto puede solo obtenerse por extraccion de caldo de fermentacion, y ese proceso no puede simplificarse. Posteriormente, el coste de preparacion es caro. Asf, la presente invencion proporciona una novedosa aplicacion de 4-acetilantroquinonol B que va a usarse como farmaco 15 anticancerfgeno mediante su actividad antiproliferativa sobre celulas cancerosas.

En resumen, la presente invencion presenta un enfoque original para la extraccion de compuestos bioactivos y adicionalmente identifico sus propiedades multifuncionales en terminos de actividades antiproliferativas sobre celulas cancerosas.

Claims

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1. Un compuesto bioactivo purificado de Antrodia camphorata, en donde la purificacion comprende las etapas de:

etapa 1: proporcionar las pellas de micelio de Antrodia camphorata;

etapa 2: extraer las pellas de micelio de Antrodia camphorata con etanol y luego liofilizar;

etapa 3: disolver en agua el extracto de etanol de micelio liofilizado de la etapa 2 y extraer la suspension con acetato de etilo;

etapa 4: purificar el extracto de acetato de etilo de la etapa 3 por cromatograffa en gel de sflice, en donde la fraccion f se eluye con 80 % de hexano/20 % de acetato de etilo a 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo y la fraccion g se eluye con 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo a 60 % de hexano/40 % de acetato de etilo; etapa 5: purificar la fraccion g de la etapa 4 por cromatograffa en gel de sflice usando gradiente de hexano/acetato de etilo como fase movil, en donde la fraccion E se eluye con 80 % de hexano/20 % de acetato de etilo a 75 % de hexano/25 % de acetato de etilo, y las fracciones F y G se eluyen con 75 % de hexano/25 % de acetato de etilo, y la fraccion H se eluye con 75 % de hexano/25 % de acetato de etilo a 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo y la fraccion I se eluye con 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo;

etapa 6: purificar las fracciones E, F, G, H e I de la etapa 5 por cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC) para obtener 4-acetilantroquinonol B;

en donde el compuesto bioactivo esta seleccionado del grupo que consiste en el extracto de acetato de etilo de la etapa 3, fracciones f y g de la etapa 4, fracciones E, F, G, H e I de la etapa 5.
2. El compuesto bioactivo segun la reivindicacion 1, en donde en la etapa 2 las pellas liofilizadas se extraen con etanol y en donde la relacion de pellas de micelio con respecto a etanol esta en el intervalo de 0,02 a 0,1 (g/ml).
3. El compuesto bioactivo segun la reivindicacion 1, en donde en la etapa 3 el extracto de etanol de micelio se disuelve primero en agua y a continuacion la suspension del extracto de etanol de micelio se extrae con acetato de etilo y en donde la relacion de la suspension de micelio con respecto a acetato de etilo esta en el intervalo de 0,4 a 3,0.
4. El compuesto bioactivo segun la reivindicacion 1, en donde en la etapa 4 la cromatograffa en gel de sflice se aplica con geles de sflice para cromatograffa preparativa.
5. El compuesto bioactivo segun la reivindicacion 1, en donde en la etapa 5 la cromatograffa en gel de sflice se aplica con geles de sflice para cromatograffa preparativa.
6. El compuesto bioactivo segun la reivindicacion 1, en donde la columna para cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC) es la columna de gel de sflice de fase normal y las fracciones se eluyen con 50 % de hexano/50 % de acetato de etilo, 60 % de hexano/40 % de acetato de etilo, 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo, 80 % de hexano/20 % de acetato de etilo o 90 % de hexano/10 % de acetato de etilo.
7. Un compuesto bioactivo purificado de Antrodia camphorata para su uso en el tratamiento de cancer, en donde la purificacion comprende las etapas de:

etapa 1: proporcionar las pellas de micelio de Antrodia camphorata;

etapa 2: extraer las pellas de micelio de Antrodia camphorata con etanol y luego liofilizar;

etapa 3: disolver en agua el extracto de etanol de micelio liofilizado de la etapa 2 y extraer la suspension con acetato de etilo;

etapa 4: purificar el extracto de acetato de etilo de la etapa 3 por cromatograffa en gel de sflice, en donde la fraccion f se eluye con 80 % de hexano/20 % de acetato de etilo a 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo y la fraccion g se eluye con 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo a 60 % de hexano/40 % de acetato de etilo; etapa 5: purificar la fraccion g de la etapa 4 por cromatograffa en gel de sflice usando gradiente de hexano/acetato de etilo como fase movil, en donde la fraccion E se eluye con 80 % de hexano/20 % de acetato de etilo a 75 % de hexano/25 % de acetato de etilo, y las fracciones F y G se eluyen con 75 % de hexano/25 % de acetato de etilo, y la fraccion H se eluye con 75 % de hexano/25 % de acetato de etilo a 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo y la fraccion I se eluye con 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo;

etapa 6: purificar las fracciones E, F, G, H e I de la etapa 5 por cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC) para obtener 4-acetilantroquinonol B;

en donde el compuesto bioactivo esta seleccionado del grupo que consiste en el extracto de acetato de etilo de la etapa 3, fracciones f y g de la etapa 4, fracciones E, F, G, H e I de la etapa 5 y 4-acetilantroquinonol B.
8. El compuesto bioactivo para su uso segun la reivindicacion 7, en donde en la etapa 2 las pellas liofilizadas se extraen con etanol y en donde la relacion de pellas de micelio con respecto a etanol esta en el intervalo de 0,02 a 0,1 (g/ml).

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9. El compuesto bioactivo para su uso segun la reivindicacion 7, en donde en la etapa 3 el extracto de etanol de micelio se disuelve primero en agua y a continuacion la suspension del extracto de etanol de micelio se extrae con acetato de etilo y en donde la relacion de la suspension de micelio con respecto a acetato de etilo esta en el intervalo de 0,4 a 3,0.
10. El compuesto bioactivo para su uso segun la reivindicacion 7, en donde en la etapa 4 la cromatograffa en gel de sflice se aplica con geles de sflice para cromatograffa preparativa.
11. El compuesto bioactivo para su uso segun la reivindicacion 7, en donde en la etapa 5 la cromatograffa en gel de sflice se aplica con geles de sflice para cromatograffa preparativa.
12. El compuesto bioactivo para su uso segun la reivindicacion 7, en donde la columna para cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC) es la columna de gel de sflice de fase normal y las fracciones se eluyen con 50 % de hexano/50 % de acetato de etilo, 60 % de hexano/40 % de acetato de etilo, 70 % de hexano/30 % de acetato de etilo, 80 % de hexano/20 % de acetato de etilo o 90 % de hexano/10 % de acetato de etilo.
13. El compuesto bioactivo para su uso segun la reivindicacion 7, en donde el compuesto bioactivo inhibe la proliferacion de celulas cancerosas de hepatoma de hfgado, celulas de cancer de colon, celulas de cancer de prostata o celulas de cancer de mama.
14. Una composicion farmaceutica para su uso para inhibir la proliferacion de celulas cancerosas, que comprende el compuesto bioactivo de la reivindicacion 7 y excipientes farmaceuticos aceptables, en donde las celulas cancerosas estan seleccionadas preferentemente del grupo que consiste cancerosas de cancer de hepatoma de hfgado, celulas de cancer de colon, celulas de cancer de prostata y celulas de cancer de mama.
15. 4-Acetilantroquinonol B para su uso en el tratamiento de cancer, en donde el 4-acetilantroquinonol B tiene la siguiente estructura:

imagen1
16. Uso de 4-acetilantroquinonol B en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de cancer, en donde el 4-acetilantroquinonol B tiene la siguiente estructura:

imagen2
17. El uso de 4-acetilantroquinonol B segun la reivindicacion 16, en donde el medicamento inhibe la proliferacion de celulas cancerosas, celulas cancerosas que estan seleccionadas preferentemente del grupo que consiste en celulas cancerosas de hepatoma de hfgado, celulas de cancer de colon, celulas de cancer de prostata y celulas de cancer de mama.