JP5752925B2 - 樟芝の抗ガン活性組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、樟芝の抗ガン活性組成物、製備方法およびその用途に関するもので、特に肝癌細胞の増殖を抑制して抗肝癌効果を達成できる樟芝活性組成物を、指す。
樟芝(Antrodia camphorata)は、牛樟樹(Cinnamomum kanchirai Hayata, Lauraceae)の中空の木幹内に寄生する微生物で、台湾に原生する。樟芝は、多種類の健康を促進する効果を有し、抗酸化，抗炎症，抗腫瘍活性などを含む(Chang and Chou, 2004; Mau, Huang, Huang, and Chen, 2004; Song and Yen, 2003; Hseu, Chang, Hseu, Lee, Yech, and Chen, 2002; Shen, Chou, Wang, Chen, Chou, and Lu, 2004；Ao et al., 2009)。このような真菌が伝統的に肝臓疾病の治療に用いられるが、但しその抗腫瘍活性、特に抗肝癌活性が既に注意を広範に引く。
樟芝の子実体に含まれる複数種の化合物が既に分離され、且つ抗腫瘍活性を有することを識別する。Lienとその他の人は、乾燥した樟芝子実体の中から4,7-ジメトキシ-5-メチル-1,3-ベンゾジオキソール(4,7-dimethoxy-5-methyl-1,3-benzodioxole)を分離し、且つ該化合物が人類の結腸細胞の増殖を抑制できることを、見い出す(Lien et al., 2009)。その他に、樟芝の中から分離された24-methylenelanosta-7,9-(11)-diene-3β,15α-diol-21-oic (MMH01)が、人類の白血病細胞U937と膵臓癌細胞BxPC3の成長を抑制できることを、実証する(Chen, Chou, and Chang, 2009)。
抗腫瘍活性の以外に、分離された幾つかの樟芝活性成分も、既に抗炎症の効果を有することを実証し、Yangたち（2009年）は、樟芝菌糸体の中から、antroquinonol B、4-acetyl-antroquinonol B、2,3-(methylenedioxy)-6-methylbenzene-1,4-diol、2,4-dimethoxy-6-methyl-benzene-1,3-diol、antrodin Dの5種類の成分を分離し、且つこれらの成分が一酸化窒素の生成の抑制に対し、所定の効果を有し、ひいては所定の抗炎症作用を達成できることを、見い出す。
樟芝の高価値医療および緩慢成長速度のために、樟芝子実体の値段が高いままで下がらない。市場上ではこの薬用真菌の膨大な需要量を満たすために、目前に既に液体の発酵を使用して樟芝の菌糸体を培養することにより、工業レベルの生産を行う(Shin, Pan, and Heieh, 2006)。
樟芝の医療効果が既に人々の注意を広範に引くが、然しながら樟芝の菌糸体内における抗ガン成分の分離と鑑定に対する研究がまだ多くないが、Nakamuraたちは、樟芝の菌糸体の中から、5種類のリンゴ酸とコハク酸の誘導体を見い出し、これらの成分がLLC肺癌腫瘍細胞株に対し、細胞毒性効果(cytotoxic effects)を有し、且つその半数効果濃度 (EC50)の範囲 が3.6ないし20μg/mLの間にある(Nakamure et al., 2004)。Cheng、Huang、Chang、WangとLuたちは、2005年に樟芝から分離された多糖体が、血管内皮細胞増殖因子受容体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGF receptor)を介して信号を伝導することにより、サイクリンD1(cyclin D1)の表現を抑制し、血管新生の抑制を招いてもよいことを、実証する。
肝癌は、中国，台湾，韓国とサハラ砂漠以南のアフリカ等の地区に流行する最高致死率の悪性腫瘍の一つ(Seow, Liang, Leow, and Chung, 2001; Kern, Breuhahn, and Schirmacher, 2002)である。数部の研究によると、樟芝の菌糸体は、肝臓を保護してアルコール，四塩化炭素(CCl4)とリポ多糖(lipopolysaccharide)の傷害(Dai et al., 2003; Lu et al., 2007; Hsiao et al., 2003; Song and Yen, 2003; Hattori and Sheu, 2006; Ao et al., 2009)を避けてもよいことを、指摘する。Guoたちは、樟芝の菌糸体がジメチルニトロソアミン (dimethylnitrosamine, DMN)により起こされた肝臓の繊維化に対して逆転の効果を有することを、見い出す(Guo, 2002)。樟芝菌糸体のメタノール抽出物も、体外試験中に肝癌細胞の増殖を抑制でき、且つそのHepG2及びHep3B肝癌細胞株に対する半数阻害濃度(IC50)がそれぞれ49.5と62.7μg/mLであることを、見い出す(Song, Hsu, and Yen, 2005)。Panたちは、5トンの発酵槽を使用して樟芝を培養し、樟芝菌糸体のエタノール抽出物がHepG2肝癌細胞に対する半数阻害濃度(IC50)は、4.25μg/mLであることを、見い出す(Pan, Chen, Sheen, and Chiang, 2008)。既に十分な証拠があって樟芝の菌糸体が抗肝癌機能を有するように示すが、然しながら、その確実な生物活性組成物が依然として明らかではない。従って本発明の発明者は、前述の樟芝の有する抗肝癌効果に鑑み、樟芝の抗ガン活性成分を鋭意に研究して分析し、且つ多年を経て苦心して孤独に努力して鋭意に研究した後に、ついに本発明の樟芝の抗ガン活性組成物、製備方法およびその用途を、成功的に研究して完成する。
Ao, Z. H., Xu, Z. H., Lu, Z. M., Xu, H. Y., Zhang, X. M., and Dou, W. F. (2009). Niuchangchih (Antrodia comphorata) and its potential in treating liver diseases. J. Ethnopharm, 121, 194-212.
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本発明の目的は、即ち樟芝の抗ガン活性組成物を提供するもので、該活性組成物が肝癌細胞の増殖を抑制して更に抗肝癌を達成する効果を、有する。
本発明の副次的な目的は、即ち樟芝の抗ガン活性組成物の製備方法を提供するもので、樟芝の菌糸体を材料として抽出することにより該樟芝の抗ガン活性組成物を取得する。
本発明の他の目的は、即ち樟芝の抗ガン活性組成物の用途を提供するもので、該活性組成物が抗ガン薬物の製備に用いられる。
前述の発明目的を達成できる樟芝活性組成物は、樟芝の菌糸体が下記の工程を実施することにより生成されるもので、
工程1：樟芝の菌糸体が液体にて発酵することにより培養し、
工程2：工程1にて得られた菌糸体がエタノールの抽出を経てエタノール抽出物を取得し、
工程3：工程2にて得られたエタノール抽出物が濃縮した後に水中に溶解し、且つ同体積の酢酸エチル(ethyl acetate)を加えて抽出することにより、酢酸エチル抽出物を取得し、
工程4：工程3にて得られた酢酸エチル抽出物がシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、且つｎ−ヘキサン／酢酸エチルの勾配溶出液(hexane/ethyl acetate gradient elution)を、100％ｎ−ヘキサン／0％酢酸エチルないし0％ｎ−ヘキサン／100％酢酸エチルとし、最後に更に100％メタノール(methanol)に溶出させて、700ml毎に1本を収集し、その中でも、80％ｎ−ヘキサン／20％酢酸エチルないし70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルにより勾配溶出して、画分fを取得でき、70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルないし60％ｎ−ヘキサン／40％酢酸エチルにより勾配溶出して、画分gを取得でき、
工程5：工程4にて得られた勾配溶出液の画分gがシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、且つｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配溶出液を、80％ｎ−ヘキサン／20％酢酸エチルの勾配ないし50％ｎ−ヘキサン／50％酢酸エチルとし、最後に更に100％酢酸エチルに溶出させ、50ml毎に1本を収集し、つまり勾配溶出液の画分E，F，G，H，Iを取得でき、その中でも、画分Eが80％ｎ−ヘキサン／20％酢酸エチルないし75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、画分F，Gがそれぞれ75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルにより順番に勾配溶出して取得し、画分Hをそれぞれ75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルないし70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルにより順番に勾配溶出して取得し、画分Iを70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、
工程6：ひいては工程5にて得られた「勾配溶出液の画分E，F，G，H，I」が適用の精製分離方法により、更にこれらの活性組成物から4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）を精製・分離でき、該精製分離方法を含み、但しゲルカラムクロマトグラフィーに限定されず、
その中でも、該エタノール抽出物，酢酸エチル抽出物，勾配溶出液の画分f，勾配溶出液の画分g，勾配溶出液の画分E，F，G，H，Iと4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）が、即ち樟芝の抗ガン活性組成物である。
工程1：樟芝の菌糸体が液体にて発酵することにより培養し、
工程2：工程1にて得られた菌糸体がエタノールの抽出を経てエタノール抽出物を取得し、
工程3：工程2にて得られたエタノール抽出物が濃縮した後に水中に溶解し、且つ同体積の酢酸エチル(ethyl acetate)を加えて抽出することにより、酢酸エチル抽出物を取得し、
工程4：工程3にて得られた酢酸エチル抽出物がシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、且つｎ−ヘキサン／酢酸エチルの勾配溶出液(hexane/ethyl acetate gradient elution)を、100％ｎ−ヘキサン／0％酢酸エチルないし0％ｎ−ヘキサン／100％酢酸エチルとし、最後に更に100％メタノール(methanol)に溶出させて、700ml毎に1本を収集し、その中でも、80％ｎ−ヘキサン／20％酢酸エチルないし70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルにより勾配溶出して、画分fを取得でき、70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルないし60％ｎ−ヘキサン／40％酢酸エチルにより勾配溶出して、画分gを取得でき、
工程5：工程4にて得られた勾配溶出液の画分gがシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、且つｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配溶出液を、80％ｎ−ヘキサン／20％酢酸エチルの勾配ないし50％ｎ−ヘキサン／50％酢酸エチルとし、最後に更に100％酢酸エチルに溶出させ、50ml毎に1本を収集し、つまり勾配溶出液の画分E，F，G，H，Iを取得でき、その中でも、画分Eが80％ｎ−ヘキサン／20％酢酸エチルないし75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、画分F，Gがそれぞれ75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルにより順番に勾配溶出して取得し、画分Hをそれぞれ75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルないし70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルにより順番に勾配溶出して取得し、画分Iを70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、
工程6：ひいては工程5にて得られた「勾配溶出液の画分E，F，G，H，I」が適用の精製分離方法により、更にこれらの活性組成物から4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）を精製・分離でき、該精製分離方法を含み、但しゲルカラムクロマトグラフィーに限定されず、
その中でも、該エタノール抽出物，酢酸エチル抽出物，勾配溶出液の画分f，勾配溶出液の画分g，勾配溶出液の画分E，F，G，H，Iと4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）が、即ち樟芝の抗ガン活性組成物である。
これらの樟芝の抗ガン活性組成物は、ガンを直接に施行・治療できる以外に、更にこれらの抗ガン・ガン治療の医薬組成物または適切な用途の物用原料をも製備できる。
本発明の述べた「樟芝の抗ガン活性組成物」は、本発明の製備方法により製成されたエタノール粗抽出物，酢酸エチル抽出物，勾配溶出液の画分f，勾配溶出液の画分g，勾配溶出液の画分E，F，G，H，Iと4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）等の抗ガン活性組成物を含む。
より好ましい実施例に用いられる樟芝は、財団法人食品工業発展研究所の生物資源保存及び研究センターに預けられる樟芝BCRC35716から取得され、但し本発明の述べた樟芝活性組成物がこの菌種による取得に限らない。
より好ましい実施例の中において、該液体発酵培養工程は、2％ブドウ糖と2％麦芽抽出物を含有する発酵培養液（pHが4.5〜5.5）に、20〜25℃，タンク圧0.5〜1vvm，20〜100rpm攪拌速度の条件下では、4週間培養する。
より好ましい実施例の中において、該エタノール抽出工程は、樟芝の菌糸体を乾燥した後に、90〜99％エタノールにより該菌糸体と混合し、該樟芝の菌糸体とエタノールとの割合が1：10〜1：50（g／ml）で、続いてホモジナイザーにより、12〜48時間に混合する。
より好ましい実施例の中において、該工程4に用いられるゲルカラムは、シリカゲルカラム(silica gel chromatography)，230〜400篩目，750〜75mmである。
より好ましい実施例の中において、該工程5に用いられるゲルカラムは、シリカゲルカラム(silica gel chromatography)，230〜400篩目，420〜25mmである。
より好ましい実施例の中において、該工程6に用いられるゲルカラムは、シリカゲルカラムLuna 5u Silica（2）100A column（4.6×250nm）で、且つ用いられる勾配溶出液がｎ−ヘキサン／酢酸エチル混合液で、その割合が80：20である。
その他に、本発明は、抗ガン組成物を更に提供するもので、前述の有効量の樟芝の抗ガン活性組成物および適当な希釈剤，賦形剤またはキャリアを含み、且つ該抗ガン組成物が癌細胞の増殖を抑制できる。
ひいては、本発明は、抗ガンに用いられる薬学組成物を提供するもので、有効量の4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）およびキャリアを含み、該4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）が下記の化学構造を有する。
その他に、本発明は、前述の4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）の新規な用途を提供するもので、抗ガン薬物の製備に用いられ、且つ該抗ガン薬物が癌細胞の増殖を抑制できる。
本発明は、下記の実施例により明らかに表示し、但し本発明が下記の実施例により限定されない。本発明の使用する材料は、特別な明示がなければ、何れも市販で且つ取得しやすい材料である。
実施例1. 樟芝発酵液の製備
1.1 樟芝の出所
本実施例に用いられる樟芝は、財団法人食品工業発展研究所（台湾・新竹）の生物資源保存及び研究センターに預けられる樟芝BCRC35716から取得されるが、但し本発明の述べた樟芝活性組成物がこの菌種から取得するとは限らない。
1.1 樟芝の出所
本実施例に用いられる樟芝は、財団法人食品工業発展研究所（台湾・新竹）の生物資源保存及び研究センターに預けられる樟芝BCRC35716から取得されるが、但し本発明の述べた樟芝活性組成物がこの菌種から取得するとは限らない。
1.2 樟芝の液体発酵培養：
5トンの体積に2％ブドウ糖と2％麦芽抽出物を含有する発酵培養液（pHが5.0）内には、樟芝の菌糸体を接種し、22℃に置き、毎分50回転（50rpm）の回転速度にて、且つ毎分0.5倍の単位液体体積（0.5vvm）の通気量により培養し、4週間に培養する。
5トンの体積に2％ブドウ糖と2％麦芽抽出物を含有する発酵培養液（pHが5.0）内には、樟芝の菌糸体を接種し、22℃に置き、毎分50回転（50rpm）の回転速度にて、且つ毎分0.5倍の単位液体体積（0.5vvm）の通気量により培養し、4週間に培養する。
1.3 樟芝の液体発酵液の処理：
発酵培養が終了した後に、樟芝の発酵液を遠心処理することにより、樟芝の菌糸体と発酵液を分離し、樟芝菌糸体の沈殿物が無菌水にて2回洗浄することにより、残留の発酵液を除去し、その後に該樟芝菌糸体の沈殿物が乾く凍り且つ4℃に貯蔵し、1g菌糸体：20mlエタノールの割合にて、乾く凍った樟芝の菌糸体が95％エタノールと混合し、更に高速ホモジナイザー(polytron)により24時間に振蕩し、樟芝の菌糸体中にエタノールに溶解する成分を、抽出する。得られた抽出物がロータリーエバポレーター- (rotary evaporator)により濃縮され、且つ−80℃に貯蔵して予備する。
発酵培養が終了した後に、樟芝の発酵液を遠心処理することにより、樟芝の菌糸体と発酵液を分離し、樟芝菌糸体の沈殿物が無菌水にて2回洗浄することにより、残留の発酵液を除去し、その後に該樟芝菌糸体の沈殿物が乾く凍り且つ4℃に貯蔵し、1g菌糸体：20mlエタノールの割合にて、乾く凍った樟芝の菌糸体が95％エタノールと混合し、更に高速ホモジナイザー(polytron)により24時間に振蕩し、樟芝の菌糸体中にエタノールに溶解する成分を、抽出する。得られた抽出物がロータリーエバポレーター- (rotary evaporator)により濃縮され、且つ−80℃に貯蔵して予備する。
実施例2 樟芝活性組成物の製備
樟芝エタノール粗抽出液（857g）を2Lの水中に溶け戻し、且つ同体積の酢酸エチル(ethyl acetate)により抽出し、更に該水層と水飽和n−ブタノール(water-saturated n-butanol)を3回抽出する。該粗抽出液，酢酸エチル抽出液，n−ブタノール抽出液と水層が、そのHepG2肝癌細胞株増殖の抑制の効果をそれぞれテストするために用いられる。
樟芝エタノール粗抽出液（857g）を2Lの水中に溶け戻し、且つ同体積の酢酸エチル(ethyl acetate)により抽出し、更に該水層と水飽和n−ブタノール(water-saturated n-butanol)を3回抽出する。該粗抽出液，酢酸エチル抽出液，n−ブタノール抽出液と水層が、そのHepG2肝癌細胞株増殖の抑制の効果をそれぞれテストするために用いられる。
前述の抗腫瘍活性を最も有する抽出物を、絶えずにシリカゲルカラムクロマトグラフィー(silica gel chromatography，230〜400篩目，750〜75mm)により精製し、且つｎ−ヘキサン／酢酸エチルの勾配の勾配溶出液(hexane/ethyl acetate gradient elution、ｎ−ヘキサン／酢酸エチルの割合が100：0ないし0：100)にて勾配溶出して、最後に100％メタノール(Methanol)にて最後の残留物を溶出させる。毎段の勾配溶出液（700mL）を収集し、且つ薄層クロマトグラフィー(thin-layer chromatography, TLC Silica gel 60 F254, Merck Co.)を使用し、酢酸エチル／ｎ−ヘキサン(50/50; v/v)を展開液とし、その組成物をテストする。黄色蛍光を表示するUV波長が254mmのランプチューブが、これらの抽出画分中に類似する骨格を有する成分を、分類するために用いられ、薄層クロマトグラフィーの結果より示すように、全ての勾配溶出物が13個の画分に分けられてもよく、これらの画分を収集し、且つその抗腫瘍活性をテストし、表1を参照して示すように、その中でも、画分fが80／20ないし70／30のｎ−ヘキサン／酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、収集の瓶番号が36〜42で、収集の体積が4.9リットルで、画分gが70／30ないし60／40のｎ−ヘキサン／酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、収集の瓶番号が43〜55で、収集の体積が9.1リットルである。
前述の最高の抗腫瘍活性を有する抽出物は、続いて他のシリカゲルカラム(silica gel column，230〜400篩目，750〜75mm)により分離され、その洗濯液がｎ−ヘキサン及び酢酸エチルの混合液（ｎ−ヘキサン／酢酸エチルの割合が80：20ないし50：50）で、最後に純酢酸エチルにより最後の残留物を溶出させて、合計でそれぞれ12個の画分を収集でき、毎段の勾配溶出液（50ml）を収集し、その中でも、画分Eが80％ｎ−ヘキサン／20％酢酸エチルないし75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、収集の瓶番号が44〜56で、収集の体積が650mlで、画分F，Gが75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、収集の瓶番号がそれぞれ57〜61、62〜69で、収集の体積がそれぞれ250、400mlで、画分Hを75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルないし70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、収集の瓶番号が70〜73で、収集の体積が200mlで、画分Iを70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、収集の瓶番号が74〜84で、収集の体積が550mlで、これらの画分の抗腫瘍活性をテストし、ひいては画分中に最高の活性を有するのが精製を行う。
チューナブル吸収検出器(tunable absorbance detector,型番：1100シリーズ,Agilent,米国)を配置するAgilent高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用してHPLCを行い、勾配溶出の条件は、流速が1mL/min、カラム温度が25℃、UV波長が254nmである。最高のピークを有する画分が、再びシリカゲルカラム(4.6×250nm，Luna 5u silica（2）100A column)にて、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル(80:20, v/v)溶剤システムに対応して分離することにより、主要な抗腫瘍活性成分を取得する。更に核磁気共鳴分析(NMR,Bruker AMX-400)により、該精製組成成分の構造を鑑定する。
実施例3 樟芝活性組成物が肝癌細胞の増殖を抑制する抑制能力の分析
3.1材料
HepG2細胞がアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, メリーランド州，米国)から購入され、HepG2細胞がWME (Williams medium E) 培地により培養され、WME培地には、10mMの4−（2−ヒドロキシエチル）−1−ピペラジンエタンスルフォン酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid， Hepes]，5μg/mLのインスリン(insulin)，2μg/mLのグルカゴン(glucagon)，0.05μg/mLのヒドロコルチゾン (hydrocortisone)と5%のウシ胎仔血清 (fetal bovine serum) (Gibco Life Technologies, Grand Island,ニューヨーク州，米国)を含有する。大腸癌細胞CT26，前立腺癌細胞LNCaPと乳癌細胞MDA-MB-231が財団法人食品工業発展研究所の生物資源保存及び研究センターのBCRC 60443，BCRC 60088と BCRC60425から購入される。
3.1材料
HepG2細胞がアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, メリーランド州，米国)から購入され、HepG2細胞がWME (Williams medium E) 培地により培養され、WME培地には、10mMの4−（2−ヒドロキシエチル）−1−ピペラジンエタンスルフォン酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid， Hepes]，5μg/mLのインスリン(insulin)，2μg/mLのグルカゴン(glucagon)，0.05μg/mLのヒドロコルチゾン (hydrocortisone)と5%のウシ胎仔血清 (fetal bovine serum) (Gibco Life Technologies, Grand Island,ニューヨーク州，米国)を含有する。大腸癌細胞CT26，前立腺癌細胞LNCaPと乳癌細胞MDA-MB-231が財団法人食品工業発展研究所の生物資源保存及び研究センターのBCRC 60443，BCRC 60088と BCRC60425から購入される。
3.2 方法
96穴平底細胞培養プレートの内に、毎穴2.5×104個のHepG2肝癌細胞を植え、WME培地にて、37℃，5%CO2環境下では4時間に培養した後に、培地が異なる濃度の樟芝菌糸体抽出物のサンプルを含有するWME培地に置き換えられ、先ずこれらの樟芝抽出物のサンプルを1%DMSOに溶解し、更にWME培地の内に加えて異なる濃度を形成し、そしてDMSOの最終濃度が1％よりも小さくなるように制御する。対照群の細胞が抽出用溶剤のみを含有するWME培地により培養され、そしてダミー対照群が細胞を含まず、100μLのWME培地のみを含有する。37℃，5%CO2環境下では、各セットの細胞が72と96時間の培養を実施した後に、MTS単一溶液細胞増殖分析(MTS-based cell titer 96 non-radioactivity cell proliferation assay, Promega, Madison,ウィスコンシン州，米国)により、HepG2肝癌細胞が増殖するかどうかを判断し、これにより、各抽出画分の抗肝腫瘍活性を評価する。
96穴平底細胞培養プレートの内に、毎穴2.5×104個のHepG2肝癌細胞を植え、WME培地にて、37℃，5%CO2環境下では4時間に培養した後に、培地が異なる濃度の樟芝菌糸体抽出物のサンプルを含有するWME培地に置き換えられ、先ずこれらの樟芝抽出物のサンプルを1%DMSOに溶解し、更にWME培地の内に加えて異なる濃度を形成し、そしてDMSOの最終濃度が1％よりも小さくなるように制御する。対照群の細胞が抽出用溶剤のみを含有するWME培地により培養され、そしてダミー対照群が細胞を含まず、100μLのWME培地のみを含有する。37℃，5%CO2環境下では、各セットの細胞が72と96時間の培養を実施した後に、MTS単一溶液細胞増殖分析(MTS-based cell titer 96 non-radioactivity cell proliferation assay, Promega, Madison,ウィスコンシン州，米国)により、HepG2肝癌細胞が増殖するかどうかを判断し、これにより、各抽出画分の抗肝腫瘍活性を評価する。
MTSがテトラゾリウム試薬(tetrazolium reagent)を利用して比色を行う分析方法である。細胞増殖の判断は、490nm波長下で、各処理群の細胞MTS吸収読取値が対照群の吸収読取値と比較して判断を行う。
半数細胞毒性濃度(CC50)は、24時間内に細胞生存率が対照群の細胞生存率の50％まで下がる時の細胞毒性濃度である。そして半数効果濃度 (EC50)は、該癌細胞を一区切りの特定な時間に処理した後のサンプルの中間効果薬分量（50％細胞生存率を招くサンプル濃度）と定義する。全ての樟芝抽出物のサンプルが少なくとも3回を繰り返して行うことにより、処理された肝癌細胞の増殖状況と細胞毒性を確認する。癌細胞に対する選択性効果が選択性指標(selective index, SI)値により表示される。テスト・サンプルのSI値は、つまり該サンプルの半数細胞毒性濃度(CC50)値が半数効果濃度 (EC50)値に対する比較値である。
3.3 統計分析方法
分散分析方法(ANOVA)及びDuncanの多重範囲検定法(Duncan’s multiple-range test, SAS Institute Inc., Cary,ノースカロライナ州，米国)にて、数字データを分析することにより、各平均値の間に著しい差異（P＜0.05）を有するかどうかを、決定する。
分散分析方法(ANOVA)及びDuncanの多重範囲検定法(Duncan’s multiple-range test, SAS Institute Inc., Cary,ノースカロライナ州，米国)にて、数字データを分析することにより、各平均値の間に著しい差異（P＜0.05）を有するかどうかを、決定する。
3.4 結果
（1）樟芝菌糸体の粗抽出物の抗腫瘍活性の分析
樟芝菌糸体のエタノール粗抽出液中から抽出された酢酸エチル抽出液，ｎ−ヘキサン抽出液と水層抽出液の重量がそれぞれ574g，196g，87gである。これらの抽出物の抗腫瘍活性が例えば図1に示し、72時間に処理した後に、樟芝菌糸体のエタノール粗抽出液，酢酸エチル抽出液，ｎ−ヘキサン抽出液と水層抽出液がHepG2肝癌細胞増殖の抑制に対する半数効果濃度 (EC50)値は、それぞれ5.59±0.16μg/mL，2.83±0.06μg/mL，18.26±2.72μg/mLと>100μg/mLで、96時間に処理した後に、これらの抽出物がHepG2肝癌細胞増殖の抑制に対する半数効果濃度 (EC50)値は、それぞれ2.76±0.01μg/mL，1.94±0.13μg/mL，5.3±0.00μg/mLと9.35±0.32μg/mLである。結果より示すように、樟芝菌糸体の酢酸エチル抽出物がHepG2肝癌細胞の増殖に対し、最高の抑制活性を有し、即ち最高の抗腫瘍活性を有し、従って該抽出物を取り、ひいてはシリカゲルカラムにより活性成分の分離を行う。
（1）樟芝菌糸体の粗抽出物の抗腫瘍活性の分析
樟芝菌糸体のエタノール粗抽出液中から抽出された酢酸エチル抽出液，ｎ−ヘキサン抽出液と水層抽出液の重量がそれぞれ574g，196g，87gである。これらの抽出物の抗腫瘍活性が例えば図1に示し、72時間に処理した後に、樟芝菌糸体のエタノール粗抽出液，酢酸エチル抽出液，ｎ−ヘキサン抽出液と水層抽出液がHepG2肝癌細胞増殖の抑制に対する半数効果濃度 (EC50)値は、それぞれ5.59±0.16μg/mL，2.83±0.06μg/mL，18.26±2.72μg/mLと>100μg/mLで、96時間に処理した後に、これらの抽出物がHepG2肝癌細胞増殖の抑制に対する半数効果濃度 (EC50)値は、それぞれ2.76±0.01μg/mL，1.94±0.13μg/mL，5.3±0.00μg/mLと9.35±0.32μg/mLである。結果より示すように、樟芝菌糸体の酢酸エチル抽出物がHepG2肝癌細胞の増殖に対し、最高の抑制活性を有し、即ち最高の抗腫瘍活性を有し、従って該抽出物を取り、ひいてはシリカゲルカラムにより活性成分の分離を行う。
（2）1回目のシリカゲルカラムクロマトグラフィー分離を実施した樟芝菌糸体抽出物の抗腫瘍活性の分析
ひいては前述の樟芝菌糸体の酢酸エチル抽出物が、シリカゲルカラムにより13個の勾配溶出液の画分に分離され、この13個の勾配溶出液の画分がHepG2肝癌細胞増殖の抑制に対する半数効果濃度 (EC50)値は、例えば表3に示す。結果より示すように、勾配溶出液の画分fとgが最高の抗腫瘍活性を有するが、然しながら、2.29gの勾配溶出液の画分fのみを回収し、そして13.25gの勾配溶出液の画分gを回収し、従って数量上では、勾配溶出液の画分gが最も多い活性組成物を含有し、故に勾配溶出液の画分gにより研究を更に行う。
ひいては前述の樟芝菌糸体の酢酸エチル抽出物が、シリカゲルカラムにより13個の勾配溶出液の画分に分離され、この13個の勾配溶出液の画分がHepG2肝癌細胞増殖の抑制に対する半数効果濃度 (EC50)値は、例えば表3に示す。結果より示すように、勾配溶出液の画分fとgが最高の抗腫瘍活性を有するが、然しながら、2.29gの勾配溶出液の画分fのみを回収し、そして13.25gの勾配溶出液の画分gを回収し、従って数量上では、勾配溶出液の画分gが最も多い活性組成物を含有し、故に勾配溶出液の画分gにより研究を更に行う。
HepG2肝癌細胞を72時間と96時間に処理した後に、勾配溶出液の画分gが該癌細胞増殖の抑制に対する半数効果濃度 (EC50)値は、それぞれ1.33μg/mLと0.82μg/mLである。その他にHepG2肝癌細胞を96時間に処理した後に、勾配溶出液の画分gの選択性指標値(SI)が86である。薄層クロマトグラフィー(TLC)の結果より示すように、勾配溶出液の画分gが依然として非活性成分の汚染を含有し、従って本発明の発明者は、シリカゲルカラムにより、勾配溶出液の画分gに対し、活性成分の分離を更に行う。
a~h異なる字母標示の平均値を有し、これらの平均値の間に著しい差異（P＜0.05）を有することを、表示する。
（3）２回目のシリカゲルカラムクロマトグラフィー分離を実施した樟芝菌糸体抽出物の抗腫瘍活性の分析
前述の勾配溶出液の画分gが再びシリカゲルカラムにより12個の勾配溶出液の画分に分離され、この12個の勾配溶出液の画分がHepG2肝癌細胞増殖の抑制に対する半数効果濃度 (EC50)値は、例えば表4に示す。結果から示すように、勾配溶出液の画分F，G，Hが最高の抗腫瘍活性を有し、該肝癌細胞を72時間に処理した後に、その半数効果濃度 (EC50)が約0.5μg/mLである。そして該肝癌細胞を96時間に処理した後に、勾配溶出液の画分E，F，G，H，Iの半数効果濃度 (EC50)が約0.4μg/mLである。
前述の勾配溶出液の画分gが再びシリカゲルカラムにより12個の勾配溶出液の画分に分離され、この12個の勾配溶出液の画分がHepG2肝癌細胞増殖の抑制に対する半数効果濃度 (EC50)値は、例えば表4に示す。結果から示すように、勾配溶出液の画分F，G，Hが最高の抗腫瘍活性を有し、該肝癌細胞を72時間に処理した後に、その半数効果濃度 (EC50)が約0.5μg/mLである。そして該肝癌細胞を96時間に処理した後に、勾配溶出液の画分E，F，G，H，Iの半数効果濃度 (EC50)が約0.4μg/mLである。
２回目のシリカゲルカラムクロマトグラフィー分離を実施した樟芝菌糸体抽出物は、全ての勾配溶出液の画分がHepG2肝癌細胞増殖の抑制に対する半数細胞毒性濃度(CC50)値は、何れも50μg/mLよりも大きい。これらの勾配溶出液の画分の選択性指標値(SI)の範囲が111ないし119の間にあり、これらの勾配溶出液の画分が肝癌細胞に対し良好な選択性を有することを、示す。
a~h異なる字母標示の平均値を有し、これらの平均値の間に著しい差異（P＜0.05）を有することを、表示する。
（4）HPLCにより分離・精製された樟芝菌糸体組成成分の抗腫瘍活性の分析
ひいては前述の勾配溶出液の画分E，F，G，H，IがHPLCシステムにより活性組成物を分離し、同一滞留時間(retention time)には、これらの画分が何れも一つの主要なピーク（例えば図2Aないし図2Eに示すように）を含有し、該ピークに位置する勾配溶出物を収集し、且つ生物の分析と鑑定を行う。このピークの成分（化合物）の抗腫瘍活性が、例えば図3に示すように、HepG2肝癌細胞を72時間と96時間に処理した後に、該成分（化合物）が該癌細胞増殖の抑制に対する半数効果濃度 (EC50)値は、それぞれ0.1μg/mLと0.08μg/mLである。全体の樟芝菌糸体の活性成分精製過程中に、この成分が最高の抗腫瘍活性を有し、該成分（化合物）の抗腫瘍活性が粗抽出液よりも高くて約50倍に達する。
ひいては前述の勾配溶出液の画分E，F，G，H，IがHPLCシステムにより活性組成物を分離し、同一滞留時間(retention time)には、これらの画分が何れも一つの主要なピーク（例えば図2Aないし図2Eに示すように）を含有し、該ピークに位置する勾配溶出物を収集し、且つ生物の分析と鑑定を行う。このピークの成分（化合物）の抗腫瘍活性が、例えば図3に示すように、HepG2肝癌細胞を72時間と96時間に処理した後に、該成分（化合物）が該癌細胞増殖の抑制に対する半数効果濃度 (EC50)値は、それぞれ0.1μg/mLと0.08μg/mLである。全体の樟芝菌糸体の活性成分精製過程中に、この成分が最高の抗腫瘍活性を有し、該成分（化合物）の抗腫瘍活性が粗抽出液よりも高くて約50倍に達する。
その他に、本発明も、該精製後の化合物（4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B））が他の癌細胞の成長抑制に対する能力を、分析する。図4を参照して示すように、該化合物が大腸癌細胞CT26，前立腺癌細胞LNCaPに対する半数阻害濃度(IC50)は、それぞれ48.12±5.61，16.841±3.41と0.091μg/mLで、これにより、これらの癌細胞の細胞生存率が何れも50％以下に達し、従って該化合物も、大腸癌細胞，前立腺癌細胞と乳癌細胞の成長を抑制するために用いられることが出来、ひいてはこれらのガンを治療するために用いられることが出来る。
（5）樟芝菌糸体の抗腫瘍活性組成成分の化学構造
前述の樟芝の抗腫瘍活性成分の化学構造は、スペクトロスコピー法(spectroscopic methods)により測定され、該方法が1次元核磁気共鳴，2次元核磁気共鳴とスペクトル分析を含み、該活性成分の化学構造が、例えば図5に示すように、その化学名が4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）と称する。
前述の樟芝の抗腫瘍活性成分の化学構造は、スペクトロスコピー法(spectroscopic methods)により測定され、該方法が1次元核磁気共鳴，2次元核磁気共鳴とスペクトル分析を含み、該活性成分の化学構造が、例えば図5に示すように、その化学名が4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）と称する。
4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）のスペクトル分析結果が下記の通りである。
EIMS, m/z 485 [M + Na]+; 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 5.73 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-4), 5.28 (1H, t, J = 6.9 Hz, H-12), 5.14 (1H, t, J = 6.7 Hz, H-8), 4.69 (1H, m, H-15), 3.98 (3H, s, H-24), 3.61 (3H, s, H-23), 2.74 (1H, m, H-17), 2.50 (1H, m, H-6), 2.38 (1H, dd, J = 7.0, 13.8 Hz, H-14), 2.28 (2H, m, H-7), 2.27 (1H, m, H-14), 2.22 (2H, m, H-16), 2.17 (2H, m, H-11), 2.08 (3H, s, -OAc), 2.06 (2H, m, H-10), 1.93 (1H, m, H-5), 1.66 (3H, s, H-21), 1.57 (3H, s, H-20), 1.22 (3H, d, J = 7.3 Hz, H-19), 1.17 (3H, d, J = 6.9 Hz, H-22); 13C NMR (500 MHz, CD3OD) δ 199.0 (s, C-1), 182.7 (s, C-18), 171.4 (s, CH3CO-), 160.5 (s, C-3), 138.7 (s, C9), 138.3 (s, C-2), 131.6 (s, C-13), 129.2 (d, C-12), 122.4 (d, C-8), 78.8 (d, C-15), 70.4 (d, C-4), 61.0 (q, C-23), 60.3 (q, C-24), 45.8 (t, C-14), 44.2 (d, C-5), 42.5 (d, C-6), 40.5 (t, C-10), 35.5 (t, C-16), 35.0 (d, C-17), 27.9 (t, C-7), 27.0 (t, C-11), 20.8 (CH3CO-), 16.4 (q, C-21), 16.2 (q, C-20), 15.9 (q, C-19), 13.0 (q, C-22)。
該活性成分の化学構造は、2009年にYangたちの分離した五つの樟芝の抗炎症成分中の4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）と同じ化学構造を有するが、然しながらYangたちの研究には、該成分が肝癌細胞，大腸癌細胞，前立腺癌細胞と乳癌細胞の増殖を抑制して抗肝癌，抗大腸癌と抗前立腺癌と抗乳癌を更に達成する効果(Yang, Wang, Wang, Lin, Kuo, and Lee, 2009)を有することを、まだ掲示しないが(Yang, Wang, Wang, Lin, Kuo, and Lee, 2009)、従って本発明は、各種な樟芝の抗ガン活性組成物（異なる抽出物）を提供する以外に、更に該活性組成物中の4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）の抗腫瘍，抗ガンなどの新規な用途を提供する。
本発明の提供する樟芝の抗ガン活性組成物、製備方法およびその用途は、他の従来の技術と互いに比較すると、下記の利点を更に有する。
試験を経て証明するように、本発明の提供する樟芝の抗ガン活性組成物は、単一の組成成分となるように精製するだけではなく、且つ極めて低い薬分量下では（0.1μg/mLにて72時間に作用し、或いは0.08μg/mLにて96時間に作用する）、癌細胞を抑制する効果を達成でき、該単一成分が樟芝菌糸体の発酵培養液により精製できるだけではなく、成分が確実であるので、更に化学合成方法をも使用して製成でき、抗ガン効果を達成し、また樟芝の値段が高いままで下がらない問題を解決でき、互いに比較する下では、周知の樟芝活性組成物が何れも粗抽出物で、組成成分を確定できず、樟芝の発酵液のみにより抽出でき、プロセスの上では簡略化できず、生産コストを大幅に低減できない。その他に、本発明も、樟芝の抗ガン活性組成物中における4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）の新規な用途を提供し、癌細胞の成長を抑制するために用いられることが出来、ひいてはガンを治療する。
以上の詳細な説明は、本発明に対して実行可能な実施例の具体的な説明で、但し該実施例が本発明の特許請求の範囲を限定するために用いられるものではなく、例えば本発明の技術精神をまだ逸脱しない下で完成された等価な実施または変更が、何れも本発明の特許請求の範囲中に含まれるべきである。
上記を総合し、本発明は、活性組成物の抽出上では、確かに革新に属するだけではなく、且つ慣用の品物よりも前述の多項目の効果を更に増進でき、既に新規性と進歩性の法定の発明の特許要件を十分に満たすべきで、従って特許法により本発明の出願を提出し、貴局には本発明の特許請求の範囲の出願が許可されるよう切望する次第で、発明を励ます。
Claims (4)
- 樟芝の抗ガン活性組成物は、樟芝の菌糸体が下記の工程を実施することにより生成されるもので、
工程1：樟芝の菌糸体を取得し、
工程2：樟芝の菌糸体が有機溶剤により抽出され、且つ乾燥した後に粗抽出物を取得し、
工程3：工程2にて得られた粗抽出物を水中に溶解し、懸濁液を呈し、且つ酢酸エチル(ethyl acetate)を加えて抽出することにより、酢酸エチル抽出物を取得し、
工程4：工程3にて得られた酢酸エチル抽出物をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、且つｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配溶出液(hexane/ethyl acetate gradient elution)として、80％ｎ−ヘキサン／20％酢酸エチルないし70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルにより勾配溶出して、画分fを取得でき、70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルないし60％ｎ−ヘキサン／40％酢酸エチルにより勾配溶出して、画分gを取得でき、
工程5：工程4にて得られた勾配溶出液の画分gをシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、且つｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配溶出液により、当該勾配溶出液の画分E，F，G，H，Iを取得し、その中でも、画分Eを80％ｎ−ヘキサン／20％酢酸エチルないし75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、画分Fの次に画分Gをそれぞれ75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、画分Hを75％ｎ−ヘキサン／25％酢酸エチルないし70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、画分Iを70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチルにより勾配溶出して取得し、
工程6：工程5にて得られた勾配溶出液の画分E，F，G，H，Iから高効率液相クロマトグラフィー・システム（HPLC）により4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）を精製し、その中でも、工程3にて得られた酢酸エチル抽出物，工程4にて得られた勾配溶出液の画分fと当該勾配溶出液の画分g，工程5にて得られた勾配溶出液の画分E，F，G，H，Iと4−アセチルアントロキノノールB（4-acetylantroquinonol B）の全てを含む、樟芝の抗ガン活性組成物であり、
肝癌細胞，大腸癌細胞，前立腺癌細胞と乳癌細胞の増殖を抑制できることを特徴とする、樟芝の抗ガン活性組成物。 - 工程2の中に、樟芝の菌糸体と有機溶剤との割合が0.02〜0.1（g／ml）であることを特徴とする、請求項1に記載の樟芝の抗ガン活性組成物。
- 工程3の中に、樟芝菌糸体の粗抽出物が水に溶解した後に、懸濁液を成し、懸濁液に酢酸エチルを加えて抽出し、且つ懸濁液と酢酸エチルの割合が0.4〜3.0であることを特徴とする、請求項1に記載の樟芝の抗ガン活性組成物。
- 工程6の高効率液相クロマトグラフィー・システム（HPLC）に使用されるカラムは、順相シリカゲルカラム(normal phase silica gel column)で、且つその使用する勾配溶出液がｎ−ヘキサン／酢酸エチルの混合液で、その割合が50％ｎ−ヘキサン／50％酢酸エチル，60％ｎ−ヘキサン／40％酢酸エチル，70％ｎ−ヘキサン／30％酢酸エチル，80％ｎ−ヘキサン／20％酢酸エチル又は90％ｎ−ヘキサン／10％酢酸エチルであることを特徴とする、請求項1に記載の樟芝の抗ガン活性組成物。
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