JPWO2005035774A1 - シロ−イノシトールの製造方法 - Google Patents

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Abstract

NAD+非存在下でミオ−イノシトールをシロ−イノソースに変換する新規なNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ、NADHまたはNADPH存在下でシロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する新規酵素シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ、及びミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有するアセトバクター属またはバークホルデリア属に属する新規な微生物を提供する。これらの酵素又は微生物を用いてシロ−イノシトールを製造する。また、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液にホウ酸及び金属塩を加えてシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させ、前記複合体を混合液から分離し、分離した複合体を酸に溶解して酸性溶液又は酸性懸濁液を調製し、該酸性溶液又は酸性懸濁液からシロ−イノシトールを精製する。

Description

本発明は、微生物変換によってミオ−イノシトールからシロ−イノシトールを製造する方法に関する。
本発明はまた、新規なNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ及びその製造方法に関する。本発明はまた、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標としたシロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法に関する。本発明はさらに、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ又は該酵素の高活性株を用いたシロ−イノソース及びシロ−イノシトールの製造方法に関する。
本発明はまた、新規酵素シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ及び、当該酵素を利用したシロ−イノシトールの製造方法に関する。更に詳しくは、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する新規酵素シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ及び、当該酵素を利用したシロ−イノシトールの製造方法に関する。
本発明はさらに、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液から、シロ−イノシトールを効率良く製造する方法に関する。
シロ−イノシトールはアルツハイマー病の治療薬や、生理活性物質の合成原料、液晶化合物の合成原料として利用することができる。
ミオ−イノシトールは次の立体構造式（Ａ）
Figure 2005035774
 で表される天然に産する既知の物質である。
また、シロ−イノソースは次の立体構造式（Ｂ）
Figure 2005035774
 で表される既知の物質である。
さらに、シロ−イノシトールは次の立体構造式（Ｃ）
Figure 2005035774
 で表される既知の化合物である。
シロ−イノシトールはミオ−イノシトールの立体異性体の一つで動物・植物中に広く見出される物質である。また、シロ−イノソースはミオ−イノシトールの２位のアキシャル水酸基が酸化された構造を有する化合物であり、これも天然物として普遍的に存在する。
シロ−イノシトールはアルツハイマー病の治療薬（非特許文献１参照）や、生理活性物質の合成原料（特許文献１参照）、液晶化合物の合成原料（特許文献２参照）としての用途が期待されている物質である。
化学合成的手法でシロ−イノソースまたはシロ−イノシトールの製法としては、（i）ヘキサヒドロキシベンゼンをラネーニッケルで還元し、シロ−イノシトールを得る方法（非特許文献２参照）、（ii）グルコフラノース誘導体から5段階の反応でシロ−イノソースを得て還元し、シロ−イノシトールを得る方法（非特許文献３参照）、（iii）シス−トリオキサ−トリス−ホモベンゼンを原料に４段階以上の反応でシロ−イノシトールを得る方法（非特許文献４参照）、（iv）ミオ−イノシトールを白金触媒で酸化しシロ−イノソースを得、続いてエステル化したのち還元と加水分解を行って、シロ−イノシトールを得る方法（特許文献２参照）等がある。
また、微生物を用いてミオ−イノシトールをシロ−イノシトールへ変換する方法としては、アグロバクテリウム属細菌を用いる方法が知られている（特許文献３参照）。しかし、この方法では、シロ−イノシトールの収率は低く、他の変換物も生じるために、工業的規模では利用できない。
一方、アセトバクター属細菌（非特許文献５参照）は、ミオ−イノシトールに作用して、酸素を吸収し、シロ−イノソースへ酸化することが知られているが、詳細なメカニズムは検討されていない。
ミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ酸化する酵素（ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ）は動物・藻類・酵母・細菌等多くの生物種からの報告があり、自然界に広く存在する酵素である。前記酵素を有する代表的な微生物種としては、エアロバクター エアロゲネス（非特許文献６参照）、バチルス属細菌（非特許文献７又は８参照、特許文献４〜６参照）、シュードモナス属細菌等（非特許文献９又は１０参照）がある。
しかしながら、これらの報告におけるミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼは、NAD+依存型の酵素であり、酸化のためにNAD+またはNADP+を要求し、工業的規模で作用させる場合、これら補酵素をリサイクルするため、発酵生産を用いなければならず、そのため基質の一部が分解される、または、基質濃度を低くしなければならないなど、工業的規模における問題点があった。
一方、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼについて、ウシの脳中と、ゴキブリ脂肪組織中に存在するという報告例（非特許文献１１参照）があり、この酵素はシロ−イノソースを基質として、NADPHで還元させると、シロ−イノシトールと、ミオ−イノシトールの両方が生じるとされている。しかしながら、基質特異性が低い点、また、高度な精製酵素を使用しておらず、諸性質も不明であることから、基質特異性の低いアルコールデヒドロゲナーゼである可能性があり、酵素ハンドブック（朝倉書店発行）には記載されなかった経緯を持つ。このように動物において報告例はあるものの、その真偽はさだかではない。
また、微生物酸化により製造したシロ−イノソースを化学還元することにより、シロ−イノシトールを製造する方法も知られている（特許文献７参照）。しかしながら、シロ−イノソースの化学還元によって得られる物質はシロ−イノシトールとミオ−イノシトールの混合物であるため、混合物を脱塩精製し、さらに濃縮液から溶解度の低いシロ−イノシトールを晶析によって得るという操作が必要であった。そのため、このような方法は多くの操作を要し、シロ−イノシトールの収率という点で改善の余地があった。このような状況のもと、シロ−イノシトールを簡便に効率よく製造するために、シロ−イノソースの還元等によって得られるシロ−イノシトールとミオ−イノシトールの混合物から精製シロ−イノシトールを製造する方法の開発が望まれていた。
溶液中で、NaBH4を用いてシロ−イノソースを還元した場合、反応後の溶液にはミオ−イノシトール、シロ−イノシトールの他にシロ−イノシトール・ホウ酸複合体が少量含まれる。このようなシロ−イノシトール・ホウ酸複合体については、まず、複合体を沈殿物としてろ過し、稀硫酸に溶解し、メタノールを加えて、ホウ酸と共沸させて、ホウ酸を除去し、残った溶液をイオン交換樹脂で脱塩して、シロ−イノシトールを得る方法（非特許文献１２参照）が知られていた。
このシロ−イノシトール・ホウ酸複合体は以下の立体構造式（D）で表される物質である。
Figure 2005035774
しかしながら、上記のようなNaBH4を用いてシロ−イノソースを還元する方法においては、生じるシロ−イノシトール・ホウ酸複合体の割合は低く、溶液中にもシロ−イノシトールが生成するため、複合体と溶液成分とを分離し、それぞれからシロ−イノシトールを得る必要があった。さらに、複合体からシロ−イノシトールを得るためには、大量の有機溶媒を必要としていたため、経済性の面で改善の余地があった。従って、工業規模で簡便に且つ効率良くシロ−イノシトールを製造する方法が要望されていた。
米国特許 第5,412,080号明細書 ドイツ連邦共和国特許 第3,405,663号明細書 特開平9−140388号公報 特開平4−126075号公報 特開平05-192163号公報 特開平06-007158号公報 特開平2003−102492公報 「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」（米国）、2000年、 275巻（No.24）、p.18495-18502 「ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Journal of the American Chemical Society）」（米国）、1948年、70巻p. 2931〜2935 「ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Journal of the American Chemical Society）」（米国）、1968年、90巻、p. 3289-3290 「アンゲバント・ヒェミー（Angewandte Chemie）」（ドイツ）、1973年、85巻、p. 1110-1111 「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」（米国）、1948年、 174巻， p.173〜188 「アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Archives of Biochemistry and Biophysics）」（米国）、1956年、J,Larner et al.、60巻、p.352〜363 「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」（米国）、1979年、254巻、p.7684〜7690 「マイクロバイオロジー（Microbiology）」（米国）、1994年、140巻、p.2289〜2298 「モナトゼフテ・ヒュア・ケミ（Monatshefte fur Chemie）」（ドイツ）、1969年、100巻、p. 1327-1337 「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）」（米国）、1977年、131巻、p.872-875 「バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ」（アメリカ）、第68巻、p.1133（1976年） 「ジャーナル・オブ・オルガニック・ケミストリー（Journal of Organic Chemistry）」（米国）、1958年、23巻、p.329〜330
本発明は、ミオ−イノシトールから、直接に微生物変換のみで、高収量でシロ−イノシトールを製造する方法を提供することを課題とする。
本発明はまた、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースに変換する反応を触媒する新規な酵素、及びそれを用いたシロ−イノソース及びシロ−イノシトールの新規な製造方法を提供することを課題とする。
本発明はまた、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する新規酵素シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ、及び、当該酵素を利用したシロ−イノシトールの新規な製造方法を提供することを課題とする。
本発明はさらに、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液から、高純度のシロ−イノシトールを効率よく製造する新しい方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成する能力を有する微生物を探す研究により、自然界より分離したアセトバクター属に属する細菌（AB10253株）を発見し、この菌株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P-18868（国際寄託番号FERM BP-10136）の受託番号で寄託した。さらに、この菌株を利用し、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを製造する方法、および、得られたシロ−イノソースを化学還元によりシロ−イノシトールを製造する方法を確立した（特開平2003-102492号公報）。
その後、シロ−イノソースへの変換能力を上げる目的で、この菌株を変異により育種したところ、これら変異菌株の中に、ミオ−イノシトールから一旦生成したシロ−イノソースを生物的に還元し、わずかではあるがシロ−イノシトールを生成する菌株が存在することを発見した。そこで、発明者らは、この菌株について、培養変換のみでミオ−イノシトールから直接にシロ−イノシトールを主要に生成蓄積する株を得ることを目的に、さらに変異育種を行なった。その結果、目的に合致する変異菌株、すなわち、ミオ−イノシトールの酸化により生じたシロ−イノソースをシロ−イノシトールに還元し、培地中に蓄積する能力を獲得した菌株を得ることに成功した。
さらに、AB10253株よりも低い変換能力であるが、ミオ−イノシトールからシロ−イノシトールを生成する能力を有する菌株を自然界から見出し、16SrRNAの塩基配列による同定を試みたところ、アセトバクター・セルビシエ、アセトバクター・マローラム、または、バークホルデリア・アンドロポゴニスに属する微生物が見出された。
これらの微生物を用いることにより、シロ−イノシトールを効率よく製造できることを見出した。
本発明者らはさらに、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースに効率よく変換することのできる酵素を取得することができれば、そのような酵素を用いることにより、高い基質濃度のミオ−イノシトールからシロ−イノソースを効率良く製造することが可能であると考えた。また、そのような酵素の高活性株をスクリーニングにより単離することができれば、そのような菌株もシロ−イノソースの製造に使用することができると考えた。
そこで、本発明者らは、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースへ変換する反応を触媒することのできる、従来知られていない新しいタイプのNAD+非依存型のミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼがあるという仮説のもと、該酵素を単離すべく、鋭意研究した。その結果、アセトバクター属に属するアセトバクター・エスピーAB10253株においてNAD+非依存型のミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼが存在することを見出した。さらに、本発明者らは、この酵素、又はこの酵素の活性の高い微生物を使用することにより、シロ−イノソースを効率よく製造することができること、及び得られたシロ−イノソースを還元することによって高純度のシロ−イノシトールを効率よく製造することに成功した。
本発明者は、次に、上記ミオ−イノシトールから直接にシロ−イノシトールを生産する菌株の菌体中でどのようにして、ミオ−イノシトールからシロ−イノシトールへ変換がなされているか検討したところ、ミオ−イノシトールの2位の水酸基が、酸素依存で酸化され、シロ−イノソースになった後に、NADHまたはNADPH依存でシロ−イノソースをシロ−イノシトールへ還元する活性を有する酵素が働き、シロ−イノシトールが生成することを見出した。そのような活性を指標にすることによって、シロ−イノソースをシロ−イノシトールへ還元する活性を有する酵素を精製することに成功した。この酵素がNADPH依存で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する活性と、NADP+依存で、シロ−イノシトールをシロ−イノソースへ酸化する活性を有することを見出し、この酵素を「シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ」と命名した。また、本酵素はミオ−イノシトールの５位の水酸基も酸化する能力を有していることから、ミオ−イノシトール５−デヒドロゲナーゼと称することもできる。
さらに、大腸菌やアグロバクテリウム属、バチルス ズブチリス、キサントモナス キャンペストリスのゲノムからPCR法によってシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。
また、本研究者らは、本酵素がNAD+またはNADP+依存で、酸化還元反応を行なうことから、既存のミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ（NAD+またはNADP+依存で、シロ−イノソースをミオ−イノシトールへ還元する活性を有する：EC 1.1.1.18）と共役させることによって（図1：参照）、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを経由して、シロ−イノシトールへ直接変換できると考え、これに成功した。
さらに、本発明者らは、シロ−イノソースの還元等によって得られる、シロ−イノシトール、及びミオ−イノシトールなどの中性糖を含有する混合液から、効率良くシロ−イノシトールを製造するためには、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させることが有利であると考えた。このような考えに基づいて、本研究者らは、シロ−イノシトールとミオ−イノシトールの混合液中のシロ−イノシトールのみを効率良く、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体に導く方法を、鋭意研究した。その結果、シロ−イノシトール、ホウ酸、及び金属イオンからなるシロ−イノシトール・ホウ酸複合体は、特異な結合を有し、他の中性糖の複合体には見られない溶解度の低い複合体であることを見出した。さらに、混合液中の溶解シロ−イノシトールに対して、２倍モル以上、好ましくは２〜３倍モルのホウ酸と金属塩を加え、かつ、溶液をｐＨ8.0〜11.0、好ましくはｐH9.0〜10.0のアルカリ性に保つことにより、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体が効率良く形成し、沈殿することを見出した。このような条件の下で、シロ−イノシトール、及びミオ−イノシトールなどの中性糖を含有する混合液からシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させ、該複合体を酸に溶解させた後、イオン交換樹脂や水溶性有機溶媒などを用いて精製することにより、シロ−イノシトールを効率よく製造することに成功した。
以上によって、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１） アセトバクター属またはバークホルデリア属に属する微生物であって、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含む溶液中でミオ−イノシトールに作用させることにより、シロ−イノシトールを前記溶液中に生成蓄積させ、該溶液中からシロ−イノシトールを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法。
（２） 前記ミオ−イノシトールを含む溶液がミオ−イノシトールを含有する液体培地であり、前記微生物を、該液体培地中で培養することによりミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、（１）の製造方法。
（３） 培養により得られた前記微生物の菌体を、前記溶液中でミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、（１）の製造方法。
（４） 前記微生物が、アセトバクター・セルビシエ、アセトバクター・マローラム、または、バークホルデリア・アンドロポゴニスに属する微生物である（1）〜（３）のいずれかの製造方法。
（５） 前記微生物が、アセトバクター・エスピーAB10281株（FERM BP-10119）またはその変異株である、（1）〜（３）のいずれかの製造方法。
（６） ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する、アセトバクター・エスピーAB10281株（FERM BP-10119）またはその変異株。
（７） 少なくとも以下の理化学的性質を有するNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ
（ａ）作用：電子受容物質の存在下で、ミオ−イノシトールから電子を奪いシロ−イノソースを生成する反応を触媒する、
（ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ4.5〜5.5において活性が極大値を示す、
（ｃ）補因子：1モルの酵素に1モルのヘム鉄を含有する、
（ｄ）阻害剤：１ｍＭのＳｎ2+イオンにより酵素活性が１％以下に阻害される、
（ｅ）サブユニット構造：少なくとも分子量76kダルトンと46ｋダルトンのタンパク質を含有するヘテロマーである、
（ｆ）基質特異性：Ｄ−キロ−イノシトール、ムコ−イノシトール、ミオ−イノシトールに反応し、Ｄ−キロ−1−イノソース、Ｌ−キロ−２−イノソース、シロ−イノソースへ、それぞれ、変換する。アロ−イノシトール、シロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、グルコースには反応しない。
（８） NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ生産能を有するアセトバクター属に属する微生物を培養し、培養された微生物の菌体から、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼを分離精製することを特徴とする、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼの製造方法。
（９） 前記微生物がアセトバクター・エスピーAB10253株 （FERM BP-10136）である、（８）の製造方法。
（１０） ミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中で、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを溶液中から分離精製することを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法。
（１１） ミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中で、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成させる工程、前記シロ−イノソースに還元剤を作用させてシロ−イノシトールを生成させる工程、及び前記シロ−イノシトールを分離精製する工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
（１２） アセトバクター・エスピーのAB10253株を変異処理し、得られた変異株から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法。
（１３） 微生物を含む天然試料の中から微生物を単離し、単離された微生物から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法。
（１４） （１２）又は（１３）のスクリーニング方法によって得られたシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを培地から分離精製することを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法。
（１５） （１２）又は（１３）のスクリーニング方法によって得られたシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させる工程、前記シロ−イノソースに還元剤を作用させてシロ−イノシトールを生成させる工程、及び前記シロ−イノシトールを分離精製する工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
（１６） 下記の理化学的性質を有するシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ。
反応：下記反応式に示すように、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する。
Figure 2005035774
 （１７） さらに、下記の理化学的性質を有する、（１６）のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ。
（a）分子量および会合特性 ： 38〜46ｋダルトン、２または３量体を形成する。
（b）補酵素 ： NAD+若しくはNADP+又はNADH若しくはNADPHを補酵素とする。
（c）活性化重金属 ： Co2+イオンの存在下で活性化される。
（d）阻害重金属 ： Sn2+イオンの存在下で阻害される。
（e）至適ｐH ： ｐH５〜９で活性を有する。
（１８） 以下の（A）または（B）のタンパク質。
（A）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（B）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
（１９） 以下の（A）または（B）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（A）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（B）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
（２０） 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号２７に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２７に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２１） （１９）または（２０）のＤＮＡを含むベクター。
（２２） （１９）もしくは（２０）のＤＮＡ、または（２１）のベクターを保持する形質転換微生物。
（２３） 形質転換する宿主が大腸菌である（２２）の形質転換微生物。
（２４） （２２）または（２３）の形質転換微生物を培養し、培養物からシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの製造方法。
（２５） （１６）のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼと、NAD+またはNADP+存在下でミオ−イノシトールを酸化しシロ−イノソースを生成する反応を触媒するミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.18）とを共存させた溶液中、ｐH6.0〜8.5で、かつNAD+ またはNADP+存在下で、ミオーイノシトールを基質として、シロ−イノシトールへ酵素変換反応させることを特徴とする、シローイノシトールの製造方法。
（２６） 溶液中に、シロ−イノソースを0.01〜3％になるように添加することを特徴とする、（２５）のシローイノシトールの製造方法。
（２７） 溶液中に、シロ−イノソースを0.2〜0.5％になるように添加することを特徴とする、（２５）のシローイノシトールの製造方法。
（２８） 溶液中に、Co塩および／または、Mg塩を0.01〜5.0mMになるように添加することを特徴とする、（２５）のシローイノシトールの製造方法。
（２９） 溶液中に、Co塩および／または、Mg塩を0.2〜2.0mMになるように添加することを特徴とする、（２５）のシローイノシトールの製造方法。
（３０） 溶液中のミオ−イノシトール濃度が5〜22％になるように調製し、酵素反応で生成したシロ−イノシトールを反応溶液中で結晶化させ、シロ−イノシトールを系外に結晶として、ろ別することを特徴とする、（２５）のシローイノシトールの製造方法。
（３１） シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質である（２５）の製造方法。
（Ａ）配列番号28に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号28に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
（３２） シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質である（２５）の製造方法。
（ａ）配列番号27に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｂ）配列番号27に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
（３３） シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質である（２５）の製造方法。
（Ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
（３４） シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質である（２５）の製造方法。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１または１３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１または１３に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３５） シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液に、該混合液中に溶解したシロ−イノシトールの２倍モル以上の量のホウ酸及び金属塩を加え、かつ該混合液のｐＨを8.0〜11.0に調整してシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させる第１の工程、前記複合体を混合液から分離する第２の工程、分離した複合体を酸に溶解させてシロ−イノシトールとホウ酸に開裂させる第３の工程、第３の工程で得られた酸性溶液又は酸性懸濁液からシロ−イノシトールを単離精製する第４の工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
（３６） 前記第１の工程において、加えるホウ酸及び金属塩の量が、前記混合液中に溶解したシロ−イノシトールの２倍モル以上、かつ３倍モル以下であることを特徴とする、（３５）の製造方法。
（３７） 前記第１の工程において、前記混合液のｐHを9.0〜10.0に調整することを特徴とする、（３５）の製造方法。
（３８） 前記金属塩が、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、Na2SO4、NaHSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、硼砂、KCl、KHCO3、K2CO3、K2SO4、KHSO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4、MgCl2、MgCO3、およびMgSO4からなる群より選ばれる１種または２種類以上の金属塩である、（３５）の製造方法。
（３９） 前記シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液が、シロ−イノソースを含有する溶液中でシロ−イノソースを還元することにより得られるミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液である、（３５）の製造方法。
（４０） 前記第３の工程において、前記複合体を酸に溶解させて得られた溶液を0.1規定以上の酸性に調整し、かつ、前記第４の工程において、前記酸性溶液を強酸性イオン交換樹脂、及び強塩基性イオン交換樹脂又はホウ酸選択的吸着樹脂に接触させた後、該酸性溶液からシロ−イノシトールを析出させることを特徴とする、（３５）の製造方法。
（４１） 前記第４の工程において、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に水溶性有機溶媒を加えてシロ−イノシトールを析出させることを特徴とする、（３５）の製造方法。
（４２） 前記水溶性有機溶媒がエタノール又はメタノールであり、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に対して、エタノールを0.3〜3倍容、又はメタノールを0.3〜5倍容加えることを特徴とする、（４１）の製造方法。
（４３） 前記水溶性有機溶媒がエタノール又はメタノールであり、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に対して、エタノールを0.６〜1.5倍容、またはメタノールを0.9容〜２倍容加えることを特徴とする、（４１）の製造方法。
（４４） シロ−イノソースを含有する溶液中において、シロ−イノソースを水素化ホウ素金属塩を用いて還元し、ミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液を得る第1の工程、前記混合液に酸を加えて混合液中のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を溶解させ、かつ溶液を0.01規定以上の酸性溶液に調整する第２の工程、及び前記酸性溶液に、水溶性有機溶媒をミオ−イノシトールが析出しない量で加えて、シロ−イノシトールのみを析出させる第３の工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
（４５） 前記第３の工程において、加える水溶性有機溶媒がエタノール、メタノール又は１−プロパノールであり、前記酸性溶液に対して、エタノールを0.2〜0.4倍容、メタノールを0.2〜0.8倍容、又は１−プロパノールを0.2〜0.4倍容加えることを特徴とする、（４４）の製造方法。
（４６） 前記第３の工程において、加える水溶性有機溶媒がエタノール、メタノール又は１−プロパノールであり、前記酸性溶液に対して、エタノールを0.35〜0.45倍容、メタノールを0.45〜0.55倍容、又は１−プロパノールを0.35〜0.45倍容加えることを特徴とする、（４４）の製造方法。
酵素の共役によるシロ−イノシトールの製造原理を示す図。
１．アセトバクター属またはバークホルデリア属に属する微生物を用いたシロ−イノシトールの製造法
本発明の一形態は、アセトバクター属またはバークホルデリア属に属する微生物であって、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含む溶液中でミオ−イノシトールに作用させることにより、シロ−イノシトールを前記溶液中に生成蓄積させ、該溶液中からシロ−イノシトールを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法に関する。
当該製造方法において使用する微生物は、アセトバクター属または、バークホルデリア属に属する微生物であって、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する微生物である。ここで、アセトバクター属に属する微生物としては、アセトバクター・セルビシエ（Acetobacter cerevisiae）、アセトバクター・マローラム（Acetobacter malorum）、アセトバクター・オルレアネンシス（Acetobacter orleanensis）、アセトバクター・インドネシエンシス（Acetobacter indonesiensis）、アセトバクター・オリエンタリス（Acetobacter orientalis）、アセトバクター・アセティ（Acetobacter aceti）、アセトバクター・リケファシエンス（Acetobacter liquefaciens）、アセトバクター・パステウリアヌス（Acetobacter pasteurianus）、アセトバクター・ハンセニー（Acetobacter hansenii）、またはこれらの種未同定株（エスピー）を挙げることができる。バークホルデリア属に属する微生物としては、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Burkholderia andropogonis）、バークホルデリア・カリオフィリィ（Burkholderia caryophylli）、バークホルデリア・グラミニス（Burkholderia graminis）を挙げることができる。この中では、アセトバクター・セルビシエ、アセトバクター・マローラムまたは、バークホルデリア・アンドロポゴニスが特に好ましい。「ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力」とは、例えば、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養したときに該培地中にシロ−イノシトールを蓄積する能力をいう。
上記微生物の具体例としては、アセトバクター・エスピーAB10281株を挙げることができる。この菌株は、アセトバクター・エスピーAB10253株（FERM BP-10136）を変異育種して、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を付与したものであり、２００４年1月２０日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にFERM P-19639の受託番号で寄託され、さらに、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-10119の受託番号が付与されている。
なお、アセトバクター・エスピーAB10253株は、２００２年５月２４日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM P-18868として寄託され、さらに、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-10136の受託番号で寄託されている。
また、上記微生物アセトバクター・エスピーAB10281株あるいは、アセトバクター・エスピーAB10253株などのアセトバクター属に属する微生物の派生株を用いることもできる。派生株は、上記微生物を変異育種して、変異が導入された株から、ミオ−イノシトールを直接シロ−イノシトールに選択的に変換できる特性を有しているものを選択することによって得ることができる。変異育種の方法としては、例えば、UV照射、放射線照射などの物理的変異方法の他、Nニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル、亜硝酸、メタンスルホン酸メチル、アクリジン色素、ベンゾピレン、硫酸ジメチルなどの変異剤の混合による化学的変異方法が例示される。
上述したような微生物をミオ−イノシトールを含む溶液中でミオ−イノシトールに作用させる方法としては、まず、ミオ−イノシトールを含む液体培地中で本発明の微生物を培養する方法を挙げることができる。
この場合、用いる液体培地の組成は、目的に達する限り何ら特別の制限はなく、シロ−イノシトールへの変換原料であるミオ−イノシトールに加えて、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよく、合成培地・天然培地のいずれも使用できる。ミオ−イノシトールを0.1%〜40%、より好ましくは10%〜30%添加し、炭素源としては、グリセロール、シュークロース、マルトースあるいは澱粉を0.1％〜20％、より好ましくは0.3〜5％、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を0.01％〜5.0％、好ましくは0.5％〜2.0％添加するのが望ましい。その他、必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することができる。培養液中の水素イオン濃度は特に調製する必要は無いが、好ましくはpH4〜10、より好ましくはpH5〜9に調整し培養すると、効率よくシロ−イノシトールを得ることができる。
培養条件は、培地の種類によっても異なるが、培養温度は12〜35℃、好ましくは20〜27℃であり、また、培養は液体培地を振とうしたり、液体培地中に空気あるいは酸素ガスを吹き込むなどして好気的に行えば良い。本培養では、ミオ−イノシトールが培養初期に、酸化されて生じたシロ−イノソースが、培養後期に、生体中で還元されてシロ−イノシトールが生じる。さらに培養を行なうと、徐々にシロ−イノシトールも分解される。従って、培養期間は、シロ−イノシトールが最大または、必要量の蓄積量を示すまで行えば良く、通常1〜10日、好ましくは3〜8日である。
また、培養により得られた微生物の菌体をミオ−イノシトールを含む溶液中でミオ−イノシトールに作用させてもよい。ここで、培養により得られた菌体としては、微生物を別途適当な培養条件で培養して得たものを用いてもよいし、シロ−イノシトールの製造に用いられた微生物を培養液から分離して集めた菌体を再度用いてもよい。菌体を得るための集菌は、遠心分離、濾過など公知の方法により行えばよい。
上記のようにして微生物をミオ−イノシトールに作用させることにより、溶液中にはシロ−イノシトールが蓄積する。培養液からシロ−イノシトールを採取する方法は、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、培養液から菌体を除去した後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、シロ−イノシトール以外の不純物をほとんど除くことができる。その後、再結晶等の方法を用いることにより、目的物質を単離することができる。
より具体的には、シロ−イノシトールが蓄積した培養上清液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト(登録商標)C-20(H+型)を充填したカラムに通過させ通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併する。こうして得られた溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト(登録商標)A116(OH-型)を充填したカラムに通過させ通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併して、シロ−イノシトールを含みそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を取得する。この水溶液を濃縮して得られたシロ−イノシトールの濃厚溶液に、エタノールの適当量を加え、室温または低温で一晩放置すると、純粋なシロ−イノシトールの結晶を晶出できる。また、シロ−イノシトールは水溶解性が低いことを利用して、この水溶液を濃縮し、ろ過するだけでも、純粋なシロ−イノシトールの結晶を晶出できる。さらに、カラム操作を行なう際に、脱色を目的として、活性炭を充填したカラムを使用することもできる。
その他の精製方法として、後述するような、培養で得られたシロ−イノシトールを含む溶液に、ホウ酸と、NaClを加えて、シロ−イノシトールホウ酸複合体を作り、これをろ別後に、酸によりホウ酸を遊離させ、メタノールのような有機溶媒を加えることで結晶化させる方法によっても、純粋なシロ−イノシトールの結晶を得る事ができる。
さらに、本菌株の培養中では、常温で、水溶解性が低い（溶解度約1.6％）シロ−イノシトールは、結晶化し、沈殿が生じる。そのため、この培養途中に、ミオ−イノシトールを追加して加え、さらに、シロ−イノシトールを結晶として蓄積させることも可能である。
２．新規なNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ、ならびに該酵素を用いたシロ−イノソースおよびシロ−イノシトールの製法
本発明の他の形態は、新規なNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ、ならびに該酵素を用いたシロ−イノソースおよびシロ−イノシトールの製法に関する。
＜２−１＞新規なNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ
本発明のNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼは、少なくとも以下の理化学的性質を有する。
（ａ）作用：電子受容物質の存在下で、ミオ−イノシトールから電子を奪いシロ−イノソースを生成する反応を触媒する、
（ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ4.5〜5.5において活性が極大値を示す、
（ｃ）補因子：1モルの酵素に1モルのヘム鉄を含有する、
（ｄ）阻害剤：１ｍＭのＳｎ2+イオンにより酵素活性が１％以下に阻害される、
（ｅ）サブユニット構造：少なくとも分子量76kダルトンと46ｋダルトンのタンパク質を含有するヘテロマーである、
（ｆ）基質特異性：Ｄ−キロ−イノシトール、ムコ−イノシトール、ミオ−イノシトールに反応し、Ｄ−キロ−1−イノソース、Ｌ−キロ−２−イノソース、シロ−イノソースへ、それぞれ、変換する。アロ−イノシトール、シロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、グルコースには反応しない。
（ａ）の作用は、電子受容物質の存在下で、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。ここで、電子受容物質としては酸化型DCIP、PMS（フェナジンメソサルフェート）、メチレンブルー、Fe3+イオン等が例示され、これらを組み合わせて使用することができるが、好ましくは酸化型DCIPが使用される。ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、100ｍMリン酸緩衝液（ｐH5.0）、ミオ−イノシトール5mg、２、４−ジクロロインドフェノール（酸化型DCIP）0.4mgからなる1ｍL溶液における600nmの吸収度変化を反応速度に換算して、1分間あたり、1μmolのミオ−イノシトールが酸化される活性を1ユニットとして測定することができる。（ｂ）の至適ｐＨは、各ｐＨにおいてミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を測定し、酵素活性が極大を示すｐＨの範囲を調べることによって確認することができる。また、（ｄ）の性質は、酵素活性測定系にＳｎ2+イオンを添加して酵素活性を測定し、Ｓｎ2+イオン非添加時の活性と比較することによって確認することができる。また、（e）のサブユニット構造は、例えば、SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動)などによって確認することができる。なお、各サブユニットの76kダルトン及び46ｋダルトンという分子量はそれぞれおおよその値であり、この前後数キロダルトンの値であってもよい。
本発明のNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼは、上記性質を有している限り特に限定されないが、例えば、アセトバクター・エスピーAB10253株由来のものが挙げられる。本発明のNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼの基質特異性は上述したとおりであるが、アセトバクター・エスピーAB10253株由来の酵素について、基質濃度50mMにおける相対活性及びKm値を示すと、以下のとおりである。すなわち、Ｄ−キロ−イノシトール（相対活性100％、Ｋｍ＝8.8mM）、ムコ−イノシトール（相対活性68％、Km=14.5mM）、ミオ−イノシトール（相対活性５３％、Km=20mM）である。
本発明のNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼは、従来知られているNAD+依存型のミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼと異なるタイプのNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼである。特に異なる点について、両酵素を比較すると、以下の表１のようになる。
Figure 2005035774
＜２−２＞NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼの製造法
本発明のNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼの製造法は、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ生産能を有するアセトバクター属に属する微生物を培養し、培養された微生物の菌体から、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼを分離精製することを特徴とする製造方法である。
NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼの製造に使用することのできる微生物としては、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ生産能を有する限り特に限定されないが、例えば、アセトバクター・エスピーAB10253（FERM BP-10136）が挙げられる。微生物を培養するために用いる培地は、従来知られる一般的な微生物培養に使用されるもので、炭素源、窒素源、その他栄養素などを含むものを使用することができる。ここで、炭素源として、グルコース、シュークロース、マルトースあるいは澱粉などが例示される。その濃度は、0.1％〜20％、より好ましくは0.3〜5％添加するのが望ましい。窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素あるいは肉エキスなどが例示される。その濃度は、0.01％〜5.0％、好ましくは0.5％〜2.0％添加するのが望ましい。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが好ましい。培養液中の水素イオン濃度はpH３〜10、好ましくはpH5〜７に調整し培養すると、効率よく本酵素の発現を誘導することができる。なお、％で示した値は、ｗ／ｖの百分率を示すものであり、濃度を％で表示する場合は、以下においても同様とする。
なお、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼの発現を誘導するために、ミオ−イノシトールを含有する培地を使用することが好ましい。この場合、加えるミオ−イノシトールの濃度は、0.2％〜15%、好ましくは1％〜5％、より好ましくは3％が適当である。
培養条件は、培地の種類によっても異なるが、培養温度は好ましくは12〜35℃、より好ましくは20〜27℃であり、また、培養は液体培地を振とうしたり、液体培地中に空気あるいは酸素ガスを吹き込むなどして好気的に行うことが好ましい。培養期間は、培養液中にミオ−イノシトールが完全に消失し、且つ、シロ−イノソースが最大の蓄積量を示すまで行うことが好ましく、通常1〜10日、好ましくは3〜8日である。
この様に培養した菌体から酵素を分離精製することにより、本発明の酵素を得ることができる。酵素の分離精製は、通常のタンパク質の精製方法と同様にして行うことができる。以下に具体例を挙げて説明するが、分離精製方法はこれらに限定されない。
まず、培養して得られた菌体を遠心分離やフィルターろ過などにより沈殿又は濃縮する。次に、得られた菌体沈殿物、または菌体懸濁液を破砕する。破砕は、フレンチプレス、ダイノミール、超音波破砕などの方法が使用できるが、超音波破砕が好ましい。例えば、培養液１リットルから集められた菌体の場合、水により洗浄を行ない、最終的に50mlの水に懸濁し、この懸濁液に超音波を照射して細胞を破砕し、12000rpmの遠心分離によって、沈殿を得る。さらに得られた沈殿を、適当な緩衝液、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液（濃度は2mM〜100mM、ｐHはpH6.0〜8.0）に懸濁し、ここに、界面活性剤を加えることで膜酵素を抽出することができる。界面活性剤の種類としては、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）などが例示でき、その濃度は、0.02％〜1.0％で使用できるが、好ましくはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を0.6％の濃度で使用するのが望ましい。
上記で得られた界面活性剤を加えた懸濁液を、低温で１〜５時間程度インキュベートすることにより、酵素を抽出することができる。この後、再度遠心分離を行ない、上清に可溶化してきた酵素を得ることができる。この様にして得られた酵素液は、このまま、シロ−イノソースの製造のために使用することもできるが、必要があれば、通常の酵素の濃縮に使用される方法により、酵素を濃縮し、使用することができる。酵素の濃縮方法として、例えば、硫安分画、限外ろ過などが例示される。また、より高度に精製するためには、さらに以下の処理を行うことが好ましい。
可溶化した酵素は、カラムクロマトグラフィー精製を行うことが好ましい。カラムクロマトグラフィーとしては、DEAEカラムクロマトグラフィーなどが挙げられる。DEAEカラムは、DEAE基を有していれば、特に担体の性状が異なっていても使用できる。好ましくはDEAEトヨパール（東ソー社製）が例示される。DEAEトヨパールを用いて精製する場合、上述した酵素液は、塩強度２０ｍＭに調製して、カラムに加えるとよい。その様にしてカラムに吸着させたタンパク質は次に、界面活性剤を含まない２０ｍＭの緩衝液（ｐHはpH6.0〜8.0）に、NaCl、またはKClの直線濃度勾配をかけた溶液を通過させ、タンパク質を溶出させる。NaClの場合0ｍＭから、500ｍＭの濃度勾配、KClの場合、0ｍＭから350ｍＭの濃度勾配が使用される。次に、このカラムを、再度、界面活性剤を含まない２０ｍＭの緩衝液（ｐHはpH6.0〜8.0）を通して、洗浄し、次に界面活性剤を含む２０ｍＭの緩衝液（ｐHはpH6.0〜8.0）に、NaCl、またはKClの直線濃度勾配をかけた溶液を通過させ、タンパク質を溶出させる。NaClの場合0ｍＭから、500ｍＭの濃度勾配、KClの場合、0ｍＭから350ｍＭの濃度勾配が使用される。添加される界面活性剤は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０などが例示でき、その濃度は、0.02％〜1.0％で使用できるが、好ましくはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を0.1％の濃度で使用するのが望ましい。このような条件の中で、本酵素は、界面活性剤を含む20ｍＭ緩衝液に100〜170mMのNaClを含む溶液によって、カラムから溶出される。この様にして得られた酵素液は、このまま、シロ−イノソースの製造のために使用することもできるが、より高度に精製するためには、さらに処理がなされる。
なお、酵素活性を指標にして精製する場合、酵素活性の測定は、例えば、タンパク溶液を100ｍMリン酸緩衝液（ｐH5.0）、ミオ−イノシトール5mg、２、４−ジクロロインドフェノール（酸化型DCIP）0.4mgからなる1ｍｌ溶液に加え、600nmの吸収度変化を反応速度に換算して、1分間あたり、1μmolのミオ−イノシトールが酸化される活性を1ユニットとして測定することができる。
本酵素をさらに精製する場合、本酵素液を透析や、限外ろ過により脱塩した後に、例えば、ヒドロキシアパタイトカラムに加えることが好ましい。この場合、ヒドロキシアパタイトカラムに吸着したタンパク質は、界面活性剤を含むリン酸緩衝液（ｐH7.0）の直線濃度勾配をかけた溶液を通過させることによって溶出される。この時使用されるリン酸緩衝液の濃度勾配は0ｍＭから500ｍＭの濃度勾配が使用される。また、添加される界面活性剤は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０などが例示でき、その濃度は、0.02％〜1.0％で使用できるが、好ましくはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を0.1％の濃度で使用するのが望ましい。このような条件の中で、本酵素は、界面活性剤を含む210〜260mMのリン酸緩衝液によって、カラムから溶出される。この様にして得られた酵素液は、ほぼ、純粋なNAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼを含んでおり、このまま、シロ−イノソースの製造のために使用することができる。
＜２−３＞シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法
本発明はまた、アセトバクター・エスピーのAB10253株を変異処理し、得られた変異株から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法に関する。
ここで、指標となるNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性の測定は、例えば、微生物菌体から得られた膜画分を100ｍMリン酸緩衝液（ｐH5.0）、ミオ−イノシトール5mg、２、４−ジクロロインドフェノール（酸化型DCIP）0.4mgからなる1ｍＬ溶液に加え、600nmの吸収度変化を測定することによって行うことができる。選別の基準としては、例えば、上記方法で活性を測定して比較した場合に、非変異AB10253株の１．２倍以上、好ましくは２倍以上のNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を示す菌株を選別することが好ましい。
アセトバクター・エスピーAB10253株を変異処理する方法は、通常の微生物の変異方法が使用できる。例えば、UV照射、放射線照射などの物理的変異方法の他、Nニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル、亜硝酸、メタンスルホン酸メチル、アクリジン色素、ベンゾピレン、硫酸ジメチルなどの変異剤の混合による化学的変異方法が例示される。
これらの変異処理を施したアセトバクター・エスピーから、シロ−イノソース製造用微生物をスクリーニングする方法を以下に例示する。ただし、スクリーニング方法は、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして行う限り、この方法に限定されない。
変異処理したAB10253株を、ミオ−イノシトールと栄養成分を含有する寒天培地に、９ｃｍ径のシャーレ１枚当たり、10〜300コロニー、好ましくは100〜150コロニーが形成する様に広げる。ここで、培地の栄養成分として加えられる炭素源、窒素源、その他栄養素としては、従来知られる一般的な微生物培養に使用されるものが使用可能である。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース、マルトースあるいは澱粉などが例示される。その濃度は、0.1％〜20％、より好ましくは0.3〜5％添加するのが望ましい。窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素あるいは肉エキス、などが例示される。その濃度は、0.01％〜5.0％、好ましくは0.5％〜2.0％添加するのが望ましい。
その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。培養液中の水素イオン濃度はpH3〜10、好ましくはpH5〜7に調整し培養すると、効率よく本酵素を誘導することができる。
培養はコロニーが十分形成する時間、培養すれば良く、約３日でコロニーが形成する。培養温度は、好ましくは菌の生育適温である25〜30℃、より好ましくは２７℃で培養される。
コロニーは単離培養し、個々に、NAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を測定し、活性の強い株を選抜することもできるが、以下に述べる様に、9cm径のシャーレを用いて、寒天培地の上で効率良く、選抜することができる。
培養後、９ｃｍ径のシャーレに形成したコロニーの上に、検定用寒天培地を10mlゆっくりと注ぎ入れる。検定用寒天培地の組成は、100mMリン酸緩衝液、1％ミオ−イノシトール、0.4％酸化型DCIPからなる組成に0.5％寒天になるように寒天を加えて、寒天を溶解後、36℃まで冷却し、寒天が固まらない様に調製した粘凋な溶液である。このような処理を行なった検定用寒天培地は、27℃でゆっくりと冷却され、９ｃｍ径のシャーレに形成したコロニーの上に、重層された形で、固化する。
処理後、27℃で、シャーレをインキュベートすることにより、徐々にNAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性の大きさに従って、寒天培地上に一面に広がった酸化型DCIPの青色が、コロニーのまわりのみ、透明になり始めるのが観察される。この時、より速く、透明になった所のコロニーを新しい培地に継代し、NAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性の高い株を取得することができる。
また、ここで得られたシロ−イノソース生産微生物に、さらに変異処理を施し、酸素呼吸能力を指標にしてスクリーニングを行うことにより、酸素を電子受容体として、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースに変換する能力を持った菌株を育種することが可能である。ここで、酸素呼吸能力とは低酸素条件でよく生育する能力をいい、低酸素条件とは、例えば酸素濃度３％以下の条件をいう。アセトバクター・エスピーAB10253株は絶対好気性菌なので、低酸素条件でよく生育するコロニーを新しい培地に継代することで酸素呼吸能力の高い菌株を得ることができる。
さらに、上記のスクリーニング方法は、天然の微生物に対しても行うことができる。すなわち、本発明のもう一つのスクリーニング方法は、微生物を含む天然試料の中から微生物を単離し、単離された微生物から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とするスクリーニング方法である。ここで、天然の微生物を含む試料とは、例えば、天然の土壌等が挙げられる。天然試料の中から微生物を単離する方法は、例えば、天然試料の懸濁液又はその希釈液を寒天培地に塗布し、天然試料に含まれる微生物を独立のコロニーとして寒天培地上に生育させる方法等が挙げられる。単離された微生物の中からシロ−イノソース製造用微生物をスクリーニング方法は、培地のｐHを3〜4、好ましくは3.5にする点を除いて、アセトバクター・エスピーAB10253株を用いる場合と同様の操作が適用できる。
＜２−４＞シロ−イノソースの製造方法
本発明はまた、ミオ−イノシトールに、NAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ又は同酵素の高活性株（シロ−イノソース製造用微生物）を作用させることを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法に関する。
（ｉ）NAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼを用いたシロ−イノソースの製造方法
本発明の「NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼを用いたシロ−イノソースの製造方法」は、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中でミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを溶液中から分離精製することを特徴とする製造方法である。ここでNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼは、既述した方法によって得られるものを使用することができる。なお、本酵素はミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成する活性を有する限り、その精製の程度は問わない。
ここで、基質であるミオ−イノシトールは0.1％〜20％、好ましくは、5％〜10％の濃度で使用する。本反応に使用される酵素液は、上述した粗酵素液、または高度に精製された酵素液を使用することができる。反応時のｐHは、好ましくはｐH5.0に保たれる様にし、ｐHをモニターして、アルカリ性溶液、または、酸性溶液を適時、添加できる他、適当な緩衝液を使用することができる。緩衝液の例としては、ｐH5.0付近で緩衝能力のあるものであれば特に限定されずに使用することができ、好ましくはリン酸緩衝液が使用される。
この酵素を用いる製造方法においては、反応液中に電子受容物質を加える必要がある。ここで、電子受容物質としては酸化型DCIPの他、PMS（フェナジンメソサルフェート）、メチレンブルー、Fe3+イオン等が例示され、これらを組み合わせて使用することができるが、好ましくは酸化型DCIPが使用される。加えられる電子受容物質の量はミオ−イノシトール1モルに対して、1モルの量が必要であり、これを相当するミオ−イノシトールのモル数に対して適時加えることができる。反応が進むに従い、これら電子受容物質の濃度が高くなる時、還元型電子受容物質が析出することがあるが、その場合は、遠心分離、またはろ過などの操作により、除去することができる。本反応は電子受容物質の溶解度により、不均一系である場合があり、攪拌下に反応を行なうことが好ましい。
本反応の反応温度は、酵素が失活しない程度で作用させるのであれば、特に限定されないが、好ましくは20℃〜40℃で作用させることができる。反応時間は好ましくは１〜７２時間であり、より好ましくは８〜１２時間である。生成したシロ−イノソースは、例えば再結晶法などによって分離精製することができる。
（ii）微生物を用いたシロ−イノソースの製造方法
本発明はまた、上記スクリーニング方法によって得られるシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを培地から分離精製することを特徴とする、微生物を用いたシロ−イノソースの製造方法に関する。
ここで用いる液体培地の組成は、微生物がミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成できる限り何ら特別の制限はなく、例えばシロ−イノソースへの変換原料であるミオ−イノシトールに加えて、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地を挙げることができる。合成培地・天然培地のいずれも使用できる。具体的には、ミオ−イノシトールを0.1%〜40%、より好ましくは10%〜30%添加し、炭素源としては、グリセロール、シュークロース、マルトースあるいは澱粉を0.1％〜20％、より好ましくは0.3〜5％、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を0.01％〜5.0％、好ましくは0.5％〜2.0％含有する培地が望ましい。
その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。培養液中の水素イオン濃度はpH4〜10、好ましくはpH5〜9に調整し培養すると、効率よくシロ−イノソースを得ることができる。
培養条件は、菌株や培地の種類によっても異なるが、培養温度は好ましくは12〜35℃、より好ましくは20〜27℃であり、また、培養は液体培地を振とうしたり、液体培地中に空気あるいは酸素ガスを吹き込むなどして好気的に行うことが好ましい。培養期間は、培養液中にミオ−イノシトールが完全に消失し、且つ、シロ−イノソースが最大の蓄積量を示すまで行うことが好ましく、通常1〜10日、好ましくは3〜8日である。
培養液から目的物を分離精製する方法は、通常の水溶性中性物質を分離精製する一般的な方法を応用することができる。例えば、培養液から菌体を除去した後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、シロ−イノソース以外の不純物をほとんど除くことができる。ただし、強塩基性陰イオン交換樹脂のOH-型はシロ−イノソースを化学変化させるので使用しないほうが好ましい。その後、再結晶等の方法を用いることにより、目的物質を単離することができる。
以下にシロ−イノソースの分離精製の具体的方法を例示する。ただし、分離精製の方法は、これらに限定されない。まず、シロ−イノソースが蓄積した培養上清液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト(登録商標)C-20(H+型)（住友化学製）を充填したカラムに通過させ通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併する。こうして得られた溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト(Duolite:登録商標)A368S(遊離塩基型)を充填したカラムに通過させ通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を混合して、シロ−イノソースを含みそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を取得する。この水溶液を濃縮して得られたシロ−イノソースの濃厚溶液に、エタノールの適当量を加え、室温または低温で一晩放置すると、純粋なシロ−イノソースの結晶を晶出できる。
＜２−５＞シロ−イノシトールの製造法
本発明はまた、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ又は該酵素の高活性株を用いてミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させ、得られたシロ−イノソースを還元してシロ−イノシトールを得る事を特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法に関する。
この製造方法において、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ又は該酵素の高活性株（シロ−イノソース製造用微生物）を用いてミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させる工程は、既述した方法によって行うことができる。この工程によって得られるシロ−イノソースは、単離精製して還元工程に用いてもよいが、単離精製せずに還元工程に用いてもよい。シロ−イノソース製造用微生物を用いてシロ−イノソースを生成させる場合、培養液中にシロ−イノソースを生成蓄積させた後、シロ−イノソースを単離せず、菌体のみを分離して得た培養ろ液を還元工程に用いてもよい。
反応液系中でシロ−イノソースをシロ−イノシトールに還元できる還元剤としては、特に限定されないが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウムが挙げられる。これらの還元剤によりシロ−イノソースを還元すると、シロ−イノシトール及びミオ−イノシトールが生成する。その生成比率は反応温度、還元試薬の種類によって異なるが、一般的にはシロ−イノシトール：ミオ−イノシトール＝約4：6の混合物が得られる。したがって、混合物からシロ−イノシトールを分離精製する必要がある。
なお、シロ−イノソースからシロ−イノシトールへの還元は、後述するような、本発明が提供する新規シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼを用いて行ってもよい。
還元反応液からシロ−イノシトールを分離精製するには、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。例えば、まず、反応液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、シロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含みそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を得る。この水溶液からシロ−イノシトールだけを取得するには、主に水に対する溶解度の差を利用することが有効である。すなわち、前記の水溶液を濃縮し、水に対する溶解度の低いシロ−イノシトールを固体として析出せしめこれを取得する方法などを使用することができる。
また、後述するように、得られたシロ−イノシトールを含む溶液に、ホウ酸と、NaClを加えて、シロ−イノシトールホウ酸複合体を作り、これをろ別後に、酸によりホウ酸を遊離させ、メタノールのような有機溶媒を加えることで結晶化させる方法によって、シロ−イノシトールを分離精製してもよい。
３．シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ及びこれを用いたシロ−イノシトールの製法
本発明の他の形態は、新規酵素シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ、ならびに該酵素を用いたシロ−イノシトールの製法に関する。
＜シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ＞
本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、以下の反応式に示すように、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する。
Figure 2005035774
 シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは上記反応活性を有するものである限り、その由来は限定されるものではないが、微生物由来であることが好ましく、大腸菌（Escherichia coli）、アセトバクター属（Acetobacter）、バチルス属（Bacillus）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、キサントモナス属（Xanthomonas）等であることが特に好ましい。更に、大腸菌Ｋ−１２株 ＡＴＣＣ１０７９８（Escherichia coli K-12 ATCC10798）、アセトバクター・エスピー AB10281株 FERM BP-10119（Acetobacter sp.AB10281 FERM BP-10119）、バチルス ズブチリス 168株 ATCC23857（Bacillus subtilis 168 ATCC23857）、アグロバクテリウム チュメファシエンス C58株 ATCC33970（Agrobacterium tumefacience C58 ATCC33970）、アグロバクテリウム・エスピー AB10121株 FERM P-17383（Agrobacterium sp.AB10121 FERM P-17383)、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス ATCC33913（Xanthomonas campestris pv. campestris ATCC33913）であることが特に好ましい。
本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、下記の理化学的性質を有するシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼが包含される。
反応：以下の反応式に示すように、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する。
Figure 2005035774
 シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性の測定方法は、還元活性を測定する方法と、酸化活性を測定する方法、いずれの測定方法でも、測定可能であるが、酸化活性の測定は共存するミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼに由来する活性により、精度が低く、また、酸化活性自体が微弱なため、好ましくは、還元活性を測定する方が望ましい。
還元活性の測定は、シローイノソースを基質にして、NADHまたは、NADPHを共存させ、NADHまたはNADPHの340nmの吸収の減少を測定することで成される。また、反応後の溶液を、HPLC、GLCなどの分析装置で、生産物（シロ−イノシトールか、ミオ−イノシトール）の判断でも可能である。
本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、好ましくはさらに下記の理化学的性質を有する。
分子量および会合特性： 38〜46ｋダルトン、２または３量体を形成する。
分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動）などの結果から、またはＤＮＡの全長から酵素の推定分子量を算出することができる。また、会合特性は、ゲルろ過カラム（東ソー社：2000SWXL）で分画した画分の活性を測定し、相当する分子量画分から、分子量を計算し、これを、酵素の分子量で割った値を整数化することにより求めることが可能である。
また、本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、好ましくはさらに下記の理化学的性質を有する。
補酵素： NAD+若しくはNADP+又はNADH若しくはNADPHを補酵素とする。
補酵素の選択性は、反応液（200mMトリス緩衝液pH8.0、2% NADPHまたはNADH、1%シロ−イノソース）5μｌと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定することで確認することができる。なお、％で示した値は質量／体積（Ｗ／Ｖ）の百分率を示すものであり、濃度を％で表示する場合は、以下においても同様とする。
また、上記測定法により補酵素相対活性も確認することが可能である。当該補酵素相対活性により、例えば、NADPH：NADHが１００：１〜１００：１０のグループ、１００：１０〜１００：３０のグループ、１００：３０〜１００：６０のグループ、１００：６０〜１００：１２０のグループに分けることも可能である。
また、本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、好ましくはさらに下記の理化学的性質を有する。
活性化重金属 ： Co2+イオンの存在下で活性化される。または、Mn2+、Zn2+、Ca2+イオンの存在下で活性化される場合もあり得る。
阻害重金属 ： Sn2+イオンの存在下で阻害される。または、Zn2+イオンの存在下で阻害される場合もあり得る。
当該重金属による効果は、反応液（200mMトリス緩衝液pH8.0、2% NADPH、1%シロ−イノソース、２mM金属塩）5μｌと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定することで確認できる。「活性化されるとは」重金属無添加区の酵素活性を100％としたときに重金属１mM添加区の酵素活性が１０５％以上を、好ましくは１２０％以上を示すことを意味する。一方、「阻害されるとは」重金属無添加区の酵素活性を100％としたときに重金属１mM添加区の酵素活性が９５％以下に、好ましくは７０％以下になることを意味する。
また、本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、好ましくはさらに下記の理化学的性質を有する。
至適ｐH ： 本発明酵素は、ｐH５〜９で活性を有する。
至適ｐHは、反応液（200mMリン酸緩衝液pH5.0〜9.0、2% NADPH、1%シロ−イノソース）5μｌと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定することで確認できる。至適ｐHとは、最大活性の９０％以上の活性を有することを意味する。本発明酵素は、例えば、至適ｐHの範囲により酸性側に至適ｐHがあるグループ（至適ｐHがpH5.5〜6.5）、中性域に至適ｐHがあるグループ（至適ｐHがpH6.5〜7.5またはpH6.5〜8.5）、アルカリ性側に至適ｐHがあるグループ（至適ｐHがpH7.0〜8.5またはpH7.5〜9.0）に分けることも可能である。
また、本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、好ましくはさらに下記の理化学的性質を有する。
熱安定性：本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、６０℃まで安定である。
熱安定性は、酵素液を所定の温度で10min間処理した後、冷却し、この酵素液と反応液（200mMリン酸緩衝液pH5.0〜9.0、2% NADPH、1%シロ−イノソース）5μｌを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定することで確認できる。「熱安定であるとは」20℃10min処理区の活性を100％として、上記熱処理した酵素の活性が９０％以上残存していることを意味する。
また、本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、好ましくはさらに下記の理化学的性質を有する。
シロ−イノソースに対するＫｍ値： シロ−イノソースに対するKm値は、２〜１３ｍＭを示す。
シロ−イノソースに対するKm値は、反応液（200mMトリス緩衝液pH8.0、2% NADPH、0.001〜2.5%シロ−イノソース）5μｌと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定することで確認できる。測定値は定法に従い、逆数プロットし、Km値を算出する。本発明酵素は、例えば、シロ−イノソースに対するKm値が４ｍＭ未満のグループ、４ｍＭ以上１０ｍＭ未満のグループ、１０ｍＭ以上１３ｍＭ未満のグループに分けることも可能である。
また、本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、好ましくはさらに下記の理化学的性質を有する。
基質特異性：相対活性が７０％以上の基質は、シロ−イノシトール（ＳＩ）、ミオ−イノシトール（ＭＩ）、Ｄ−キロ−イノシトール（ＤＣＩ）、エピ−イノシトール（ＥＩ）、Ｌ−キロ−イノシトール（ＬＣＩ）が挙げられる。相対活性が２０％以上７０％未満の基質は、Ｌ−キロ−イノシトール（ＬＣＩ）、エピ−イノシトール（ＥＩ）、ムコ−イノシトール（ＭｕＩ）、ミオ−イノシトール（ＭＩ）、Ｄ−キロ−イノシトール（ＤＣＩ）、アロ−イノシトール（ＡＩ）、ネオ−イノシトール（ＮＩ）が挙げられる。相対活性が２０％未満の基質は、アロ−イノシトール（ＡＩ）、ネオ−イノシトール（ＮＩ）、Ｄ−キロ−イノシトール（ＤＣＩ）、Ｌ−キロ−イノシトール（ＬＣＩ）、エピ−イノシトール（ＥＩ）、ムコ−イノシトール（ＭｕＩ）が挙げられる。
基質特異性は、酸化活性を指標にシロ−イノシトールに対する反応性に対する相対活性を測定することで確認できる。イノシトール異性体としては、シロ−イノシトール（ＳＩ）、ミオ−イノシトール（ＭＩ）、Ｄ−キロ−イノシトール（ＤＣＩ）、Ｌ−キロ−イノシトール（ＬＣＩ）、エピ−イノシトール（ＥＩ）、ムコ−イノシトール（ＭｕＩ）、アロ−イノシトール（ＡＩ）、ネオ−イノシトール（ＮＩ）等が挙げられる。本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの基質特異性は、相対活性が70％以上の区、70％未満20％以上の区、20％未満の区に分けて示すことが可能である。
測定方法として、反応液（各種イノシトール異性体1%（ネオ−イノシトールのみ0.4％））、200mMトリス緩衝液pH8.0、0.002%NADP+、0.002%ジアホラーゼ、0.01%ニトロテトラゾリウムブルー）50μlと、酵素液50μlを混合し、25℃、3min毎に、545nmの吸光度の増加をマイクロプレートリーダーで測定することが可能である。
これら理化学的性質は、そのいずれかの組み合わせを有していることが望ましい。
＜シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの製造および精製＞
シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの製造に使用することのできる微生物としては、該酵素の生産能を有する限り特に限定されないが、例えば、大腸菌Ｋ−１２株 ATCC10798（Escherichia coli K-12 ATCC10798）（以下、大腸菌Ｋ−１２株ともいう）、アセトバクター・エスピー AB10281株 FERM BP-10119（Acetobacter sp.AB10281 FERM BP-10119）（以下、AB10281株ともいう）、バチルス ズブチリス 168株 ATCC23857（Bacillus subtilis 168 ATCC23857）（以下、Bucillus sub.168株、B.sub.168株ともいう）、アグロバクテリウム チュメファシエンス C58株 ATCC33970（Agrobacterium tumefacience C58 ATCC33970）（以下、A.tume.C58株ともいう）、アグロバクテリウム・エスピー AB10121株 FERM P-17383（Agrobacterium sp.AB10121 FERM P-17383）（以下、AB10121株ともいう）、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス ATCC33913（Xanthomonas campestris pv. campestris ATCC33913）（以下、X.camp.ともいう）が挙げられる。
シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼを製造する目的で、これら微生物を培養するために用いる培地は、従来知られる一般的な微生物用培地を使用することが可能である。例えば、アセトバクター・エスピー AB10281株 FERM BP-10119、バチルス ズブチリス 168株 ATCC23857、アグロバクテリウム チュメファシエンス C58株 ATCC33970、アグロバクテリウム・エスピー AB10121株 FERM P-17383、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス ATCC33913を培養するときの培地組成は、目的に達する限り何ら特別の制限はなく、シロ−イノシトールへの変換原料であるミオ−イノシトールに加えて、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよく、合成培地・天然培地のいずれも使用できる。ミオ−イノシトールを0.1〜40%、より好ましくは10〜30%添加し、炭素源としては、グリセロール、シュークロース、マルトースあるいは澱粉を0.1〜20％、より好ましくは0.3〜5％、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を0.01〜5.0％、好ましくは0.5〜2.0％添加するのが望ましい。その他、必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することができる。培養液中の水素イオン濃度は特に調製する必要は無いが、好ましくはpH4〜10、より好ましくはpH5〜9に調整し培養すると、効率よくシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ含有する菌体を得ることができる。
培養条件は、培地の種類によっても異なるが、培養温度は12〜38℃、好ましくは20〜27℃であり、また、培養は液体培地を振とうするか、液体培地中に空気あるいは酸素ガスを吹き込むなどして好気的に行えば良い。培養期間は、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼが最大または、必要量の活性量を示すまで行えば良く、通常1〜10日、好ましくは3〜8日である。
一方、大腸菌Ｋ−１２株 ATCC10798を培養する時の培地の組成も、目的に達する限り何ら特別の制限はなく、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよく、合成培地・天然培地のいずれも使用できる。例えば、LB培地や、TB培地の他、YT培地などが例示される。さらに、大腸菌Ｋ−１２株 ATCC10798のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの比活性を約3倍増加させる物質として、培地にソルボースを0.05〜1％、好ましくは0.5％添加するのが望ましい。培養条件は、培地の種類によっても異なるが、培養温度は28〜38℃、好ましくは36℃であり、また、培養は液体培地を振とうするか、液体培地中に空気あるいは酸素ガスを吹き込むなどして好気的に行えば良い。培養期間は、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼが最大または、必要量の活性量を示すまで行えば良く、通常1〜3日、好ましくは1日である。
この様に培養した菌体から酵素を分離精製することによりシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼを得ることができる。酵素の分離精製は、通常のタンパク質精製方法と同様にして行うことができる。以下具体的に説明するが、分離精製方法はこれらに限定されない。
まず、培養後に得られた菌体を集めるためには、遠心分離や、膜濃縮などの方法が使用できる。必要であれば、この段階で、菌体を適当な溶液に懸濁し、再度、遠心分離や、膜濃縮などの方法で、菌体を集めることで洗浄することができる。このようにして得られた菌体は、次に、オートミールや、超音波などの物理的方法で破砕し、菌体内に存在する本発明酵素を抽出することが可能である。
破砕された菌体を含む菌体破砕液は、遠心分離や、膜濃縮などの方法で、可溶物と、不溶物に分けられる。その後、可溶物から当該酵素を単離するために、一般的な酵素精製の手順に則って、精製することができる。すなわち、ブルートヨパール（東ソー社）などのアフィニティーカラム、DEAEカラム、CMカラムに代表されるイオン交換カラム、ゲルろ過カラム、ヒドロキシアパタイトカラム、などのカラム操作の他、硫安分画法、等電点沈殿法などのバッチワイズな操作法も使用できる。
シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性の測定方法は、還元活性を測定する方法と、酸化活性を測定する方法、いずれの測定方法でも、測定可能であるが、酸化活性の測定は共存するミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼに由来する活性により、精度が低く、また、酸化活性自体が微弱なため、好ましくは、還元活性を測定する方が望ましい。還元活性の測定は、シローイノソースを基質にして、NADHまたは、NADPHを共存させ、NADHまたはNADPHの340nmの吸収の減少を測定することで成される。また、反応後の溶液を、HPLC、GLCなどの分析装置で、生産物（シロ−イノシトールか、ミオ−イノシトール）の判断も可能である。
精製された酵素は、その精製度をNative（ネイティブ）ＰＡＧＥや、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ＰＡＧＥなどを用いた電気泳動によって、確認することができる他、ＰＶＤＦ膜などのタンパク吸着性膜へ、トランスブロットすることにより、相当するタンパク質をより高度に精製することができる。
本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼとして具体的には、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質が挙げられる。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
この中で配列番号２８のアミノ酸配列を有するシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、本発明によって提供される新規なタンパク質である。
上記「１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質」とは、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を実質的に害さない１もしくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を有していてもよいことを示す。
すなわち、天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多形や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないものも、本発明タンパク質に包含される。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、または活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するタンパク質であり、本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼに包含されるものである。
なお本明細書における「複数のアミノ酸」とは、本発明酵素の活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば400アミノ酸残基からなるポリペプチドの場合、２〜２０程度、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜３の数を示す。また、本発明タンパク質との相同性が、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上となる程度の数値を示すタンパク質は本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼに含まれる。
本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼとしてはまた、以下のDNAによってコードされるものがあげられる。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または２７に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または２７に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
この中で配列番号２７の塩基配列を有するDNAは、本発明によって提供される新規な、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼをコードするDNAである。
ここでいう「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。「ストリンジェントな条件下」として具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mMＨＥＰＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100μg/mlサケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、50℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。、別の言い方をすれば、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが特異的にハイブリダイズする条件が挙げられる。すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または２７に記載の塩基配列との相同性が、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であるＤＮＡは本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡに含まれる。
＜シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼを用いたシロ−イノシトールの製造方法＞
本発明はさらに、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼと、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼとを共存させた溶液中で、NAＤＨまたはNADPＨ存在下で、（図1を参照）、安価なミオ−イノシトールを基質として、シロ−イノソースを経由して、シロ−イノシトールへ酵素変換反応させることを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法に関する。
当該製造方法で使用するシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、上述した酵素の精製によって製造した酵素であってもよく、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを用いた遺伝子操作によって製造したリコンビナント酵素でもよい。
シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡは、例えば、微生物から抽出した全ゲノムを鋳型にして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または２７などの塩基配列を有するＤＮＡをポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）によって増幅することにより単離できる。
また、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡは、その相同性から検索されるホモログＤＮＡを単離することによっても得ることが可能である。ここで、ydgJ遺伝子と称される一連の相同性の高い遺伝子は、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡである可能性が高い。
このようにして得たＤＮＡをプラスミドベクターに組み込む。この際に使用するプラスミドは、好ましくは、マルチクローニングサイトを有する発現プラスミドベクターが使用されるが、酵素を発現させることが可能であり、かつ、適当な制限酵素サイトを有する他のプラスミドベクターであっても使用できる。あらかじめ断片の末端に、適切な制限酵素サイトを設定しておき、これをプラスミドベクター上にある同じ制限酵素サイトへ、ライゲートさせることによって、プラスミドを構築できる。
また、プラスミドに組み込まれたＤＮＡを発現させるために使用されるプロモーターは、宿主微生物中で、ＤＮＡが発現すれば、特に限定されない。例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが使用できる。
このように調製された組換えプラスミドベクターは、宿主微生物に導入することが可能である。この際用いられる宿主微生物としては、組換えプラスミドベクターが、安定でかつ自律的に増殖可能であるものであれば特に制限されず、通常の遺伝子組換えに用いられているもの、例えばエッシェリヒア属、バチルス属に属する微生物などが好ましく使用され、更に好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が使用できる。
宿主微生物に組換えプラスミドベクターを導入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で、組換えＤＮＡの導入を行ってもよいし、コンピテントセル法を用いてもよい、またバチルス属に属する微生物の場合には、コンピテントセル、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法またはマイクロインジェクション法を用いることが可能である。宿主微生物への所望組換えＤＮＡ導入の有無の選択については、組換えプラスミドベクターを構成するベクターの薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で、当該宿主微生物を培養し、生育する宿主微生物を選択すればよい。
次に、酵素を発現誘導するために使用される培地は、宿主微生物が安定して増殖する培地であれば、特に限定されない。例えば、Nutrient Broth、L-Broth、などを例示することができる。また、プラスミドベクターの種類によっては、培地中にＤＮＡを発現させるためにイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のようなインデューサーを加えてもよいし、培養途中にインデューサーを加えても良い。
このように調製されたＤＮＡをもつ組換えプラスミドベクターを導入した宿主微生物を培養し、本発明ＤＮＡを発現させる。発現した本発明酵素を有する微生物は、遠心分離され、培地を除去し、さらに、ペレットとなった微生物を水で洗浄後、遠心分離し、洗浄菌体を得ることができる。この洗浄菌体を水、または適当な溶液に懸濁させ、超音波によって菌を破砕する。破砕後、遠心分離し、上清の本発明ＤＮＡ由来のリコンビナント酵素を含有する溶液を得る事ができる。
リコンビナント酵素を発現した菌体は、洗浄後に、そのまま反応溶液に加えて、菌体懸濁液として反応させることもできるが、好ましくは、菌体を破砕し、菌体内に存在する酵素を抽出した溶液を用いることが好ましい。また、この抽出液を精製して使用することもできる。精製としては硫安分画処理、または、イオン交換樹脂に吸着後、塩濃度による直線濃度勾配を利用したカラムクロマトグラフィー、温度処理などによって、精製することができる。さらに、本酵素は固定化酵素もしくは固定化菌体としても使用可能である。固定化法としては、ゲル抱埋法、イオン交換樹脂吸着法など、一般の固定化方法が適用できる。
一方、当該方法で使用するミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼは、NAD+またはNADP+存在下で、ミオ−イノシトールを酸化し、シロ−イノソースを生成する酵素を用いることが好ましい。
この製造方法では既知のNAD+またはNADP+依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼを使用することができる。例えば、市販の酵素、バチルス ズブチリス、バチルス ハロヂュランスなどの培養菌体から精製することによって製造した酵素、または、遺伝子配列が既知であることから、遺伝子操作によって発現させたリコンビナント酵素を使用してもよい。
既知のミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列としては、例えば、NCBI(National Center for Biotechnology Information）のプロテインデータベースにアクセション番号2636516、17982589、23464076、10174936、17742455、50120397、28853468、または13422633で登録されており、これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列情報も上記アクセション番号のＣＤＳを参照することにより得ることができる。
リコンビナント酵素を発現した菌体は、洗浄後に、そのまま反応溶液に加えて、菌体懸濁液として反応させることもできるが、好ましくは、菌体を破砕し、菌体内に存在する酵素を抽出した溶液を用いることが好ましい。また、本抽出液を精製して使用することもできる。精製としては硫安分画処理、または、イオン交換樹脂に吸着後、塩濃度による直線濃度勾配を利用したカラムクロマトグラフィー、温度処理などによって、精製することができる。さらに、本酵素は固定化酵素もしくは固定化菌体としても使用可能である。固定化法としては、ゲル抱埋法、イオン交換樹脂吸着法など、一般の固定化方法が適用できる。
リコンビナント酵素を使用する場合、遺伝子操作により、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼと、本発明酵素を両方同時に発現させることも可能であり、そのようにして発現し調製された酵素液等を使用することもできる。
本反応系でのミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼと、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの活性量（U）の比率は、ユニット数で定義すると、36℃において、基質をシロ−イノソースとした時、1min間に1μmolのNADHまたはNADPHが消費されるのを1Uとした場合、両方の活性量（U）の比率が、1：10〜10：1、好ましくは1：2〜2：1になるようにするのが望ましい。
本反応系では、補酵素NAD+またはNADP+が必要であり、反応液中でNADHまたはNADPHに変換され、且つ、NADHまたはNADPHはNAD+またはNADP+に戻るため、リサイクルされることがわかる。NAD+またはNADP+とNADHまたはNADPHは、溶液中のｐH安定性が異なり、NAD+またはNADP+はpH8.0以下で安定であり、NADHまたはNADPHはpH8.0以上で安定である。従って、本反応系のpHは約ｐH8.0に保つことが好ましい。
本酵素反応に使用する補酵素は、ＮＡＤ+、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤＰＨの何れか１つ又は、これらの混合物としても利用することができるが、安定性を考慮すると、ＮＡＤ+または、ＮＡＤＰ+が望ましく、その濃度は、0.0001〜0.1%、好ましくは0.004〜0.01%添加することが望ましい。
加えて、本反応系の中間体であるシロ−イノソースを反応溶液に添加することにより、本反応の反応速度は著しく増大する。従って、シロ−イノソースを0.01〜3％、好ましくは0.2〜0.5％になるように反応溶液に添加するのが望ましい。
また、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼとシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、pH8.0において反応させることができるため、酵素反応の溶液のｐＨは、ｐＨ6.0〜8.5の範囲に調整して反応させるが、NAD+またはNADP+の安定性、シロ−イノソースの安定性を考慮して、好ましくはｐＨ7.7〜8.3、さらに好ましくは、ｐＨ8.0が望ましい。また、反応中に、このｐＨを反応中に保つために、必要があれば、緩衝液を加えることもできる。加える緩衝液の種類は特に限定されないが、ｐＨ8.0付近で緩衝能力のある緩衝液が望ましく、さらに好ましくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などが例示される。
さらに、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼは、Mg2+イオンで活性化され、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、Co2+イオンで活性化されることから、これらの金属イオンを添加することで、反応速度は増大する。従って、Co塩および／または、Mg塩を0.01〜5.0mM、好ましくは0.2〜2.0mMになるように反応溶液に添加するのが望ましい。使用されるCo塩、Mg塩は水に溶解する塩であれば使用することができ、塩酸塩、硫酸塩などが例示される。
本発明に使用する基質であるミオ−イノシトールの反応溶液中の濃度は１〜30％、好ましくは5〜22％で使用するのが望ましい。反応が進行すると、1.6％を超える過飽和のシロ−イノシトールは結晶として析出するため、ミオ−イノシトールは減少する。そのため、減少したミオ−イノシトール量を反応溶液に添加して、ミオ−イノシトール濃度を一定に維持し、反応を連続的に行なうこともできる。
反応温度は、反応が進行すれば、特に限定されないが、基質の溶解度、NAD+またはNADP+の安定性、酵素の耐熱性を考慮すると、20〜50℃、好ましくは35〜40℃で反応させることが望ましい。菌体を懸濁する方法であれば、不均一反応の為に、攪拌を必要とするが、抽出酵素を使用する場合は、均一溶液なので、攪拌する必要は無いが、温度を均一化するため攪拌することが望ましい。
酵素反応は反応物であるシロ−イノシトールが溶解度以上になれば、結晶性シロ−イノシトールとして沈殿させることができるため、ろ過、デカンテーション等の固液分離を用いれば、反応を停止させる必要は無く、ろ過液などの溶液に再度ミオ−イノシトールを添加して反応を続けることができる。
酵素反応の停止が必要な場合は、酵素反応自体が停止すればよく、加熱、ｐＨの変化、タンパク質変性剤の添加などの方法が使用できる。しかしながら、次工程のシロ−イノシトールの精製を考慮すると、加熱が望ましい。例えば、反応溶液を70〜120℃、好ましくは80〜90℃で10〜20分間加熱するなどが例示できる。
また、酵素反応の停止は、酵素を回収して、反応を停止させることもできる。酵素回収はイオン交換樹脂カラムに反応溶液を通過させることにより酵素を回収することができる。固定化された酵素を使用した場合は、反応溶液を遠心分離、あるいはろ過操作することによって、固定化酵素を回収することができる。
反応停止後、または反応中に過飽和になったシロ−イノシトールは結晶として析出する。結晶性シロ−イノシトールは、ろ別、または遠心分離などの操作で単離することができる。さらに、菌体、不溶性変成タンパクと共存する場合は、水を加えて結晶性シロ−イノシトールを溶解後に、ろ別、または遠心分離などの操作を加えることで、菌体、不溶性変成タンパクを除去することができる。
このようにして得られた結晶性シロ−イノシトールの精製方法は以下の様にして行なうことができる。この段階で留意する点は、結晶性シロ−イノシトール中に含まれる、ネオ−イノシトールの除去である。ネオ−イノシトールは、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼが、一部のミオ−イノシトールの５位を酸化することによって生じるネオ−イノソースが、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼによって、還元されて生じた物質で、本反応系で微量に生じる物質である。また、ネオ−イノシトールは、水溶解度が0.5％と、低く、シロ−イノシトールと共に結晶性の沈殿を起こしやすい物質である。
しかし、この結晶性シロ−イノシトールを再度水に溶解して得られるシロ−イノシトール溶液は、ミオ−イノシトールを殆ど含んでおらず、再濃縮した時に生じる結晶性シロ−イノシトールをろ別、または遠心分離などの操作で単離する操作で、微量のネオ−イノシトールを含有するシロ−イノシトールを得る事ができる。また、より高度に精製する場合、脱塩カラム、活性炭カラムを通過させて、精製後、液体を濃縮することで、再び結晶化してくる再結晶シロ−イノシトールをろ別、または遠心分離などの操作で単離することで、ネオ−イノシトールを含まない純品シロ−イノシトールを得る事ができる。
脱塩カラムは、イオン交換樹脂を用いたカラムが望ましい。この際に使用されるイオン交換樹脂は、強塩基性イオン交換樹脂、および、弱塩基性イオン交換樹脂の何れか1つ、もしくは、両方の混合物と、強酸性イオン交換樹脂、及び弱酸性イオン交換樹脂の何れか1つ、もしくは、両方の混合物が使用できる。イオン交換樹脂の作用のさせ方は、カラム状に詰めたイオン交換樹脂中に溶液を通す方法が最適であるが、バッチ式で攪拌混合し、ろ過することで脱塩することも可能である。
活性炭カラムは、脱色を目的とし、溶液をカラム状に詰めた活性炭中に溶液を通す方法も使用できるが、バッチ式で攪拌混合し、ろ過することで脱色することも可能である。
次に、酵素反応停止後、反応溶液中に溶解している溶解性シロ−イノシトールの精製方法は以下の様にして行なうことができる。この段階で留意する点は、結晶性シロ−イノシトールと異なり、ミオ−イノシトール、とネオ−イノシトールの除去である。
溶解性シロ−イノシトールは、原料のミオ−イノシトール、およびネオ−イノシトールと一緒に溶解しており、ろ別、または遠心分離などの操作で溶液として、取り出すことができる。これらの溶液は、他に、溶解性ペプチド、塩を含んでいるため、脱塩カラム、活性炭カラムを通過させて、精製後、ミオ−イノシトールが析出しない程度（ミオ−イノシトールが21％以上にならないよう）に濃縮し、析出してくる結晶性シロ−イノシトールをろ別、または遠心分離などの操作で単離することができる。必要があれば、水と混和する有機溶媒を加えて、結晶化させることも可能である。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどが挙げられる。
また、後述するように、得られたシロ−イノシトールを含む溶液に、ホウ酸と、NaClを加えて、シロ−イノシトールホウ酸複合体を作り、これをろ別後に、酸によりホウ酸を遊離させ、メタノールのような有機溶媒を加えることで結晶化させる方法によって、シロ−イノシトールを分離精製してもよい。
４．シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液からシロ−イノシトールを製造する方法
本発明はさらに、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液からシロ−イノシトールを製造する方法に関する。
＜４−１＞
当該方法の一形態は、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液に、該混合液中に溶解したシロ−イノシトールの２倍モル以上の量のホウ酸及び金属塩を加え、かつ該混合液のｐＨを8.0〜11.0に調整してシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させる第１の工程、前記複合体を混合液から分離する第２の工程、分離した複合体を酸に溶解させてシロ−イノシトールとホウ酸に開裂させる第３の工程、第３の工程で得られた酸性溶液又は酸性懸濁液からシロ−イノシトールを単離精製する第４の工程を含む、精製されたシロ−イノシトールの製造方法である。
この製造方法の第１の工程は、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液に、該混合液中に溶解したシロ−イノシトールの２倍モル以上の量のホウ酸及び金属塩を加え、かつ該混合液のｐＨを8.0〜11.0に調整してシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させる工程である。
ここで用いる「シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液」は溶液であっても懸濁液であってもよい。さらに、「シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖」以外の物質を含むものであってもよく、予め少量のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を含むものであってもよい。混合液中に含まれる中性糖としては、４炭糖、5炭糖、6炭糖、7炭糖の中性糖が好ましく、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトースなどのアルドース、ケトース、イノシトールの各種異性体、及びグリセロール、エチレングリコールなどの多価アルコール類を挙げることができる。ここで、イノシトールの異性体としては、例えばミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、エピ−イノシトール、ムコ−イノシトール、アロ−イノシトール、シス−イノシトール、ネオ−イノシトールを挙げることができる。
これらのうち、ミオ−イノシトールを特に好適に使用することができ、この場合の「シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液」としては、例えば、以下に示すようにしてシロ−イノソースを還元した場合に生じる、シロ−イノシトールとミオ−イノシトールを含む混合液を挙げることができる。
還元反応に用いるシロ−イノソースは、例えば、培地や溶液中で微生物を用いてミオ−イノシトールを酸化することによって得られるもの（特開2003-102492号公報）を使用することができる。微生物酸化によって得られるシロ−イノソースは、精製した後に溶解して用いてもよいが、培養ろ液を用いてもよい。また、白金触媒でミオ−イノシトールを酸化して調製したシロ−イノソースを使用することもできる。
シロ−イノソースをシロ−イノシトールに還元するために用いる還元剤は、水系中でシロ−イノソースをシロ−イノシトールに還元することのできる還元剤であれば特に限定されないが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウムを例示することができる。
シロ−イノソースの還元反応は、例えば、20％（ｗ／ｖ）以下の含量でシロ−イノソースを溶解した溶液に、還元剤を粉末または水溶液として添加することによって行うことができる。この際に溶液を攪拌することが好ましい。また、還元反応により反応熱が発生することがあるが、生成したイノソースの分解を押さえるために、反応液を５０℃以下になるように制御するのが望ましい。さらに、水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を使用する場合には、還元剤の一部が分解して水素ガスが発生することがあるが、水素ガスの発泡を押さえるために消泡剤などを添加しておくことが好ましい。
シロ−イノソースの還元によって得られるシロ−イノシトールとミオ−イノシトールの混合液中において、シロ−イノシトールは、濃度が約1.6％（ｗ／ｖ）を超えると、徐々に結晶化を始める。通常、5％（ｗ／ｖ）のシロ−イノソース水溶液の還元により、約3％（ｗ／ｖ）ミオ−イノシトール、及び約2％（ｗ／ｖ）シロ−イノシトールが生じるが、室温で数時間放置すると、シロ−イノシトールの過飽和部分の約0.4％（ｗ／ｖ）が結晶化を始める。そのため、シロ−イノソースの還元によって得られるシロ−イノシトールとミオ−イノシトールの混合液を用いる場合は、このシロ−イノシトール自体の結晶が出る前に、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させる工程を行う方が好ましい。シロ−イノソースの還元反応後、直ぐにシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させる工程を行うことがより好ましい。
第１の工程では、上記のような「シロ−イノシトールとミオ−イノシトールを含む混合液」などの「シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液」に、ホウ酸及び金属塩を、それぞれ、混合液中に溶解しているシロ−イノシトールの２倍モル以上、好ましくは２倍モル以上、かつ３倍モル以下の量で加えて、溶解させた後、混合液のｐHをｐＨ8.0〜11.0、好ましくはｐH9.0〜10.0のアルカリ性に調整することによって行う。なお、ここで２倍モルとは２倍のモル数をいう。反応液のｐHはNaOH、KOH、Na2CO3、K2CO3などの塩基で調整することができる。
ここで、添加する金属塩は、例えばNaCl、NaHCO3、Na2CO3、Na2SO4、NaHSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、硼砂、KCl、KHCO3、K2CO3、K2SO4、KHSO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4、MgCl2、MgCO3、およびMgSO4からなる群より選ばれる、１種または２種類以上の金属塩を使用することができる。また、添加するホウ酸の量は、混合液中に既にホウ酸が含まれている場合は、その量と合わせて、溶解シロ−イノシトールの量の２倍以上のモル数、好ましくは２倍以上、かつ３倍以下のモル数になるような量にする。
第1の工程は、ホウ酸や金属塩を混合液中に効率よく溶解させるため、及びｐH調整時に溶液を均一にするために、攪拌しながら行うことが好ましい。この工程は、５℃〜８５℃、好ましくは１５〜４０℃の範囲の温度で行なうのが望ましい。この工程に要する時間は、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体が必要量得られる限り特に限定されないが、90％以上の回収率を得るためには、12〜76時間が好ましい。
シロ−イノシトール・ホウ酸複合体は、NMRで確認した水への溶解度が0.01％（ｗ／ｖ）以下であるため、混合液中では大部分が沈殿として存在する。第２の工程では、このシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を混合液から分離する。この工程では、通常の固液分離操作が適用でき、例えば、ろ過操作、遠心分離操作などが適用しうる。なお、この工程によってシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を分離した後の混合液中に残留するシロ−イノシトールは、0.2%（ｗ／ｖ）以下の濃度であるため、反応開始前の混合液中に含有されていたシロ−イノシトールの大部分をシロ−イノシトール・ホウ酸複合体の形で回収できることになる。一方、ミオ−イノシトール等の中性糖は溶液中に溶解した状態で存在するため、ろ過操作ではろ液に存在し、この工程によって中性糖とシロ−イノシトールを分離することができることになる。
分離されたシロ−イノシトール・ホウ酸複合体は乾燥させ、粉末として単離することができる。また、必要があれば、熱水から再結晶することにより、結晶として単離することもできる。
次に、第３の工程では、分離されたシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を酸に溶解する。この溶解により、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体は、シロ−イノシトールとホウ酸に開裂し、さらに複合体に結合していた金属イオンも溶液中に解離する。この工程で、溶解に用いる酸の種類としては、複合体を溶解することができる限り特に限定されないが、金属イオンの種類によって、溶解度積の低い塩を形成しないものが望ましい。好ましくは塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの鉱酸を用いることができ、より好ましくは塩酸を用いることができる。これらの酸は、溶解によって生じる金属イオンと中和反応を起こすため、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体を溶解した溶液が、最終的に0.1規定以上の酸性溶液となるように調整することが好ましい。また、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体を効率よく溶解させるためには、１規定以上の酸で複合体を溶解し、最終的に0.1規定以上の酸性溶液にすることが好ましい。
第４の工程では、第３の工程で得られた酸性溶液又は酸性懸濁液からシロ−イノシトールを単離精製する。酸性溶液からシロ−イノシトールを単離精製する方法は、特に限定されないが、例えば後述するようなイオン交換樹脂等の樹脂を用いる方法、有機溶媒への溶解度差を利用する方法などを用いることができる。
また、ホウ酸を遊離させた後、低級アルコールを加え、低級アルコールとホウ酸のエステルとして、減圧留去する方法（Journal of Organic Chemistry、23巻、p.329〜330、1958年）を用いてもよい。
これらの方法のうち、イオン交換樹脂を用いたシロ−イノシトールの単離精製方法は以下のようにして行うことができる。この場合、第３の工程で得られた液体は複合体が完全に溶解した０．１規定以上の酸性溶液であることが好ましい。また、この酸性溶液は、遊離したシロ−イノシトールが析出しない様にするため、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体の割合が2.5（ｗ／ｖ）％以下になるような容量で酸を加えて調製されたものであることが好ましい。
このような酸性溶液を、まず、金属イオンを除去するために強酸性イオン交換樹脂と接触させる。用いる強酸性イオン交換樹脂は、金属イオンを吸着するものであれば特に限定されないが、例えば、硫酸基を有するイオン交換樹脂を挙げることができる。例えば、DuoliteC20・H+タイプ（住友化学）などを挙げることができる。接触の仕方は、バッチ的に、一定量の溶液に強酸性イオン交換樹脂を加えて攪拌する操作によって行なっても良いが、カラム状に詰めた強酸性イオン交換樹脂に溶液を通過させて行なう方が望ましい。
強酸性イオン交換樹脂により金属イオンが除去された溶液は、次に、ホウ酸を除去するため、強塩基性イオン交換樹脂または、ホウ酸吸着樹脂と接触させる。これらの樹脂は、ホウ酸を吸着するものである特に限定されないが、例えば、強塩基性イオン交換樹脂としては４級アンモニウム基を有するものが挙げられ、ホウ酸吸着樹脂としてはN−メチルグルカミン基を有するものなどが挙げられる。具体的には、強塩基性イオン交換樹脂としてDuoliteＡ116・ＯH-タイプ（住友化学）などを挙げることができる。また、ホウ酸吸着樹脂として具体的には、Duolite ES371N（住友化学）などを挙げることができる。接触の仕方は、バッチ的に、一定量の溶液にイオン交換樹脂を加えて攪拌する操作によって行なっても良いが、カラム状に詰めたイオン交換樹脂に溶液を加えて行なった方が望ましい。
樹脂に接触させる順番は、ホウ酸とシロ−イノシトールが、酸性状態で解離しているため、順不同ではなく、始めに、強酸性イオン交換樹脂、次に、強塩基性イオン交換樹脂またはホウ酸吸着樹脂の順序で接触させる。
これらの樹脂に接触させて、金属イオン及びホウ酸が除去された溶液には、中性糖であるシロ−イノシトールのみが含まれる。したがって、この溶液を常法によって濃縮してシロ−イノシトールを析出させることによって、精製されたシロ−イノシトールを結晶または粉末として単離できる。
また、第４の工程において、有機溶媒への溶解度差を利用してシロ−イノシトールを単離精製する場合は、以下のようにして行うことができる。なお、この方法においては、溶解後、有機溶媒添加までの間にイオン交換樹脂等による精製操作を行わないため、第3の工程の酸による溶解によって得られる液体は、溶解液であってもよいが、懸濁液であってもよい。また、第３の工程では、溶解後にシロ−イノシトールが析出しやすくするため、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体の割合が2.5％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは3.0％〜10％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、4.0％〜6.0％（ｗ／ｖ）になるような容量で酸を加えることが望ましい。
まず、遊離したシロ−イノシトールを析出させるため、得られた酸性溶液または懸濁液に水溶性有機溶媒を加える。使用される有機溶媒は、ホウ酸が溶解し、酸と塩を形成した金属塩が溶解した状態でシロ−イノシトールを析出させることのできるものであれば特に限定されないが、例えば、エタノール、メタノールが挙げられる。
有機溶媒の量は、例えば、エタノールを用いる場合、酸性溶液に対して、0.3〜3倍容のエタノールを加えることが好ましく、0.6〜1.5倍容のエタノールを加えることがより好ましい。メタノールを用いる場合、酸性溶液に対して、0.3〜5倍容のメタノールを加えることが好ましく、0.9〜2倍容のメタノールを加えることがより好ましい。特にシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させる時に使用した金属塩が、NaCl、NaHCO3、Na2CO3の内の、いずれか一つ、または、２種類以上である場合においては、これらの容量で有機溶媒を加えることが有効である。さらに、水溶性有機溶媒を加えた後の混合液が、0.1規定以上の酸性溶液になるように調整することが好ましい。
第４の工程において、混合系が、均一溶液の場合は、必ずしも攪拌しなくてもよいが、懸濁液の場合は攪拌したほうが好ましい。また、混合する温度は、シロ−イノシトールのみが析出する温度であれば、特に限定されないが、好ましくは−10℃〜50℃、より好ましくは4℃〜35℃とする。混合する時間は、10分〜24時間が好ましく、3〜5時間がより好ましい。
この様な操作によってシロ−イノシトールのみを析出させることができる。析出したシロ−イノシトールを、ろ過または、遠心分離などの通常の固液分離操作によって、溶液から分離することができる。得られたシロ−イノシトールは純粋なものであるが、必要があれば、再結晶などの方法によって、結晶として得ることもできる。より純度を上げるために、析出したシロ−イノシトールを水に溶解した後、イオン交換樹脂等によってさらに精製してもよい。
＜４−２＞シロ−イノソースからシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を経ずにシロ−イノシトールを製造する方法
次に、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液からシロ−イノシトールを製造する方法のもう一つの形態について説明する。
この方法は、シロ−イノソースを含有する溶液中において、シロ−イノソースを水素化ホウ素金属塩を用いて還元し、ミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液を得る第1の工程、前記混合液に酸を加えて混合液中のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を溶解させ、かつ溶液を0.01規定以上の酸性溶液に調整する第２の工程、及び前記酸性溶液に、水溶性有機溶媒をミオ−イノシトールが析出しない量で加えて、シロ−イノシトールのみを析出させる第３の工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法である。
シロ−イノソースを含有する溶液において、シロ−イノソースを水素化ホウ素金属を用いて還元した場合、溶液中には、還元されて生じたシロ−イノシトールとミオ−イノシトールの他、ホウ酸、および金属イオンが存在するために、シロ−イノシトールの一部は、水に不溶のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成し、溶液成分のみからシロ−イノシトールを精製する場合、収率が低下する。第２の発明は、シロ−イノソースの還元によって得られるミオ-イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液において、該混合液中に少量生成するシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を酸に溶解し、得られた酸性溶液からシロ−イノシトールのみを析出させて精製することを目的とする。
第１の工程において、「シロ−イノソースを含有する溶液」は、例えば、培地や溶液中で微生物を用いてミオ−イノシトールを酸化することによって得られる（特開2003-102492号公報）ものを使用することができる。微生物酸化によって得られるシロ−イノソースは、精製した後に溶解して用いてもよいが、培養ろ液を用いてもよい。「シロ−イノソースを含有する溶液」は、この培養ろ液のようにシロ−イノソース以外の物質を含むものであってもよい。また、白金触媒でミオ−イノシトールを酸化して調製したシロ−イノソースを溶解して使用することもできる。
還元に用いる水素化ホウ素金属は、水系中でシロ−イノソースをシロ−イノシトールに還元でき、かつ、ホウ素を遊離することのできる還元剤であれば特に限定されないが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウムを例示することができる。
シロ−イノソースの還元反応は、例えば、20％（ｗ／ｖ）以下の含量でシロ−イノソースを溶解した溶液に、還元剤を粉末または、水溶液として添加することで行うことができる。この際に溶液を攪拌することが好ましい。また、還元反応により反応熱が発生することがあるが、生成したイノソースの分解を押さえるために、反応液を５０℃以下になるように制御するのが望ましい。さらに、還元剤の一部が分解して水素ガスが発生することがあるが、水素ガスの発泡を押さえるために消泡剤などを添加しておくことが好ましい。
このようにして、シロ−イノソースは、シロ−イノシトールとミオ−イノシトールに還元され、溶液中にはシロ−イノシトールとミオ−イノシトールが混合状態で存在する。この時、シロ−イノシトールは、濃度が約1.6％（ｗ／ｖ）を超えると、徐々に結晶化を始める。通常、5％（ｗ／ｖ）のシロ−イノソース水溶液の還元により、約3％（ｗ／ｖ）ミオ−イノシトール、約2％（ｗ／ｖ）シロ−イノシトールが生じるが、室温で数時間放置すると、シロ−イノシトールの過飽和部分の約0.4％（ｗ／ｖ）が結晶化を始める。さらに、シロ−イノソースの還元により得られたシロ−イノシトールとミオ−イノシトールとの混合液には、ホウ酸が含まれるために、シロ−イノシトールの一部が、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成し始める。第２の発明の製造方法においては、第1の工程の後、直ぐに第2の工程を行ってもよいが、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体は酸処理によって溶解するため、第1の工程の後、しばらく放置した後に第2の工程を行ってもよい。
第２の工程は、第１の工程によって得られた「ミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液」に酸を加えて、混合液中のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を溶解し、溶液を0.01規定以上の酸性溶液に調整する。この時、使用される酸は塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの鉱酸を使用することができるが、好ましくは塩酸または硫酸が使用される。
第３の工程では、第２の工程で得られる酸性溶液に、ミオ−イノシトールを析出させず、シロ−イノシトールのみを析出させる量の水溶性有機溶媒を加える。この時使用される水溶性有機溶媒は、シロ−イノシトールを析出させ、ミオ−イノシトールを溶解させた状態を満足するものであれば特に限定されないが、エタノールまたはメタノールまたは１−プロパノールが望ましい。
ミオ−イノシトールを析出させず、シロ−イノシトールのみを析出させる量とは、例えば、酸性溶液に対して、エタノールの場合0.2〜0.4倍容、メタノールの場合0.2〜0.8倍容、１−プロパノールの場合0.2〜0.4倍容であり、好ましくは、酸性溶液に対して、エタノールの場合0.35〜0.45倍容、メタノールの場合0.45〜0.55倍容、１−プロパノールの場合0.35〜0.45倍容である。
水溶性有機溶媒を混合する際には、混合系が、均一溶液の場合は、必ずしも攪拌する必要は無いが、懸濁液の場合攪拌することが好ましい。混合する際の温度は、シロ−イノシトールのみが析出する温度であれば、特に限定されないが、好ましくは−10℃〜50℃、より好ましくは4℃〜35℃である。混合する時間は、好ましくは15〜76時間、より好ましくは、20時間〜24時間である。
このような条件で水性有機溶媒を混合する場合、シロ−イノシトールのみが析出する。析出したシロ−イノシトールを、ろ過または、遠心分離などの通常の固液分離操作によって、固体として取り出すことができる。この固体は、ほぼ純粋なシロ−イノシトールのみからなるが、必要があれば、再結晶などの方法によって、結晶として得ることもできる。より純度を上げるために、析出したシロ−イノシトールを水に溶解した後、イオン交換樹脂等によってさらに精製してもよい。
［実施例］
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
＜シロ−イノシトールの製造方法（小スケール）＞
ミオ−イノシトール 10.0%、酵母エキス 1.0%、シュークロース1.0%を含む液体培地3リットルを、1N NaOHを用いてｐH7.0に調製し、100mlずつ500ml容のバッフル付き三角フラスコ30本に分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにアセトバクター・エスピーAB10281株（FERM BP-10119）のスラント培養物を１白金耳接種し、27℃で5日間ロータリーシェーカーで培養した。培養後、各々の三角フラスコに、水を250mlづつ加え、1時間ロータリーシェーカーで攪拌し、培養液に存在する結晶性のシロ−イノシトールを溶解した。この培養液を集めて、遠心分離（8,000 rpm 20分間）し、上清を培養上清液(10.2L)とした。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはシロ−イノシトールが12.6mg/ml (129g、変換率43％)生成していることがわかった。この時の培養上清液中には、シロ−イノソースが2.1mg/ml残存し、ミオ−イノシトールは検出されなかった。
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム：Wakosil 5NH2 （4.6 × 250 mm）
カラム温度 ： 40℃
検出器 ： RI DETECTER ERC-7515A (ERMA CR.INC.)
注入量 ： 5μｌ
溶媒 ： アセトニトリル−水= 4 : 1
流量 ： 2 ml/min
溶出時間 ： シロ−イノソース ； 11.6分
ミオ−イノシトール； 17.8分
シロ−イノシトール； 18.2分
なお、上記のシロ−イノシトールの変換率は、次式により求めた。
Figure 2005035774
次に、培養上清液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)C-20（H+型）（住友化学社製）500mlを充填したカラム(内径5cm、長さ40cm)と活性炭200mlを充填したカラム（内径5cm、長さ16cm）を連結したカラムに通過させ、その後、このカラムに500mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)A116（OH-型）（住友化学社製）1000mlを充填したカラム(内径7cm、長さ40cm)に通過させ、その後このカラムに1000mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。こうして得られた通過液及び水洗浄液中には上記シロ−イノシトール以外の不純物はほとんど存在していなかった。
上記により得た水溶液を減圧下で約700mlまで濃縮し、エタノールを3倍量加え5℃で一晩放置したところ、純粋なシロ−イノシトールの無色結晶をろ過し、乾燥させ、118g得た。この時の精製回収収率は92%で、ミオ−イノシトールからのシロ−イノシトールの全回収率は39％であった。
＜シロ−イノシトールの製造方法（大スケール）＞
ミオ−イノシトール 10.0%、酵母エキス 1.0%、シュークロース1.0%を含む液体培地４０リットルを50L容ジャーファメンターに導入し、1N NaOHを用いてｐH7.0に調製し、オートクレーブ滅菌した。同一組成の培地（三角フラスコ）で培養したアセトバクター・エスピーAB10281株（FERM BP-10119）を400ml接種し、27℃で5日間、通気量１vvm、回転数200rpmで培養した。培養後、取り出された培養液約40Lに、約50℃の温水を60L加え、1時間攪拌し、培養液に存在する結晶性のシロ−イノシトールを溶解した。この培養液を連続遠心分離（8,000 rpm）し、菌体を除去した液を培養除菌液(約100L)とした。
この培養除菌液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養除菌液中にはシロ−イノシトールが16.8 mg/ml (1.68ｋg、変換率42％)生成していることがわかった。この時の培養除菌液中には、シロ−イノソースが2.9mg/ml残存し、ミオ−イノシトールは検出されなかった。なお、高速液体クロマトグラフィーの分析条件は実施例1と同様である。
次に、得られた100Lの溶液に、水酸化ナトリウム400gを加えて、攪拌下で加熱し、98℃、1時間処理を行なった。次に液体が熱いうちに、水酸化ナトリウム560g、ホウ酸1340ｇ、NaCl 1260ｇを加えて、溶解させた。攪拌を止めて、この溶液を放熱させ、23℃になるまで放置した（約24時間）。
次に、液体中に形成したシロ−イノシトールホウ酸複合体の結晶を単離するために、この溶液をろ過し、結晶を水で白色になるまで、洗浄した。得られた結晶（約3.9kg）は、別の容器に取りだし、これに水5.9L、37％塩酸1.95Lを加え、攪拌した。30分後、この操作で、ホウ酸を遊離したシロ−イノシトールをさらに沈殿させるため、メタノールを9.4L加え、さらに、1時間攪拌した。
次に、液体中に結晶化したシロ−イノシトールを単離するために、この溶液をろ過し、結晶を50％メタノール1Lで洗浄した。得られた微粉の結晶（約1.8kg）は、別の容器に取りだし、これに水10Lを加え、攪拌しながら、温度をかけて、1時間煮沸した。その後、この溶液を攪拌しながら冷却し、20℃になった段階で、ろ過して、シロ−イノシトール微結晶を得た。乾燥後、純粋なシロ−イノシトールの無色結晶を1.35ｋg得た。この時の精製回収収率は80%で、ミオ−イノシトールからのシロ−イノシトールの全回収率は34％であった。
＜シロ−イノシトール生成菌の16SrRNA塩基配列による同定＞
ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する3つの自然分離菌株、AB10285株、AB10286株、AB10287株、および、AB10253株より育種されたAB10281株の計4菌株の16SrRNA塩基配列解析は、常法に従って行なった。すなわち、培養後の菌体からゲノムDNAを抽出後、16SrRNAの約1.6kbpが増幅できる様に設計されたプライマーを用いてPCR法により、相当するDNA断片を調製し、約1.3kbp相当のシークエンスを解析（北海道システムサイエンス社）した。その配列結果を元にデータベースと照合し、近縁種を同定した。
表２に、照合結果、相同性、実施例1と同様に培養した時のシロ−イノシトールへの変換率を示した。
Figure 2005035774
この結果から、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する4種類の菌株は大きく2群に分けることができることが判る。第1群として、AB10281株とAB10285株は、アセトバクター・セルビシエ（Acetobacter cerevisiae）、または、アセトバクター・マローラム（Acetobacter malorum）であると同定され、また、第2群として、AB10286株とAB10287株は、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Burkholderia andropogonis）であると同定された。
＜アセトバクター・エスピーAB10253株からのNAD+非依存のミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼの単離＞
500ml容ワッフル付き三角フラスコに、ミオ−イノシトール3ｇ、酵母エキス（FNI205：Lallemand BI社製）1ｇ、グルコース0.5ｇを加え、100ｍｌになる様に水に溶解し、ｐH5.0に調整し、オートクレーブにより滅菌した培地を４本作製し、これに、アセトバクター・エスピーAB10253株をスラントから、それぞれ１白金耳加えて、２日間、２７℃、ロータリーシェーカーでプレ培養した。
次に、50リットル容ジャーファメンターに、ミオ−イノシトール1.2ｋｇ、酵母エキス（FNI205：Lallemand BI社製）0.4ｋｇ、グルコース0.2ｋｇを加え、40リットルになる様に水に溶解し、ｐH5.0に調整し、オートクレーブにより滅菌した。これにプレ培養したアセトバクター・エスピーAB10253株の菌液約400ｍｌを加えて、３日間、２７℃、通気量1vvm、回転数200rpmで培養した。
培養後、連続遠心機を用いて、菌体を沈殿として得た。得られた菌体は水２リットルに再懸濁し、遠心分離によって、洗浄菌体を得た後に、20mMトリス緩衝液ｐH7.0 ２リットルに懸濁した。次に、この懸濁液に超音波を照射し、菌体を破砕した。菌体破砕液は、破砕した菌体を沈殿させるため、遠心分離を行ない、沈殿物として、破砕菌体を得た。この沈殿物に、20mMトリス緩衝液ｐH7.0、0.6％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Kodak社製）500mlを加えて、懸濁し、3時間、15℃で酵素を抽出した。その後、遠心分離を行ない、上清の粗酵素液420mlを取り出した。
粗酵素液420ｍｌは、限外ろ過装置（MW30000cut off）によって150ｍｌまで濃縮し、この濃縮液を、２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）で平衡化したDEAEトヨパールカラム400mlを通過させ、タンパク質を吸着させた。カラムに吸着させたタンパク質は次に、界面活性剤を含まない２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）に、NaCl 0ｍＭから、500ｍＭの直線濃度勾配をかけた溶液（総量1.6リットル）を1分間に10ｍｌの速度で通過させ、タンパク質を溶出させた。溶出液は40ｍｌずつの画分に分画した。次に、このカラムを、再度、界面活性剤を含まない２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）600ｍｌを通して、洗浄し、次に0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）に、NaCl 0ｍＭから、500ｍＭの直線濃度勾配をかけた溶液（総量1.6リットル）を1分間に10ｍｌの速度で通過させ、タンパク質を溶出させた。溶出液は40ｍｌずつの画分に分画した。
各画分の酵素活性の測定は、標準的な方法として、タンパク溶液50μｌに100ｍMリン酸緩衝液（ｐH5.0）、ミオ−イノシトール5mg、２、４−ジクロロインドフェノール（酸化型DCIP）0.4mgからなる1ｍｌ溶液の600nmの吸収度変化を反応速度に換算して、1分間あたり、1μmolのミオ−イノシトールが酸化される活性を1ユニットとして測定した。
その結果、本酵素は、0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）、NaCl 100〜170mMの溶液画分に溶出することが判った。次に、この画分（240ｍｌ）を集めて、限外ろ過装置（MW30000cut off）によって30ｍｌまで濃縮し、0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）100ｍｌを加えてさらに濃縮し、30ｍｌまで濃縮された溶液に、２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）を70ml加えて、脱塩を行なった。
この様にして調製した酵素液は次に、0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム100ｍｌを通過させ、タンパク質を吸着させた。カラムに吸着させたタンパク質は、次に、0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むトリス緩衝液（ｐH7.0）に、リン酸緩衝液（ｐH7.0）を0ｍＭから、500ｍＭの直線濃度勾配をかけた溶液（総量400ｍｌ）を1分間に3ｍｌの速度で通過させ、タンパク質を溶出させた。溶出液は10ｍｌずつの画分に分画し、各画分の酵素活性を測定した。
その結果、本酵素は、0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）、リン酸緩衝液 100〜170mMの溶液画分に溶出することが判った。この様にして得られた酵素液は、ほぼ、純粋なNAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼを含んでいた。次に、この画分（40ｍｌ）を集めて、限外ろ過装置（MW30000cut off）によって5ｍｌまで濃縮し、２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）100ｍｌを加えてさらに5ｍｌまで濃縮し、脱塩を行なった。
この様にして調製されたこの濃縮液を、再度、0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）で平衡化したDEAEトヨパールカラム（東ソー社製）20mlを通過させ、タンパク質を吸着させた。カラムに吸着させたタンパク質は次に、0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐH7.0）に、NaCl 50ｍＭから、250ｍＭの直線濃度勾配をかけた溶液（総量160ｍｌ）を1分間に1ｍｌの速度で通過させ、タンパク質を溶出させた。溶出液は4ｍｌずつの画分に分画した。分画後、各画分の酵素活性測定と、活性のある各画分のSDS電気泳動を行なった。
その結果、本酵素の酵素活性と相関性のあるタンパク質のバンドがSDS電気泳動から、明らかになった。前後の活性のない画分に由来するタンパク質のバンドを除去すると、本酵素は、少なくとも分子量約76kダルトンと約46ｋダルトンのタンパク質を含有する酵素であることが判明した。
また、酵素の活性のある画分は赤色の色を有し、UVスペクトルパターンからチトクロムＣを含有することが判った。さらに目的タンパク質の含有量と、チトクロムＣの吸光度から本酵素1モルには1モルのチトクロムＣが含有されていることが判明した。
至適ｐHの測定は、酵素活性測定の際、緩衝液及びｐHを変えて測定を行なった。緩衝液は、１００ｍMリン酸緩衝液（ｐＨ３〜８）、１００ｍMトリス緩衝液（ｐH７〜８）及び１００ｍM炭酸緩衝液（ｐH８〜１１）を用いた。その結果、本酵素はｐＨ4.5〜5.5に極大活性を有することが判った。さらに、標準的酵素活性測定（100ｍMリン酸緩衝液（ｐH5.0））の際に、各種重金属イオン（Sn2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Fe、Zn2+、Co2+、Pb2+、Ca2+、Cd2+、Ni2+）を加えて測定したところ、本酵素は、Ｓｎ2+イオンにより特異的に阻害されることが判った。酵素活性は、１ｍMのＳｎ2+イオン存在下において、Ｓｎ2+イオン非存在下の活性の１％以下まで阻害された。
また、本酵素は膜画分から、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によって抽出される酵素であり、抽出酵素は、還元型DCIP存在下に、ミオ−イノシトールを酸化するが、還元型DCIP非存在下では酸素吸収は起きないことを確認した。このことは、生体中で細胞膜電子伝達系と共役し、ミオ−イノシトールから電子を奪いシロ−イノソースを生成することを意味する。
本酵素の基質特異性は、ミオ−イノシトールの代わりに各種糖を最終濃度50mM含む溶液で酵素活性を測定した。また、活性のある糖について、糖の濃度を変えて酵素活性を測定し、Km値を測定した。さらに、酸化反応物をHPLCで分析して、どのような物質が生成するかを測定した。HPLC条件は、カラムにWakosil5NH2カラムφ4.6×250ｍｍ（カラム温度４０℃）、移動相に80％アセトニトリル（流速2ml/min）、検出器にRI検出器を用いて測定した。
結果として、本酵素は、Ｄ−キロ−イノシトール（相対活性１００％：Ｋｍ＝8.8mM）、ムコ−イノシトール（相対活性６８％：Km=14.5mM）、ミオ−イノシトール（相対活性５３％：Km=20mM）に反応し、Ｄ−キロ−1−イノソース、Ｌ−キロ−２−イノソース、シロ−イノソースへ、それぞれ、変換する。アロ−イノシトール、シロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、グルコースには反応しないことが判った。
＜NAD+非依存のミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼによるミオ−イノシトールのシロ−イノソースへの変換＞
実施例４と同様にして、40Lジャーファメンターから精製を行ない、途中のヒドロキシアパタイトカラム100ｍｌにより精製、脱塩を行なった５ｍｌの酵素溶液を、酵素液として、以下の変換反応を行なった。
400ml容の遠心チューブに、ミオ−イノシトール30ｇ（166.7mmol）、1Mリン酸緩衝液（ｐH5.0）15ｍｌを加えて３００ｍｌに水で希釈して、ミオ−イノシトールを溶解させた。これに、３０℃で、酵素液１ｍｌを加えて攪拌しながら、還元型ＤＣＩＰ（Ｎａ塩）8ｇを徐々に加えた。還元型ＤＣＩＰに由来する青色が消失した後、青色の消失と共に生じる白色の不溶物（酸化型ＤＣＩＰ）を遠心分離で沈殿させ、上清を新たな400ml容の遠心チューブに移しかえた。さらに本溶液を1規定リン酸によりｐＨを5.0に調製し、攪拌しながら、さらに還元型ＤＣＩＰ（Ｎａ塩）を8ｇずつ加えた。この操作を、６回繰返し、合計48ｇの還元型ＤＣＩＰ（Ｎａ塩）加え、青色が消失した段階で、最後に3ｇの還元型ＤＣＩＰ（Ｎａ塩）を加え、1時間放置後、遠心分離により、上清を取り出した。このような操作によって、上清292ｍｌを得た。操作時間は8時間を要した。
次に、得られた上清は、カラムに詰めた強酸性イオン交換樹脂（DuoliteC20、H+タイプ）100ｍｌに溶解液を1分間に1.5ｍｌの流速で通過させ、得られた溶出液を、カラムに詰めた弱塩基性イオン交換樹脂（Duolite368Ｓ、ＯH-タイプ）150ｍｌに通過させ、さらに、得られた溶出液を、カラムに詰めた活性炭50ｍｌに通過させた。得られた溶出液を濃縮し、白色粉末26.5ｇ（148.9 mmol）を得た（収率89％）。本物質をNMRと、HPLCにより分析した結果、本物質には、シロ−イノソースが99％、ミオ−イノシトール1％が含まれていた。
＜NAD+非依存性ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にした、アセトバクター・エスピーAB10253株の変異株からのスクリーニング＞
試験管に入れた酵母エキス（Difco社製）1％、グルコース0.5％を含むｐH5.0の液体培地5ｍｌを滅菌し、これに、スラントからアセトバクター・エスピーAB10253株を1白金耳加えて、２７℃、１６時間、振騰培養を行なった。培養液2.5ｍｌを滅菌チューブにとり出し、3000×ｇの遠心分離を行ない、菌体を集菌した。上清を捨て、200ｍMリン酸緩衝液（ｐH8.0）2.5ｍｌに再度懸濁し、3000×ｇの遠心分離を行ない、菌体を集菌した。上清を捨て、200ｍMリン酸緩衝液（ｐH8.0）2.5ｍｌに再度懸濁し、この内、2.0ｍｌを、滅菌した100ml容の三角フラスコに入れ、0.5mlの40％グルコース溶液と、7.5mlの200ｍMリン酸緩衝液（ｐH8.0）を加え混ぜ合わせ、これに、20μｌのメタンスルホン酸エチルを加えて、30℃、45分間、振とう培養を行なった。処理後、1mlを滅菌チューブにとり出し、3000×ｇの遠心分離を行ない、菌体を集菌した。上清を捨て、200ｍMリン酸緩衝液（ｐH7.0）2.5ｍｌに懸濁し、3000×ｇの遠心分離を行ない、菌体を集菌する。上清を捨て、200ｍMリン酸緩衝液（ｐH7.0）2.5ｍｌに再度懸濁し、変異処理菌液を得た。
これらの変異処理を施したアセトバクター・エスピーAB10253株は、次に、3％ミオ−イノシトール、酵母エキス（Difco社製）1％、グルコース0.5％、1.5％寒天を含むｐH5.0の培地を滅菌し、９ｃｍ径のシャーレ中で固化させた寒天培地に、シャーレ１枚当たり、変異処理菌液0.12mlを広げて、27℃、2日間培養した。この操作によって、生菌数は約1.6％に減少した。また、シャーレ1枚当たり約95〜125コロニーが形成した。
培養後、９ｃｍ径のシャーレに形成したコロニーの上に、100mMリン酸緩衝液、1％ミオ−イノシトール、0.4％酸化型DCIPからなる組成液をろ過滅菌し、これに、オートクレーブ滅菌した1％寒天を熱いうちに等量混合し、36℃まで冷却後、寒天が固まらない様に調製した粘凋な溶液を10mlゆっくりと注ぎ入れた。このような処理を行なった寒天培地は、27℃でゆっくりと冷却され、９ｃｍ径のシャーレに形成したコロニーの上に、重層された形で、固化した。
処理後、27℃で、シャーレをインキュベートすることにより、徐々にNAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性の大きさに従って、寒天培地上に一面に広がった酸化型DCIPの青色が、コロニーのまわりのみ、透明になり始めるのが観察された。この時、より速く、透明になった所のコロニーを、滅菌した針でつついて、新しい培地に継代し、1次選抜で、全コロニー数2154コロニーから、NAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性の高い株を22株、取得することができた。
次に、試験管に入れた3％ミオ−イノシトール、酵母エキス（Difco社製）1％、グルコース0.5％を含むｐH5.0の液体培地5ｍｌを滅菌した培地に、2次選抜として、上記で得た22株のコロニーを形成した菌を、それぞれ植菌した。27℃、3日間、振騰培養を行なった後、培養液1mlを試験管に取りだし、3000×ｇの遠心分離を行ない、菌体を集菌した。上清を捨て、菌体の入った試験管に10％ミオ−イノシトール、50ｍMリン酸緩衝液（ｐH5.0）を含む溶液を1ml加え、27℃、４時間、振騰培養を行なった後、16000×ｇの遠心分離を行ない、上清に含まれるミオ−イノシトールからシロ−イノソースの変換率をHPLCで測定した。一方、培養液5mlの内、0.5mlを滅菌チューブに取りだし、3000×ｇの遠心分離を行ない、上清を捨てて、沈殿の菌体は水で洗浄後、NAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を測定した。
その結果、２２株の変異株のうち、変異前の菌と比べて、NAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性が1.3倍以上に増加した菌株は、3株（系統No. E6-55、H2-68、B7-14）あり、それぞれ、1.6倍、2.2倍、2.8倍に増加していた。またこれらの、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースの変換率は、それぞれ、1.1倍、1.4倍、1.5倍に増加しており、NAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性が1.3倍以下の株のミオ−イノシトールからシロ−イノソースの変換率は、変異前の菌と同等であった。このことから、NAD+非依存ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にしたスクリーニングは、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースの変換率の増加と相関性があることがわかった。
＜変異菌株（B7-14）を用いたミオ−イノシトールからシロ−イノソースの変換によるシロ−イノソースの製造＞
500ml容ワッフル付き三角フラスコに、ミオ−イノシトール10ｇ、酵母エキス（FNI205：Lallemand BI社製）1ｇ、グルコース0.5ｇを加え、100ｍｌになる様に水に溶解し、ｐH5.0に調整し、オートクレーブにより滅菌した培地を２０本（２リットル相当：ミオ−イノシトール200ｇ（1.11mol））作製し、これに、変異菌株（B7-14）をスラントから、それぞれ１白金耳加えて、3日間、２７℃、ロータリーシェーカーで培養した。
培養後、培養液を遠心分離し、得られた上清は、カラムに詰めた強酸性イオン交換樹脂（DuoliteC20、H+タイプ）500ｍｌに溶解液を1分間に10ｍｌの流速で通過させ、得られた溶出液を、カラムに詰めた弱塩基性イオン交換樹脂（Duolite368Ｓ、ＯH-タイプ）900ｍｌに通過させ、さらに、得られた溶出液を、カラムに詰めた活性炭50ｍｌに通過させた。得られた溶出液を濃縮し、白色粉末162ｇ（0.91mol）を得た（収率82％）。本物質をNMRと、HPLCにより分析した結果、本物質には、シロ−イノソースが91％、ミオ−イノシトール3％、シロ−イノシトール6％が含まれていた（シロ−イノソース純度91％）。
＜変異菌株（B7-14）を用いたミオ−イノシトールからシロ−イノソースの変換と化学還元によるシロ−イノシトールの製造＞
500ml容ワッフル付き三角フラスコに、ミオ−イノシトール10ｇ、酵母エキス（FNI205：Lallemand BI社製）1ｇ、グルコース0.5ｇを加え、100ｍｌになる様に水に溶解し、ｐH5.0に調整し、オートクレーブにより滅菌した培地を２０本（２リットル相当：ミオ−イノシトール200ｇ（1.11mol））作製し、これに、変異菌株（B7-14）をスラントから、それぞれ１白金耳加えて、3日間、２７℃、ロータリーシェーカーで培養した。
培養後、培養液を8000×ｇで遠心分離し、得られた上清約２リットルを、5規定NaOH溶液を用いて、ｐH7.5に調整した。これに攪拌しながら、NaBH4 9.2ｇを加えて還元反応を行なった。反応熱で反応液の温度は３７℃に上昇した。３０分後、不溶物が徐々に現れ、ここに1.2リットルの水を加えて、発生する不溶物を殆ど溶解した。この溶液をろ過し、不溶物を取り除いたろ液は、カラムに詰めた強酸性イオン交換樹脂（DuoliteC20、H+タイプ）500ｍｌに溶解液を1分間に10ｍｌの流速で通過させ、得られた溶出液を、カラムに詰めた強塩基性イオン交換樹脂（DuoliteA116、ＯH-タイプ）900ｍｌに通過させ、さらに、得られた溶出液を、カラムに詰めた活性炭300ｍｌに通過させた。得られた溶出液を濃縮し、白色粉末145ｇを得た。本物質をHPLCにより分析した結果、本物質には、シロ−イノシトールが36％、ミオ−イノシトール64％が含まれていた。
得られた白色粉末を、水で470ｍｌになるように懸濁し、７０℃に加熱し、ミオ−イノシトールを十分溶解させた。３０℃まで攪拌しながら冷却し、白濁した溶液をろ過して、不溶物を集めた。不溶物は少量の水で洗浄し、乾燥後、44.2ｇの粉末として得られた。本物質をHPLCにより分析した結果、本物質には、シロ−イノシトールが98％、ミオ−イノシトール2％が含まれていた。さらに、得られた粉末に700ｍｌの水を加えて、８５℃に加熱し、全て溶解させ、徐々に攪拌しながら、３０℃まで冷却し、ここにエタノールを700ml加えた。一晩、室温で放置後、得られた結晶をろ過して集め、乾燥後、40.1ｇ（222.8mmol）の結晶を得た（収率20％）。結晶をNMRおよびHPLCにより分析した結果、本物質は、99.9％以上の純度のシロ−イノシトールであった。
＜アセトバクター・エスピー AB10281株 FERM BP-10119の産生するシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの精製＞
ミオ−イノシトール 10.0%、酵母エキス 1.0%、シュークロース1.0%を含む液体培地3リットルを、1N NaOHを用いてｐH7.0に調製し、100mlずつ500ml容のバッフル付き三角フラスコ30本に分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにアセトバクター・エスピー AB10281株 FERM BP-10119のスラント培養物を１白金耳接種し、27℃で5日間ロータリーシェーカー（１８０rpm）を用いて培養した。培養後、各々の三角フラスコに、水を250mlずつ加え、1時間ロータリーシェーカーで攪拌し、培養液に存在する結晶性のシロ−イノシトールを溶解した。この培養液を集めて、遠心分離（8,000 rpm 20分間）し、菌体（湿重量75ｇ）を得た。
この菌体を300mlの水に懸濁し、10℃以下で超音波で破砕した。破砕溶液は、pH4.8を示し、この溶液を１ＮのＮａＯＨでpH7.0に調製した後に、遠心分離（16,000 rpm 20分間）により、上清液を単離した。次に、上清液が2mM Mg2+になるようにMgSO4を加えて、ブルートヨパールカラム（東ソー社：20ml）にチャージし、2mM Mg2+になるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 50mlを通過させ、カラムを洗浄した。その後、1M KCｌになるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 50mlを通過させ、吸着タンパクを溶出させた。次に、溶出液をMW30000cut offの限外ろ過装置で、濃縮を行ない、濃縮液に、20mMトリス緩衝液pH7.0 50mlを加えて、再度濃縮し、脱塩濃縮液を得た。次に、この脱塩濃縮液を、DEAEトヨパールカラム（東ソー社：20ml）にチャージし、20mMトリス緩衝液pH7.0 から、500mM NaClになるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 の直線濃度勾配をかけた溶液で溶出し、溶出液をフラクション別に分画した。分画した溶液別に、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を測定したところ、吸着しなかった画分（SIDH1）、200mM NaClで溶出した画分（SIDH2）、300mMで溶出した画分（SIDH3）の三つの画分にそれぞれ、活性があった。
活性測定は、反応液（200mMトリス緩衝液pH8.0、2%NADPH、1%シロ−イノソース）5μｌと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定した。必要があれば、酵素液は希釈を行なった。
上記カラム非吸着画分は、さらに、CMトヨパールカラム（東ソー社：20ml）にチャージし、20mMトリス緩衝液pH7.0 から、500mM NaClになるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 の直線濃度勾配をかけた溶液で溶出し、溶出液をフラクション別に分画した。分画した溶液別に、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を測定したところ、吸着しなかった画分に、活性があった。200mM NaClで溶出した画分、300mMで溶出した画分は、それぞれ別々に、再度限外ろ過装置で脱塩し、DEAEトヨパールカラム（東ソー社：20ml）にチャージし、200mM NaClになるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 から、300mM NaClになるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 の直線濃度勾配をかけた溶液で溶出し、溶出液をフラクション別に分画し、精製した。さらに、これら三つのシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素液を、それぞれ、限外ろ過装置で濃縮し、ゲルろ過カラム（東ソー社：2000SWXL）にチャージし、溶出液に200mM NaClになるように添加した20mMリン酸緩衝液pH7.0を用いて、精製した。このように精製された酵素液をスラブゲルＳＤＳ電気泳動し、電気泳動後ゲルを取り出し、コマシブリリアントブルー染色液（ラピッドＣＢＢ ＫＡＮＴＯ：関東化学社製）で染色後脱色し、青く染まるタンパク質のバンドをデンシトメーター（ＡＴＴＯ社製）で測定し、目的のバンドの純度を測定したところ、いずれも純度85％以上であった。
＜大腸菌Ｋ１２株 ATCC10798が産生する本発明酵素の精製と、N末端分析＞
Ｌ−ソルボース 0.5%を含む、ＬＢブロス培地（１％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0）3リットルを、100mlずつ500ml容の坂口フラスコ30本に分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコに大腸菌K12株のスラント培養物を１白金耳接種し、36℃で1日間レシプロシェーカー（１３５rpm）で培養した。培養後、培養液を集めて、遠心分離（8,000 rpm 20分間）し、菌体（湿重量32ｇ）を得た。この菌体を100mlの水に懸濁し、10℃以下で超音波で破砕した。破砕溶液は、pH6.8を示し、この溶液を１ＮのＮａＯＨ溶液で、pH7.0に調製した後に、遠心分離（16,000 rpm 20分間）により、上清液を単離した。次に、上清液が2mM Mg2+になるようにMgSO4を加えて、ブルートヨパールカラム（東ソー社：20ml）にチャージし、2mM Mg2+になるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 50mlを通過させ、カラムを洗浄した。その後、1M KCｌになるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 50mlを通過させ、吸着タンパクを溶出させた。次に、溶出液をMW30000cut offの限外ろ過装置で、濃縮を行ない、濃縮液に、20mMトリス緩衝液pH7.0 50mlを加えて、再度濃縮し、脱塩濃縮液を得た。次に、この脱塩濃縮液を、DEAEトヨパールカラム（東ソー社：20ml）にチャージし、20mMトリス緩衝液pH7.0 から、500mM NaClになるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 の直線濃度勾配をかけた溶液で溶出し、溶出液をフラクション別に分画した。分画した溶液別に、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を測定したところ、300mMで溶出した画分に活性があった。
活性測定は、実施例９で上述した方法と同様で、340nmの吸光度の減少量を測定した。必要があれば、酵素液は希釈を行なった。
300mM NaClで溶出した画分は、再度限外ろ過装置で脱塩し、DEAEトヨパールカラム（東ソー社：20ml）にチャージし、250mM NaClになるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 から、350mM NaClになるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 の直線濃度勾配をかけた溶液で溶出し、溶出液をフラクション別に分画する操作を3回行ない、共雑するタンパク質を除き、精製した。さらに、このシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素液を、それぞれ、限外ろ過装置で濃縮し、ゲルろ過カラム（東ソー社：2000SWXL）にチャージし、溶出液に200mM NaClになるように添加した20mMリン酸緩衝液pH7.0を用いて、精製した。
このように精製された酵素液をスラブゲルＳＤＳ電気泳動後、ゲルを取り出し、ゲルと同じ大きさのＰＶＤＦ膜（イモビロンＰＳＱ：ミリポア社製）にセミドライエレクトロプロット装置（フナコシ社製）で吸着させた後、このＰＶＤＦ膜を取り出し、コマシブリリアントブルー染色液（ラピッドＣＢＢ ＫＡＮＴＯ：関東化学社製）で染色後脱色し、実施例９で記述した方法と同様にデンシトメーターで純度を測定したところ、純度が４０％であった。さらに、前後に存在する不要なタンパク質を除くため、相当するタンパク質部分を切り取り、純度の高い、本発明酵素を得た。
次に、PVDF膜にある純度の高い、本発明酵素を、N末端アミノ酸分析装置（Hewlett Packard社）により、分析を行なった。その結果、セリン−アスパラギン酸−アスパラギン−イソロイシン−アルギニンの配列が検出され、このような配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを大腸菌全塩基配列データベース（データベース名「Colibri」）から検索したところ、ydgJ遺伝子（またはｂ1624遺伝子）が一致した。本遺伝子産物は酸化還元酵素の一種であると予想されているが、基質、生産物は全く不明のタンパク質であった。
＜大腸菌K12株 ATCC10798由来の本発明ＤＮＡの単離と発現＞
本発明酵素をコードしていると思われるydgJ遺伝子を取得するために、まず、鋳型とする大腸菌K12株の全ゲノムを以下の様に抽出した。ＬＢフラスコ培地１００ｍｌ（１％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0）にＬＢスラント培地（１％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0、１．５％寒天）で培養した大腸菌K12株を一白金耳接種し、8時間、３６℃で好気的に培養し、これを集菌した。この菌体ペレットに、1５ｍｌのＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（0.15Ｍ NaCl、0.1M EDTA、pH8.0）とリゾチーム50mgを加えて懸濁し、37℃、2時間作用させた。処理後、この溶液に25％ＳＤＳ溶液を０．５ｍｌ加えて完全に溶菌させ、フェノールを３ｍｌ加えて、タンパク質を変成させた後に、遠心分離し、上清を取り出し、この溶液に２０ｍｌの２−プロパノールを加えて、粗ゲノムＤＮＡを析出させた。析出した粗ゲノムＤＮＡを遠心分離し、沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥した粗ゲノムＤＮＡは、さらに3ｍｌＴＥ液（10ｍＭ Tris-HCl、１mM EDTA、pH8.0）に溶解後、0.01mgのＲＮＡaseを加え、３６℃、２時間反応させ、ＲＮＡを分解させた。さらに、0.01mgのプロテイナーゼＫを加えて、３６℃、２時間反応させ、タンパク質を分解させた。次に、1mlのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加えて、ゆっくりと攪拌し、ＲＮＡaseと、プロテイナーゼＫを変成させ、遠心分離し、2相に分離した内の水相である上層を取り出し、これに3M酢酸Na溶液を0.3ml加えて、ｐＨ５．２に調製した。これに３ｍｌの２−プロパノールを加えて、ゲノムＤＮＡを析出させた。析出したゲノムＤＮＡを遠心分離し、沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥したゲノムＤＮＡは、3ｍｌＴＥ液に溶解させ、これに1mlのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加える操作から、3ｍｌＴＥ液に溶解させる過程までを、再度繰り返して、遠心分離を行い、同様にｐＨ５．２にて、上清に等量の２−プロパノールを加えて、大腸菌K12株のゲノムＤＮＡ溶液を調製した。このようにして得られたゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応のための鋳型ＤＮＡ溶液とした。
大腸菌K12株由来で、ydgJ遺伝子のリボソームバインディングサイト（RBS）を含む範囲をクローニングし、かつ、リコンビナント酵素として発現させるために、以下の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
配列番号15：ydgj-F 5'- cattcaagcttaatgagaggcaatgacatgagcg-3'
配列番号16：ydgj-R 5'- tcggaattcttcatgcaaggcacaaagtcgc-3'
ＰＣＲ反応は宝酒造社のEx taq反応用液を使用し、組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各１μｌ、Takara ExTaq 0.5μlを50μｌになるように水を加え、30μｌのミネラルオイルを重層し、調製した。反応条件は、PCR増幅装置（ASTEC社 PC-700）を用い、変成を94℃30秒、ア二−リングを55℃１分、伸長を72℃１分、の3段階の反応を３５回繰返し行った。上記のPCR反応によって、約1.0 kbpの大きさのDNA断片が増幅した。反応後、重層したミネラルオイルを0.3mlのヘキサンで抽出し、ヘキサン層を除去する操作を3回繰返し、1分間減圧することで、ミネラルオイルを除去した。この様にして得られた反応液50μｌからジーンクリーン（Bio101社）を用いてＰＣＲ断片を精製した。すなわち、キット添付のNaI溶液を300μｌ加えて混合し、10μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、4℃、15分静置した後に、遠心分離し、DNA断片の吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μｌを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液による洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、55℃で、15分加温した後、遠心分離を行い、DNA断片を含む上清12μｌを得た。
精製されたDNA断片を発現ベクターに組み込む操作は以下の用に行った。すなわち、DNA断片溶液10μｌに、発現用プラスミド（pUC119：宝酒造社製））を0.5μg、宝酒造社の制限酵素HindＩＩＩとEcoRIを各1μｌ、宝酒造社の制限酵素用緩衝液Ｋ buffer×10倍液 2μlを加え、20μlになるように滅菌水を加え、混合した。この反応液を36℃、2時間反応した。制限酵素反応後、ジーンクリーンを用いて、DNA断片と発現ベクターを単離し、これらをライゲーションさせた。すなわち、制限酵素反応液20μｌにキット添付のNaI溶液を300μｌ加えて混合し、10μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、4℃、15分静置した後に、遠心分離し、DNA断片と発現ベクターの吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μｌを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液による洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、55℃で、15分加温した後、遠心分離を行い、DNA断片と発現ベクターを含む上清12μｌを得た。この操作により、制限酵素によって生じた約50bp以下の小さなDNA断片は取り除かれ、目的とするDNA断片と、発現ベクターが得られた。
このようにして調製した溶液10μｌにTakara Ligation kit−I溶液（宝酒造社）を10μｌ加え、16℃、1時間反応させた。この溶液を、コンピテントセル（宝酒造社：DH5α）に形質転換させた。すなわち、４℃で解凍したコンピテントセル溶液６０μｌにライゲーション反応溶液を５μｌ加え、混合し、０℃３０分後、４２℃４５秒、０℃２分の処理を行い、これに５００μｌＳＯＣ溶液（２％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2）を加えて、３６℃で１時間回復培養させ、この培養液100μｌを、50μg/mlアンピシリン、40μg/ml X-gal（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside）、1ｍM IPTG（チオガラクトピラノシド）を含むLB寒天培地（１％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）に塗布した。さらに37℃、16時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドの導入で形質転換された大腸菌が得られるため、これを選択した。こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（50μg/ml）を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（QIA filter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）によりプラスミドＤＮＡの分離および精製を行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡは、目的とするydgJ遺伝子に相当する約1.0ｋbpのDNA断片を有することが確認された。
次に、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を確認するため、コロニーとして単離した菌株を50μg/mlアンピシリンを含む100ml ＬＢ培地（１％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0）に移植し、３６℃７時間培養し、この培養液に200ｍMチオガラクトピラノシド溶液を0.3ｍｌ加え、さらに３６℃３時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集め、これを生理食塩水で1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を0.6％トライトンＸ100溶液3ｍｌに懸濁し４℃で超音波により菌を破砕した。この溶液を遠心分離し、上清の酵素溶液2.8mlを取り出し、上清に1.2ｇ硫安を加え、4℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離（１５，０００rpm、２０min）で集め、上清を除去し、この沈殿物を2.5mlの20ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ7.0に溶解させ、再度遠心分離（１５，０００rpm、２０min）を行い、上清を20ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ7.0で平衡化したShephadex G-25カラム（ファルマシア社：14ml）にアプライし、20ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ7.0で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、ydgJ遺伝子産物の粗酵素液3.5ｍｌを得た。
シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの活性測定は、反応液（200mMトリス緩衝液pH8.0、2%NADPH、1%シロ−イノソース）5μｌと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定した。必要があれば、酵素液は希釈を行なった。
また、酵素反応生産物の測定は、シロ−イノソース10mg、NADPH40mg、酵素10U相当を含む100mMトリス緩衝液（pH8.0）1.0mlで、36℃、4時間反応後、80℃、10minの加熱処理を行ない、冷却後、強塩基性陽イオン交換樹脂100μl、強酸性陰イオン交換樹脂100μl、活性炭10mgを加えて攪拌し、遠心分離後、上清を2倍希釈し、HPLC（Shodex Asahipak NH2P-50 4E φ4.6×250mm：Ｓｈｏｄｅｘ社）を用いて、カラム温度40℃、移動相流速1.5ml（80％アセトニトリル）の条件下、RI検出器で測定した。その結果、ydgJ遺伝子産物は、高いシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を示し、その生産物は、100％シロ−イノシトールへ還元されたものであり、異性体であるミオ−イノシトールは検出されなかった。結果として、ydgJ遺伝子由来のリコンビナント酵素溶液は、高いシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を有し、この遺伝子産物が、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼであることを確認した。また、シローイノソースからの還元反応物は、シロ−イノシトールのみ検出され、立体特異的に、シロ−イノシトールへ還元する酵素であった。また、ydgJ遺伝子の配列は配列番号1に、相当するアミノ酸配列は配列番号2に記載した。
＜大腸菌ydgJ遺伝子の相同性から推定されるホモログＤＮＡの単離と発現、およびその諸性質＞
大腸菌ydgJ遺伝子産物のアミノ酸配列から三次元構造を推定すると、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼのファミリーに属することが推定された。このファミリーにはミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.18）も含まれ、アミノ酸配列の内、NAD結合に関与する配列は、相同性が高いことが判った。さらに、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼのX線構造解析から、基質結合に関与する個所のアミノ酸配列を特定し、部分的に同じアミノ酸配列を有し、ydgJ遺伝子産物に相同なタンパク質を検索したところ、グラム陰性菌、陽性菌を問わず、多くの細菌に相同なタンパク質があることが判明した。
これらの細菌の中から、大腸菌ydgJ遺伝子の相同性から推定されるホモログＤＮＡを検索した結果、アグロバクテリウム チュメファシエンスC58株 ATCC33970（Agrobacterium tumefacience C58 ATCC33970）ゲノム中のAtu4375遺伝子と、Atu3234遺伝子、バチルス ズブチリス168株 ATCC23857（Bacillus subtilis 168 ATCC23857）ゲノム中のBG14057遺伝子、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株 ATCC33913（Xanthomonas campestris pv. campestris ATCC33913）ゲノム中のXcc3438遺伝子ならびに、ミオ−イノシトールから直接にシロ−イノシトールへ変換する能力のある微生物も知られているアグロバクテリウム・エスピーAB10121株 FERM P-17383（Agrobacterium sp.AB10121 FERM P-17383）ゲノム中のAtu4375遺伝子と、Atu3234遺伝子について大腸菌ydgJ遺伝子との相同性が認められた。従って、それぞれのＤＮＡの単離と発現を行なった。
上記の候補ＤＮＡを得る目的で、鋳型とするアグロバクテリウム チュメファシエンスC58株 ATCC33970、バチルス ズブチリス168株 ATCC23857、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株 ATCC33913および、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株 FERM P-17383の全ゲノムを以下の様に抽出した。アグロバクテリウム チュメファシエンスC58株、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株および、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株は、ＬＢフラスコ培地１００ｍｌ（１％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0）に、ＬＢスラント培地（１％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0、１．５％寒天）で培養したアグロバクテリウム チュメファシエンスC58株、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株および、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株をそれぞれ、一白金耳接種し、18時間、27℃で好気的に培養し、これを集菌した。この菌体ペレットに、1５ｍｌのＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（0.15Ｍ NaCl、0.1M EDTA、pH8.0）とリゾチーム50mgを加えて懸濁し、37℃、2時間作用させた。処理後、この溶液に25％ＳＤＳ溶液を０．５ｍｌ加えて完全に溶菌させ、フェノールを３ｍｌ加えて、タンパク質を変成させた後に、遠心分離し、上清を取り出し、この溶液に２０ｍｌの２−プロパノールを加えて、粗ゲノムＤＮＡを析出させた。析出した粗ゲノムＤＮＡを遠心分離し、沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥した粗ゲノムＤＮＡは、さらに3ｍｌＴＥ液（10ｍＭ Tris-HCl、１mM EDTA、pH8.0）に溶解後、0.01mgのＲＮＡaseを加え、３６℃、２時間反応させ、ＲＮＡを分解させた。さらに、0.01mgのプロテイナーゼＫを加えて、３６℃、２時間反応させ、タンパク質を分解させた。次に、1mlのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加えて、ゆっくりと攪拌し、ＲＮＡaseと、プロテイナーゼＫを変成させ、遠心分離し、2相に分離した内の水相である上層を取り出し、これに3M酢酸Na溶液を0.3ml加えて、ｐＨ５．２に調製した。これに３ｍｌの２−プロパノールを加えて、ゲノムＤＮＡを析出させた。析出したゲノムＤＮＡを遠心分離し、沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥したゲノムＤＮＡは、3ｍｌＴＥ液に溶解させ、これに1mlのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加える操作から、3ｍｌＴＥ液に溶解させる過程までを、再度繰り返して、遠心分離を行い、同様にｐＨ５．２にて、上清に等量の２−プロパノールを加えて、アグロバクテリウム チュメファシエンスC58株、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株および、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株のゲノムＤＮＡ溶液をそれぞれ、調製した。このようにして得られたゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応のための鋳型ＤＮＡ溶液とした。
バチルス ズブチリス168株 ATCC23857は、ＬＢフラスコ培地100ｍｌ（１％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0）にＬＢスラント培地（１％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）で培養したバチルス ズブチリス168株を一白金耳接種し、18時間、36℃で好気的に培養し、さらに、この内、１ｍｌを同様に調製したＬＢフラスコ培地100mlに加えて、4時間培養し、これを集菌した。集菌後の全ゲノムの抽出方法は、アグロバクテリウムで使用した方法と同様である。
次に、アグロバクテリウム チュメファシエンスC58株ゲノム中のAtu4375遺伝子、Atu3234遺伝子、アグロバクテリウム・エスピーAB10121株ゲノム中のAtu4375遺伝子、Atu3234遺伝子、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株ゲノム中のXcc3438遺伝子、のRBSを含むクローニング、かつ、リコンビナント酵素として発現させるために、以下の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
配列番号17：Atu4375-F 5'- ggcggatcctttgaaagggatagtcatgtcct -3'
配列番号18：Atu4375-R 5'- attggaagcttcgattggctgcgacctag -3'
配列番号19：Atu3234-F 5'- ttgggatcctttcaggggaaatattatggc -3'
配列番号20：Atu3234-R 5'- gccgcaagcttgttttacagcttcac -3'
配列番号23：Xcc3438-F 5'- tcggaattcgcgttgcggtgaatcgttttcaatg -3'
配列番号24：Xcc3438-R 5'- ataagaagcttgctcagtcgctgctgttgccttc -3'
バチルス ズブチリス168株ゲノム中のBG14057遺伝子のRBSを含むクローニング、かつ、リコンビナント酵素として発現させるために、以下の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。但し、5‘末端から10番目のaは本来tであるが大腸菌での発現のためaに変更した。
配列番号21：BG14057-F 5'- aggaattcgatgataacgcttttaaaggggagaa -3'
配列番号22：BG14057-R 5'- tttctgcagtttagtgctccagcataatggttcg -3'
ＰＣＲ反応は宝酒造社のEx taq反応用液を使用し、組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各１μｌ、Takara ExTaq 0.5μlを50μｌになるように水を加え、30μｌのミネラルオイルを重層し、調製した。反応条件は、PCR増幅装置（ASTEC社 PC-700）を用い、変成を94℃で30秒、ア二―リングを52℃、55℃または58℃（表３参照）で１分、伸長を72℃で１分、の3段階の反応を３５回繰返し行った。上記のPCR反応によって、約1.1 kbpの大きさのDNA断片が増幅した。
Figure 2005035774
反応後、重層したミネラルオイルを0.3mlのヘキサンで抽出し、ヘキサン層を除去する操作を3回繰返し、1分間減圧することで、ミネラルオイルを除去した。この様にして得られた反応液50μｌからジーンクリーン（Bio101社）を用いてＰＣＲ断片を精製した。すなわち、キット添付のNaI溶液を300μｌ加えて混合し、10μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、4℃、15分静置した後に、遠心分離し、DNA断片の吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μｌを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液による洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、55℃で、15分加温した後、遠心分離を行い、DNA断片を含む上清12μｌを得た。
精製されたDNA断片を発現ベクターに組み込む操作は、それぞれ以下に示す組合せで、行った。すなわち、DNA断片溶液10μｌに、発現用プラスミド（pUC118：宝酒造社製）を0.5μg、宝酒造社の制限酵素2種類を各1μｌ、宝酒造社の制限酵素用緩衝液buffer×10倍液 2μlを加え、20μlになるように滅菌水を加え、混合した。この反応液を36℃、2時間反応した。AB10121株のAtu3234遺伝子は、HindＩＩＩサイトを有するため、制限酵素処理せず、単離後、pT7Blueベクター（Novagen社製）とライゲーションさせた。
Figure 2005035774
制限酵素反応後、ジーンクリーンを用いて、DNA断片と発現ベクターを単離し、これらをライゲーションさせた。すなわち、制限酵素反応液20μｌにキット添付のNaI溶液を300μｌ加えて混合し、10μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、4℃、15分静置した後に、遠心分離し、DNA断片と発現ベクターの吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μｌを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液による洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、55℃で、15分加温した後、遠心分離を行い、DNA断片と発現ベクターを含む上清12μｌを得た。この操作により、制限酵素によって生じた約50bp以下の小さなDNA断片は取り除かれ、目的とするDNA断片と、発現ベクターが得られた。
このようにして調製した溶液10μｌにTakara Ligation kit−I溶液（宝酒造社）を10μｌ加え、16℃、1時間反応させた。この溶液を、コンピテントセル（宝酒造社：DH5α）に形質転換させた。すなわち、４℃で解凍したコンピテントセル溶液６０μｌにライゲーション反応溶液を５μｌ加え、混合し、０℃３０分後、４２℃４５秒、０℃２分の処理を行い、これに５００μｌＳＯＣ溶液（２％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2）を加えて、３６℃で１時間回復培養させ、この培養液100μｌを、50μg/mlアンピシリン、40μg/ml X-gal（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside）、1ｍM IPTG（チオガラクトピラノシド）を含むLB寒天培地（１％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）に塗布した。さらに37℃、16時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドの導入で形質転換された大腸菌が得られるため、これを選択した。こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（50μg/ml）を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（QIA filter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）によりプラスミドＤＮＡの分離および精製を行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡは、それぞれ、目的とするＤＮＡに相当する約1.0〜1.1ｋbpのDNA断片を有することが確認された。
次に、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を確認するため、コロニーとして単離した菌株を50μg/mlアンピシリンを含む100ml ＬＢ培地（１％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0）に移植し、３６℃７時間培養し、この培養液に200ｍMチオガラクトピラノシド溶液を0.3ｍｌ加え、さらに３６℃、３時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集め、これを生理食塩水で1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を0.6％トライトンＸ100溶液3ｍｌに懸濁し４℃で超音波により菌を破砕した。この溶液を遠心分離し、上清の酵素溶液2.8mlを取り出し、上清に1.2ｇ硫安を加え、4℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去し、この沈殿物を2.5mlの20ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ7.0に溶解させ、再度遠心分離を行い、上清を20ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ7.0で平衡化したShephadex G-25カラム（14ml）にアプライし、20ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ7.0で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、それぞれの遺伝子産物の粗酵素液3.5ｍｌを得た。
シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの活性測定は、反応液（200mMトリス緩衝液pH8.0、2%NADPH、1%シロ−イノソース）5μｌと、酵素液5μlを混合し、36℃30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定した。必要があれば、酵素液は希釈を行なった。
また、酵素反応生産物の測定は、シロ−イノソース10mg、NADPH40mg、酵素10U相当を含む100mMトリス緩衝液（pH8.0）1.0mlで、36℃で4時間反応後、80℃、10minの加熱処理を行ない、冷却後、強塩基性陽イオン交換樹脂100μl、強酸性陰イオン交換樹脂100μl、活性炭10mgを加えて攪拌し、遠心分離後、上清を2倍希釈し、HPLC（Shodex Asahipak NH2P-50 4E φ4.6×250mm：Ｓｈｏｄｅｘ製）にて、カラム温度40℃、移動相流速1.5ml（80％アセトニトリル）、RI検出器で測定した。その結果、アグロバクテリウム チュメファシエンスC58株のAtu4375遺伝子産物と、Atu3234遺伝子産物、バチルス ズブチリス168株のBG14057遺伝子産物、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株のXcc3438遺伝子産物、ならびに、AB10121株のAtu4375遺伝子産物と、Atu3234遺伝子遺伝子産物は、高い酵素活性を示し、その生産物は、すべて、100％シロ−イノシトールへ還元されたものであり、異性体であるミオ−イノシトールは検出されなかった。結果として、上述した遺伝子由来のリコンビナント酵素は、全て高いシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を有し、この遺伝子産物が、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼであることを確認した。また、シローイノソースからの還元反応物は、シロ−イノシトールのみ検出され、立体特異的に、シロ−イノシトールへ還元する酵素であった。
アグロバクテリウム チュメファシエンスC58株由来のAtu4375遺伝子配列は配列番号3に、相当するアミノ酸配列は配列番号4に、Atu3234遺伝子配列は配列番号5に、相当するアミノ酸配列は配列番号6に記載した。また、バチルス ズブチリス168株由来のBG14057遺伝子配列は配列番号7に、相当するアミノ酸配列は配列番号8に、AB10121株由来のAtu4375遺伝子配列は配列番号9に、相当するアミノ酸配列は配列番号10に、Atu3234遺伝子配列は配列番号11に、相当するアミノ酸配列は配列番号12に、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株由来のXcc3438遺伝子配列は配列番号13に、相当するアミノ酸配列は配列番号14に記載した。また、AB10121株のAtu4375遺伝子と、Atu3234遺伝子を含むプラスミドの塩基配列解析（北海道システムサイエンス社）の結果、アグロバクテリウム チュメファシエンスC58株のAtu4375遺伝子と、AB10121株のAtu4375遺伝子とは、塩基配列上の相同性は89％、アミノ酸配列上の相同性は96％であり、アグロバクテリウム チュメファシエンスC58株のAtu3234遺伝子と、AB10121株のAtu3234遺伝子の塩基配列上の相同性は87％、アミノ酸配列上の相同性は95％であった。
＜アセトバクター・エスピー AB10281株 FERM BP-10119の産出するSIDH1をコードするDNAの単離＞
精製された酵素の内、SIDH1を含む酵素液をPVDF膜（イモビロンPSQ：ミリポア社製）を通過させ、PVDF膜に吸着させた。このPVDF膜を取りだし、コマシブリリアントブルー染色液（ラピッドCBB KANTO：関東化学社製）で染色後脱色し、乾燥後、N末端アミノ酸分析装置（Hewlett Packard社）により分析を行なった。その結果、N末端から、メチオニン−リシ゛ン−アルキ゛ニン−リシ゛ン−ロイシン−アルキ゛ニン−イソロイシン−ク゛リシン−ロイシン−イソロイシン−ク゛リシン−セリン−ク゛リシン−フェニルアラニン−メチオニン−ク゛リシン−アルキ゛ニン−スレオニン−ヒスチシ゛ン−アラニン−フェニルアラニン−ク゛リシン−チロシン−セリンの配列が検出され、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を想定し、以下の2種類のプライマーを作製した。
配列番号29：SIDH1-F1 atgaarcgnaarytncgiatyggyytiatygg
配列番号30：SIDH1-F2 ggyttyatgggycgnacicaygcittyggyta
次に、実施例１０〜１２で得られた各種シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの塩基配列を元に、配列内部のコンセンサスの強い領域を含む以下の2種類のプライマーを作製した。
配列番号31：SIDH1-B1 ggyttrtcrmmgayracrtgrstrcc
配列番号32： SIDH1-B2 artgwrirtgrttgggigt
また、鋳型となるAB10281株のゲノムDNAは、実施例９で調製した菌体ヘ゜レット（湿重量約400mg）を対象に、実施例１２に記載したDNA調製方法と同様の方法で、AB10281株のゲノムDNA溶液を調製した。
ＰＣＲ反応は宝酒造社のEx taq反応用液を使用し、組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各１μｌ（SIDH1-F1と、SIDH1-B1）、Takara ExTaq 0.5μlを50μｌになるように水を加え、30μｌのミネラルオイルを重層し、調製した。反応条件は、PCR増幅装置（ASTEC社 PC-700）を用い、変成を94℃30秒、ア二―リングを50℃30秒、伸長を72℃１分、の3段階の反応を３５回繰返し行った。上記のPCR反応によって、電気泳動後、約0.3kbpの大きさのDNA断片が増幅したことを確認した。さらに、この0.3kbpのバンドをゲルから切りだし、ゲル破砕溶液の一部を鋳型（2μl）として、プライマーの組合せをSIDH1-F2と、SIDH1-B2にした以外は、同様のPCR反応液組成で反応液を調製し、反応条件は、PCR増幅装置（ASTEC社 PC-700）を用い、変成を94℃30秒、ア二―リングを46℃30秒、伸長を72℃１分、の3段階の反応を３５回繰返し行った。このPCR反応によって、電気泳動後、約0.25kbpの大きさのDNA断片が増幅したことを確認した。
約0.25kbpの大きさのDNA断片は、この部分をゲルから切り出し、ジーンクリーン（Bio101社製）を用いてＰＣＲ断片を精製した。すなわち、ゲルをNaI溶液に溶解させる以外は、実施例１２に記載の精製方法と同様の方法で、DNA断片溶液12μｌを得た。
次に、精製されたDNA断片をpT7Blueベクターとライゲートさせた。すなわち、DNA断片溶液10μｌに、pT7Blueベクターを0.5μg、Takara Ligation kit−I溶液（宝酒造社）を10μｌ加え、16℃、1時間反応させた。この溶液を、コンピテントセル（宝酒造社DH5α）に形質転換させた。形質転換操作、形質転換からのプラスミドの単離は実施例１２と同様の方法で行った。
得られたプラスミドを、ユニバーサルプライマー（R-20merと、U-19mer）を用いて、塩基配列解析（北海道システムサイエンス社）したところ、この酵素をコードする遺伝子の塩基配列の前半約1/3が明らかになった。
さらに、完全長の塩基配列を決定するため、AB10281株のゲノムDNAを制限酵素BamHIで完全に消化させ、得られたDNA断片溶液を、ジーンクリーン（Bio101社製）を用いて精製し、この断片をセルフライゲートさせた。すなわち、DNA断片溶液10μｌに、Takara Ligation kit−I溶液（宝酒造社）を10μｌ加え、16℃、1時間反応させた。反応後、ジーンクリーン（Bio101社製）を用いて、このDNAを精製し、インバースPCR用の鋳型DNA溶液とした。
次に、明らかになった前半約1/3の塩基配列を元に、以下の3種類のプライマーを作製し、インバースPCR反応を行なった。
配列番号33：SIDH1-INV-F gctcgtcaacgatcctgaaattgat
配列番号34：SIDH1-INV-B ttcgctgcagcttcatcggaaatat
配列番号35：SIDH1-INVF3 cccttcaatttccgggcgggt
インバースＰＣＲ反応は宝酒造社のEx taq反応用液を使用し、組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各１μｌ（SIDH1-INV-FとSIDH1-INV-Bの組合せ、SIDH1-INV-FとSIDH1-INV3の組合せ）、Takara ExTaq 0.5μlを50μｌになるように水を加え、30μｌのミネラルオイルを重層し、調製した。反応条件は、PCR増幅装置（ASTEC社 PC-700）を用い、変成を94℃30秒、アニーリングを50℃1分、伸長を72℃2分、の3段階の反応を３５回繰返し行った。上記のPCR反応によって、電気泳動後、約2.7kbpと、約1.8kbpの大きさのDNA断片が増幅した。この約2.7kbpと、約1.8kbpのバンドをゲルから切りだし、ジーンクリーン（Bio101社製）を用いてＰＣＲ断片を精製し、DNA断片溶液10μｌを得た。得られたDNA断片2種類を、PCRで使用したプライマーを用いて、塩基配列解析（北海道システムサイエンス社）を行ない、この酵素をコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。
次に、AB10281株の産出するSIDH1遺伝子のRBSサイトを含むクローニング、かつ、リコンビナント酵素として発現させるために、以下の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
配列番号36：281SIDH1-F gctggatcccgcccttattgtgaata
配列番号37：281SIDH1-R tatgaattcgttatgccttctcatgctgtcg
ＰＣＲ反応は宝酒造社のEx taq反応用液を使用し、組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各１μｌ、Takara ExTaq 0.5μlを50μｌになるように水を加え、30μｌのミネラルオイルを重層し、調製した。反応条件は、PCR増幅装置（ASTEC社 PC-700）を用い、変成を94℃30秒、ア二―リングを55℃１分、伸長を72℃１分、の3段階の反応を３５回繰返し行った。上記のPCR反応によって、約1.2 kbpの大きさのDNA断片が増幅した。
約1.2kbpの大きさのDNA断片は、ジーンクリーン（Bio101社製）を用いて精製され、DNA断片溶液12μｌを得た。このDNA断片を発現ベクターに組み込む操作は、DNA断片溶液10μｌに、発現用プラスミドを0.5μg（pUC119）、宝酒造社の制限酵素（BamH1、EcoRI）を各1μｌ、宝酒造社の制限酵素用緩衝液K buffer×10倍液 2μlを加え、20μlになるように滅菌水を加え、混合した。この反応液を36℃、2時間反応した。
反応溶液からのDNA断片の回収、精製、ライゲーション反応、および、コンピテントセル（宝酒造社DH5α）への形質転換は実施例１２と同様の方法で行った。さらに、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を確認するための、酵素の発現と、活性測定方法も実施例１２と同様の方法で行い、本遺伝子産物が、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼであることを確認した。
結果として、AB10281株の産出するSIDH1をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号27に、また、アミノ酸配列を配列番号28に記載した。
＜本発明酵素である各種シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの諸性質の検討＞
実施例９の酵素精製により得られたAB10281株由来のSIDH1、SIDH2、SIDH3と、実施例１１のリコンビナント酵素として得られた大腸菌由来のydgJ遺伝子産物と、実施例１２のリコンビナント酵素として得られたアグロバクテリウム チュメファシエンスC58株のAtu4375遺伝子産物と、Atu3234遺伝子産物、バチルス ズブチリス168株のBG14057遺伝子産物、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株のXcc3438遺伝子産物、ならびに、AB10121株のAtu4375遺伝子産物と、Atu3234遺伝子産物の酵素としての諸性質を以下に示す方法で検討し、その結果を表５に記載した。
また、表６はアミノ酸配列の相同性を示した表であり、全てに共通したアミノ酸だけの相同性は、約5％で低い相同性であるが、似た性質を有するアミノ酸まで含めると、特にN末端の前半約30％のNADまたはNADP結合ドメインは、相同性が高いことが判った。さらにNADまたはNADPの酸化還元作用部位であるニコチンアミドの結合に関与する配列中央前半寄りのリジン−プロリン配列はよく保存されていた。リジン−プロリン配列からC末端側へ27番目のアスパラギンと、配列中央付近のアスパラギン酸−（3アミノ酸）−ヒスチジン配列もよく保存されており、推定三次元構造から基質結合に関与する重要な配列と考えられる。表中、共通した配列は「＊」印で、性質の似たアミノ酸は「：」印、または「．」印で表示し、さらに、リジン−プロリン配列、リジン−プロリン配列からC末端側へ27番目のアスパラギン、配列中央付近のアスパラギン酸−（3アミノ酸）−ヒスチジン配列は網掛けで示した。
分子量の比較は、AB10281株由来の本発明酵素は、分子量マーカー（プレステイン・スタンダード（ブロードレンジタイプ）：バイオラッド社製）を指標としたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、他の本発明酵素は遺伝子の全長から推定される酵素の分子量を算出した。その結果、酵素精製により得られたＡＢ１０２８１株由来の本発明酵素SIDH1、SIDH2、SIDH3の分子量は、それぞれ４６ｋダルトン、４２ｋダルトン、４０ｋダルトンであった。また、実施例１１のリコンビナント酵素として得られた大腸菌Ｋ−１２株由来のydgJ遺伝子由来の本発明酵素の分子量は３８．２ｋダルトン、実施例１２のリコンビナント酵素として得られたアグロバクテリウム チュメファシエンスC58株のAtu4375遺伝子、Atu3234遺伝子由来の本発明酵素の分子量はそれぞれ４１．３ｋダルトン、４２．４ｋダルトン、バチルス ズブチリス168株のBG14057遺伝子、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株のXcc3438遺伝子、ならびに、AB10121株のAtu4375遺伝子、Atu3234遺伝子由来の本発明酵素の分子量はそれぞれ４０．１ｋダルトン、３８．５ｋダルトン、４１．４ｋダルトン、４２．５ｋダルトンであった。つまり、本発明酵素である各種シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは３８〜４６ｋダルトンの分子量を示すことが判明した。
本発明酵素の会合特性は、ゲルろ過カラム（東ソー社：2000SWXL）で分画した画分の活性を測定し、相当する分子量画分から、分子量を計算し、これを、酵素の分子量で割った値を整数化した。その結果、本発明酵素である各種シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、80ｋ〜110ｋダルトンの分子量を示し、未変性状態では２または３量体を形成していると考えられた。
本発明酵素の補酵素の選択性は、反応液（200mMトリス緩衝液pH8.0、2%NADPHまたはNADH、1%シロ−イノソース）5μｌと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定した。必要があれば、酵素液は希釈を行なった。その結果、本発明酵素である各種シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、NADPH、NADHの何れも補酵素として使用できるが、表５に示すような補酵素相対活性を示した。NADPHに対して良く作用する酵素が多いことが判った。
本発明酵素の至適ｐHは、反応液（200mMリン酸緩衝液pH5.0〜9.0、2% NADPH、1%シロ−イノソース）5μｌと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定した。必要があれば、酵素液は希釈を行なった。その結果、本発明酵素である各種シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、表５に示すような至適ｐHを示した。つまり、本発明酵素はpH5〜９の広い範囲で作用することが判った。また、最大活性が酸性側のpH6付近の酵素と、中性域ｐH6.5〜7.5付近の酵素と、アルカリ性側のｐH7.5〜9付近にある酵素があることもわかった。
本発明酵素の熱安定性は、酵素液を所定の温度で10min間処理した後、冷却し、この酵素液と反応液（200mMリン酸緩衝液pH5.0〜9.0、2% NADPH、1%シロ−イノソース）5μｌを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定した。必要があれば、酵素液は希釈を行なった。20℃、10min処理区の活性を100％として相対活性を比較した。その結果、本発明酵素である各種シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの熱安定性は、表５に示すように各酵素によって異なり、酵素によりその安定性は40〜60℃まで異なることが判った。
本発明酵素の重金属効果は、反応液（200mMトリス緩衝液pH8.0、2% NADPH、1%シロ−イノソース、２mM金属塩）5μｌと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定した。必要があれば、酵素液は希釈を行なった。金属塩の種類は、CaCl2、CoCl2、ZnSO4、MgSO4、SnCl2、NiCl2、MnSO4を使用し、無添加区の活性を100％として相対活性を比較した。その結果、本発明酵素である各種シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは表５に示すように、少なくとも、Co2+イオンの存在下で活性化され、Sn2+イオンの存在下で阻害された。ほとんどの酵素はZn2+イオンの存在下で阻害されるが、バチルス ズブチリス168株由来の酵素は逆に、Zn2+イオンの存在下で活性化された。
本発明酵素のシロ−イノソースに対するKm値は、反応液（200mMトリス緩衝液pH8.0、2% NADPH、0.001〜2.5%シロ−イノソース）5μｌと、酵素液5μlを混合し、36℃30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定した。必要があれば、酵素液は希釈を行なった。値は逆数プロットされ、Km値を算出した。その結果、本発明酵素である各種シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼのKm値は表５に示すように、2.6〜12.6mMの範囲を示した。
本発明酵素の基質特異性は、酸化活性を指標にシロ−イノシトールに対する反応性に対する相対活性を測定した。使用したイノシトール異性体は、シロ−イノシトール（ＳＩ）、ミオ−イノシトール（ＭＩ）、Ｄ−キロ−イノシトール（ＤＣＩ）、Ｌ−キロ−イノシトール（ＬＣＩ）、エピ−イノシトール（ＥＩ）、ムコ−イノシトール（ＭｕＩ）、アロ−イノシトール（ＡＩ）、ネオ−イノシトール（ＮＩ）である。表５には相対活性が70％以上の区、70％未満20％以上の区、20％未満の区で表示した。
基質特異性の測定方法は、反応液（各種イノシトール異性体1%（ネオ−イノシトールのみ0.4％）、200mMトリス緩衝液pH8.0、0.002%NADP+、0.002%ジアホラーゼ、0.01%ニトロテトラゾリウムブルー）50μlと、酵素液50μlを混合し、25℃、3min毎に、545nmの吸光度の増加をマイクロプレートリーダーで測定した。時間毎の吸光度の増分から反応速度を算出した結果、酵素の種類別に基質特異性は若干異なり、イノシトール異性体構造との相関から、少なくとも、これらの酵素がシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性と、ミオ−イノシトール５−デヒドロゲナーゼ活性を有していることも判明した。
Figure 2005035774
Figure 2005035774
Figure 2005035774
＜本発明酵素を用いたシロ−イノシトールの製造＞
本製造法で使用する酵素は、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼと、本発明酵素の2種類が必要である。ここでは、バチルス ズブチリス168株 ATCC23857由来のBG10669遺伝子産物であるミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼのリコンビナント酵素と、本発明ＤＮＡによりコードされる（大腸菌K12株由来ydgJ遺伝子：配列番号１）本発明酵素のリコンビナント酵素を用いた実施例を示す。
始めに、バチルス ズブチリス168株 ATCC23857由来のBG10669遺伝子産物であるミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼのリコンビナント酵素を得るために以下の実験を行なった。バチルス ズブチリス168株由来のBG10669遺伝子のクローニング、かつ、リコンビナント酵素として発現させるために、以下の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
配列番号25：BG10669-F 5'- ttgggatccgatgagtttacgtattggcgtaattg -3'
配列番号26：BG10669-R 5'- aaactgcagttagttttgaactgttgtaaaagattgata -3'
ＰＣＲ反応は宝酒造社のEx taq反応用液を使用し、組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各１μｌ、Takara ExTaq 0.5μlを50μｌになるように水を加え、30μｌのミネラルオイルを重層し、調製した。反応条件は、PCR増幅装置（ASTEC社 PC-700）を用い、変成を94℃30秒、ア二―リングを53℃１分、伸長を72℃１分、の3段階の反応を３５回繰返し行った。上記のPCR反応によって、約1.0 kbpの大きさのDNA断片が増幅した。反応後、重層したミネラルオイルを0.3mlのヘキサンで抽出し、ヘキサン層を除去する操作を3回繰返し、1分間減圧することで、ミネラルオイルを除去した。この様にして得られた反応液50μｌからジーンクリーン（Bio101社）を用いてＰＣＲ断片を精製した。すなわち、キット添付のNaI溶液を300μｌ加えて混合し、10μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、4℃、15分静置した後に、遠心分離し、DNA断片の吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μｌを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液による洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、55℃で、15分加温した後、遠心分離を行い、DNA断片を含む上清12μｌを得た。
精製されたDNA断片を発現ベクターに組み込む操作は以下の用に行った。すなわち、DNA断片溶液10μｌに、発現用プラスミド（pUC118：宝酒造社製）を0.5μg、宝酒造社の制限酵素BamHI、PstIを各1μｌ、宝酒造社の制限酵素用緩衝液Ｋ buffer×10倍液 2μlを加え、20μlになるように滅菌水を加え、混合した。この反応液を36℃、2時間反応した。制限酵素反応後、ジーンクリーンを用いて、DNA断片と発現ベクターを単離し、これらをライゲーションさせた。すなわち、制限酵素反応液20μｌにキット添付のNaI溶液を300μｌ加えて混合し、10μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、4℃、15分静置した後に、遠心分離し、DNA断片と発現ベクターの吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のNew wash溶液500μｌを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このNew wash溶液による洗浄操作は3回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、15μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、55℃で、15分加温した後、遠心分離を行い、DNA断片と発現ベクターを含む上清12μｌを得た。この操作により、制限酵素によって生じた約50bp以下の小さなDNA断片は取り除かれ、目的とするDNA断片と、発現ベクターが得られた。
このようにして調製した溶液10μｌにTakara Ligation kit−I溶液（宝酒造社）を10μｌ加え、16℃、1時間反応させた。この溶液を、コンピテントセル（宝酒造社：DH5α）に形質転換させた。すなわち、４℃で解凍したコンピテントセル溶液６０μｌにライゲーション反応溶液を５μｌ加え、混合し、０℃３０分後、４２℃４５秒、０℃２分の処理を行い、これに５００μｌＳＯＣ溶液（２％バクト-トリプトン、0.5％酵母エキス、10mM NaCl、20mMグルコース、10mM MgSO4、10mM MgCl2）を加えて、３６℃で１時間回復培養させ、この培養液100μｌを、50μg/mlアンピシリン、40μg/ml X-gal（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside）、1ｍM IPTG（チオガラクトピラノシド）を含むLB寒天培地（１％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0、1.5％寒天）に塗布した。さらに37℃、16時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドの導入で形質転換された大腸菌が得られるため、これを選択した。こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（50μg/ml）を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（QIA filter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）によりプラスミドＤＮＡの分離および精製を行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡは、目的とするBG10669遺伝子に相当する約1.0ｋbpのDNA断片を有することが確認された。
次に、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を確認するため、コロニーとして単離した菌株を50μg/mlアンピシリンを含む100ml ＬＢ培地（１％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.0）30本に移植し、３６℃７時間培養し、この培養液100ml毎に200ｍMチオガラクトピラノシド溶液を0.3ｍｌ加え、さらに３６℃３時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集め、これを生理食塩水で1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を0.6％トライトンＸ100溶液3ｍｌに懸濁し４℃で超音波により菌を破砕した。この溶液を遠心分離し、上清の酵素溶液84mlを取り出し、上清に36ｇ硫安を加え、4℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去し、この沈殿物を75mlの20ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ7.0に溶解させ、再度遠心分離を行い、上清を20ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ7.0で平衡化したShephadex G-25カラム（ファルマシア製）（400ml）にアプライし、20ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ7.0で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、BG10669遺伝子産物であるの粗酵素液105ｍｌを得た。
ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ還元活性は以下のように測定した。反応液（200mM トリス緩衝液pH8.0、2% NADH、1%シロ−イノソース）５μｌと、酵素液５μｌを混合し、３６℃で３０min反応後ただちに、５００μｌの水を加えて、３４０nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験管のブランク値から、３４０nmの吸光度の減少量を測定した。必要があれば酵素液は希釈を行い、シロ−イノソースの還元活性があることを確認した。一方、酸化活性の測定方法は、反応液（ミオ−イノシトールまたはシロ−イノシトール1％、200mMトリス緩衝液pH8.0、0.002% NAD+、0.002%ジアホラーゼ、0.01%ニトロテトラゾリウムブルー）５０μｌと、酵素液５０μｌを混合し、２５℃、３min毎に、５４５nmの吸光度の増加をマイクロプレートリーダーで測定した。時間毎の吸光度の増分から反応速度を算出し、調製された酵素の酸化活性がミオ−イノシトールに活性を示し、シロ−イノシトールに活性を示さないことを確認した。
このようにして調製されたミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ酵素溶液と、実施例１１で調整されたシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ粗酵素溶液（30倍スケールである3L培養液から調製した酵素液105ml）を用いて、ミオ−イノシトールからシロ−イノシトールへの変換反応を行なった。反応溶液は、ミオ−イノシトール200ｇ、5％シロ−イノソース70ml、CoCl2 130mg、MgSO4・7H2O 250mgと、水を加えて750mlにし、50℃まで加熱して、ミオ−イノシトールを溶解させる。これを36℃まで冷却し、1N NaOH水溶液でpH8.0に調製し、水を加えて790mlにする。これに36℃で、ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼの粗酵素液105ｍｌ、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ粗酵素溶液105ｍｌ、NADP+ 70mgを加えて、約1Lになる溶液を、36℃で保温し、ゆっくり攪拌しながら、反応させる。反応液はpHが徐々に酸性になるため、1N NaOHでｐH8.0になるように調製する。42時間後、反応液中にシロ−イノシトールの結晶が生じ、白濁した反応液が得られる。この溶液をろ紙を用いて、ろ過し、結晶性シロ−イノシトール（湿重量73ｇ）を回収した。この固体に3Lの水を加えて、50℃で溶解させ、4.5Lになるように水を加えて、室温まで冷却し、得られた溶液を遠心分離（8,000 rpm 20分間）して、微量な不溶物を除去した上清液を、強塩基性陽イオン交換樹脂100ｍｌカラム、強酸性陰イオン交換樹脂100ｍｌカラム、活性炭50ｍｌカラムの順に通過させて溶出させた溶出液を得た後に、カラム洗浄のために500mlの水を順に通過させ溶出させた洗浄液と、溶出液を一緒にして、濃縮した。
濃縮は、溶液の量が少なくなると、シロ−イノシトールの微結晶が析出し始め、内容物が130ｇになるまで濃縮し、これを4℃まで冷却後、一晩放置した。放置後、スラリー状になった物質をろ過し、ろ紙上のシロ−イノシトールの結晶を少量の水で洗浄後、105℃で3hr乾燥させた。得られたシロ−イノシトールは白色の結晶（61ｇ）で、NMR分析、および、HPLC分析では、他に不純物は認められず、純度99％以上のものであった。ミオ−イノシトールからの収率は31％であった。また、ろ別された反応液は、まだ、使用可能であり、ミオ−イノシトールを64g溶解させると、さらに、結晶性シロ−イノシトールが析出した。
＜シロ−イノシトール・ホウ酸複合体の形成、および形成条件の検討＞
粉末のシロ−イノソース１００ｇを５００ｍｌの熱水に溶解し、室温まで冷却後、水を加えて９００ｍｌになるようにした。この溶液を５規定ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨ７．５に合わせ、さらに水を加えて、１リットルになるようにした。
この溶液に、攪拌しながら、NaBH4 ５．９ｇを粉末で徐々に１５分かけて加え、還元反応を行なった。反応溶液は反応熱により３８℃まで温度が上昇した。３０分後、３２℃まで冷却された反応液に、ホウ酸 67.5ｇとNaCl 72.2ｇを溶解させ、複合体形成溶液を調製した。この溶液のｐＨは5.9であった。
次に、８規定ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨ6.0に調整した複合体形成溶液を２００ｍｌ容の蓋付きのプラスチック容器に１００ｍｌ取り分け、さらに、８規定ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ7.0に調整した複合体形成溶液を同様の操作で１００ｍｌ取り分け、さらに、ｐＨ8.0、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、12.0および12.8になるように調整した複合体形成溶液も、順次、１００ｍｌ取り分けた。
このようにｐＨ調整された溶液は、徐々に沈殿を形成し始めた。１日おきに沈殿をろ別し、ろ液は８規定ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨを所定のｐＨに調整した後にもとの容器に戻し、得られた沈殿は乾燥後、重量を測定した。本来、還元によって生成するシロ−イノシトールが全てシロ−イノシトール・ホウ酸複合体になり、かつ、全てが沈殿として得られた場合、沈殿の重量は61.8ｇになるため、各ｐＨ調整された溶液から得られた沈殿の重量を１日おきに積算し、これを理論収量の61.8ｇで割った値を、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体沈殿の回収率とした。
このようにして得られた数値を、表にまとめると以下の様になった。
表中の灰色部分は、回収率が90％を超えた試験区を示す。
Figure 2005035774
表７に示されるように、処理ｐＨ9.5の試験区が最もシロ−イノシトール・ホウ酸複合体沈殿形成に適していることが判る。また、ｐＨ9.0、ｐＨ9.5、pH10.0の試験区は４日目までに90％以上の回収率を示し、回収率は延長しても94％で一定になることが判る。
ｐH9.5の試験区の７日目のろ液のNMR分析から、溶液中には、5.9％（ｗ／ｖ）のミオ−イノシトールと、約0.2%（ｗ／ｖ）のシロ−イノシトールが残留していることが判明した。つまり、0.2％（ｗ／ｖ）以上の濃度のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体は、本方法によって沈殿として取り出すことができることが判る。
＜シロ−イノソース還元混合液からシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させ、複合体を溶解した後、イオン交換樹脂を用いてシロ−イノシトールを遊離、脱塩する方法＞
粉末のシロ−イノソース１０ｇ（56mmol）を５０ｍｌの熱水に溶解し、室温まで冷却後、水を加えて９０ｍｌになるようにした。この溶液を５規定ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨ７．５に合わせ、さらに水を加えて、100ｍｌになるようにした。
この溶液に、攪拌しながら、NaBH4 0.59ｇを粉末で徐々に１５分かけて加え、還元反応を行なった。反応溶液は反応熱により36℃まで温度が上昇した。３０分後、31℃まで冷却された反応液に、ホウ酸 6.75ｇとNaCl 7.22ｇを溶解させ、複合体形成溶液を調製した。次に、この複合体形成溶液を5規定ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨ9.5に調整し、攪拌しながら、ｐＨスタット装置を取りつけ、５規定ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨ9.5を維持する様にした。３日後に複合体形成溶液中に析出した沈殿をろ過し、少量の水で洗浄し、乾燥後、5.71ｇ（20.5mmol）のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を得た。
得られたシロ−イノシトール・ホウ酸複合体5.71ｇに1.05規定の塩酸溶液を230ｍｌ加え、シロ−イノシトール・ホウ酸複合体を溶解し、溶解液を得た。この溶解液は、0.2規定の酸性溶液であった。次に、カラムに詰めた強酸性イオン交換樹脂（DuoliteC20、H+タイプ、住友化学）200ｍｌに溶解液を1分間に２ｍｌの流速で通過させ、得られた溶出液を、カラムに詰めた強塩基性イオン交換樹脂（DuoliteＡ116、ＯH-タイプ、住友化学）400ｍｌに通過させた。得られた溶出液を濃縮し、白色粉末3.52ｇ（19.5mmol）を得た。この白色粉末は、ＮＭＲによる分析で、シロ−イノシトールであることが判った。また、シロ−イノソースからの収率は35％であった。
＜シロ−イノソース還元混合液からシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させ、複合体を溶解した後、有機溶媒沈殿を用いてシロ−イノシトールを遊離、結晶化する方法＞
粉末のシロ−イノソース１０ｇ（56mmol）から、実施例１７に示す方法と同様の方法で調製した5.71ｇ（20.5mmol）のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を原料とした。
シロ−イノシトール・ホウ酸複合体5.71ｇを100ml容の蓋付き三角フラスコに攪拌子と一緒に入れ、22.8ｍｌの1.83規定の塩酸溶液を加えて、懸濁溶液を調製した。攪拌1時間後、メタノールを２３ｍｌ加えて、さらに攪拌した。５時間後、懸濁溶液を、ろ過し、固体を少量のメタノールで洗浄し、乾燥させ、粗シロ−イノシトール3.58ｇ（20.0mmol）を得た。
さらに、得られた粗シロ−イノシトール3.58ｇを230ｍｌの水に溶解し、強酸性イオン交換樹脂（DuoliteC20・H+タイプ）20ｍｌ、強塩基性イオン交換樹脂（DuoliteＡ116・ＯH-タイプ）40ｍｌを加えて攪拌した。攪拌30分後に、イオン交換樹脂をろ別し、得られたろ液を濃縮し、白色粉末3.41ｇ（18.9mmol）を得た。この白色粉末は、ＮＭＲによる分析で、シロ−イノシトールであることが判った。また、シロ−イノソースからの収率は34％であった。
＜シロ−イソースを還元した後、直接、シロ−イノシトールを遊離、結晶化させる方法＞
粉末のシロ−イノソース5ｇ（28mmol）を40ｍｌの熱水に溶解し、室温まで冷却後、この溶液を５規定ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨ７．５に合わせ、水を加えて45ｍｌになるようにした。
この溶液に、攪拌しながら、NaBH4 0.29ｇを粉末で徐々に１５分かけて加え、還元反応を行なった。反応溶液は反応熱により37℃まで温度が上昇した。３０分後、30℃まで冷却された反応液を、5規定塩酸を用いて、ｐH1.0に調整した。その後、水を加えて50ｍｌになるようにし、0.1規定の酸性溶液とした。次に、この溶液に、攪拌しながら、メタノール25mlを加えたところ、溶液は10分後から徐々に濁り始め、さらに、この懸濁溶液を24時間攪拌した。24時間後、懸濁溶液をろ過し、少量のメタノールで洗浄し、乾燥後、1.55ｇ（8.6mmol）の粗シロ−イノシトールを得た。
さらに、得られた粗シロ−イノシトール1.55ｇを120ｍｌの水に溶解し、強酸性イオン交換樹脂（DuoliteC20・H+タイプ）10ｍｌ、強塩基性イオン交換樹脂（DuoliteＡ116・ＯH-タイプ）20ｍｌを加えて攪拌した。攪拌30分後に、イオン交換樹脂をろ別し、得られたろ液を濃縮し、白色粉末1.51ｇ（8.3mmol）を得た。この白色粉末は、ＮＭＲによる分析で、シロ−イノシトールであることが判った。また、シロ−イノソースからの収率は30％であった。
 産業上の利用の可能性
本発明によれば、医薬品として利用価値があるシロ−イノシトールを、安価なミオ−イノシトールから、微生物変換または酵素反応のみで、直接に製造することができ、シロ−イノシトールを効率良く製造することができる。また、本発明の製造方法は、異性体が生じにくいという利点もある。
本発明のNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼを用いることにより、NAD+を反応液中に添加することなく、シロ−イノソースを製造することができる。さらに得られたシロ−イノソースを還元することにより、簡便かつ高効率で高純度のシロ−イノシトールを得ることができる。
本発明によれば、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液から、効率良くシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成せることができ、得られたシロ−イノシトール・ホウ酸複合体から高純度のシロ−イノシトールを効率よく簡便な操作で得ることができる。

Claims (46)

  1. アセトバクター属またはバークホルデリア属に属する微生物であって、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含む溶液中でミオ−イノシトールに作用させることにより、シロ−イノシトールを前記溶液中に生成蓄積させ、該溶液中からシロ−イノシトールを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法。
  2. 前記ミオ−イノシトールを含む溶液がミオ−イノシトールを含有する液体培地であり、前記微生物を、該液体培地中で培養することによりミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。
  3. 培養により得られた前記微生物の菌体を、前記溶液中でミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。
  4. 前記微生物が、アセトバクター・セルビシエ、アセトバクター・マローラム、またはバークホルデリア・アンドロポゴニスに属する微生物である請求項１〜３のいずれかの項に記載の製造方法。
  5. 前記微生物が、アセトバクター・エスピーAB10281株（FERM BP-10119）またはその変異株である、請求項1〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する、アセトバクター・エスピーAB10281株（FERM BP-10119）またはその変異株。
  7. 少なくとも以下の理化学的性質を有するNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ
    （ａ）作用：電子受容物質の存在下で、ミオ−イノシトールから電子を奪いシロ−イノソースを生成する反応を触媒する、
    （ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ4.5〜5.5において活性が極大値を示す、
    （ｃ）補因子：1モルの酵素に1モルのヘム鉄を含有する、
    （ｄ）阻害剤：１ｍＭのＳｎ2+イオンにより酵素活性が１％以下に阻害される、
    （ｅ）サブユニット構造：少なくとも分子量76kダルトンと46ｋダルトンのタンパク質を含有するヘテロマーである、
    （ｆ）基質特異性：Ｄ−キロ−イノシトール、ムコ−イノシトール、ミオ−イノシトールに反応し、Ｄ−キロ−1−イノソース、Ｌ−キロ−２−イノソース、シロ−イノソースへ、それぞれ、変換する。アロ−イノシトール、シロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、グルコースには反応しない。
  8. NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ生産能を有するアセトバクター属に属する微生物を培養し、培養された微生物の菌体から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼを分離精製することを特徴とする、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼの製造方法。
  9. 前記微生物がアセトバクター・エスピーAB10253株 （FERM BP-10136）である、請求項８記載の製造方法。
  10. ミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中で、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを溶液中から分離精製することを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法。
  11. ミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中で、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成させる工程、前記シロ−イノソースに還元剤を作用させてシロ−イノシトールを生成させる工程、及び前記シロ−イノシトールを分離精製する工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
  12. アセトバクター・エスピーのAB10253株を変異処理し、得られた変異株から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法。
  13. 微生物を含む天然試料の中から微生物を単離し、単離された微生物から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法。
  14. 請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法によって得られたシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを培地から分離精製することを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法。
  15. 請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法によって得られたシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させる工程、前記シロ−イノソースに還元剤を作用させてシロ−イノシトールを生成させる工程、及び前記シロ−イノシトールを分離精製する工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
  16. 下記の理化学的性質を有するシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ。
    反応：下記反応式に示すように、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する。
    Figure 2005035774
  17. さらに、下記の理化学的性質を有する、請求項１６に記載のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ。
    （１）分子量および会合特性 ： 38〜46ｋダルトン、２または３量体を形成する。
    （２）補酵素 ： NAD+若しくはNADP+又はNADH若しくはNADPHを補酵素とする。
    （３）活性化重金属 ： Co2+イオンの存在下で活性化される。
    （４）阻害重金属 ： Sn2+イオンの存在下で阻害される。
    （５）至適ｐH ： ｐH５〜９で活性を有する。
  18. 以下の（A）または（B）のタンパク質。
    （A）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （B）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
  19. 以下の（A）または（B）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （A）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （B）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
  20. 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
    （ａ）配列番号２７に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
    （ｂ）配列番号２７に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  21. 請求項１９または２０に記載のＤＮＡを含むベクター。
  22. 請求項１９または２０に記載のＤＮＡ、または請求項２１に記載のベクターを保持する形質転換微生物。
  23. 形質転換する宿主が大腸菌である請求項２２に記載の形質転換微生物。
  24. 請求項２２または２３に記載の形質転換微生物を培養し、培養物からシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの製造方法。
  25. 請求項１６に記載のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼと、NAD+またはNADP+存在下でミオ−イノシトールを酸化しシロ−イノソースを生成する反応を触媒するミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.18）とを共存させた溶液中、ｐH6.0〜8.5で、かつNAD+ またはNADP+存在下で、ミオーイノシトールを基質として、シロ−イノシトールへ酵素変換反応させることを特徴とする、シローイノシトールの製造方法。
  26. 溶液中に、シロ−イノソースを0.01〜3％になるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
  27. 溶液中に、シロ−イノソースを0.2〜0.5％になるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
  28. 溶液中に、Co塩および／または、Mg塩を0.01〜5.0mMになるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
  29. 溶液中に、Co塩および／または、Mg塩を0.2〜2.0mMになるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
  30. 溶液中のミオ−イノシトール濃度が5〜22％になるように調製し、酵素反応で生成したシロ−イノシトールを反応溶液中で結晶化させ、シロ−イノシトールを系外に結晶として、ろ別することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
  31. シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
    （Ａ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
  32. シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
    （ａ）配列番号２７に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
    （ｂ）配列番号２７に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
  33. シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
    （Ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
  34. シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
    （ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１または１３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
    （ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１または１３に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  35. シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液に、該混合液中に溶解したシロ−イノシトールの２倍モル以上の量のホウ酸及び金属塩を加え、かつ該混合液のｐＨを8.0〜11.0に調整してシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させる第１の工程、前記複合体を混合液から分離する第２の工程、分離した複合体を酸に溶解させてシロ−イノシトールとホウ酸に開裂させる第３の工程、第３の工程で得られた酸性溶液又は酸性懸濁液からシロ−イノシトールを単離精製する第４の工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
  36. 前記第１の工程において、加えるホウ酸及び金属塩の量が、前記混合液中に溶解したシロ−イノシトールの２倍モル以上、かつ３倍モル以下であることを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
  37. 前記第１の工程において、前記混合液のｐHを9.0〜10.0に調整することを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
  38. 前記金属塩が、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、Na2SO4、NaHSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、硼砂、KCl、KHCO3、K2CO3、K2SO4、KHSO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4、MgCl2、MgCO3、およびMgSO4からなる群より選ばれる１種または２種類以上の金属塩である、請求項３５に記載の製造方法。
  39. 前記シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液が、シロ−イノソースを含有する溶液中でシロ−イノソースを還元することにより得られるミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液である、請求項３５に記載の製造方法。
  40. 前記第３の工程において、前記複合体を酸に溶解させて得られた溶液を0.1規定以上の酸性に調整し、かつ、前記第４の工程において、前記酸性溶液を強酸性イオン交換樹脂、及び強塩基性イオン交換樹脂又はホウ酸選択的吸着樹脂に接触させた後、該酸性溶液からシロ−イノシトールを析出させることを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
  41. 前記第４の工程において、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に水溶性有機溶媒を加えてシロ−イノシトールを析出させることを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
  42. 前記水溶性有機溶媒がエタノール又はメタノールであり、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に対して、エタノールを0.3〜3倍容、又はメタノールを0.3〜5倍容加えることを特徴とする、請求項４１に記載の製造方法。
  43. 前記水溶性有機溶媒がエタノール又はメタノールであり、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に対して、エタノールを0.6〜1.5倍容、またはメタノールを0.9容〜２倍容加えることを特徴とする、請求項４１に記載の製造方法。
  44. シロ−イノソースを含有する溶液中において、シロ−イノソースを水素化ホウ素金属塩を用いて還元し、ミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液を得る第1の工程、前記混合液に酸を加えて混合液中のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を溶解させ、かつ溶液を0.01規定以上の酸性溶液に調整する第２の工程、及び前記酸性溶液に、水溶性有機溶媒をミオ−イノシトールが析出しない量で加えて、シロ−イノシトールのみを析出させる第３の工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
  45. 前記第３の工程において、加える水溶性有機溶媒がエタノール、メタノール又は１−プロパノールであり、前記酸性溶液に対して、エタノールを0.2〜0.4倍容、メタノールを0.2〜0.8倍容、又は１−プロパノールを0.2〜0.4倍容加えることを特徴とする、請求項４４に記載の製造方法。
  46. 前記第３の工程において、加える水溶性有機溶媒がエタノール、メタノール又は１−プロパノールであり、前記酸性溶液に対して、エタノールを0.35〜0.45倍容、メタノールを0.45〜0.55倍容、又は１−プロパノールを0.35〜0.45倍容加えることを特徴とする、請求項４４に記載の製造方法。
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