PT1674578E - Processo para a produção de cilo-inositol - Google Patents
Processo para a produção de cilo-inositol Download PDFInfo
- Publication number
- PT1674578E PT1674578E PT04817164T PT04817164T PT1674578E PT 1674578 E PT1674578 E PT 1674578E PT 04817164 T PT04817164 T PT 04817164T PT 04817164 T PT04817164 T PT 04817164T PT 1674578 E PT1674578 E PT 1674578E
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- inositol
- solution
- scyllo
- myo
- added
- Prior art date
Links
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 698
- CDAISMWEOUEBRE-CDRYSYESSA-N scyllo-inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-CDRYSYESSA-N 0.000 title claims abstract description 367
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 104
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 82
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 claims abstract description 194
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims abstract description 174
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 60
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 55
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 claims abstract description 12
- 241000589234 Acetobacter sp. Species 0.000 claims description 23
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 17
- 241000776564 Acetobacter cerevisiae Species 0.000 claims description 8
- 241000776559 Acetobacter malorum Species 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 278
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 276
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 156
- VYEGBDHSGHXOGT-HYFGLKJPSA-N 2,4,6/3,5-pentahydroxycyclohexanone Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)C(=O)[C@@H](O)[C@@H]1O VYEGBDHSGHXOGT-HYFGLKJPSA-N 0.000 abstract description 109
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical class OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 94
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 abstract description 93
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 abstract description 68
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 55
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 54
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 abstract description 49
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 42
- 108010050450 myo-inositol 2-dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 31
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 abstract description 31
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 abstract description 22
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 20
- 229910052751 metal Chemical class 0.000 abstract description 14
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 abstract description 14
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 abstract description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 abstract 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 659
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 277
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 207
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 193
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 160
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 130
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 128
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 119
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 115
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 104
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 90
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 87
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 74
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 74
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 73
- 239000000047 product Substances 0.000 description 67
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 66
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 53
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 50
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 49
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 48
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 47
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 45
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 43
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 43
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 42
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 42
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 42
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 42
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 40
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 40
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 38
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 37
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 34
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 33
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 31
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 31
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 31
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 30
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 30
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 29
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 28
- 101150085694 ydgJ gene Proteins 0.000 description 27
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 26
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 25
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 23
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 23
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 23
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 23
- 241000589649 Xanthomonas campestris pv. campestris Species 0.000 description 22
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 21
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 20
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 20
- CDAISMWEOUEBRE-NIPYSYMMSA-N epi-inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O CDAISMWEOUEBRE-NIPYSYMMSA-N 0.000 description 19
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 19
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 19
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 19
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 18
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 18
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 17
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 17
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 17
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 17
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 16
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 16
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 15
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 15
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 15
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 15
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 15
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 15
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 15
- CDAISMWEOUEBRE-LKPKBOIGSA-N 1D-chiro-inositol Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-LKPKBOIGSA-N 0.000 description 14
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 14
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 14
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 14
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 14
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 13
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 13
- 241000589159 Agrobacterium sp. Species 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 12
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 12
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 12
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 12
- 229910052718 tin Inorganic materials 0.000 description 12
- CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroindophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C1 CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102100034289 Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 Human genes 0.000 description 11
- 101000641031 Homo sapiens Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 Proteins 0.000 description 11
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 10
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 10
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 10
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 10
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 9
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 9
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 9
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 8
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 8
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 8
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 7
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 7
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 6
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 6
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 6
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 6
- 150000004001 inositols Chemical class 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 6
- CDAISMWEOUEBRE-GNIYUCBRSA-N muco-inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GNIYUCBRSA-N 0.000 description 6
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- YSPIHUWHLMNFOV-UHFFFAOYSA-N 4-N-[4-[5-(cyclopropylmethyl)-1-methylpyrazol-4-yl]-5-fluoropyrimidin-2-yl]cyclohexane-1,4-diamine Chemical compound Cn1ncc(c1CC1CC1)-c1nc(NC2CCC(N)CC2)ncc1F YSPIHUWHLMNFOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010009512 Glucose-fructose oxidoreductase Proteins 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 4
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 4
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000010718 Oxidation Activity Effects 0.000 description 4
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 4
- 230000010757 Reduction Activity Effects 0.000 description 4
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 241001135520 Robbsia andropogonis Species 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M sodium;(2r)-2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]oxirane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].C=1C=C(Cl)C=CC=1OCCCCCC[C@]1(C(=O)[O-])CO1 RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 3
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150040736 K12 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 3
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241001583810 Colibri Species 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013081 microcrystal Substances 0.000 description 2
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 2
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000011135 tin Substances 0.000 description 2
- 238000012982 x-ray structure analysis Methods 0.000 description 2
- VYEGBDHSGHXOGT-ZLIBEWLCSA-N (2r,3s,5r,6s)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexan-1-one Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(=O)[C@@H](O)[C@@H]1O VYEGBDHSGHXOGT-ZLIBEWLCSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- HFZWRUODUSTPEG-UHFFFAOYSA-N 2,4-dichlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl HFZWRUODUSTPEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SPTMROWPYQRZSX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-N-(5-methyl-3-isoxazolyl)-1,1,4-trioxo-3H-1$l^{6},2-benzothiazine-3-carboxamide Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C1C(=O)NC=1C=C(C)ON=1 SPTMROWPYQRZSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000283763 Acetobacter aceti Species 0.000 description 1
- 235000007847 Acetobacter aceti Nutrition 0.000 description 1
- 241001497543 Acetobacter indonesiensis Species 0.000 description 1
- 241001310537 Acetobacter orientalis Species 0.000 description 1
- 241001497697 Acetobacter orleanensis Species 0.000 description 1
- 241000589212 Acetobacter pasteurianus Species 0.000 description 1
- 241000009881 Aega Species 0.000 description 1
- 101100125460 Arabidopsis thaliana IDH3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150054493 BG gene Proteins 0.000 description 1
- FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N Benz[a]pyrene Chemical compound C1=C2C3=CC=CC=C3C=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001674044 Blattodea Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000032686 Gluconacetobacter liquefaciens Species 0.000 description 1
- 101150042441 K gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 241000589216 Komagataeibacter hansenii Species 0.000 description 1
- 239000012448 Lithium borohydride Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical group CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 229910004809 Na2 SO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021204 NaH2 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 239000007868 Raney catalyst Substances 0.000 description 1
- NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N Raney nickel Chemical compound [Al].[Ni] NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000564 Raney nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910006130 SO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100386054 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CYS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229910021626 Tin(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000999 acridine dye Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- VWPUAXALDFFXJW-UHFFFAOYSA-N benzenehexol Chemical compound OC1=C(O)C(O)=C(O)C(O)=C1O VWPUAXALDFFXJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-JMVOWJSSSA-N cis-inositol Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-JMVOWJSSSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002386 heptoses Chemical class 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004140 ketosis Effects 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- CHKVPAROMQMJNQ-UHFFFAOYSA-M potassium bisulfate Chemical compound [K+].OS([O-])(=O)=O CHKVPAROMQMJNQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000343 potassium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000011150 stannous chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 101150035983 str1 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003538 tetroses Chemical class 0.000 description 1
- AXZWODMDQAVCJE-UHFFFAOYSA-L tin(II) chloride (anhydrous) Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Sn+2] AXZWODMDQAVCJE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000404 tripotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019798 tripotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C29/00—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring
- C07C29/132—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by reduction of an oxygen containing functional group
- C07C29/136—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by reduction of an oxygen containing functional group of >C=O containing groups, e.g. —COOH
- C07C29/143—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by reduction of an oxygen containing functional group of >C=O containing groups, e.g. —COOH of ketones
- C07C29/145—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by reduction of an oxygen containing functional group of >C=O containing groups, e.g. —COOH of ketones with hydrogen or hydrogen-containing gases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
Description
DESCRIÇÃO
PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE CILO-INOSITOL
Domínio técnico A presente invenção tem por objecto um processo de produção de cilo-inositol a partir de mio-inositol por meio de uma conversão microbiana com Acetobacter. 0 cilo-inositol pode ser utilizado como agente terapêutico para o tratamento de uma doença de Alzheimer, como matéria-prima para a síntese de substâncias bioactivas ou uma matéria-prima para a síntese de compostos de cristais líquidos. Técnica anterior 0 mio-inositol é uma substância conhecida de ocorrência natural representada pela fórmula estrutural espacial (A) que se segue.
OH
(A) A cilo-inosose é uma substância conhecida representada pela fórmula estrutural espacial (B).
(B) 1
Além disso, o cilo-inositol é uma substância conhecida representada pela fórmula estrutural espacial (C).
0 cilo-inositol é um dos estereoisómeros do mio-inositol e é uma substância que se encontra amplamente entre animais e plantas. A cilo-inosose é um composto com uma estrutura em que um grupo axial de hidroxilo na segunda posição do mio-inositol está oxidado e existe geralmente como um composto natural. 0 cilo-inositol é uma substância que se espera que tenha aplicações como um agente terapêutico para uma doença de Alzheimer (ver o documento 1 não pertencente a patentes), uma matéria-prima para a sintese de substâncias bioactivas (documento 1 das patentes) ou uma matéria-prima para a síntese de compostos de cristais líquidos (documento 2 das patentes) .
Exemplos de um processo para a produção de cilo-inosose ou de cilo-inositol por meio de um processo de síntese química incluem: (i) um processo de obtenção de cilo-inositol por meio da redução de hexa-hidroxibenzeno com níquel de Raney (documento 2 não pertencente a patentes); (ii) um processo de obtenção de cilo-inositol por meio da redução da cilo-inosose obtida a partir de um derivado de glicofuranose através de uma reacção que envolve cinco etapas (documento 3 não pertencente a patentes); (iii) um processo de obtenção de cilo-inositol utilizando como matéria-prima cis-trioxa-tris-homobenzeno através de uma reacção que envolve quatro etapas 2 ou mais (documento 4 não pertencente a patentes); e (iv) um processo de obtenção de cilo-inositol incluindo a oxidação de mio-inositol com um catalisador de platina para assim se obter cilo-inosose e submetendo a cilo-inosose a esterificação seguida de redução e de hidrólise (ver documento 2 das patentes).
Como processo de conversão de mio-inositol em cilo-inositol utilizando um microrganismo, conhece-se um processo utilizando uma bactéria pertencente ao género Agrobacterium (documento 3 das patentes) . Contudo, este processo não se aplica para uma produção á escala industrial por causa do baixo rendimento de cilo-inositol e da geração de outros produtos convertidos. Entretanto, conhece-se uma bactéria que pertence ao género Acetobacter (ver o documento 5 não pertencente a patentes) para actuar no mio-inositol para absorver oxigénio e assim oxidar o mio-inositol em cilo-inosose. Contudo, o seu mecanismo detalhado ainda não está bem estudado. A enzima que oxida o mio-inositol em cilo-inosose (mio-inositol 2-desidrogenase) tem sido referenciada num certo número de organismos tais como animais, algas, leveduras e bactérias e é uma enzima que existe em larga escala na natureza. Exemplos de um microrganismo tipico que comporta a enzima incluem Aerobacter aerogenes (ver o documento 6 não pertencente a patentes), bactérias que pertencem ao género Bacillus (documentos 7 e 8 não pertencentes a patentes; documentos 4-6 das patentes) e bactérias pertencendo ao género Pseudomonas (documentos 9 e 10 não pertencentes a patentes) .
Contudo, as mio-inositol 2-desidrogenases, nesses relatórios, são enzimas dependentes de NAD+, por isso 3 necessitam de NAD+ ou de NADP+ para a oxidação. Quando a enzima é submetida a uma reacção à escala industrial, deve-se utilizar uma produção por fermentação de modo a reciclar essas co-enzimas, resultando na decomposição de parte dos substratos. Além disso, tem havido problemas na produção à escala industrial de modo que se deve manter baixa a concentração do substrato.
Entretanto, há um relato da presença de uma cilo-inositol desidrogenase num cérebro de bovino e num tecido gordo de uma barata (documento 11 não pertencente a patentes). Quando a cilo-inosose, como substrato, é reduzida por esta enzima com NADPH, há a referência de que se gera tanto cilo-inositol como mio-inositol. Contudo, as enzimas têm pouca especificidade para o substrato, não se utilizou uma enzima altamente purificada, por isso a enzima pode ser uma desidrogenase alcoólica com uma baixa especificidade para o substrato. Por isso, a enzima não está descrita no Handbook of Enzymes (publicado pela Asakura Shoten). Tal como descrito antes, embora existam relatórios sobre animais, ainda não foi confirmado se estes relatórios são verdadeiros.
Além disso, existe também um processo conhecido de produção de cilo-inositol por meio de redução química da cilo-inosose produzida por oxidação microbiana (documento 7 das patentes) . Dado que a substância obtida pela redução química de cilo-inosose é uma mistura de cilo-inositol e mio-inositol, a mistura tem de ser dessalinizada e purificada, seguida de separação do cilo-inositol com baixa solubilidade, a partir da solução concentrada por cristalização. Assim, esses processos exigem muitas operações e assim há espaço para melhorias no que respeita ao rendimento de cilo-inositol. Nestas circunstâncias, pretende-se o desenvolvimento de um processo de produção de cilo-inositol 4 purificado a partir de uma mistura de cilo-inositol e mio-inositol que se obtém por redução de cilo-inosose ou similar, para produzir silo-inositol convenientemente e eficientemente.
Quando se reduz cilo-inosose utilizando NaBH4 em solução, a solução, depois da reacção, contém mio-inositol, cilo-inositol e uma pequena quantidade de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico. Para esse complexo de cilo-inositol/ácido bórico já se conhece um processo de obtenção que envolve cilo-inositol: filtração do complexo como precipitado; dissolução do precipitado em ácido sulfúrico diluído; adição de metanol para o submeter a azeotropia com ácido bórico; eliminação do ácido bórico; e dessalinização da solução remanescente utilizando uma resina permutadora de iões (documento 12 não pertencente a patentes). 0 complexo de cilo-inosose/ácido bórico é uma substância representada pela fórmula estrutural espacial (D) que se segue.
OH
Contudo, no processo descrito antes de redução de cilo-inosose utilizando NaBH4, a relação do complexo de cilo-inositol/ácido bórico gerado é baixa e também se gera cilo-inositol na solução. Por isso, o complexo e os componentes na solução têm de ser separados para assim se obter o cilo-inositol de cada um deles. Além disso, é necessária uma 5 grande quantidade de um dissolvente orgânico para se obter o cilo-inositol a partir do complexo, havendo um grande espaço de melhoria do ponto de vista económico. Assim, procura-se um processo para produzir cilo-inositol convenientemente e eficientemente numa produção à escala industrial.
[Documento [Documento [Documento [Documento [Documento [Documento [Documento [Documento Biological 1 de patente] Patente 2 de patente] DE 3.405.663
3 de patente] JP09-140388A
4 de patente] JP04-126075A
5 de patente] JP05-192163A
6 de patente] JP06-007158A
The Journal of 7 de patente] JP2003-102492A 1 não contido em patentes^
Chemistry (US), 2000, vol.275, No.24, p.18495- 18502 [Documento 2 não contido em patentes] Journal of the
American Chemical Society (US), 1948, vol.70, p.2931-2935) [Documento 3 não contido em patentes] Journal of the
American Chemical Society (US), 1968, vol.70, p.2931-3290) [Documento 4 não contido em patentes] Angewandte Chemie (Alemanha), 1973, vol.85 p.1110-1111 [Documento 5 não contido em patentes] The Journal of
Biological Chemistry (US), 1948, vol.174, p.173-188 [Documento 6 não contido em patentes] Archives of Biochemistry and Biophysics (US), 1956, J, Larner et al., vol.60, p.352-363 [Documento 7 não contido em patentes] The Journal of
Biological Chemistry (US), 1979, vol. 254, p.7684-7690 [Documento 8 não contido em patentes] Microbiology (US) , 1994, vol.140, p.2289-2298 [Documento 9 não contido em patentes] Monatshefte fur
Chemie (Alemanha), 1969, vol.100 p.1327-1337 6 [Documento 10 não contido em patentes] Journal of Bacteriology (US), 1977, vol.131, p.872-875 [Documento 10 não contido em patentes] Biochemical and Biophysical Research Communications (US), vol.68, p.1133, 1976 [Documento 12 não contido em patentes] Journal of Organic Chemistry (US), 1958, vol.23, p.329-330
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Constitui um objecto da presente invenção providenciar um processo de produção de cilo-inositol directamente a partir de mio-inositol, com rendimentos elevados, por meio apenas de uma conversão microbiana.
Os requerentes da presente invenção estudaram para pesquisar um microrganismo capaz de produzir cilo-inosose a partir de mio-inositol e encontraram uma bactéria pertencente ao género Acetobacter que se separou da natureza (estirpe AB 10253). A estirpe foi depositada no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology com o número de acesso FERM P-18868 (número internacional de depositário FERM BP-10136). Utilizou-se esta estirpe para estabelecer um processo de produção de cilo-inosose partir de mio-inositol e um processo de produção de cilo-inositol a partir da cilo-inosose por meio da redução quimica (JP 2003-102492 A).
Em seguida, para se aumentar a capacidade de a converter em cilo-inosose, a estirpe foi submetida a um processo de geração por meio de uma mutação. Por meio desta operação, os requerentes verificaram que existem algumas estirpes que reduzem biologicamente a cilo-inosose gerada a partir de mio-inositol e geraram uma pequena quantidade de cilo-inositol, 7 entre as estirpes mutantes. Depois, os requerentes da presente invenção submeteram essas estirpes a um processo de geração por mutação de modo a obter-se uma estirpe que produz e acumula principalmente cilo-inositol directamente a partir de mio-inositol por meio apenas da conversão por meio de uma cultura. Como resultado, tiveram sucesso na obtenção de uma estirpe mutante que cumpre o objectivo, isto é, uma estirpe que tenha adquirido a capacidade para reduzir a cilo-inosose gerada pela redução de mio-inositol em cilo-inositol e acumulando o cilo-inositol num meio.
Além disso, embora a capacidade de conversão seja inferior à da estirpe AB10253, encontrou-se, na natureza, estirpes capazes de gerarem cilo-inositol a partir de mio-inositol. A identificação utilizando as suas sequências de nucleótidos do ARN de 16Sr confirmou que essas estirpes são microrganismos, cada um deles pertencendo a Acetobacter cerevisiae, Acetobacter malorum ou Burkholderia andropogonis.
Os requerentes da presente invenção verificaram que o cilo-inositol pode ser eficientemente produzido utilizando aqueles microrganismos.
Os requerentes da presente invenção consideraram que se se puder adquirir uma enzima capaz de converter eficientemente mio-inositol em cilo-inosose, é possível a produção eficiente de cilo-inosose a partir de uma elevada concentração de mio-inositol no substrato, utilizando essa enzima. Também consideraram que se uma estirpe com uma elevada actividade dessa enzima pode ser isolada por rastreio, é possivel utilizar essa estirpe para a produção de cilo-inosose.
Na hipótese de haver um novo tipo de mio-inositol 2-desidrogenase independente de NAD+, que até agora não era conhecida, capaz de catalisar uma reacção de conversão a partir de mio-inositol em cilo-inosose, os requerentes da presente invenção fizeram estudos aprofundados para obter essa enzima. Como resultado, verificaram que a mio-inositol 2-desidrogenase independente de NAD+ está presente na estirpe AB10253 de Acetobacter sp. pertencendo ao género de Acetobacter. Os requerentes da presente invenção tiveram sucesso na produção eficiente de cilo-inosose utilizando esta enzima ou um microrganismo com uma actividade elevada desta enzima e na produção eficiente de cilo-inositol com uma elevada pureza, reduzindo a cilo-inosose obtida.
Em seguida, os requerentes da presente invenção estudaram como é que o mio-inositol se converte no cilo-inositol nas células microbianas da estirpe que produz cilo-inositol directamente a partir de mio-inositol. Como resultado, um grupo hidroxilo, na segunda posição de mio-inositol está oxidado de uma forma dependente do oxigénio para gerar cilo-inosose e depois forma-se cilo-inositol por meio da função de uma enzima com actividade de redução de cilo-inosose para cilo-inositol de uma forma dependente de NADH ou de NADPH. Com base nessa actividade, os requerentes tiveram sucesso na purificação de uma enzima com actividade de redução de cilo-inosose para cilo-inositol. Também verificaram que esta enzima tem uma actividade para reduzir especificamente, sob o ponto de vista estereoquimico, cilo-inosose para cilo-inositol de uma forma dependente de NADPH e uma actividade para oxidar cilo-inositol para cilo-inosose de uma forma dependente de NADP+ e que se designa por "cilo-inositol desidrogenase". Além disso, esta enzima tem capacidade para oxidar um grupo hidroxilo na quinta posição 9 de mio-inositol, por isso esta enzima pode também ser referida como mio-inositol 5-desidrogenase.
Além disso, os requerentes tiveram sucesso na clonagem de genes, cada um deles codificando uma cilo-inositol desidrogenase por meio de RCP a partir de genomas de Escherichia coli, os géneros Agrobacterium, Bacillus subtilis e Xanthomonas campestris.
Além disso, dado que a enzima realiza uma reacção de oxidação-redução de uma forma dependente de NAD+ ou NADP+, os requerentes da presente invenção consideraram que o cilo-inositol pode ser convertido directamente a partir de mio-inositol por via da cilo-inosose combinando a enzima e uma mio-inositol 2-desidrogenase conhecida (com actividade para reduzir cilo-inosose para mio-inositol de uma forma dependente de NAD+ ou NADP+: EC 1.1.1.18) (ver: FIG 1) e tiveram sucesso.
Além disso, os requerentes da presente invenção consideraram que, para produzir eficientemente cilo-inositol a partir de uma mistura liquida contendo cilo-inositol e açúcares neutros tais como mio-inositol que se obtém por redução da cilo-inosose, é vantajoso formar um complexo de cilo-inositol/ácido bórico. Com base nestas considerações, os requerentes da presente invenção estudaram com profundidade um processo para fazer contactar eficientemente apenas cilo-inositol numa mistura líquida contendo cilo-inositol e mio-inositol nesse tal complexo de cilo-inositol/ácido bórico. Como resultado, verificaram que um complexo de cilo-inositol/ácido bórico que consiste em cilo-inositol, ácido bórico e um ião metálico, tem uma associação específica e é um complexo com baixa solubilidade que é diferente de outros complexos de açúcares neutros. Além disso, os requerentes 10 verificaram que o complexo de cilo-inositol/ácido bórico forma-se eficazmente e precipita por meio de: adição de ácido bórico e um sal de metal em quantidades que duplicam ou mais o número de moles, preferencialmente duas ou três vezes mais do que o cilo-inositol dissolvido numa mistura liquida; e mantendo a solução em condições alcalinas de pH 8,0 a 11,0, preferencialmente pH 9,0 a 10,0. Nestas condições, formou-se o complexo de cilo-inositol/ácido bórico a partir de uma mistura liquida contendo cilo-inositol e açúcares neutros tais como mio-inositol. Depois, dissolveu-se o complexo num ácido, seguido da purificação utilizando uma resina permutadora de iões ou um dissolvente orgânico solúvel em água e assim produz-se eficientemente cilo-inositol.
Assim se completou a presente invenção.
Isto é, a presente invenção tem por objecto o seguinte. (1) Um processo para produzir cilo-inositol compreendendo: permitir que um microrganismo capaz de converter mio-inositol em cilo-inositol e pertencendo ao género Acetobacter reaja com mio-inositol numa solução contendo mio-inositol para produzir e acumular cilo-inositol na solução; e recolher o cilo-inositol a partir da solução. (2) Um processo de acordo com (1), em que a solução que contém mio-inositol é um meio liquido contendo mio-inositol e deixa-se o microrganismo reagir com mio-inositol fazendo uma cultura do microrganismo num meio liquido. 11 (3) Um processo de acordo com (1), em que se deixa reagir as células, obtidas por meio de uma cultura do microrganismo, com mio-inositol na solução. (4) Um processo de acordo com uma qualquer de (1) a (3) , em que o microrganismo é um microrganismo que pertence a Acetobacter cerevisiae ou Acetobacter malorum. (5) Um processo de acordo com uma qualquer de (1) a (3) , em que o microrganismo é a estirpe AB10281 de Acetobacter sp. (FERM BP-10119) ou uma estirpe mutante desta. (6) Estirpe AB10281 de Acetobacter sp. (FERM BP-10119) ou uma estirpe que é mutante desta com uma capacidade para converter mio-inositol em cilo-inositol.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A fig. 1 mostra um esquema do principio de produção do cilo-inositol por combinação de enzimas.
DESCRIÇÃO DOS ENQUADRAMENTOS PREFERIDOS 1. Processo de produção de cilo-inositol utilizando um microrganismo pertencendo ao género Acetobacter
Um enquadramento da presente invenção tem por objecto um processo de produção de cilo-inositol compreendendo a produção e a acumulação de cilo-inositol numa solução contendo mio-inositol fazendo reagir o mio-inositol com um microrganismo que pertence ao género Acetobacter e que tem a capacidade de converter mio-inositol em cilo-inositol; e recolhendo o cilo-inositol da solução. 12 0 microrganismo a ser utilizado no processo de produção da presente invenção é um microrganismo que pertence ao género Acetobacter e tem uma capacidade para converter mio-inositol em cilo-inositol. Aqui, exemplos de microrganismos que pertencem ao género Acetobacter incluem Acetobacter cerevisiae, Acetobacter malorum, Acetobacter orleanensis, Acetobacter indonesiensis, Acetobacter orientalis, Acetobacter aceti, Acetobacter liquefaciens, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter hansenii e as suas estirpes não identificadas (sp.).
Desses, são particularmente preferidos Acetobacter cerevisiae e Acetobacter malorum. A frase "uma capacidade para converter mio-inositol em cilo-inositol" refere-se, por exemplo, a uma capacidade de um microrganismo para acumular cilo-inositol num meio quando o microrganismo é posto em cultura num meio contendo mio-inositol.
Um exemplo especifico do microrganismo inclui a estirpe AB 10281 de Acetobacter sp. A estirpe é uma estirpe obtida por mutação da estirpe AB 10253 de Acetobacter sp. (FERM BP-10136) para conferir uma capacidade para converter mio-inositol em cilo-inositol. A estirpe foi depositada na International Patent Organism Depositary, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (código postal: 305-8566, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japão) com o número de acesso FERM P-19639 em 20 de Janeiro de 2004 depois convertido no depósito internacional de acordo com o Tratado de Budapeste a que foi atribuído o número de acesso FERM BP-10119. A estirpe AB10253 de Acetobacter sp. foi depositada no International Patent Organism Depositary, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology com o 13 número de acesso FERM P-18868 em 24 de Maio de 2002, depois depois convertido no depósito internacional de acordo com o Tratado de Budapeste e depositado com o número de acesso FERM BP-10136.
As estirpes derivadas de um microrganismo que pertence ao género Acetobacter tal como a estirpe AB10281 de Acetobacter sp. ou a estirpe AB10253 de Acetobacter sp. podem também ser utilizadas. Essas estirpes derivadas podem ser obtidas por mutação do microrganismo e selecção de uma estirpe que tenha a propriedade de converter selectivamente e directamente o mio-inositol em cilo-inositol, entre as estirpes nas quais se introduziu uma mutação. Exemplos de um processo de mutação incluem um processo fisico de mutação tal como com uma radiação de UV ou uma radiação de rádio, assim como um processo de mutação quimica que utiliza agentes de mutação incluindo N-nitrosoguanidina, metano-sulfonato de etilo, nitrito, metano-sulfonato de metilo, um corante de acridina, benzopireno, sulfato de dimetilo e similares.
Um exemplo de um processo de reacção do microrganismo descrito antes com mio-inositol numa solução contendo o mio-inositol inclui um processo de cultura do microrganismo da presente invenção num meio liquido contendo mio-inositol.
Neste caso, a composição do meio liquido a ser utilizada não está particularmente limitada desde que se atinja o objectivo da presente invenção. Um meio liquido pode ser qualquer meio que contenha mio-inositol como material a ser convertido em cilo-inositol, para além das fontes de carbono, fontes de azoto, nutrientes orgânicos, sais inorgânicos e similares. Pode-se utilizar tanto um meio sintético como um meio natural. Adiciona-se o meio líquido com 0,1 % a 40 %, mais preferencialmente 10 % a 30 % de mio-inositol e, 14 preferencialmente é adicionado com: 0,1 % a 20 %, mais preferencialmente 0,3 % a 5 % de glicerol, sacarose, maltose ou um amido como fonte de carbono; e 0,01 % a 5,0 %, preferencialmente 0,5 % a 2,0 % de um extracto de levedura, peptona, ácido de casamino, sulfato de amónio, cloreto de amónio, nitrato de amónio, ureia ou similar como fonte de azoto. Além disso, se necessário, também se pode adicionar ao meio sais inorgânicos, cada um deles capaz de formar um ião de sódio, potássio, cálcio, magnésio, cobalto, manganês, zinco, ferro, cobre, molibdénio, ácido fosfórico, ácido sulfúrico ou similares. A concentração de iões de hidrogénio na solução da cultura não tem necessariamente de ser controlada. Contudo, o cilo-inositol é produzido com eficácia por meio de uma cultura em condições ajustadas preferencialmente a pH de 4 a 10, mais preferencialmente a pH de 5 a 9.
As condições de cultura variam consoante o tipo de meio. Contudo, a temperatura da cultura é de 12 a 35 °C, preferencialmente de 20 a 27 °C. A cultura pode ser realizada aerobicamente, por exemplo, agitando o meio liquido ou por aeração com ar ou um gás oxigenado no meio liquido. Durante a cultura principal, o mio-inositol oxida num estádio inicial da cultura para gerar cilo-inosose e depois a cilo-inosose reduz-se, num organismo vivo, numa etapa posterior, para assim gerar o cilo-inositol. Uma outra cultura resulta numa decomposição gradual do cilo-inositol. Por isso, um período de cultura pode ser até ao momento em que a acumulação do cilo-inositol se torna na quantidade máxima ou na quantidade requerida e é geralmente de 1 a 10 dias, preferencialmente de 3 a 8 dias.
Alternativamente, as células de um microrganismo obtido por cultura podem reagir com mio-inositol numa solução 15 contendo mio-inositol. Aqui, para as células obtidas por cultura, podem obter-se células de um microrganismo de cultura em condições de cultura apropriadas ou podem reutilizar-se células separadas e recolhidas do caldo de cultura de um microrganismo utilizado para a produção de cilo-inositol. A recolha das células, para se obter as células, pode ser realizada por um processo conhecido tal como separação centrífuga ou filtração.
Fazendo reagir o microrganismo com mio-inositol, tal como descrito antes, tal como descrito antes, o cilo-inositol acumula-se na solução. Pode-se aplicar um processo geral para o isolamento e a purificação de uma substância neutra, aquosa, normal para o processo de recolha de cilo-inositol a partir da solução da cultura. Isto é, os sobrenadantes da solução da cultura são tratados com carvão activado, uma resina de permuta iónica ou similar, depois de as células terem sido removidas da solução de cultura, para assim permitir que a maior parte das impurezas, para além do cilo-inositol, sejam eliminadas. Depois disso, pode-se isolar uma substância com interesse utilizando um processo tal como a recristalização.
Mais especificamente, faz-se passar o sobrenadante da cultura, no qual se acumulou o cilo-inositol, através de uma coluna cheia com uma resina permutadora de catiões de ácido forte tal como Duolite® C-20 (do tipo H+) para eliminar os componentes indesejáveis. Recolhe-se a solução que flui através da coluna e depois faz-se passar água desionizada através da coluna para lavar a coluna e assim recolher uma solução de lavagem. Combina-se a solução que fluiu através da coluna com a solução de lavagem. Depois, faz-se passar a solução assim obtida através de uma coluna cheia com uma resina permutadora de aniões de uma base forte tal como 16
Duolite® A 116 (do tipo OH-). Recolhe-se a solução que fluiu através da coluna e depois faz-se passar água desionizada através da coluna para lavar a coluna e assim recolher uma solução de lavagem. Combina-se a solução que fluiu através da coluna com a solução de lavagem para se obter uma solução aquosa contendo cilo-inositol mas praticamente sem outras impurezas. Concentrou-se a solução aquosa para se obter assim uma solução concentrada de cilo-inositol. Adicionou-se então à solução concentrada uma quantidade apropriada de etanol e deixou-se durante a noite à temperatura ambiente ou a uma temperatura baixa para permitir assim que cristalize um cristal de cilo-inositol puro. Entretanto, com base na baixa solubilidade em água do cilo-inositol, pode cristalizar um cristal puro de cilo-inositol apenas por concentração e filtração da solução aquosa. Além disso, pode-se utilizar uma coluna cheia com carvão activado para descorar durante a operação da coluna.
Pode-se obter um cristal puro de cilo-inositol por outros processos de purificação, tal como os descritos a seguir, que compreendem: a preparação de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico por adição de ácido bórico e NaCl à solução contendo o cilo-inositol obtida por meio da cultura; a filtração e a separação do complexo de cilo-inositol/ácido bórico; permitindo que o ácido bórico seja libertado por meio da adição de um ácido; e a cristalização de cilo-inositol por meio da adição de um dissolvente orgânico tal como metanol.
Além disso, durante a cultura da estirpe da presente invenção, o cilo-inositol com uma baixa solubilidade em água (solubilidade de cerca de 1,6 %) à temperatura normal, cristaliza e precipita. Por isso, o mio-inositol pode ser ainda adicionado durante a cultura para ainda acumular mais cilo-inositol sob a forma de cristais. 17
Depois de a reacção estar completa ou durante a reacção, o cilo-inositol sobre-saturado precipita sob a forma de cristal. 0 cilo-inositol cristalino pode ser isolado por meio de uma operação tal como filtração ou separação centrífuga. Quando o cilo-inositol cristalino coexiste com células e proteínas desnaturadas insolúveis, as células e as proteínas desnaturadas insolúveis podem ser eliminadas por dissolução do cilo-inositol cristalino em água, seguida de uma operação tal como filtração ou separação centrífuga.
Um processo de purificação do cilo-inositol cristalino assim obtido pode ser realizado como se segue. 0 ponto a ser assinalado nesta etapa é a eliminação do neo-inositol no cilo-inositol cristalino. 0 neo-inositol é uma substância gerada de tal modo que: a quinta posição de uma parte de mio-inositol é oxidada pela cilo-inositol desidrogenase para gerar a neo-inosose; e reduz-se a neo-inosose gerada por meio de mio-inositol 2-desidrogenase. No presente sistema de reacção, gera-se uma quantidade em traços da substância. 0 neo-inositol é também uma substância com uma solubilidade baixa em água de 0,5 % e está apta a precipitar sob a forma de cristal com o cilo-inositol.
Contudo, uma solução de cilo-inositol obtida pela dissolução de cilo-inositol cristalino em água novamente praticamente não contém mio-inositol. O cilo-inositol que contém uma quantidade em traços do neo-inositol pode ser obtido por meio de uma operação tal como filtração ou separação centrífuga para o isolamento de um cilo-inositol cristalino a ser gerado por reconcentração da solução de cilo-inositol. Além disso, para uma purificação maior, isola-se um cilo-inositol recristalizado, que é recristalizado através da concentração do liquido depois de ter sido 18 purificado por meio de uma passagem através de uma coluna de dessalinização ou de uma coluna de carvão activado, utilizando uma operação tal como filtração ou separação centrífuga, para se obter um cilo-inositol puro não contendo neo-inositol.
Para a coluna de dessalinização é preferível utilizar uma coluna com uma resina permutadora de iões. Para a resina permutadora de iões a ser utilizada desta vez, pode-se utilizar qualquer uma das resinas permutadoras de iões básicos fortes e uma resina permutadora de iões de bases fracas ou uma combinação delas ou qualquer resina permutadora de iões de ácidos fortes e uma resina permutadora de iões fracos ou uma combinação delas. Conforme a maneira pela qual a resina permutadora de iões reage, um processo óptimo compreende a passagem de uma solução através de uma resina permutadora de iões carregada numa coluna. A solução pode também ser dessalinizada por filtração depois de ter sido misturada em lotes e agitada com a resina permutadora de iões. A coluna de carvão activado é utilizada para a descoloração. Pode-se utilizar um processo que compreende a passagem da solução através de carvão activado carregado numa coluna. A solução pode também ser descorada por filtração depois de ter sido misturada em lotes e agitada com carvão activado.
Em seguida, depois de terminar a reacção enzimática, pode-se realizar um processo de purificação do cilo-inositol solúvel que se dissolve na solução reaccional, como se segue. 0 ponto a ser assinalado nesta etapa é a eliminação do mio-inositol e do neo-inositol que é diferente do caso do cilo-inositol cristalino. 19
Dissolve-se o cilo-inositol solúvel em conjunto com o mio-inositol (matéria-prima) e o neo-inositol e pode-se obter uma solução por meio de uma operação tal como filtração ou separação centrífuga. Dado que a solução contém péptidos solúveis e sais, para além do mio-inositol e do neo-inositol, purifica-se fazendo passar através de uma coluna de dessalinização ou de uma coluna de carvão activado seguindo-se uma concentração até ao grau em que o mio-inositol precipita (a concentração de mio-inositol deve ser inferior a 21 %). Depois pode-se isolar o cilo-inositol cristalino a ser precipitado, por meio de uma operação tal como filtração ou separação centrífuga. Se necessário, pode-se adicionar um dissolvente orgânico miscivel em água para a cristalização. Exemplos desses dissolventes orgânicos incluem metanol, etanol e propanol.
Entretanto, tal como se descreve aqui a seguir, pode-se separar o cilo-inositol e purificar por um processo que compreende: a adição de ácido bórico e NaCl à solução obtida contendo cilo-inositol, para assim se formar um complexo de cilo-inositol/ácido bórico; a filtração e a separação do complexo; permitindo que o ácido bórico seja libertado utilizando um ácido; e a cristalização do cilo-inositol por meio da adição de um dissolvente orgânico tal como metanol. 4. Processo de produção de cilo-inositol a partir de uma mistura liquida contendo cilo-inositol e açúcares neutros para além do cilo-inositol
Além disso, a presente invenção tem por objecto um processo de produção de cilo-inositol a partir de uma mistura liquida contendo o cilo-inositol e açúcares neutros para além do cilo-inositol. 20 <4-1>
Também se descreve um processo de produção de cilo-inositol purificado, compreendendo: uma primeira etapa de formação de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico por adição de ácido bórico e de um sal de metal numa quantidade duas vezes ou mais maior do que a do cilo-inositol dissolvido numa mistura liquida contendo o cilo-inositol e ácidos neutros para além do cilo-inositol e ajustando o pH da mistura liquida para 8,0 até 11,0; uma segunda etapa de separação do complexo a partir da mistura liquida; uma terceira etapa de clivagem no cilo-inositol e no ácido bórico por meio da dissolução do complexo separado um, ácido; e uma quarta etapa de isolamento e purificação do cilo-inositol a partir de uma solução ácida ou de uma suspensão ácida obtida na terceira etapa. A primeira etapa do processo de produção é uma etapa de formação de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico por adição de ácido bórico e de um sal de metal numa quantidade duas vezes ou mais do que a do cilo-inositol dissolvido numa mistura liquida contendo o cilo-inositol e ácidos neutros para além do cilo-inositol e ajustando o pH da mistura liquida para 8,0 até 11,0.
Tal como se utiliza aqui, a "mistura liquida contendo o cilo-inositol e açúcares neutros para além do cilo-inositol" pode ser uma solução ou uma suspensão. Além disso, pode ser uma mistura que ainda contenha substâncias para além do "cilo-inositol e de açúcares neutros para além do cilo-inositol" ou pode ser uma mistura que já contém uma pequena quantidade do complexo de cilo-inositol/ácido bórico. Preferencialmente, os açúcares neutros contidos na mistura liquida incluem açúcares neutros tal como tetrose, pentose, 21 hexose e heptose. Exemplos deles incluem: aldose tal como glicose, frutose e galactose; cetose; vários isómeros de inositol; e poliálcoois tais como glicerol e etileno-glicol. Aqui, exemplos de isómeros de inositol incluem: mio-inositol, D-quiro-inositol, L-quiro-inositol, epi-inositol, muco-inositol, alo-inositol, cis-inositol e neo-inositol.
De todos eles é preferível utilizar, particularmente, mio-inositol. Neste caso, a "mistura liquida contendo cilo-inositol e açúcares neutros diferentes de cilo-inositol" inclui, por exemplo, uma mistura liquida contendo cilo-inositol e mio-inositol que se obtém por redução de cilo-inosose tal como se descreve aqui a seguir.
Para a cilo-inosose a ser utilizada para a reacção de redução, pode-se utilizar, por exemplo, a obtida por oxidação de mio-inositol utilizando um microrganismo num meio ou numa solução (JP-A-2003-102492). A cilo-inosose obtida por meio da oxidação microbiana pode ser utilizada dissolvendo a purificada ou um seu filtrado de uma cultura. Entretanto, pode-se utilizar a cilo-inosose preparada por oxidação de mio-inositol utilizando um catalisador de platina. 0 agente de redução a ser utilizado para a redução da cilo-inosose para cilo-inositol não está particularmente limitado desde que seja um agente de redução capaz de reduzir a cilo-inosose para cilo-inositol em água. Exemplos desses agentes incluem boro-hidreto de sódio, boro-hidreto de litio, boro-hidreto de potássio, boro-hidreto de trimetoxi de sódio e boro-hidreto de sódio cianado. A reacção de redução da cilo-inosose pode ser realizada, por exemplo, adicionando um pó ou uma solução de um agente de redução a uma solução contendo a cilo-inosose dissolvida numa 22 ou menos (p/v). Neste momento é concentração de 20 % preferível agitar a solução. O calor da reacção pode gerar falhas na reacção de redução, por isso, preferencialmente, a solução reaccional é preferencialmente controlada para ter uma temperatura de 50 °C ou inferior, de modo a evitar a decomposição da inosose gerada. Além disso, quando se utiliza um agente de redução tal como boro-hidreto de sódio, uma parte do agente de redução pode decompor-se para gerar hidrogénio gasoso. Por isso, preferencialmente adiciona-se um agente anti-espuma ou similar, para reduzir a formação de espuma do hidrogénio gasoso.
Numa mistura líquida de cilo-inositol e mio-inositol obtida a partir da redução da cilo-inosose, o cilo-inositol começa gradualmente a cristalizar quando a sua concentração excede cerca de 1,6 % (p/v) . Geralmente, a redução de 5 % (p/v) da solução de cilo-inosose gera cerca de 3 % (p/v) do mio-inositol e cerca de 2 % (p/v) do cilo-inositol. Contudo, quando se deixa a solução à temperatura ambiente durante várias horas, cerca de 0,4 % de uma parte sobre-saturada do cilo-inositol começa a cristalizar. Por isso, quando se utiliza a mistura líquida do cilo-inositol e de mio-inositol, obtida da redução de cilo-inosose, a etapa de formação de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico é preferencialmente realizada antes de se gerar o próprio cristal de cilo-inositol. A etapa de formação um complexo de cilo- inositol/ácido bórico é preferencialmente realizada imediatamente depois da reacção de redução da cilo-inosose. A primeira etapa realiza-se por adição de ácido bórico e sais de metal a uma "mistura líquida contendo cilo-inositol e açúcares neutros para além do cilo-inositol", tal como a "mistura líquida contendo cilo-inositol e mio-inositol" descrita antes, numa quantidade, em moles, duas ou mais vezes 23 maior, preferencialmente duas ou mais vezes em moles mas três vezes ou menos moles do que a de cilo-inositol dissolvido na mistura liquida, respectivamente e depois dissolvem-se, ajustando a mistura liquida para ser alcalina a pH de 8,0 a 11,0, preferencialmente a pH de 9,0 a 10,0. A expressão "duas vezes o número de moles" tal como se utiliza aqui refere-se a um número de moles em duplicado. O pH da solução de reacção pode ser ajustado utilizando uma base tal como NaOH, KOH, Na2C03 ou K2CO3.
Aqui, OS exemplos de sais de metal que se podem adicionar incluem um ou mais tipos de sais de metal seleccionados no grupo < que consiste em NaCl, NaHCOs, Na2C03, Nâ2S04/ NaHSCU, , NaH2P04, Na2HP04, Na3PC>4, , borax, KC1, KHCO3, K2CO3, K2SO4, KHSO4, KH2PO4, K2HPO4, K3PO4, MgCl2, MgC03 e MgS04. A quantidade de ácido bórico a ser adicionada ou a quantidade de ácido bórico, se a mistura liquida já contiver ácido bórico, é de duas vezes ou mais moles, preferencialmente duas ou mais vezes mas três vezes ou menos moles do que o cilo-inositol dissolvido. A primeira etapa realiza-se, preferencialmente, com agitação para dissolver eficientemente o ácido bórico e os sais de metal na mistura liquida e tornando a solução homogénea depois do ajustamento do pH. A etapa realiza-se, preferencialmente a uma temperatura variando de 5 °C a 85 °C, preferencialmente 15 a 40 °C. O tempo necessário para a etapa não está particularmente limitado desde que se forma a quantidade requerida do complexo de cilo-inositol/ácido bórico, contudo, são preferíveis 12 a 76 horas de modo a recolhê-lo com um rendimento de 90 % ou mais. A maior parte do complexo de cilo-inositol/ácido bórico existe sob a forma de um precipitado na mistura líquida dado 24 que tem uma solubilidade em água de 0,01 % (p/v) ou menos, conforme confirmado por RMN. Na segunda etapa, separa-se o complexo de cilo-inositol/ácido bórico da mistura liquida. Pode-se aplicar à etapa uma operação geral de separação de sólidos, por exemplo, uma operação de filtração ou uma operação de separação por centrifugação. O cilo-inositol deixado na mistura liquida donde se tinha separado o complexo de cilo-inositol/ácido bórico por meio da etapa anterior tinha uma concentração de 0,2 % (p/v) ou menos. Por isso, pode-se recolher a maior parte de cilo-inositol da mistura liquida antes de se iniciar a reacção, sob a forma de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico. Entretanto, os açúcares neutros tal como mio-inositol existem em estado dissolvido na solução. Por isso, os açúcares neutros existem num filtrado, após a operação de filtração e assim os açúcares neutros e o cilo-inositol podem ser separados por meio desta etapa.
Pode-se secar o complexo de cilo-inositol/ácido bórico separado e isolá-lo sob a forma de um pó. Se necessário, pode-se isolar sob a forma de um cristal, por meio de recristalização utilizando água quente.
Em seguida, a terceira etapa envolve a dissolução num ácido do complexo de cilo-inositol/ácido bórico separado. A dissolução cliva o complexo de cilo-inositol/ácido bórico em cilo-inositol e ácido bórico e os iões de metal ligados ao complexo também se dissociam na solução. O tipo de ácido a ser utilizado para a dissolução na etapa não está particularmente limitado desde que dissolva o complexo, contudo, é desejável um ácido que não forme um sal com uma solubilidade baixa consoante o tipo de ião de metal desejado. Preferencialmente, pode-se utilizar ácidos inorgânicos tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico e ácido 25 fosfórico, sendo preferível o ácido clorídrico. Dado que cada um desses ácidos dá origem a uma reacção de neutralização com os iões de metal gerados pela dissolução, é preferível fazer um ajustamento de modo que a solução contendo o complexo de cilo-inositol/ácido bórico se torne finalmente numa solução ácida 0,1 N ou mais. Também para se dissolver eficientemente o complexo de cilo-inositol/ácido bórico, dissolve-se preferencialmente o complexo com um ácido 1 N ou superior para finalmente se obter uma solução ácida 0,1 N ou superior. A quarta etapa envolve o isolamento e a purificação do cilo-inositol a partir da solução ácida ou da suspensão ácida obtida na terceira etapa. O processo de isolamento e purificação do cilo-inositol a partir da solução ácida não está particularmente limitado. Contudo, pode-se utilizar, por exemplo, um processo que compreende a utilização de uma resina tal como uma resina permutadora de iões tal como se descreve aqui a seguir ou um processo que utilize a diferença de solubilidade num dissolvente orgânico.
Ainda se pode utilizar um processo que compreende uma destilação em vácuo como um éster de um álcool inferior e ácido bórico por meio da adição de um álcool inferior depois da libertação do ácido bórico (Journal of Organic Chemistry, vol. 23, p.329-330, 1958).
De entre esses processos, o processo de isolamento e purificação do cilo-inositol utilizando uma resina permutadora de iões pode realizar-se como se segue. Neste caso, a solução obtida na terceira etapa é preferencialmente uma solução ácida 0,1 N ou superior na qual o complexo se dissolve completamente. Também a solução ácida prepara-se preferencialmente por adição de um ácido numa quantidade tal que a relação do complexo de cilo-inositol/ácido bórico passe 26 a ser de 2,5 % (p/v) ou menos, de modo a não precipitar o cilo-inositol livre.
Em primeiro lugar, essa solução ácida é posta em contacto com uma resina permutadora de iões de ácido forte para assim remover os iões de metal. A resina permutadora de iões de ácido forte a ser utilizada não está particularmente limitada desde que adsorva os iões de metal e um exemplo dela inclui uma resina permutadora de iões com um grupo sulfato. Um exemplo disso inclui Duolite do tipo C20 H+ (fabricada pela Sumitomo Chemical Co., Ltd.). 0 contacto pode ser realizado por meio de uma operação que compreende a adição em lotes da resina permutadora de iões de ácidos fortes numa dada quantidade da solução seguida de agitação. Contudo, é preferível que a solução passe através de uma resina permutadora de iões de ácidos fortes numa coluna.
Em seguida, a solução donde se retiram os iões de metal, por meio de uma resina permutadora de iões de ácidos fortes é posta em contacto com uma resina permutadora de iões de bases fortes ou uma resina que adsorva ácido bórico de modo a eliminar o ácido bórico. Essas resinas não estão particularmente limitadas desde que adsorvam ácido bórico. Um exemplo da resina permutadora de iões de bases fortes inclui uma resina com um grupo de amónio quaternário e um exemplo de uma resina que adsorva ácido bórico inclui uma resina que inclui uma resina com um grupo N-metilglucamina. Um exemplo específico de uma resina permutadora de iões de bases fortes inclui Duolite A 116 do tipo 0H‘ (fabricada pela Sumitomo Chemical Co., Ltd.). Um exemplo específico da resina que adsorve ácido bórico inclui Duolite ES371N (fabricada pela Sumitomo Chemical Co., Ltd.). 0 contacto pode ser realizado por meio de uma operação que compreende a adição em lotes da resina permutadora de iões numa dada quantidade da solução 27 seguida de agitação. Contudo, é preferível que a solução seja adicionada à resina permutadora de iões carregada numa coluna. A ordem das resinas com as quais a solução contacta não é aleatória porque o ácido bórico e o cilo-inositol se dissociam um do outro no estado ácido. As soluções contactam com a resina permutadora de iões de ácidos fortes e a resina que adsorve o ácido bórico, por esta ordem.
Uma solução da qual os iões de metal e o ácido bórico tenham sido eliminados por meio do contacto com essas resinas contém apenas cilo-inositol, isto é, um açúcar neutro. Por isso, concentrando a solução utilizando um processo geral para precipitar o cilo-inositol, pode-se isolar um cristal ou um pó do cilo-inositol purificado.
Além disso, na quarta etapa, no caso em que se isola e purifica o cilo-inositol, utilizando a diferença de solubilidade num dissolvente orgânico, pode realizar-se como se segue. Neste processo, uma solução obtida pela dissolução com o ácido utilizado na terceira etapa pode ser uma solução ou uma suspensão dissolvida porque a operação de purificação, utilizando as resinas permutadoras de iões ou similar, não se realiza até à adição do dissolvente orgânico depois da dissolução. Na terceira etapa, para facilitar que o cilo-inositol precipite depois da dissolução, adiciona-se preferencialmente o ácido numa quantidade tal que a relação do complexo de cilo-inositol/ácido bórico é de 2,5 % (p/v) ou mais preferencialmente de 3,0 % a 10 % (p/v), mais preferencialmente de 4,0 % a 6,0 % (p/v).
Primeiro, adiciona-se um dissolvente orgânico solúvel em água à solução ou à suspensão ácida obtida para permitir que 28 o cilo-inositol livre precipite. 0 dissolvente orgânico a ser utilizado não está particularmente limitado desde que seja um dissolvente que permita que o cilo-inositol a ser precipitado enquanto o ácido bórico se dissolve e os sais de metal que consistem em ácido e sal estejam dissolvidos. Exemplos desse dissolvente orgânico incluem etanol e metanol. A quantidade de dissolvente orgânico é a seguinte: quando se utiliza etanol, adiciona-se preferencialmente o etanol numa quantidade de 0,3 a 3 vezes superior, mais preferencialmente 0,6 a 1,5 vezes superior à da solução ácida. Quando se utiliza metanol, adiciona-se preferencialmente o metanol numa quantidade 0,3 a 5 vezes maior, mais preferencialmente 0,9 a 2 vezes maior do que a da solução ácida. Em particular, o dissolvente orgânico é adicionada eficientemente na quantidade anterior quando o sal de metal a ser utilizado para formar o complexo de cilo-inositol/ácido bórico é um ou mais dos sais de NaCl, NaHC03 e Na2CC>3. Além disso, a mistura liquida adicionada com o dissolvente aquoso orgânico é preferencialmente uma solução ácida de 0,1 N ou mais.
Na quarta etapa, quando a mistura é uma solução homogénea, não é necessária agitação, mas quando a mistura é uma suspensão, é preferível realizar uma agitação. A temperatura da mistura não está particularmente limitada desde que seja a temperatura à qual apenas o cilo-inositol precipita, contudo é preferível uma temperatura de -10 °C a 50 °C e ainda mais preferível uma temperatura de 4 °C a 35 °C. O tempo de mistura é preferencialmente de 10 minutos a 24 horas, mais preferencialmente 3 a 5 horas.
Essa operação permite que precipite apenas o cilo-inositol. O precipitado de cilo-inositol pode ser separado da 29 solução por meio de filtração ou de uma operação geral de separação de sólido-liquido tal como uma operação de centrifugação. 0 cilo-inositol assim obtido é puro, contudo, se necessário. 0 cilo-inositol pode obter-se sob a forma de um cristal por meio de um processo tal como recristalização. 0 cilo-inositol precipitado pode ainda ser purificado utilizando uma resina permutadora de iões ou similar, depois de ter sido dissolvido em água, para assim aumentar a sua pureza.
Exemplos
Daqui para a frente, a presente invenção será descrita especificamente com referência aos exemplos.
Exemplo 1 <Processo de produção de cilo-inositol (a uma escala pequena)>
Ajustou-se 3 L de um meio liquido contendo 10,0 % de mio-inositol, 1,0 % de extracto de levedura e 1,0 % de sacarose para pH 7,0 com NaOH IN e distribui-se o meio por aliquotas de 100 ml em 30 peças de frascos cónicos com um volume de 500 ml e espaçados, seguido da esterilização utilizando uma autoclave. Inoculou-se, num aro de platina, uma estirpe AB 10281 (FERM BP-10119) de Acetobacter sp. de uma cultura modificada em cada um dos frascos cónicos e fez-se a cultura do microrganismo a 27 °C durante 5 dias num agitador rotativo. Depois da cultura, adicionou-se 250 ml de água a cada um dos frascos cónicos e agitou-se a mistura durante 1 hora num agitador rotativo para dissolver o cilo-inositol gerado na solução da cultura. Recolheu-se a solução da cultura e centrifugou-se (8.000 rpm 20 minutos) e o 30 sobrenadante obtido foi definido como uma solução do sobrenadante da cultura (10,2 L). A solução do sobrenadante da cultura foi analisada por cromatografia liquida de alta resolução nas condições que se seguem. O resultado revelou que se gerou 12,6 mg/ml (129 g, taxa de conversão de 43 %) de cilo-inositol na solução do sobrenadante da cultura. Na solução do sobrenadante da cultura, permaneceram 2,1 mg/ml de cilo-inosose, enquanto não se detectou mio-inositol.
As condições de análise da cromatografia liquida de alta resolução foram as que se seguem.
Coluna: Wakosil 5NH2 (4,6 χ 250 mm)
Temperatura da coluna: 40 °C
Detector: DETECTOR de RI ERC-7515 A (ERMA CR.INC.)
Volume de injecção: 5 μΐ
Dissolvente: Acetonitrilo-Água = 4:1
Velocidade de fluxo: 2 ml/min
Tempo de diluição: Cilo-inosose; 11,6 minutos
Mio-inositol; 17,8 minutos
Cilo-inositol; 18,2 minutos A taxa de conversão do cilo-inositol descrita antes foi calculada por meio da equação seguinte.
Taxa de conversão em % = {Número de moles de cilo-inositol em sobrenadante da cultura) / Número de moles de mio-inositol antes da cultura)} x 100
Em seguida, fez-se passar a solução do sobrenadante da cultura através de uma coluna formada ligando a coluna (diâmetro interno de 5 cm, comprimento de 40 cm) cheia com 500 ml de uma resina de permuta catiónica de um ácido forte, Duolite (marca registada) C-20 (do tipo H+) (fabricada pela 31
Sumitomo Chemical Co., Ltd.) com uma coluna (diâmetro interno de 5 cm, comprimento de 16 cm) cheia com 200 ml de carvão activado e depois fez-se passar 500 ml da água permutada com iões através da coluna para a lavar. Fez-se então passar a solução que fluiu através da coluna e a solução de lavagem através de uma coluna (diâmetro interno de 7 cm, comprimento de 40 cm) cheia com 1.000 ml de uma resina de permuta aniónica de uma base forte, Duolite (marca registada) A116 (do tipo OH-) (fabricada pela Sumitomo Chemical Co., Ltd.) e depois fez-se passar 1.000 ml de água permutada com iões através da coluna para a lavar. Verificou-se que a solução, que se obteve depois de ter fluido através da coluna e a solução da lavagem com água, incluíam várias impurezas para além do cilo-inositol descrito antes.
Concentrou-se a solução obtida antes para cerca de 700 ml a pressão reduzida e adicionou-se-lhe 3 vezes o volume de etanol. Depois, deixou-se a mistura em repouso a 5 °C durante a noite e filtraram-se os cristais incolores de cilo-inositol puro resultantes e secaram-se para se obter 118 g de cilo-inositol. A purificação originou uma recuperação com um rendimento de 92 % e a taxa de recuperação total de cilo-inositol a partir de mio-inositol foi de 39 %.
Exemplo 2 <Processo de produção de cilo-inositol (em grande escala)>
Verteu-se 40 L de um meio líquido contendo 10,0 % de mio-inositol, 1,0 % de extracto de levedura e 1,0 % de sacarose num frasco fermentador de 50-L e ajustou-se para um pH de 7,0 com NaOH IN, seguido de esterilização utilizando uma autoclave. Inoculou-se 400 ml de AB 10281 (FERM BP-10119) de Acetobacter sp. que tinha estado em cultura num meio com a 32 mesma composição (frasco cónico) e fez-se uma cultura a 27 °C durante 5 dias a uma taxa de aeração de 1 vvm e uma agitação de 200 rpm. Depois da cultura, adicionou-se 60 L de água quente (cerca de 50 °C) até cerca de 40 L da solução de cultura recolhida e agitou-se a mistura durante 1 hora para dissolver o cilo-inositol cristalino que tinha estado presente na solução de cultura. A solução de cultura foi submetida a uma centrifugação continua (8.000 rpm) para eliminar as células e definiu-se a solução resultante como uma solução da qual se tinha eliminado o microrganismo da cultura (cerca de 100 L). A solução da qual se tinha eliminado o microrganismo da cultura foi analisada por cromatografia liquida de alta resolução. O resultado revelou que se gerou 16,8 mg/ml (1,68 kg, taxa de conversão de 42 %) de cilo-inositol na solução da qual se tinha eliminado o microrganismo da cultura. Na solução da qual se tinha eliminado o microrganismo da cultura, permaneceram 2,9 mg/ml de cilo-inosose, enquanto não se detectou mio-inositol. As condições de análise para a cromatografia líquida de alta resolução foram as mesmas do exemplo 1.
Em seguida, adicionou-se 400 g de hidróxido de sódio a 100 L da solução obtida e aqueceu-se a mistura com agitação a 98 °C durante 1 hora. Em seguida, adicionou-se 560 g de hidróxido de sódio, 1.340 g de ácido bórico e 1.260 g de NaCl e dissolveu-se enquanto a mistura estava quente. Depois de se parar a agitação, retirou-se o aquecimento da solução e deixou-se a solução em repouso até a temperatura atingir 23 °C (cerca de 24 horas).
Em seguida, filtrou-se a solução para isolar os cristais de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico formado no 33 líquido e lavaram-se os cristais com água até eles se tornarem brancos. Os cristais resultantes (cerca de 3,9 kg) foram retirados para um recipiente e adicionou-se-lhe 5,9 L de água e 1,95 L de ácido clorídrico a 37 %, seguido de agitação 30 minutos mais tarde, para precipitar o cilo-inosito que se tina libertado do ácido bórico, por meio desse processo, adicionou-se 9,4 L de metanol e depois agitou-se a mistura durante 1 hora.
Em seguida, filtrou-se a solução para isolar o cilo-inositol cristalizado no líquido e lavaram-se os cristais com 1 L de metanol a 50 %. Passaram-se os cristais de pó fino resultantes (cerca de 1,8 kg) para outro recipiente e adicionou-se 10 L de água, seguida de aquecimento até à ebulição com agitação durante 1 hora. Depois, arrefeceu-se a solução para 20 °C com agitação e depois filtrou-se para se obter assim cristais finos de cilo-inositol. Depois da secagem, obteve-se 1,35 kg de cristais incolores de cilo-inositol puro. A purificação originou uma recuperação com um rendimento de 80 % e a taxa de recuperação total de cilo- inositol a partir de mio-inositol foi de 34 %.
Exemplo 3 <Identificação de microrganismos produzindo cilo-inositol com base na sequência de nucleótidos do ARN de 16Sr>
As sequências de nucleótidos do ARN de 16Sr foram analisadas para 4 estirpes microbianas consistindo em 3 estirpes naturais isoladas, AB 10285, AB 10286 e AB 10287, tendo cada uma delas a capacidade de converter mio-inositol em cilo-inositol e AB10281 obtida a partir de AB 10253, de acordo com o processo convencional. Mais especificamente, extraiu-se um ADN genómico a partir das células de cultura e 34 depois prepararam-se os correspondentes fragmentos de ADN por meio de RCP utilizando iniciadores que foram concebidos de modo a amplificar cerca de 1,6 kpb do ARN de 16Sr, seguida de análise de cerca de 1,3 kpb de sequências (Hokkaido System Science Co., Ltd.)· Os resultados das sequências foram rastreados comparando com a base de dados para identificar espécies relacionadas. 0 quadro 2 mostra os resultados da pesquisa, as homologias e as taxas de conversão de cilo-inositol na cultura de microrganismos, da mesma maneira que no exemplo 1.
Identificação de estirpes microbianas por meio da análise da sequência de nucleótidos do ARN de 16Sr
Quadro 2
Nome da Nome dos microrganismos identificados Homologia Taxa de conversão estirpe AB 102 81 Acetobacter cerevisiae, Acetobacter malorum 99,93% 40,0% AB10285 Acetobacter cerevisiae, Acetobacter malorum 99,78% 4,5% AB10286 Burkholderia andropogonis 98,12% 2, 6% AB10287 Burkholderia andropogonis 98,04% 1,4%
Os resultados revelaram que as 4 estirpes microbianas, cada uma delas com a capacidade de converter mio-inositol em cilo-inositol, podem ser de um modo geral divididas em 2 grupos. No primeiro grupo, identificou-se AB 10281 e AB 10285 como Acetobacter cerevisiae ou Acetobacter malorum, enquanto no segundo grupo, identificou-se AB 10286 e AB 10287 como Burkholderia andropogonis.
Exemplo 4 35 <Isolamento de mio-inositol 2-desidrogenase, independente de NAD+, a partir de AB10253 de Acetobacter sp.
Adicionou-se 3 g de mio-inositol, 1 g de extracto de levedura (FNI205: fabricado pela Lallemand BI) e 0,5 g de glicose a frascos cónicos de 50 ml, espaçados e dissolveu-se com água de modo a que a mistura tenha um volume de 100 ml e ajustou-se o pH da solução para pH 5,0, seguido de esterilização utilizando numa autoclave. De acordo com esses processos, preparam-se 4 peças dos frascos de um meio. Adicionou-se AB10253 de Acetobacter sp. modificada, num aro de platina, a cada meio e fez-se uma pré-cultura do microrganismo a 27 °C durante 2 dias utilizando um agitador rotativo.
Em seguida, adicionou-se 1,2 kg de mio-inositol, 0,4 kg de extracto de levedura (FNI205: fabricado pela Lallemand BI) e 0,2 kg de glicose a frascos fermentadores de 50 1, espaçados e dissolveu-se com água de modo a que a mistura tivesse um volume de 40 1. Ajustou-se o pH da solução para pH 5,0, seguido dea esterilização utilizando uma autoclave. Adicionou-se-lhe cerca de 400 ml de uma solução microbiana da pré-cultura de AB 10253 de Acetobacter sp. e fez-se uma cultura do microrganismo a 27 °C durante 3 dias a uma taxa de aeração de 1 vvm e a uma agitação de 200 rpm.
Depois da cultura, obtiveram-se as células precipitadas utilizando um centrifugador continuo. Fez-se uma nova suspensão das células obtidas em 2 L de água e as células lavadas foram obtidas por centrifugação e foram suspensas em 2 L de tampão Tris 20 mM (pH 7,0). Em seguida, aplicaram-se ondas ultra-sónicas à suspensão para romper as células. Centrifugou-se a solução de lise das células para precipitar as células divididas e obtiveram-se as células divididas sob 36
Fez-se uma a forma de precipitados. Fez-se uma suspensão dos precipitados adicionando 500 ml de tampão Tris 20 mM (pH 7,0), 0,6 % de Triton X-100 (fabricado pela Kodak) e extrairam-se as enzimas a 15 °C durante 3 horas. Depois, centrifugou-se a suspensão e retirou-se 420 ml do sobrenadante (solução da enzima impura).
Concentrou-se 420 ml da solução da enzima impura para 150 ml utilizando um ultrafiltro (corte PM 30.000) e fez-se passar a solução concentrada através de uma coluna DEAE Toyopearl de 400 ml com tampão Tris 20 mM (pH 7,0) para adsorver as proteínas. Em seguida, fez-se passar uma solução com um gradiente com uma concentração linear de 0 mM a 500 mM de NaCl em tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) não contendo tensioactivo (volume total de 1,6 L) através de uma coluna com proteínas adsorvidas a uma velocidade de 10 ml/min para eluir as proteínas. O produto eluído foi fraccionado em fracções de 40 ml. Em seguida, fez-se passar novamente, através da coluna, 600 ml de tampão de Tris 20 mM (pH 7,0), não contendo tensioactivo, para a lavagem e depois fez-se passar novamente através da coluna uma solução com um gradiente com uma concentração linear de 0 mM a 500 mM de NaCl em tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) contendo Triton X-100 a 0,1 % (volume total de 1,6 L) a uma velocidade de 10 ml/min para eluir as proteínas. 0 produto eluído foi fraccionado em fracções de 40 ml. A actividade enzimática de cada fracção foi medida por um processo padrão: isto é, a alteração na densidade óptica, a 600 nm, de 1 ml de uma solução contendo 50 μΐ da solução de proteína, tampão de fosfato 100 mM (pH 5,0), 5 mg de mio-inositol e 0,4 mg de 2,4-dicloroindofenol (DCIP oxidado) foi calculada a uma taxa de reacção e com uma actividade para 37 oxidar 1 ymole de mio-inositol por minuto que foi definida como uma unidade.
Os resultados revelaram que a enzima-alvo foi eluida em fracções de soluções contendo tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) contendo 0,1 % de Triton X-100 e NaCl 100 a 170 mM. Em seguida, recolheram-se essas fracções (240 ml) e concentraram-se para 30 ml utilizando um ultrafiltro (corte de PM 30.000) e adicionou-se 100 ml de tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) contendo 0,1 % de Triton X-100. Concentrou-se depois a solução para 30 ml e adicionou-se 70 ml de tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) à solução concentrada para dessalinização.
Em seguida, a solução assim preparada passou através de uma coluna de 100 ml de hidroxiapatite equilibrada com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) contendo 0,1 % de Triton X-100 para adsorver as proteínas. Em seguida, fez-se passar uma solução com um gradiente de concentração linear de 0 mM a 500 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) em tampão de Tris (pH 7,0) contendo 0,1 % de Triton X-100 (volume total de 400 ml) através de uma coluna com proteínas adsorvidas a uma velocidade de 3 ml/min para eluir as proteínas. O produto eluído foi fraccionado em fracções de 10 ml e mediu-se a actividade enzimática de cada fracção.
Os resultados revelaram que a enzima-alvo foi eluida em fracções de soluções contendo tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) contendo 0,1 % de Triton X-100 e tampão de fosfato 100 a 170 mM. Verificou-se que a solução de enzima assim obtida continha mio-inositol 2-desidrogenase quase pura, independente de NAD+. Em seguida, recolheram-se essas fracções (40 ml) e concentraram-se para 5 ml utilizando um ultrafiltro (corte de PM 30.000) e adicionou-se 100 ml de 38 tampão de Tris 20 mM (pH 7,0). A solução foi depois concentrada para 5 ml, seguida de dessalinização. A solução concentrada assim preparada passou novamente através de uma coluna de Toyopearl com 20 ml de DEAE (fabricada pela Tosoh Corporation) equilibrada com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) contendo 0,1 % de Triton X-100 para adsorver as proteínas. Em seguida, fez-se passar uma solução com um gradiente de concentração linear de 50 mM a 250 mM de NaCl em tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) contendo 0,1 % de Triton X-100 (volume total de 160 mL) através de uma coluna com proteínas adsorvidas a uma velocidade de 1 ml/min para eluir as proteínas. O produto eluído foi fraccionado em fracções de 4 ml. Depois do fraccionamento, mediu-se a actividade enzimática de cada fracção e submeteu-se cada fracção com actividade a uma electroforese com SDS.
Como resultado, a electroforese com SDS revelou as bandas de proteínas que estão correlacionadas com a actividade enzimática da enzima-alvo. A eliminação das bandas de proteínas derivadas das fracções que não têm actividade revelaram que a enzima-alvo era uma enzima contendo pelo menos proteínas com pesos moleculares de cerca de 76 k Dalton e cerca de 46 k Dalton.
Entretanto, as fracções com actividade enzimática tinham uma cor vermelha e a configuração do espectro UV revelou que as fracções continham o citocromo C. Além disso, o teor da proteína-alvo e a absorvência do citocromo C revelou que 1 mole da enzima-alvo retém 1 mole de citocromo C.
Para a medição do pH óptimo, mediu-se a actividade enzimática enquanto se mudava o tampão e o valor do pH. Como tampão, utilizou-se tampão de fosfato 100 mM (pH 3 a 8), 39 tampão de Tris 100 mM (pH 7 a 8) e tampão de carbonato 100 mM (pH 8 a 11). Os resultados revelaram que a enzima-alvo tem a actividade máxima a pH 4,5 a 5,5. Além disso, para a medição da actividade padrão da enzima (tampão de fosfato 100 mM (pH 5,0)), adicionaram-se vários iões de metal pesado (Sn , Mn , Mg2+, Cu2+, Fe, Zn2+, Co2+, Pb2+, Ca2+, Cd2+ e Ni2+) e revelou-se que a enzima-alvo é especificamente inibida pelo ião Sn2+. A actividade enzimática foi inibida na presença do ião Sn2+ 1 mM até a 1 % ou menos de actividade na ausência do ião Sn2+.
Entretanto, confirmou-se que a enzima-alvo é uma enzima extraída com X-100 a partir de uma fracção da membrana e a enzima extraída oxida o mio-inositol na presença de DCIP reduzido, embora não ocorra nenhuma absorção de oxigénio na ausência de DCIP reduzido. Os factos significam que a enzima está acoplada ao sistema de transporte de electrões da membrana da célula num organismo vivo para evitar que os electrões do mio-inositol gerem cilo-inositol. A especificidade da enzima-alvo para o substrato foi determinada medindo a actividade da enzima numa solução contendo vários açúcares em vez de mio-inositol numa concentração final de 50 mM. Entretanto, mediu-se o valor de Km medindo a actividade da enzima para cada açúcar para o qual esta enzima mostra actividade quando se altera a concentração de açúcar. Além disso, os produtos da reacção de oxidação foram analisados por CLAR para determinar que substâncias foram geradas. A medição foi feita nas condições de CLAR que se seguem: utilizou-se, como coluna, uma coluna Wakosil 5NH2 Φ 4,6 χ 250 mm (temperatura da coluna 40 °C) , acetonitrilo a 80 % como fase móvel (velocidade de fluxo 2 ml/min) e um detector RI como detector. 40
Como resultado, verificou-se que a enzima-alvo reagia com D-quiro-inositol (actividade relativa a 100 %: Km = 8,8 mM), muco-inositol (actividade relativa a 68 %: Km = 14,5 mM) e mio-inositol (actividade relativa a 53 %: Km = 20 mM) para convertê-los em D-quiro-l-inosose, L-quiro-2-inosose e cilo-inosose, respectivamente. Verificou-se que a enzima não reage com alo-inositol, cilo-inositol, L-quiro-inositol e glicose.
Exemplo 5 <Conversão de mio-inositol em cilo-inosose por meio de mio-inositol 2-desidrogenase independente de NAD+>
Do mesmo modo que no exemplo 4, realizou-se a purificação utilizando um fermentador com um recipiente de 40 L e definiu-se como solução da enzima 5 ml de uma solução da enzima obtida por purificação e dessalinização com uma coluna de 100 ml de hidroxiapatite, que se utilizou na reacção de conversão a seguir.
Adicionou-se 30 g de mio-inositol (166,7 mmole) e 15 ml de tampão de fosfato 1 M (pH 5,0) a um tubo de centrifugação de 400 ml e diluiu-se a mistura para 300 ml com água para dissolver o mio-inositol. Adicionou-se, gradualmente, 1 ml de uma solução da enzima a 30 °C e adicionou-se à solução, gradualmente, 8 g de DCIP reduzido (sal de Na) com agitação. Depois do desaparecimento da cor azul derivada do DCIP reduzido, as matérias insolúveis brancas geradas com o desaparecimento da cor azul (DCIP oxidado) precipitaram por centrifugação e transferiu-se o sobrenadante para um novo tubo de centrifugação de 400. Depois, ajustou-se a solução para pH 5,0 com ácido fosfórico 1 N e depois adicionou-se, com agitação, 8 g de DCIP reduzido (sal de Na) . Repetiu-se o processo 6 vezes para se adicionar um total de 48 g de DCIP 41 reduzido (sal de Na) e, no momento em que desapareceu a cor azul, adicionou-se finalmente 3 g de DCIP reduzido (sal de Na). Deixou-se a mistura em repouso durante 1 hora e centrifugou-se e recolheu-se o sobrenadante. Esses processos originaram 292 ml do sobrenadante. Os processos levam 8 horas.
Em seguida, fez-se passar o sobrenadante resultante através de uma coluna cheia com 100 ml de uma resina permutadora de iões de um ácido forte (Duolite C20, do tipo H+) a uma velocidade de fluxo de 1,5 ml/min e fez-se passar o fluido eluido resultante através de uma coluna cheia com 150 ml de uma resina permutadora de iões de uma base fraca (Duolite 368S, do tipo OH”) . Além disso, o produto eluido resultante foi passado através de uma coluna cheia com 50 ml de carvão activado. Concentrou-se o produto eluido, para se obter assim 26,5 g (148,9 mmole) de um pó branco (rendimento de 89 %) . A substância foi analisada por RMN e por CLAR e verificou-se que a substância continha 99 % de cilo-inositol e 1 % de mio-inositol. ~
Exemplo 6 <Rastre±o de AB 10253 de Acetobacter sp. de mutantes à base da actividade de mio-inositol 2-desidrogenase dependente de NAD+>
Esterilizou-se 5 ml de um meio liquido (pH 5,0) contendo 1 % de extracto de levedura (fabricado pela Difco Laboratories) e 0,5 % de glicose, num tubo de ensaio e adicionou-se um aro de platina com AB 10253 de Acetobacter sp. de um "slant", seguida de agitação da cultura a 27 °C durante 16 horas. Retirou-se 2,5 ml de uma solução de cultura para um tubo esterilizado e centrifugou-se a 3.000 x g para 42 recolher as células. Eliminou-se o sobrenadante e suspenderam-se novamente as células em 2,5 ml de uma solução de tampão de fosfato 200 mM (pH 8,0), seguida de centrifugação a 3.000 x g para recolher as células. Eliminou-se o sobrenadante e suspenderam-se novamente as células em 2,5 ml de uma solução de tampão de fosfato 200 mM (pH 8,0). Verteu-se 2,0 ml da suspensão num frasco cónico esterilizado de 100 ml e adicionou-se 0,5 ml de uma solução a 40 % de glicose e 7,5 ml de tampão de fosfato 200 mM (pH 8,0) e misturou-se. Adicionou-se à mistura 20 μΐ de metano-sulfonato de etilo e agitou-se a cultura a 30 °C durante 45 minutos. Depois do tratamento, retirou-se 1 ml da mistura para um tubo esterilizado e centrifugou-se a 3.000 x g para recolher as células. Eliminou-se o sobrenadante e suspenderam-se novamente as células em 2,5 ml de tampão de fosfato 200 mM (pH 7,0), a que se seguiu uma centrifugação a 3.000 x g para recolher as células. Eliminou-se o sobrenadante e suspenderam-se novamente as células em 2,5 ml de tampão de fosfato 200 mM (pH 7,0), para assim se obter uma solução contendo um microrganismo tratado com uma mutação.
Em seguida, a estirpe AB 10253 de Acetobacter sp. tratada com uma mutação foi inoculada espalhando 0,12 ml da solução contendo o microrganismo tratado com uma mutação em meio de agar preparado por solidificação de um meio esterilizado (pH 5,0) contendo 3 % de mio-inositol, 1 % de extracto de levedura (fabricado pela Difco Laboratories), 0,5 % de glicose e 1,5 % de agar num prato de 9 cm e realizou-se a cultura a 27 °C durante 2 dias. Esses processos reduziram a contagem viável até cerca de 1,6 %. Entretanto, formaram-se cerca de 95 a 125 de colónias por cada prato.
Depois da cultura, verteu-se lentamente, sobre as colónias formadas nos pratos de 9 cm, 10 ml de uma solução 43 viscosa que tinha sido preparada por esterilização com filtração de uma solução com uma composição de tampão de fosfato 100 mM, 1 % de mio-inositol e 0,4 % de DCIP oxidado e adicionou-se um volume igual de uma solução de agar a 1 % esterilizada numa autoclave enquanto estava quente, seguida de arrefecimento para 36 °C de modo a inibir a solidificação do agar. O meio de agar que tinha sido submetido a esses tratamentos foi lentamente arrefecido para 27 °C para solidificar e foi posto em camadas sobre as colónias formadas nos pratos de 9 cm.
Depois do tratamento, incubou-se o prato a 27 °C e depois observou-se que a cor azul do DCIP oxidado que tinha sido espalhado sobre o meio de agar começava gradualmente a tornar-se transparente apenas à volta das colónias, consoante o grau de actividade de mio-inositol 2-desidrogenase independente de NAD+. Nesse momento, as colónias nessa posição em que a cor se tornava mais rapidamente transparente foram raspadas por meio de uma agulha esterilizada e postas numa subcultura em meio fresco. Todas as 2.154 colónias foram submetidas a uma selecção primária, para assim se obter 22 estirpes com uma forte actividade de mio-inositol 2-desidrogenase independente de NAD+.
Em seguida, para a selecção secundária, inocularam-se individualmente as 22 estirpes da bactéria assim obtidas que formaram colónias com 5 ml de um meio liquido esterilizado (pH 5,0) contendo 3 % de mio-inositol, 1 % de extracto de levedura (fabricado pela Difco Laboratories) e 0,5 % de glicose num tubo de ensaio. Agitou-se a cultura a 27 °C durante 3 dias e depois retirou-se 1 ml da solução da cultura para um tubo de ensaio, seguido de centrifugação a 3.000 x g para recolher as células. Eliminou-se o sobrenadante e adicionou-se 1 ml de uma solução contendo 10 % de mio- 44 inositol, tampão de fosfato 50 mM (pH 5,0) ao tubo de ensaio contendo as células, seguido de agitação da cultura a 27 °C durante 4 horas. Depois, realizou-se a centrifugação a 16.000 x g e mediu-se a taxa de conversão de mio-inositol em cilo-inosose no sobrenadante por meio de CLAR. Por outro lado, retirou-se 0,5 ml da solução de cultura (5 ml) para um tubo esterilizado e centrifugou-se a 3.000 x g e eliminou-se o sobrenadante. Lavaram-se com água as células obtidas como precipitados e mediu-se a actividade de mio-inositol 2-desidrogenase independente de NAD+.
Como resultado, em 3 estirpes (estirpe No. E6-55, H2-68 e B7-14) das 22 estirpes mutantes, a actividade de mio-inositol 2-desidrogenase independente de NAD+ aumentou 1,3 vezes ou mais depois da mutação e a actividade aumentou 1,6 vezes, 2,2 vezes e 2,8 vezes respectivamente. Entretanto, a taxa de conversão de mio-inositol em cilo-inosose aumentou 1,1 vezes, 1,4 vezes e 1,5 vezes respectivamente e a taxa de conversão de mio-inositol em cilo-inosose das estirpes tendo uma actividade de mio-inositol 2-desidrogenase independente de NAD+, de l,3vezes ou menos, foi igual à do microrganismo antes da mutação. Os resultados revelaram que o rastreio com base na actividade de mio-inositol 2-desidrogenase independente de NAD+ está correlacionado com o aumento da taxa de conversão de mio-inositol em cilo-inosose.
Exemplo 7 <Produção de cilo-inosose por conversão de mio-inositol em cilo-inosose utilizando a estirpe mutante (B7-14)>
Adicionou-se 10 g de mio-inositol, 1 g de extracto de levedura (FNI205: fabricado pela Lallemand BI) e 0,5 g de gi icose a frascos cónicos de 500 ml, espaçados e dissolveu-se 45 com água de modo a que a mistura tivesse um volume de 100 ml e ajustou-se o pH da solução para pH 5,0, seguido da esterilização utilizando numa autoclave. De acordo com esses processos, prepararam-se 20 frascos de um meio (correspondendo a 2 L: mio-inositol 200 g (1,11 mmole)). Adicionou-se um aro de platina com uma estirpe mutante (B7-14) de um "slant", a cada meio e fez-se a cultura da bactéria a 27 °C durante 3 dias utilizando um agitador rotativo.
Depois da cultura, centrifugou-se a solução da cultura e fez-se passar o sobrenadante resultante através de uma coluna cheia com 500 ml de uma resina permutadora de iões de ácido forte (Duolite C20, do tipo H+) a uma velocidade de fluxo de 10 ml/min. 0 produto eluido obtido passou através de uma coluna cheia com 900 ml de uma resina permutadora de iões de base fraca (Duolite 368S, do tipo OH“) e fez-se passar o produto eluido resultante, novamente, através de uma coluna cheia com 50 ml de carvão activado. Concentrou-se o produto eluido resultante, para se obter 162 g (0,91 mmole) de um pó branco (rendimento de 82 %) . A substância foi analisada por RMN e CLAR e verificou-se que a substância continha 91 % de cilo-inosose, 3 % de mio-inositol e 6 % de cilo-inositol (cilo-inosose com uma pureza de 91 %) .
Exemplo 8 <Produção de cilo-inosose por conversão e redução química de mio-inositol em cilo-inosose utilizando a estirpe mutante (B7-14)>
Adicionou-se 10 g de mio-inositol, 1 g de extracto de levedura (FNI205: fabricado pela Lallemand BI) e 0,5 g de glicose a frascos cónicos de 500 ml, espaçados e dissolveu-se com água de modo a que a mistura tivesse um volume de 100 ml 46 e ajustou-se o pH da solução para pH 5,0, seguido da esterilização utilizando numa autoclave. De acordo com esses processos, prepararam-se 20 frascos de um meio (correspondendo a 2 L: mio-inositol 200 g (1,11 mmole)). Adicionou-se um aro de platina com uma estirpe mutante (B7-14) de um "slant", a cada meio e fez-se a cultura da bactéria a 27 °C durante 3 dias utilizando um agitador rotativo.
Depois da cultura, centrifugou-se a solução da cultura a 8.000 x g e ajustou-se o pH dos 2 L do sobrenadante resultante para pH 7,5 com uma solução 5N de NaOH. Adicionou-se 9,2 g de NaBH4 à solução com agitação para se realizar uma reacção de redução. A temperatura da solução de reacção subiu para 37 °C por meio do aquecimento da mistura reaccional. 30 Minutos mais tarde, apareceu gradualmente o material insolúvel e adicionou-se 1,2 L de água para dissolver quase toda a matéria insolúvel gerada. Filtrou-se a solução para eliminar o material insolúvel e fez-se passar o filtrado através de uma coluna cheia com 500 ml de uma resina permutadora de iões de ácido forte (Duolite C20, do tipo H+) a uma velocidade de fluxo de 10 ml/min. 0 produto eluído obtido passou através de uma coluna cheia com 900 ml de uma resina permutadora de iões de base forte (Duolite A 116, do tipo OH“) e fez-se passar o produto eluido resultante, novamente, através de uma coluna cheia com 300 ml de carvão activado. Concentrou-se o produto eluido, para se obter 145 g de um pó branco. A substância foi analisada por CLAR e verificou-se que a substância continha 36 % de cilo-inositol e 64 % de mio-inositol.
Fez-se uma suspensão do pó branco resultante em água de modo a ter um de 470 ml e aqueceu-se a suspensão até 70 °C para dissolver cuidadosamente o mio-inositol. Arrefeceu-se a suspensão para 30 °C com agitação e filtrou-se a solução 47 branca para recolher a matéria insolúvel. Lavou-se o material insolúvel com uma pequena quantidade de áqua e secou-se para assim se obter assim 44,2 q de um pó. A substância foi analisada por CLAR e verificou-se que a substância continha 98 % de cilo-inositol e 2 % de mio-inositol. Depois, adicionou-se 700 ml de água ao pó resultante e aqueceu-se a mistura para 85 °C para dissolver todos eles. Arrefeceu-se gradualmente a mistura para 30 °C com agitação e adicionou-se 700 ml de etanol. Deixou-se a mistura em repouso durante a noite à temperatura ambiente e depois recolheram-se os cristais resultantes por filtração e secaram-se para se obter 40,1 g (222,8 mmole) de cristais (rendimento de 20 %) . Os cristais foram analisados por RMN e CLAR e verificou-se que a substância obtida era cilo-inositol com uma pureza de 99,9 % ou mais.
Exemplo 9 <Purificação de cilo-inositol desidrogenase produzida por AB10281 FERM BP-10119 de Acetobacter sp.>
Ajustou-se 3 L de um meio liquido contendo 10,0 % de mio-inositol, 1,0 % de extracto de levedura e 1,0 % de sacarose para pH 7,0 com NaOH IN e distribui-se o meio por aliquotas de 100 ml em 30 peças de frascos cónicos com um volume de 500 ml e espaçados, seguido da esterilização utilizando uma autoclave. Inoculou-se, num aro de platina, uma estirpe AB 10281 FERM BP-10119 de Acetobacter sp. de uma cultura inclinada e em cada frasco cónico fez-se uma cultura do microrganismo a 27 °C durante 5 dias utilizando um agitador rotativo (180 rpm) . Depois da cultura, adicionou-se 250 ml de água a cada um dos frascos cónicos e agitou-se a mistura durante 1 hora utilizando um agitador rotativo para dissolver o cilo-inositol que estava presente na solução da 48 cultura. A solução da cultura foi recolhida e centrifugada (8.000 peso húmido 75 g).
As células foram novamente suspensas em 300 ml de água e foram divididas por ondas ultra-sónicas a 10 °C ou menos. A solução da lise indicou um pH de 4,8 e ajustou-se o pH da solução para pH 7,0 com NaOH IN. Depois, centrifugou-se a solução (16.000 rpm, 20 minutos) para separar o sobrenadante. Em seguida, adicionou-se MgS04 de modo que o sobrenadante contivesse Mg2+ 2 mM e carregou-se a solução numa coluna Blue-Toyopearl (fabricada pela Tosoh Corporation: 20 ml) Depois, fez-se passar, através de uma coluna, 50 ml de tampão Tris 20 mM (pH 7,0) complementado com Mg2+ 2 mM para lavá-la. Depois, fez-se passar, através de uma coluna, 50 ml de tampão Tris 20 mM (pH 7,0) complementado com KC1 1 M para eluir as proteínas adsorvidas. Em seguida, concentrou-se o produto eluído utilizando um ultrafiltro (corte a PM 30.000) e adicionou-se 50 ml de tampão de Tris 20 mM (a pH 7,0) à solução concentrada, seguida novamente de concentração, para se obter uma solução concentrada dessalinizada. Em seguida, carregou-se a solução concentrada dessalinizada numa coluna de DEAE Toyopearl (Tosoh Corporation: 20 ml) e realizou-se a eluição com uma solução com um gradiente de concentração linear de NaCl de 0 mM a 500 mM em tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) . Depois o produto eluído foi fraccionado em fracções. Mediu-se a actividade de cilo-inositol desidrogenase de cada uma das soluções fraccionadas e verificou-se que tinham actividade três fracções, uma fracção não adsorvida (SIDH1), uma fracção eluída com NaCl 200 mM (SIDH2) e uma fracção eluída com 300 mM (SIDH3).
Mediu-se a actividade como se segue: misturou-se 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADPH e 1 % de cilo-inosose) e 5 μΐ de uma solução da 49 enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos e depois adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água, seguida da medição da absorvência a 340 nm. Mediu-se a diminuição da absorvência, a 340 nm, com base num valor em branco para a solução de ensaio obtida utilizando água em vez da solução de enzima. A solução da enzima foi diluído conforme necessário. A fracção não absorvida na coluna, descrita antes, foi então carregada numa coluna CM Toyopearl (Tosoh Corporation: 20 ml) e realizou-se a eluição com uma solução com um gradiente de concentração linear de NaCl de 0 mM a 500 mM em tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) . Depois o produto eluído foi fraccionado em fracções. Mediu-se a actividade de cilo-inositol desidrogenase em cada uma das soluções fraccionadas e verificou-se que a fracção não adsorvida tinha actividade. A fracção eluída com NaCl 200 mM e a fracção eluída com 300 mM foram dessalinizadas separadamente, novamente com um ultra-filtro e realizou-se a eluição com uma solução com um gradiente de concentração linear entre 200 mM e 300 mM de NaCl em tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) . Depois o produto eluído foi fraccionado em fracções e purificado. Depois, essas três soluções de enzima com actividade de cilo-inositol desidrogenase foram concentradas separadamente utilizando um ultra-filtro e as soluções concentradas foram carregadas numa coluna de filtração com gel (Tosoh Corporation: 2000 SWXL), respectivamente. Depois, purificaram-se os produtos eluídos com tampão de fosfato 20 mM (pH 7,0) complementado com NaCl 200 mM. As soluções de enzima assim purificadas foram submetidas a electroforese com SDS e gel e corou-se o gel depois da electroforese com uma solução de coloração de azul brilhante de Coomassie (Rapid CBB ΚΑΝΤΟ: fabricado pela Kanto Chemical Co., Inc.) e depois descorou-se. Mediu-se a pureza das bandas com interesse medindo as bandas azuis de proteínas utilizando um densitómetro (fabricado pela ATTO Corporation) 50 e verificou-se que a pureza de cada fracção foi de 85 % ou mais.
Exemplo 10 <Pur±f±cação da enzima da presente invenção produzida por K12 ATCC 10798 de Escherichia coli e análise do seu terminal N>
Distribuiu-se 3 L de meio de caldo LB (1 % de Bacto- triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7,0) contendo 0,5 % de L-sorbose em aliquotas de 100 ml em 30 peças de frascos de Sakaquchi de 500 ml, seguida da esterilização utilizando uma autoclave. Inoculou-se um aro de platina com uma cultura inclinada de K12 de Escherichia coli K em cada frasco cónico e fez-se a cultura do microrganismo a 36 °C durante 1 dia utilizando um agitador reciproco (135 rpm). Depois da cultura, a solução da cultura foi recolhida e centrifugada (8.000 rpm, 20 minutos), para assim se obter células (peso húmido 32 g) . As células foram novamente suspensas em 100 ml de água e foram divididas por ondas ultra-sónicas a 10 °C ou menos. A solução de lise indicou um pH de 6,8 e ajustou-se a solução para pH 7,0 com uma solução IN de NaOH e depois centrifugou-se (16.000 rpm, 20 minutos) para separar o sobrenadante. Em seguida, adicionou-se MgS04 de modo que o sobrenadante contivesse Mg2+ 2 mM e carregou-se a solução numa coluna Blue-Toyopearl (Tosoh Corporation: 20 ml) Depois, fez-se passar, através de uma coluna, 50 ml de tampão Tris 20 mM (pH 7,0) complementado com Mg2+ 2 mM para lavá-la. Depois, fez-se passar, através da coluna, 50 ml de tampão Tris 20 mM (pH 7,0) complementado com KC1 1 M para eluir as proteínas adsorvidas. Em seguida, concentrou-se o produto eluido utilizando um ultrafiltro (corte a PM 30.000) e adicionou-se 50 ml de tampão de Tris 20 mM (a pH 7,0) à solução concentrada, seguida novamente de concentração, para 51 se obter uma solução concentrada dessalinizada. Em seguida, carregou-se a solução concentrada dessalinizada numa coluna de DEAE Toyopearl (Tosoh Corporation: 20 ml) e realizou-se a eluição com uma solução com um gradiente de concentração linear de NaCl de 0 mM a 500 mM em tampão de Tris 20 mM (pH 7,0). O produto eluido foi fraccionado em fracções. Mediu-se a actividade da cilo-inositol desidrogenase de cada uma das soluções fraccionadas e verificou-se que a fracção eluida com 300 mM tinha actividade. A medição da actividade foi realizada da mesma maneira que no exemplo 9 e mediu-se a diminuição da absorvência a 340 nm. A solução da enzima foi diluído conforme necessário. A fracção eluida com NaCl 300 mM foi dessalinizada utilizando novamente um ultra-filtro e o produto resultante foi carregado numa coluna DEAE Toyopearl (Tosoh Corporation: 20 ml) Depois, realizou-se a eluição com uma solução com um gradiente de concentração linear de 250 mM a 350 mM de NaCl em tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e realizou-se a purificação repetindo as operações de fraccionamento do produto eluido três vezes para eliminar as proteínas contaminantes. Depois, essa solução de enzima com actividade de cilo-inositol desidrogenase foi concentrada utilizando um ultra-filtro e as soluções concentradas foram carregadas numa coluna de filtração com gel (Tosoh Corporation: 2000 SWXL). Purificou-se o produto eluido com tampão de fosfato 20 mM (pH 7,0) complementado com NaCl 200 mM. A solução da enzima assim purificada foi submetida a electrof orese com SDS em gel e depois retirou-se o gel e transferiram-se as proteínas para uma membrana de PVDF (Immobilon PSQ: fabricada pela Millipore Corporation) com a mesma dimensão do gel utilizando um electro-traçador semi- 52 anidro (fabricado pela Funakoshi Co., Ltd.)· Depois, retirou-se a membrana de PVDF e corou-se com uma solução corante de azul brilhante de Coomassie (Rapid CBB ΚΑΝΤΟ: fabricado pela Kanto Chemical Co., Inc.) e depois descorou-se. Mediu-se a pureza utilizando um densitómetro da mesma maneira que no exemplo 9 e a pureza foi de 40 %. Além disso, cortou-se a porção correspondente à proteina-alvo para eliminar proteínas indesejáveis presentes próximo dessa porção, obtendo-se assim uma enzima da presente invenção com uma elevada pureza.
Em seguida, a enzima da presente invenção com uma elevada pureza que existe na membrana de PVDF foi analisada utilizando um analisador dos aminoácidos do terminal N (Hewlett-Packard Company). Como resultado, detectou-se uma sequência de serina-ácido aspártico-asparagina-isoleucina-arginina. O ADN que codifica uma proteína que tem essa sequência foi pesquisado na base de dados da sequência inteira de Escherichia coli (nome da base de dados "Colibri") e o gene ydgJ (ou o gene bl624) estava emparelhado. O produto do gene, do gene ydgj, tinha sido previsto como uma das oxidoredutases, mas o seu substrato e o produto eram desconhecidos.
Exemplo 11 <Isolamento e expressão do ADN da presente invenção derivada de K12 ATCC10798 da Escherichia coli>
Para se obter o gene ydgJ que foi assumido como codificando a enzima da presente invenção, primeiro, extraiu-se o genoma completo de K12 de Escherichia coli a ser utilizado como matriz, como se segue. Inoculou-se num aro de platina com K12 de Escherichia coli, que tinha estado em cultura num meio LB inclinado (1 % de bacto-triptona, 0,5 % 53 de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7.0, 1,5 % de agar) , em 100 ml de um meio LB num frasco (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7.0) e fez-se uma cultura aeróbica durante 8 horas a 36 °C, seguida de uma recolha das células. Adicionou-se aos péletes de células 15 ml de uma solução salina-EDTA (NaCl 0,15 M, EDTA 0,1 M, a pH 8,0) e 50 mg de lisozima e fez-se uma suspensão das células, seguida da reacção a 37 °C durante 2 horas. Depois do tratamento, adicionou-se à solução 0,5 ml de uma solução de SDS a 25 % para fazer a lise completa das células e adicionou-se 3 ml de fenol às proteínas desnaturadas, seguida de centrifugação. Retirou-se o sobrenadante e adicionou-se 20 ml de 2-propanol à solução para se obter o ADN genómico impuro. O ADN genómico impuro obtido precipitou por centrifugação e eliminou-se o sobrenadante, seguido de secagem a pressão reduzida. O ADN genómico impuro anidro foi depois dissolvido em 3 ml de uma solução de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, a pH 8,0) e depois adicionou-se 0,01 mg de ARNase, seguido da reacção a 36 °C durante 2 horas para degradar o ARN. Depois, adicionou-se 0,01 mg de proteinase K e deixou-se a mistura reagir a 36 °C durante 2 horas para degradar as proteinas. Em seguida, adicionou-se 1 ml de uma solução mista de fenol-clorofórmio (1:1) e agitou-se lentamente a mistura para desnaturar a RNAase e a proteinase K. Separou-se a mistura em duas fases por centrifugação e retirou-se a camada superior (uma fase aquosa) e ajustou-se para o pH para 5,2 por meio da adição de 0,3 ml de uma solução 3 M de acetato de sódio. Adicionou-se à solução 3 ml de 2-propanol para se obter o ADN genómico. O ADN genómico obtido precipitou por centrifugação e eliminou-se o sobrenadante, seguido de secagem a pressão reduzida. O ADN genómico anidro foi dissolvido em 3 ml de uma solução de TE e repetiu-se novamente o processo da operação de adição de 1 ml de uma solução mista de fenol-clorofórmio (1:1) com a 54 operação de dissolução do ADN em 3 ml da solução de TE, seguido de centrifugação. Da mesma maneira que anteriormente, adicionou-se um volume igual de 2-propanol ao sobrenadante a pH 5,2, para assim se preparar uma solução de ADN genómico d K12 de Escherichia coli. 0 AND genómico assim obtido foi utilizado como uma solução matriz do ADN para a RCP.
Clonou-se um fragmento que derivou de K12 de Escherichia coli e que continha um sitio de ligação do ribossoma (SLR) do gene ydgJ e realizou-se a RCP utilizando iniciadores com as sequências que se seguem para expressar o gene sob a forma de uma enzima recombinante. SEQ ID No. 15: ydgj-F 5'-cattcaagcttaatgagaggcaatgacatgagcg-3' SEQ ID No. 16: ydgi-R 5'-tcggaaHcttcatgcaaggcacaaaj cgc-3'
Para a RCP, utilizou-se a solução da reacção de Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. e preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 * tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN matriz, 1 μΐ de uma solução 10 μΜ de iniciador e 0,5 μΐ de Takara ExTaq por meio da adição de água de tal modo que tivesse um volume de 50 μΐ, seguido da deposição em camadas de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (55 °C, 1 minuto) e elongação (72 °C, 1 minuto), que se repetiram 35 vezes utilizando um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700). A RCP descrita antes amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,0 kpb. Depois da reacção, o óleo mineral em camadas foi extraído com 0,3 ml de hexano e eliminou-se a camada de hexano. Repetiu-se este processo três vezes, seguido da redução da pressão durante um minuto, para assim eliminar o óleo mineral. A partir de 50 μΐ da solução de reacção assim obtida, purificou-se o fragmento de RCP utilizando GENECLEAN (Bio 101) . Especificamente, adicionou-se 55 300 μΐ de uma solução de Nal incluída no estojo e misturou-se e adicionou-se 10 μΐ de uma solução de pérolas de vidro e misturou-se. Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para precipitar as pérolas de vidro nas quais o fragmento de ADN estava adsorvido e eliminou-se o sobrenadante. Depois adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem incluída no estojo à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a mistura para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem utilizando a nova solução de lavagem foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro a pressão reduzida e, após a secagem, adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão. Aqueceu-se a mistura para 554 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para se obter 12 μΐ de um sobrenadante contendo o fragmento de ADN.
Realizou-se uma operação de inserção do fragmento de ADN purificado num vector de expressão, como se segue. Especificamente, adicionou-se 0,5 pg de um plasmido de expressão (pUC119: Fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.)), 1 μΐ de enzimas de restrição HindIII e EcoRI da Takara Shuzo Co., Ltd. e 2 μΐ de 10 x tampão K, que é um tampão de enzima de restrição da Takara Shuzo Co., Ltd., a 10 μΐ da solução de fragmento de ADN e adicionou-se água esterilizada de modo a que a mistura ficasse com um volume de 20 μΐ, seguida de mistura. Deixou-se a solução reaccional reagir a 36 °C durante 2 horas. Depois da reacção das enzimas de restrição, isolou-se o fragmento de ADN e o vector de expressão com GENECLEAN e ligaram-se um ao outro. Especificamente, adicionou-se 300 μΐ da solução de Nal incluída no estojo e misturou-se em 20 μΐ da solução reaccional das enzimas de restrição e adicionou-se-lhe 10 μΐ da solução de pérolas de vidro e misturou-se. Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C durante 15 minutos e depois centrifugou-se para precipitar as 56 pérolas de vidro nas quais o fragmento de ADN e o vector de expressão estavam adsorvidos e eliminou-se o sobrenadante. Depois, adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem, incluida no estojo, à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a suspensão para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem utilizando a nova solução de lavagem foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro a pressão reduzida e, após a secagem, adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão. Aqueceu-se a mistura para 55 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para se obter 12 μΐ de um sobrenadante contendo o fragmento de ADN e o vector de expressão. O processo eliminou pequenos fragmentos de ADN que tinham uma dimensão de cerca de 50 pb ou menos e que tinham sido gerados pelas enzimas de restrição, para se obter assim o fragmento de ADN com interesse e o vector de expressão.
Adicionou-se 10 μΐ da solução de ligação de Takara do estojo-I (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 10 μΐ da solução assim preparada e deixou-se a mistura reagir a 164 °C durante 1 hora. Utilizou-se a solução para transformar as células concorrentes (Takara Shuzo Co., Ltd.: DH5a). Especificamente, adicionou-se-lhe 5 μΐ de uma solução reaccional de ligação e misturou-se em 60 μΐ de uma solução de células concorrentes não congeladas a 4 °C e deixou-se a 0 °C durante 30 minutos e depois a 42 °C durante 45 segundos e a 0 °C durante 2 minutos. Adicionou-se-lhe 500 μΐ de uma solução de SOC (2 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, NaCl 10 mM, glicose 20 mM, MgS04 10 mM e MgCl2 10 mM) seguida da recuperação da cultura a 36 °C durante 1 hora. Aplicou-se 100 57 μΐ da solução de cultura num meio de agar LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % NaCl, a pH 7,0, 1,5 % de agar) contendo 50 yg/ml de ampicilina, 40 yg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyil-p-D-galactósido) e IPTG (tiogalactopiranósido) 1 mM. Realizou-se depois a cultura a 37 °C durante 16 horas. A cultura originou Escherichia coli transformada por introdução do plasmido descrito antes, sob a forma de colónias brancas e seleccionaram-se as colónias. As colónias assim separadas da Escherichia coli transformada foram postas em cultura em meio liquido LB contendo ampicilina (50 pg/ml). A partir das células de cultura da Escherichia coli transformada, separou-se um ADN de plasmido e purificou-se utilizando um estojo de purificação de plasmido (Estojo midi de filtro de plasmido QIA, QIAGEN). O ADN do plasmido assim obtido confirmou ter um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,0 kpb, que correspondem ao gene de interesse ydgJ.
Em seguida, para confirmar a actividade de cilo-inositol desidrogenase, transferiram-se as estirpes microbianas isoladas como colónias para 100 ml de meio LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7,0) contendo 50 yg/ml de ampicilina e fez-se uma cultura a 36 °C durante 7 horas. Adicionou-se 0,3 ml de uma solução de tiogalactopiranósido 200 mM à solução da cultura e depois colocaram-se as células em cultura a 36 °C durante 3 horas. Depois da cultura estar completa, recolheram-se as células por centrifugação e lavaram-se uma vez com uma solução salina fisiológica. Depois, fez-se uma suspensão das células lavadas em 3 ml de uma solução de Triton X-100 a 0,6 % e dividiram-se as células por ondas ultra-sónicas a 4 °C. Centrifugou-se a solução e retirou-se 2,8 ml do sobrenadante (solução da enzima). Adicionou-se 1,2 g de sulfato de amónio ao sobrenadante para salinizar as proteínas a 4 °C. Recolheram- 58 se as proteínas salinizadas por centrifugação (15.000 rpm, 20 min) e eliminou-se o sobrenadante. Dissolveram-se os precipitados em 2,5 ml de tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e centrifugou-se novamente a solução (15.000 rpm, 20 min). Aplicou-se o sobrenadante a uma coluna Sephadex G-25 (Pharmacia K.K.: 14 ml) equilibrada com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0). Realizou-se a eluição com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e dessalinizou-se o produto da eluição. Os processos originaram 3,5 ml de uma solução de enzima impura do produto do gene ydgJ.
Mediu-se a actividade de cilo-inositol desidrogenase como se segue: misturou-se 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADPH e 1% de cilo-inosose) e 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos e depois adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água, seguida da medição da absorvência a 340 nm. Mediu-se a diminuição da absorvência, a 340 nm, com base num valor em branco para a solução de ensaio obtida utilizando água em vez da solução de enzima. A solução da enzima foi diluído conforme necessário.
Entretanto, o produto da reacção da enzima foi medido como se segue: deixou-se reagir 10 mg de cilo-inosose, 40 mg de NADPH e 10U da enzima em 1,0 ml de tampão de Tris 100 mM (pH 8,0) a 36 °C durante 4 horas e realizou-se um tratamento por aquecimento a 80 °C durante 10 min, seguido de arrefecimento. Depois, adicionou-se 100 μΐ de uma resina permutadora de catiões de uma base forte, 100 μΐ de uma resina permutadora de aniões de um ácido forte e 10 mg de carvão activado e agitou-se a mistura e centrifugou-se. Depois, diluiu-se, 2 vezes, o sobrenadante e fizeram-se as medições por CLAR (Shodex Asahipak NH2P-50 4E Φ 4,6 χ 250 mm: Shodex) utilizando um detector RI nas condições de uma 59 temperatura de coluna de 40 °C e uma velocidade de fluxo da fase móvel de 1,5 ml (acetonitrilo a 80 %) . Como resultado, verificou-se que o produto do gene ydgJ tinha uma elevada actividade de cilo-inositol desidrogenase e 100 % do produto era cilo-inositol obtido por redução, enquanto o mio-inositol, que é um dos seus isómeros, não foi detectado. Como resultado, verificou-se que a solução de uma enzima recombinante derivada do gene ydgJ tinha uma elevada actividade de cilo-inositol desidrogenase e o produto do gene foi cilo-inositol desidrogenase. Entretanto, no produto obtido pela reacção de redução da cilo-inosose, detectou-se apenas cilo-inositol e verificou-se que a enzima reduzia especificamente, sob o ponto de vista estereoquímico, a cilo-inosose para cilo-inositol. Entretanto, a sequência do gene ydgJ está ilustrado na SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 2.
Exemplo 12 <Isolamento e expressão de vim homólogo de ADN estimada a partir da homologia com o gene ydgJ de Escherichia coli e as suas propriedades> A partir da estimativa da estrutura tri-dimensional do produto do gene ydgJ de Escherichia coli com base na sequência de aminoácidos, estimou-se que o produto pertencia à familia das oxidoredutases de glicose-frutose. A família também inclui mio-inositol 2-desidrogenase (EC 1.1.1.18) e verificou-se que a sequência envolvida numa ligação de NAD na sequência de aminoácidos tinha uma elevada homologia. Além disso, a identificação da sequência de aminoácidos de um sítio envolvido na ligação do substrato por análise de estrutura com raios X da oxidoredutase de glicose-frutose e a pesquisa de proteínas que tinham parcialmente a mesma 60 sequência de aminoácidos e são homólogas com o produto do gene ydgJ revelaram que há proteínas homólogas em muitas bactérias gram-negativas e bactérias gram-positivas. A partir dessas bactérias, pesquisaram-se ADNs homólogos com base na homologia do gene ydgJ de Escherichia coli. Como resultado, verificou-se que o gene ydgJ de Escherichia coli tem homologia com o gene Atu4375 e o gene Atu3234 no genoma de C58 ATCC33970 de Agrobacterium tumefacience, o gene BG14057 no genoma de 168 ATCC238S7 de Bacillus subtili, o gene Xcc3438 no genoma de ATCC33913 de Xanthomonas campestris pv. campestri , e o gene Atu4375 e o gene Atu3234 no genoma de AB 10121 FERM P-17383 de Agrobacterium sp. que é conhecido como um microrganismo com capacidade para converter directamente mio-inositol em cilo-inositol. Por isso, esses ADNs foram isolados e expressos.
Para se obter os ADNs candidatos descritos antes, os genomas totais de C58 ATCC33970 de Agrobacterium tumefaciens, 168 ATCC23857 de Bacillus subtilis, ATCC33913 de Xanthomonas campestris pv. campestris, e AB10121 FERM P-17383 de Agrobacterium sp. a serem utilizados como matrizes foram extraídos como se segue. Para a C58 de Agrobacterium tumefacience, Xanthomonas campestris pv. campestris e a AB10121 de Agrobacterium sp. fez-se uma cultura em aro de platina, de C58 de Agrobacterium tumefacience, Xanthomonas campestris pv. campestris e ABI0121 de Agrobacterium sp. que tinham estado em cultura num meio LB inclinado (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7.0, 1,5 % de aqar) e inoculou-se em 100 ml de um meio LB num frasco (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7.0) e fez-se uma cultura aeróbica durante 61 18 horas a 27 °C, seguida de uma recolhas. Adicionou-se, aos péletes de células, 15 ml de uma solução salina de EDTA (NaCl 0,15 M, EDTA 0,1 M, a pH 8,0) e 50 mg de lisozima e fez-se uma suspensão de células, seguida da reacção a 374 °C durante 2 horas. Depois do tratamento, adicionou-se à solução 0,5 ml de SDS a 25 % para fazer a lise completa das células e adicionou-se 3 ml de fenol às proteínas desnaturadas. Depois, centrifugou-se a solução e retirou-se o sobrenadante. Adicionou-se 20 ml de 2-propanol à solução para se obter o AND genómico impuro. O ADN genómico impuro obtido precipitou por centrifugação e eliminou-se o sobrenadante, seguido de secagem a pressão reduzida. Depois, o ADN genómico impuro anidro foi depois dissolvido em 3 ml de uma solução de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, a pH 8,0) e depois adicionou-se 0,01 mg de ARNase e deixou-se reagir a 36 °C durante 2 horas para degradar o ARN. Depois, adicionou-se 0,01 mg de proteinase K e deixou-se reagir a 36 °C durante 2 horas para degradar as proteínas. Em seguida, adicionou-se 1 ml de uma solução mista de fenol-clorofórmio (1:1) e agitou-se lentamente a mistura para desnaturar a RNAase e a proteinase K. Separou-se a mistura em duas fases por centrifugação e retirou-se a camada superior (uma fase aquosa) e ajustou-se para o pH para 5,2 por meio da adição de 0,3 ml de uma solução 3 M de acetato de sódio. Adicionou-se 3 ml de 2-propanol à solução para se obter o ADN genómico. O ADN genómico obtido precipitou por centrifugação e eliminou-se o 62 sobrenadante, seguido de secagem a pressão reduzida. 0 ADN genómico anidro foi dissolvido em 3 ml de uma solução de TE e repetiu-se novamente o processo da operação de adição de 1 ml de uma solução mista de fenol-clorofórmio (1:1) com a operação de dissolução do ADN em 3 ml da solução de TE, seguido de centrifugação. Depois, da mesma maneira que antes, adicionou-se um volume igual de 2-propanol ao sobrenadante a pH 5,2, para assim preparar soluções dos ADNs genómicos de C58 de Agrobacterium tumefacience, Xanthomonas campestris pv. campestris e AB 10121 de Agrobacterium sp. respectivamente. Os ADNs genómicos assim obtidos foram utilizados como uma solução matriz do ADN para a RCP. 168 ATCC23857 de Bacillus subtilis num aro de platina que tinha estado em cultura num meio de "slant" de LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7.0, 1,5 % de agar) e inoculou-se em 100 ml de um meio LB num frasco (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7.0) e fez-se uma cultura aeróbica durante 18 horas a 36 °C. Depois, adicionou-se 1 ml do meio a 100 ml de um meio LB de um frasco preparado como anteriormente e fez-se uma cultura dos microrganismos durante 4 horas, seguida de uma recolha. Depois da recolha, extraiu-se o genoma total da mesma maneira que no processo utilizado para a Agrobacterium.
Em seguida, realizou-se uma RCP utilizando iniciadores com as sequências de clonagem que se seguem do gene Atu4375 e do gene Atu3234 no genoma de C58 de Agrobacterium tumefacience, o gene Atu4375 e o gene Atu3234 no genoma de 63 ΑΒ10121 de Agrobacterium sp. e o gene Xcc3438 no genoma de Xanthomonas campestris pv. campestris (incluindo todos SLR) , para as expressar como enzimas recombinantes.
SEQ ID No. 17: Atu4375-F 5'-ggcggatccmgaaagggatagtcatgtcct-3' SEQ ID No. 18: Atu4375-F 5'-attggaagcttcgaggctgcoacctag-3' SEQ ID No. 19: Atu4375-F 5'-ttgggatccmcaggggaaatanatggc-3' SEQ ID No. 20: Atu3234-R 5'-gccgcaagcttgttttacagcttcac-3' SEQ ID No. 23: Xcc3438-F 5'-tcggaattcgcgttgcggtgaatcgttttcaatg-3' SEQ ID No. 24: Xcc3438-R 5'-ataagaagcttgctcagtcgctgctgttgccttc-3'
Realizou-se a RCP utilizando iniciadores com as sequências para clonagem que se seguem do gene BG14057 no genoma 168 de Bacillus subtilis (incluindo SLR) para o expressar como uma enzima recombinante. O "a" na posição 10 do terminal 5' é originalmente "t" mas está alterado para "a" para a expressão em Escherichia coli. SEQ ID No. 21: BG140S7-F 5'-aggaattcgatgataacgcttttaaaggggagaa-3' SEQ ID No. 22: BG14057-R 5'-tttctgcagmagtgctccagcataatggttcg-3'
Para a RCP, utilizou-se a solução da reacção Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. e preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 χ tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN-matriz, 1 μΐ de uma solução de iniciador 10 μΜ e 0,5 μΐ de Takara ExTaq por meio da adição de água de tal modo que se tivesse um volume de 50 μΐ, seguido da formação de camadas de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (52 °C, 55 °C ou 58 °C (ver quadro 3), 1 minuto) e elongação (72 °C, 1 minuto) , que se repetiram 35 vezes utilizando um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC- 64 700). A RCP descrita antes amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,1 kpb.
Quadro 3: Lista da temperatura de hibridação
Genes-alvo
Temperatura hibridação de
Para O gene Atu4375 de C58 AICC33970 de Agrobacterium tumefacience Para o gene 4375 de AB 10121 FERM P-17383 de Agrobacterium Para o gene Atu3234 de C58 AICC33970 de Agrobacterium tumefacience Para o gene Atu3234 de AB 10121 FERM P-17383 de Agrobacterium Para o gene BG 14057 de 168 ATCC23857 de Bacillus subtilis Para o gene Xcc3438 de AICC33913 de Xanthomonas compestris pv. Campestrís
55 °C 55 °C 52 °C 52 °C 55 58
°C °C
Depois da reacção, o óleo mineral em camadas foi extraído com 0,3 ml de hexano e eliminou-se a camada de hexano. Repetiu-se este processo três vezes, seguido de redução da pressão durante um minuto, para assim eliminar o óleo mineral. A partir de 50 μΐ da solução de reacção assim obtida, purificaram-se os fragmentos da RCP utilizando GENECLEAN (Bio 101). Especificamente, adicionou-se 300 μΐ de uma solução de Nal incluída no estojo e misturou-se e adicionou-se 10 μΐ de uma solução de pérolas de vidro e misturou-se. Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para precipitar as pérolas de vidro nas quais os fragmentos de ADN estavam adsorvidos e eliminou-se o sobrenadante. Depois adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem incluída no estojo à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a mistura para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem utilizando a nova solução de lavagem foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro a pressão reduzida e, após a secagem, adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão. Aqueceu-se a mistura para 55 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para 65 se obter 12 μΐ de um sobrenadante contendo os fragmentos de ADN.
Realizou-se uma operação de inserção do fragmento de ADN purificado num vector de expressão, em cada uma das combinações, como se segue. Especificamente, adicionou-se 0,5 yg de um plasmido de expressão (pUC118: fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.)), 1 μΐ de dois tipos de enzimas de restrição da Takara Shuzo Co., Ltd. e 2 μΐ de 10 χ tampão K, que é uma solução tampão de enzima de restrição da Takara Shuzo Co., Ltd., a 10 μΐ da solução de fragmento de ADN e adicionou-se água esterilizada de modo a que a mistura ficasse com um volume de 20 μΐ, seguida de mistura. Deixou-se a solução reaccional reagir a 36 °C durante 2 horas. Como o gene
Atu3234 da estirpe AB10121 contém um sitio HindIII, não se realizou o tratamento com enzimas de restrição e, depois do isolamento, ligou-se a um vector pT7Blue (fabricado pela Novagen).
Quadro 4: Lista dos plasmidos de expressão e das enzimas de restrição utilizadas
Genes-alvo Plasmidos de Enzimas de restrição expressão utilizadas
Gene Atu4375 de C58 de A.tume. pUC118 Tampão de BamH I, Hind III/K Gene4375 de AB10121 pUC 118 Tampão de BamH I, Hind III/K Gene Atu3234 de C58 de A.tume. pUC 118 Tampão de BamH I, Hind III/K Gene Atu3234 de AB 10121 pT7Blue Não utilizado Gene BG14057 de 168 de B.sub. pUC118 Tampão de EcoR I, Pst I/H Gene Xcc3438 de X. camp. pUC118 Tampão de EcoR I, Hind III/K Depois da reacção das enzimas de restrição r isolou-se fragmento de ADN e o vector de expressão com GENECLEAN e ligaram-se um ao outro. Especificamente, adicionou-se 300 μΐ da solução de Nal incluída no estojo e misturou-se em 20 μΐ da solução reaccional das enzimas de restrição e e adicionou-se 10 μΐ da solução de pérolas de vidro e misturou-se. 66
Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C durante 15 minutos e depois centrifugou-se para precipitar as pérolas de vidro nas quais o fragmento de ADN e o vector de expressão estavam adsorvidos e eliminou-se o sobrenadante. Depois, adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem, incluída no estojo, à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a suspensão para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem utilizando a nova solução de lavagem foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro a pressão reduzida e, após a secagem, adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão. Aqueceu-se a mistura para 55 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para se obter 12 μΐ de um sobrenadante contendo o fragmento de ADN e o vector de expressão. O processo eliminou pequenos fragmentos de ADN que tinham uma dimensão de cerca de 50 pb ou menos e que tinham sido gerados pelas enzimas de restrição, para se obter assim um fragmento de ADN com interesse e o vector de expressão.
Adicionou-se 10 μΐ da solução de ligação de Takara do estojo-I (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 10 μΐ da solução assim preparada e deixou-se a mistura reagir a 16 °C durante 1 hora. Utilizou-se a solução para transformar as células concorrentes (Takara Shuzo Co., Ltd.: DH5a). Especificamente, adicionou-se-lhe 5 μΐ de uma solução reaccional de ligação a 60 μΐ de uma solução de células concorrentes não congeladas a 67 4 °C e misturou-se e deixou-se a 0 °C durante 30 minutos e depois a 42 °C durante 45 segundos e a 0 °C durante 2 minutos. Adicionou-se-lhe 500 μΐ de uma solução de SOC (2 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, NaCl 10 mM, glicose 20 mM, MgSCg 10 mM, e MgCl2 10 mM) seguida da recuperação da cultura a 36 °C durante 1 hora. Aplicou-se 100 μΐ da solução de cultura a um meio de agar LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % NaCl, a pH 7,0, 1,5 % de agar) contendo 50 pg/ml de ampicilina, 40 pg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactósido) e IPTG (tio-galactopiranósido) 1 mM. Realizou-se depois a cultura a 37 °C durante 16 horas. A cultura originou Escherichia coli transformada por introdução do plasmido descrito antes, sob a forma de colónias brancas e seleccionaram-se as colónias. As colónias assim separadas da Escherichia coli transformada foram postas em cultura num meio liquido LB contendo ampicilina (50 pg/ml). A partir das células de cultura da Escherichia coli transformada, separou-se um ADN de plasmido e purificou-se uitilizando um estojo de purificação de plasmido (Estojo midi do filtro de plasmido QIA, QIAGEN). O ADN do plasmido assim obtido confirmou para cada um ter um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,0 a 1,1 kpb, que corresponde ao ADN de interesse.
Em seguida, para confirmar a actividade de cilo-inositol desidrogenase, transferiram-se as estirpes microbianas isoladas como colónias para 100 ml de meio LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7,0) contendo 50 pg/ml de ampicilina e fez-se uma cultura a 36 °C durante 7 horas. Adicionou-se 0,3 ml de uma solução de tiogalactopiranósido 200 mM à solução da cultura e depois 68 colocaram-se as células em cultura a 36 °C durante 3 horas. Depois da cultura estar completa, recolheram-se as células por centrifugação e lavaram-se uma vez com uma solução salina fisiológica. Depois, fez-se uma suspensão de células lavadas em 3 ml de uma solução de Triton X-100 a 0,6 % e dividiram-se as células por ondas ultra-sónicas a 4 °C. Centrifugou-se a solução e retirou-se 2,8 ml do sobrenadante (solução da enzima). Adicionou-se 1,2 g de sulfato de amónio ao sobrenadante para salinizar as proteínas a 4 °C. Recolheram-se as proteínas salinizadas por centrifugação e eliminou-se o sobrenadante. Dissolveram-se os precipitados em 2,5 ml de tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e centrifugou-se novamente a solução. Aplicou-se o sobrenadante numa coluna Sephadex G-25 (14 ml) equilibrada com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0). Realizou-se a eluição com uma solução tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e dessalinizou-se o produto da eluição. Os processos originaram 3,5 ml de uma solução de enzima impura do produto do gene ydgJ.
Mediu-se a actividade de cilo-inositol desidrogenase como se segue: misturou-se 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADPH e 1% de cilo-inosose) e 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos e depois adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água, seguida da medição da absorvência a 340 nm. Mediu-se a diminuição da absorvência, a 340 nm, com base num valor em branco para a solução de ensaio obtida utilizando água em vez da solução de enzima. A solução da enzima foi diluído conforme necessário.
Entretanto, o produto da reacção da enzima foi medido como se segue: deixou-se reagir 10 mg de cilo-inosose, 40 mg de NADPH e 10U da enzima em 1,0 ml de tampão de Tris 100 mM (pH 8,0) a 36 °C durante 4 horas e realizou-se um tratamento 69 seguido de por aquecimento a 80 °C durante 10 min, arrefecimento. Depois, adicionou-se 100 μΐ de uma resina permutadora de catiões de uma base forte, 100 μΐ de uma resina permutadora de aniões de um ácido forte e 10 mg de carvão activado e agitou-se a mistura e centrifugou-se. Depois, diluiu-se, 2 vezes, o sobrenadante e fizeram-se as medições por CLAR (Shodex Asahipak NH2P-50 4E Φ 4,6 x 250 mm: Shodex) utilizando um detector RI nas condições de uma temperatura de coluna de 40 °C e uma velocidade de fluxo da fase móvel de 1,5 ml (acetonitrilo a 80 %) . Como resultado, verificou-se que o produto do gene Atu4375 e o produto do gene Atu3234 de C58 de Agrobacterium tumefacience, o produto do gene BG 14057 de 168 de Bacillus subtilis, o produto do gene Xcc3438 de Xanthomonas campestris pv. campestris e o produto do gene Atu4375 e o produto do gene Atu3234 da estirpe AB 10121 tinham uma elevada actividade de enzima e 100 % do produto era cilo-inositol obtido por redução, enquanto o mio-inositol, que é um seu isómero, não foi detectado. Como resultado verificou-se que as enzimas recombinantes derivadas dos genes mencionados têm uma elevada actividade de cilo-inositol desidrogenase e os produtos do gene eram cilo-inositol desidrogenase. Entretanto, nos produtos obtidos pela reacção de redução da cilo-inosose, detectou-se apenas cilo-inositol e verificou-se que as enzimas reduziam especificamente, sob o ponto de vista estereoquimico, a cilo-inosose para cilo-inositol. A sequência do gene Atu4375 derivada de C58 de Agrobacterium tumefacience está ilustrada na SEQ ID NO: 3, a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 4, a sequência do gene Atu3234 está ilustrada na SEQ ID NO: 5 e a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 6. Entretanto, a sequência do gene BG14057 derivada de 168 de Bacillus subtilis 168 está 70 ilustrada na SEQ ID NO: 7, a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 8, a sequência do gene Atu4375 derivado de AB10121 está ilustrada na SEQ ID NO: 9, a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 10, a sequência do gene Atu3234 está ilustrada na SEQ ID NO: 11, a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 12, a sequência do gene Xcc3438 derivado de Xanthomonas campestris pv. campestris está ilustrada na SEQ ID NO: 13 e a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 14. Entretanto, a partir dos resultados da análise da sequência de nucleótidos de um plasmido incluindo o gene Atu4375 e o gene Atu3234 de AB10121 (Hokkaido System Science Co., Ltd.), a homologia entre o gene Atu4375 de C58 de Agrobacterium tumefacience e o gene Atu4375 de AB10121 foi de 89 % para a sequência de nucleótidos e 96 % para a sequência de aminoácidos, embora a homologia entre o gene Atu3234 de C58 de Agrobacterium tumefacience e o gene Atu3234 de AB10121 foi de 87 % para a sequência de nucleótidos e 95 % para a sequência de aminoácidos.
Exemplo 13 <Isolamento do ADN que codifica SIDHl que é produzido a partir de AB10281 FERM BP-10119 de Acetobacter sp.>
Das enzimas purificadas, aplicou-se uma solução de enzima contendo SIDHl numa membrana de PVDF (Immobilon PSQ: fabricada pela Millipore Corporation) e absorvida na membrana de PVDF. Depois, retira-se a membrana de PVDF e cora-se com corante de azul brilhante de Coomassie (Rapid CBB ΚΑΝΤΟ: Fabricado pela ΚΑΝΤΟ CHEMICAL CO., INC.), descorou-se e secou-se, seguido da análise com um analisador de aminoácido do terminal N (fabricado pela Hewlett-Packard Development 71
Company). Como resultado, a partir do terminal N, uma sequência:
Met-Lis-Arg-Lis-Leu-Arg-Ile-Gli-Leu-Ile-Gli-Ser-Gli-Fen-Met-Gli-Arg-Tre-His-Ala-Fen-Gli-Tir-Ser foi identificada. Depois previu-se uma sequência de AND que codifica uma sequência de aminoácidos e em seguida construiram-se dois tipos de iniciadores. SEQ ID NO: 29: SIDH1-F1 atgaarcgnaarytncgiatyggyytiatygg SEQ ID NO: 30: SIDH1-F2 ggyttyatgggycgnacicaygcittyggyta
Em seguida, com base nas sequências de nucleótidos das várias cilo-inositol desidrogenases obtidas nos exemplos 10 a 12, prepararam-se os dois iniciadores que se seguem incluindo as regiões de elevado contendo dentro das sequências. SEQ ID NO: 31: SIDH1-B1 ggyttrtcrmmgayracrtgrstrcc SEQ ID NO: 32: SIDH1-B2 artgwrirtgrttgggigt
Entretanto, como ADN genómico de AB10281 a ser utilizado como matriz, preparou-se uma solução de ADN genómico de AB10281 utilizando os péletes de células (peso húmido cerca de 400 mg) preparados no exemplo 9, da mesma maneira que o processo de preparação de ADN descrito no exemplo 12.
Para a RCP, utilizou-se a solução da reacção de Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. e preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 χ tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN-matriz, 1 μΐ de cada uma das soluções de iniciador a 10 μΜ (SIDH1-F1 e SIDH1-B1) e 0.5 μΐ de Takara ExTaq por meio da adição de água de tal modo que tenha um volume de 50 μΐ, seguido da camada de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, utilizou-se um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700) e fez-se um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (50 °C, 30
segundos) e elongação (72 °C, 1 minuto), repetido 35 vezes. A 72 electroforese revelou que a RCP descrita antes amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 0,3 kpb. Além disso, a banda na posição de 0,3 kpb foi retirada do gel, utilizou-se uma parte de uma solução de gel homogeneizada como matriz (2 μΐ) e preparou-se uma solução de reacção com a mesma composição tal como descrito antes excepto no facto de ser mudado a combinação de iniciadores para SIDH1-F2 e SIDH1-B2. Para a reacção, utilizou-se um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700) e fez-se um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (46°C, 30 segundos) e elongação (72 °C, 1 minuto), repetido 35 vezes. A electroforese revelou que a RCP amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 0,25 kpb. O fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 0,25 kpb foi retirado do gel e purificou-se o fragmento da RCP utilizando GENECLEAN (fabricado pela BiolOl) . Especifica-mente, da mesma maneira que o processo de purificação descrito no exemplo 12 excepto no facto de o gel estar dissolvido numa solução de Nal, obteve-se 12 μΐ de uma solução do fragmento de ADN.
Em seguida, ligou-se o fragmento de ADN purificado a um vector pT7Blue. Especificamente, adicionou-se 0,5 pg do vector pT7Blue e 10 μΐ da solução de ligação de Takara do estojo-I (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 10 μΐ da solução de fragmento de ADN e deixou-se a mistura reagir a 16°C durante 73 1 hora. Utilizou-se a solução para transformar as células concorrentes (DH5oí, Takara Shuzo Co., Ltd.) A operação de transformação e isolamento de um plasmido dos transformantes foi realizada da mesma maneira que no exemplo 12.
Submeteu-se o plasmido obtido a uma análise da sequência de nucleótidos (Hokkaido System Science Co., Ltd.) utilizando iniciadores universais (R-20mer e U-19mer) e revelou-se cerca de um terço da semi-região inicial da sequência de nucleótidos de um gene que codifica a enzima.
Depois, para determinar o comprimento completo da sequência de nucleótidos, digeriu-se completamente o ADN genómico de AB10281 com uma enzima de restrição BamHI e a solução de fragmento de ADN foi purificada utilizando GENECLEAN (fabricado pela BiolOl), seguida da auto-ligação do fragmento. Especificamente, adicionou-se 10 μΐ da solução de ligação de Takara do estojo-I (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 10 μΐ da solução de fragmento de ADN assim preparada e deixou-se a mistura reagir a 16 °C durante 1 hora. Depois da reacção, purificou-se o ADN utilizando GENECLEAN (fabricado pela BiolOl) e utilizou-se a solução como uma solução do ADN-matriz para a RCP inversa.
Em seguida, com base em cerca de um terço de metade da região inicial da sequência de nucleótidos revelada, prepararam-se os três iniciadores que se seguem e realizou-se a RCP inversa. 74 SEQ ID NO: 33: SIDH1-INV-F gctcgtcaacgatcctgaaattgat SEQ ID No: 34 : SIDHI-INV-B ttcgctgcagcttcatcggaaatat SEQ ID No: 35: SIDH1-INVF3 cccttcaatttccgggcgggt
Para a RCP inversa, utilizou-se a solução da reacção de Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. E preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 χ tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN-matriz, 1 μΐ de cada uma das soluções de iniciador a 10 μΜ (uma combinação de SIDH1-INV-F e SIDHI-INV-B ou uma combinação de SIDH1-INV-F e SIDH1-INV3) e 0,5 μΐ de Takara ExTaq por meio da adição de água de tal modo que tenha um volume de 50 μΐ, seguido da camada de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, utilizou-se um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700) e fez-se um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (50 °C, 30 segundos) e elongação (72 °C, 2 minutos), repetido 35 vezes. A electroforese revelou que os fragmentos de ADN amplificados pela RCP descrita antes tinham dimensões de cerca de 2,7 kpb e cerca de 1,8 kpb. Depois, as bandas nas posições de cerca de 2,7 kpb e cerca de 1,8 kpb foram retiradas do gel e os fragmentos de RCP foram purificados utilizando GENECLEAN (fabricado pela BiolOl), para se obter assim 10 μΐ de soluções de fragmentos de ADN. Os dois fragmentos de ADN resultantes foram submetidos à análise das sequências de nucleótidos (Hokkaido System Science Co., Ltd.) utilizando os iniciadores utilizados na RCP para determinar toda a sequência de nucleótidos dos genes que codificam a enzima. 75
Em seguida, realizou-se a RCP utilizando iniciadores com as sequências que se seguem para a clonagem do gene SIDH1 (incluindo um sitio de SLR) derivada da estirpe AB10281 para a sua expressão como enzima recombinante. SEQ ID NO: 36: 281SIDH1-F gctggatcccgcccttattgtgaata SEQ ID No: 37: 281SIDH1-R tatgaattcgttatgccttctcatgctgtcg
Para a RCP, utilizou-se a solução da reacção de Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. E preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 χ tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN matriz, 1 μΐ de cada solução de iniciador 10 μΜ e 0.5 μΐ de Takara ExTaq por meio da adição de água de tal modo que tenha um volume de 50 μΐ, seguido da camada de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (55 °C, 1 minuto) e elongação (72 °C, 1 minuto) , que se repetiram 35 vezes utilizando um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700). A RCP descrita antes amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,2 kpb.
Purificou-se o fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,2 kpb utilizando GENECLEAN (fabricado pela BiolOl), par assim se obter 12 μΐ de uma solução de fragmento de ADN. Para um processo para inserir o fragmento de ADN num vector de expressão, adicionou-se 0,5 pg de um plasmido de expressão (pUC119), 1 μΐ das enzimas de restrição (BamHI, EcoRI) da Takara Shuzo Co., Ltd., e 2 μΐ de 10 χ tampão K para as enzimas de restrição da Takara Shuzo Co., Ltd. a 10 μΐ de uma solução de um fragmento de ADN e adicionou-se água esterilizada de modo a ter um volume de 20 μΐ, seguindo-se a sua mistura. Deixou-se a solução reaccional reagir a 36 °C durante 2 horas. 76 A recolha do fragmento de ADN da solução de reacção, realizaram-se a purificação, reacção de ligação e transformação das células concorrentes (DH5a, Takara Shuzo Co., Ltd.) da mesma maneira que no exemplo 12. Além disso, a expressão da cilo-inositol desidrogenase e a medição da actividade realizaram-se da mesma maneira que no exemplo 12 e identificou-se o produto do gene como cilo-inositol desidrogenase.
Como resultado, a sequência de nucleótidos de um gene que codifica SIDH1 derivado da estirpe AB10281 está ilustrada na SEQ ID NO: 27, enquanto a sua sequência de aminoácidos está ilustrada na SEQ ID NO: 28.
Exemplo 14 <Estudo das propriedades da enzima da presente invenção, de vários tipos de cilo-inositol desidrogenase> 0 processo que se segue foi realizado para estudar as propriedades enzimáticas de SIDH1, SIDH2 e SIDH3 derivadas da estirpe AB 10281, que tinham sido obtidas pela purificação enzimática do exemplo 9; o produto do gene ydgJ derivado de Escherichia coli, que tinha sido obtido como uma enzima recombinante no exemplo 11; e os produtos dos genes Atu4375 e Atu3234 de C58 de Agrobacterium tumefacience, o produto do gene BG14057 de 168 de Bacillus subtilis, o produto do gene Xcc3438 de Xanthomonas campestris pv. campestris e os produtos dos genes Atu4375 e Atu3234 da estirpe AB10121, tendo todos eles sido obtidos como enzimas recombinantes no exemplo 12 e os resultados estão ilustrados no quadro 5. O quadro 6 mostra a homologia na sequência de aminoácidos. A homologia de apenas os aminoácidos comuns a 77 todas as sequências foi baixa (cerca de 5 %) , mas a homologia, incluindo ter aminoácidos com propriedades similares, foi alta, particularmente nos dominios de ligação de NAD ou de NADP em cerca de 30 % da sequência do terminal N. Além disso, a sequência de lisina-prolina em direcção ao centro da sequência, envolvida na ligação de nicotinamida, que é um sitio de reacção de oxidoredução de NAD ou NADP, estava altamente conservada. A asparagina na 27a posição em direcção ao terminal C a partir da sequência de lisina-prolina e a sequência de ácido aspártico-(3 aminoácidos)-histidina próxima do centro da sequência estavam também altamente conservadas, por isso são consideradas como sequências importantes envolvidas na ligação do substrato a partir das estimadas estruturas tri-dimensionais. No quadro, as sequências comuns estão representadas pelo simbolo os aminoácidos com propriedades similares estão representados pelo simbolo ou o simbolo e a asparagina na 27a posição em direcção ao terminal C a partir da sequência de lisina-prolina e a sequência de terminal a partir da sequência ácido aspártico-(3 aminoácidos)-histidina próxima do centro da sequência estão representadas por sombreado.
Na comparação dos pesos moleculares, o peso molecular da enzima da presente invenção, derivada de AB10281 foi calculado com base nos resultados da SDS-PAGE utilizando um marcador de peso molecular (padrão de pré-coloração (tipo de gama larga): Fabricado pela Bio-Rad Laboratories, Inc.), enquanto os pesos moleculares de outras enzimas da presente invenção foram estimados a partir dos comprimentos completos dos genes. Como resultado, os pesos moleculares das enzimas da presente invenção (SIDH1, SIDH2 e SIDH3) derivadas de AB10281, que tinham sido obtidas pela purificação da enzima, foram de 46 k Dalton, 42 k Dalton, e 40 k Dalton, respectivamente. Entretanto, o peso molecular da enzima da 78 presente invenção derivada do gene ydgJ de K12 de Escherichia coli, que se tinha obtido como uma enzima recombinante no exemplo 11, foi de 38,2 k Dalton; os pesos moleculares de outras enzimas da presente invenção derivadas do gene Atu4375 e do gene Atu3234 de C58 de Agrobacterium tumefacience, que se tinham obtido como enzimas recombinantes no exemplo 12, foram de 41,3 k Dalton e 42,4 k Dalton, respectivamente; os pesos moleculares de outras enzimas da presente invenção derivadas do gene BG14057 de 168 de Bacillus subtilis, do gene Xcc3438 de Xanthomonas campestris pv. campestris e do gene Atu4375 e do gene Atu3234 de AB 10121 foram de 40,1 k Dalton, 38,5 k Dalton, 41,4 k Dalton e 42,5 k Dalton, respectivamente. Isto é, verificou-se que as enzimas da presente invenção, cilo-inositol desidrogenase, tinham um peso molecular de 38 a 46 k Dalton.
As propriedades de associação da enzima da presente invenção foram determinadas por: medição da actividade de fracções obtidas por fraccionamento utilizando uma coluna de filtração em gel (Tosoh Corporation: 2000SWXL); calculando o peso molecular das fracções correspondentes de peso molecular; e dividindo os valores calculados pelos pesos moleculares da enzima. Os valores resultantes foram representados como números inteiros. Como resultado, verificou-se que as enzimas da presente invenção, as cilo-inositol desidrogenases, têm um peso molecular de 80 k a 110 k Dalton e considerou-se que formavam dimeros e trimeros em condições de dessnaturação. A selectividade da coenzima da enzima da presente invenção foi determinada por: mistura de 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADPH ou NADH e 1% de cilo-inosose) com 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos. Depois da 79 reacção, adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de uma solução de ensaio preparada utilizando água em vez da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340. A solução da enzima foi diluido conforme necessário. Os resultados indicam que as cilo-inositol desidrogenases das enzimas da presente invenção foram capazes de utilizar como co-enzimas tanto NADPH como NADH, mas tem a actividade relativa da coenzima como se mostra no quadro 5. Foi revelado que muitas enzimas têm uma elevada reactividade com NADPH. 0 pH óptimo das enzimas da presente invenção foi determinada por: mistura de 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de fosfatos 200 mM (pH 5,0 a 9,0), 2 % de NADPH e 1% de cilo-inosose) com 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos. Depois da reacção, adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de uma solução de ensaio preparada utilizando água em vez da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340. A solução da enzima foi diluido conforme necessário. Como resultado, verificou-se que as enzimas da presente invenção, as cilo-inositol desidrogenases, têm um pH óptimo como se mostra no quadro 5. Isto é, verificou-se que as enzimas da presente invenção reagem num amplo intervalo de pH 5 a 9. Entretanto, também foi revelado que há enzimas que têm actividade máxima do lado ácido (pH próximo de 6) , enzimas que têm uma actividade máxima numa região neutra (pH a cerca de 6,5 a 7,5) e as enzimas que têm uma actividade máxima do lado alcalino (pH a cerca de 7,5 a 9) . A termoestabilidade das enzimas da presente invenção foi determinada por: tratamento de uma solução de enzima à temperatura pré-determinada durante 10 min; arrefecimento da 80 solução; mistura da solução de enzima com 5 μΐ de uma solução de reacção (tampão de fosfato 200 mM (pH 5,0 a 9,0), 2 % de NADPH e 1 % de cilo-inosose) ; e deixando a mistura reagir a 36 °C durante 30 min. Depois, adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de uma solução de ensaio preparada utilizando água em vez da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340. A solução da enzima foi diluído conforme necessário. A actividade de um grupo tratado a 20 °C durante 10 min foi definida como 100 % e comparam-se as actividades relativas. Como resultado, verificou-se que a termo-estabilidade das enzimas da presente invenção, cilo-inositol desidrogenase, varia consoante as enzimas como se mostra no quadro 5 e verificou-se que a estabilidade varia no intervalo de 40 a 60 °C consoante as enzimas.
Os efeitos do metal pesado nas enzimas da presente invenção foram determinadas por: mistura de 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADPH e 1% de cilo-inosose e 2M de metal pesado) com 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos. Depois da reacção, adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de uma solução de ensaio preparada utilizando água em vez da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340. A solução da enzima foi diluído conforme necessário. Utilizaram-se como sais metálicos: CaCl2, C0CI2, ZnS04, MgS04, SnCl2, NÍCI2 e MnS04. A actividade do grupo que não foi adicionado foi definida como 100 % e compararam-se as actividades relativas. Como resultado, como se mostra no quadro 5, as enzimas da presente invenção, as cilo-inositol desidrogenases, foram activadas pelo menos na presença do ião Co 2+ e inibidas na presença do ião Sn2+. A maior parte das enzimas foram inibidas na presença do ião Zn 2+, pelo 81 contrário, a enzima derivada de 168 de Bacillus subtilis foi activada na presença do ião Zn2+.
Os valores de Km das enzimas da presente invenção, para cilo-inosose foram determinadas por: mistura de 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADPH e 0,001 a 2,5 % de cilo-inosose) com 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos. Depois da reacção, adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de uma solução de ensaio preparada utilizando água em vez da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340. A solução da enzima foi diluído conforme necessário. Os valores de Km foram calculados por meio de um gráfico recíproco. Como resultado, como se mostra no quadro 5, verificou-se que as enzimas da presente invenção, cilo-inositol desidrogenase, têm valores de Km no intervalo de 2,6 a 12,6 mM. A especificidade do substrato das enzimas da presente invenção foi determinada medindo a actividade relativa de oxidação no que respeita à reactividade ao cilo-inositol. Os isómeros de inositol incluem cilo-inositol (Cl), mio-inositol (MI), D-quiro-inositol (DCI), L-quiro-inositol (LQI), epi-inositol (EI), muco-inositol (Mui), alo-inositol (AI) e neo-inositol (NI) . O quadro 5 mostra o grupo de isómeros com os quais as enzimas mostram uma actividade relativa não inferior a 70 %, um grupo de isómeros com os quais as enzimas mostram uma actividade relativa não inferior a 70 % e não inferior a 20 % e um grupo de isómeros com os quais as enzimas mostram uma actividade relativa não inferior a 20 %.
Determinou-se a especificidade do substrato por meio de: mistura de 50 μΐ de uma solução reaccional (isómeros com 1 % 82 de inositol (ou apenas 0,4 % de neo-inositol), tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 0,002 % NADP+, 0,002 % de diaforase e 0,01 % de azul de nitrotetrazólio) com 50 μΐ de uma solução de enzima; e fez-se a medição do aumento da absorvência a 545 nm a 25 °C de três em três minutos utilizando um leitor de micro-placas. Calculou-se a taxa de reacção a partir dos aumentos da absorvência nos tempos respectivos. Como resultado, verificou-se que a especificidade do substrato varia ligeiramente consoante os tipos de enzimas e da correlação com as estruturas dos isómeros de inositol, também se verificou que essas enzimas têm pelo menos actividade de cilo-inositol desidrogenase e actividade de mio-inositol desidrogenase.
Quadro 5: Lista de propriedades de cilo-inositol desidrogenase
Estirpes . J, coli \cetobacter sp, lacillus sub, _1 Estirpe 168 |(ATCC238 57) Estirpe [12 (ATCC10798) ;FERM P-18868) .. nome da enzima Gene ydgJ 1 5IDH1 5IDH2 >IDH3 iene BG14 057 Γ 11 kDalton 38,2k 1 l6k (SDS-PAGE) I2k (SDS-PAGE) lOk (SDS-PAGE) 10,lk Γ ' j j j Dimero associação Dimero 1 'rimer )imero )imero Estável a 45 "C ou lienos Estável a60°C ou |ienos Estável a60°C ou lienos I Estável a40°C ou íienos Termoestabilidade ienos Actividade relativa da cozenzima NADPH:NADH =100:9 NADPH:NADH J=100:112 NADPH:NADH |=100:1 NADPH:NADH j=100:3 | NADPH:NADH J=100:52 pH óptimo )H 7,5-9,0 )H 5,5-6,5 )H 5,5-6,5 )H 5,5-6,5 )H 7,0-8,5 λ 1_^o ^ ^ n pesado: activação Co :o :o )o,Mn ’o, Mn, Zn Efeitos do metal pesado: inibiçãc Sn, Zn 5n, Zn >n, Zn >n, Zn 5n forte ΒοΗιιρ2λ da reacção Apenas CIS - SI . vpenas CIS - SI apenas CIS - SI Apenas CIS SI vpenas CIS SI 1- V» 1 Ho I^m pSrj cilo-inosose 3,9mM ', 6mM .0,6mM .2,6mM i, 5mM 1- Substrato especifico 1_ Actividade SI,MI,DQI >1 >1 >1 >I,MI relativa (70 % ou mais) 1 Λ , , especifico LQI,EI,MuI 11 11 11 )QI, EI, AI, NI 83
Actividade relativa (20 a 70 %) , Substrato especifico | DQI,LQI,EI, JluI, AI, NI Actividade AI,NI lul, AI, NI fcul,AI,NI LQI, Mui relativa (menos do que 20 %) 1 1 1_ Estirpe C58 (ATCC33970) AB10121 |(FERM P-17383) 1 pv,Campestris |(ATCC3391 3) Mr>Tno Hr, gcnc nome da enzima Gene Atu4375 !ene Atu3234 iene Atu4375 iene Atu3234 iene Xcc34 38 kDalton U,3k [2,4k H, 4k 12,5k co Tr'pri·d'd' d' associação Dimero 1 )imero )imero )imero )ímero Termoestabilidade istável a 50°C ou lenos Estável a 40°C ou jienos Estável a 50°C ou |ienos Estável a 40°C ou jnenos | Estável a40°C ou jienos Actividade relativa da cozenzima NADPH:NADH =100:9 NADPH:NADH |=100:18 NADPH:NADH j=100:6 NADPH:NADH |=100:20 | NADPH:NADH j=100:34 pH óptimo >H6, 5-8,5 )H7,0-8,5 )H6,5-8,5 )H7,0-8,5 )H6,5-7,5 ρίο.,.ησ Hri InQt_al pesado: activação Co, Mn 5o,Mn, Ca io,Mn io,Mn, Ca io Efeitos do metal pesado: inibiçãc Sn, Zn >n, Zn 5n, Zn 5n, Zn 5n, Zn forte p ^ ~ H H 1- da reacção Apenas CIS - SI . vpenas CIS -* SI Apenas CIS - SI Apenas CIS -* SI ipenas CIS - SI 1 ., , n cilo-inosose 9, 2mM 1 !, 6mM ), 8mM 5,1 mM ), lmM Substrato especifico I Actividade SI,MI,DQI,EI 51, MI, DQI, EI, LQI 51,MI,DQI,EI 51, MI, DQI, EI, LQI 51, DQI relativa (70 % ou menos) | Substrato especifico | Actividade LQI,Mui :iui jQI ,MuI lul II relativa (20 a 70 %) I Substrato especifico | Actividade AI,NI αΙ,ΝΙ ΛΙ,ΝΙ ΛΙ,ΝΙ :i,LQI,Mui, AI,NI relativa (menos do que 20 %) I Abreviaturas CIS: EI:Epi-inositol, Mi cilo-inosose, SI:£ 1:Muco-inositol, AI cyllo-inositol, MI :l· :Alo-inositol, NI:Neo lio-inositol, DQI:D-chiro-inositol, LQI:L-quiro-inositol, -inositol
Eeeii.yágJ X ca»p. Xccí438 &sub.88M0S7 X tu». Atums mimutmis kitm.Amm AS«512m«3234 £. coíi. ><tgJ X «atsp, I«s3438 &»it>.88S4357 A. tune. Atu4375 A8!012Uí.!j4375 A. tms, Atu3234 Α810)ί*Αΐύ3234 AB5028IStSJHl --------------------SSOSíRVeitGYGIfASXTFHAÍli-AfimmA¥SS~~SSSETXV ÍSEQ ÍD W* 2 ) ———mmtjwmwwwMit—astp®jihsw—sskp«h> <8eqii>ko·. m) -aiTtu(®fa(voT!KyaiLSYasâsmmL—ovueoissia—rssTSV <sbqh> no; « —aSSATKKFOS® I fiLí^SSSQGAF*S(WH8 j-AARU5087El¥A3AtSSDP«ÍA ÍSBQl»N0i4) -«ssAPKxn^ifiLatvssôc^ —no·- n» ^íOTTKCAMfBiimsaswiasw»—AAKis^mvAaALsstms m&a 10 m>-13) E& 10140· 28) 0iff7msc^ac^a(m5¥Fí#RK5scaTu(aLAes«.«¥A«;çsKn) SSSPÍXUÍAAQAR 1¥¥δλΜ£Λ2Κ i WOÍ«©*©ADFlTm !E&®â.«'¥^«SHFC EíWATAK^TU<RAAÍ^6VltSVYW8»g»mT lK& i SSGSLS)! KTYOYSY#
0íip¥TATlEEAKALA8 i VRASCStFVí. THfjtTQYMlSÍt&Sti AEGA t SKU8WM£YA OXmATL££AKAtÁ£! ¥RA$0$tR^TWT3YAÍSJtfííffi8WAD8AfâCLRH¥0A£YA 0KfXTSfâ.a}«íw>3)¥AacADALf s i tmjrasÊYP δ^Τ5^6»ΑΙ3α)Φ¥Α^ΑΙΓ!ΙΤ^3Υ?Ιί¥»^¥ε^6Τ(81«8ΚΥΡ 84
Ê®LAfXAAWK6SA£AA£W<3¥I<T0V®7(Sllí3^MUaAR!MfSMffiieÊ IffiJYRaiHA * £. «ο* i X. CW>. XCC3433 K tvm. Àtu4375 ABlÔí2Mtu4375 A. tua».Atu3Z34 tomiíktwu ABtOJSiSííiH!
Ecoií. y&J X.e»w,Xee3438 8. sub. 8614057 A. tww. Atu4375 Agí»J2IAtu4375 A. tune. Atu3234 A8íÔí2Utu3234 AB)028tStDHÍ E.coH.ydgJ X. cassp. Xcc3438 0. sub, BC 1405 7 A. tw», Atu4375 A8ISI2IAtii437§ A. ttsaa. Âtu3234 AS1012Ut«3234 AB10281S!0Ht
AQLRPSA-aSWfHAittVPCR-MIU*mAAAgS*WI¥H oRQftrâA-Rst»mimRYP«.-Miuw&vtmMtm mtm---eiwfmjmm.--mYsesswuwwôm
TSFVP®--QUSSAKtUJBBSG-AKMJIASOIAVClfâiALSUíYY
TSFVWR-CUJOSAHIUWfcSe-AXOfcfA$8 I AVGNBMLSIKVY mmm-- «IFW8R--RUM«ft»U8^^ miKnPDftâGIftMEMOifi^^-ATSSVEaflHATCfiUIQHDFEW ssasstwaLfiwm-^iW-—{e*fâ««i>~cviiRVB6E»vEEri
SÍT^YU(MQAOÍ{OQt”~ftA®fiPQ-TASÍfilBIl^^TlWWttSEâWHIHO a®ssfiKyôioeômHiA®(PE-—Dosa^ov^mnimaocmi ^<MflWHRVPOEl»F~-rPYS£PWÍL I TFJtóASASAAAWfVSÍW^GHPESlfiHefA ^seiE«H}fi?vroa«F-TPYG£{m í ra»meAM»tfS8Vps^ soKAOtEwroAOPbYiKF-TKLCEfm i „ ... . . IT-VPôhmfAYYAAIROAINQDGEIW-PASQAJ ÔVIKí. í EL61 ESAKHRAliClA- f1)GVf^YWICYAAjTa)AMAGTAÍWy-SAAMVWJ(®JlB-AQR<iAAi.<3ÔYl*lE<3tS$ fô-vsmmi8íiAÊSiiiÊmpy-Tí«E8 wiri ieaaksskqsítuib*— rt-Y8EAADAtlA«RE«ETM^ÍYiM^iaASlJffl»MVRSS^TSItníSI&í--I f-YK£AA0A! ÍAJOÍEíKAAAfiEVtYf-S^fitASLAFtaAAVRSSO-TSTetlílOí--'
Tí-rriAAHA*^?esiL«í*vi^^— í i -iWMki&mGSMmm-mmwtimKiBSGmmw.— —-LXAI EVARYlEALAfôíiPEmrHASLfilOTLVET IHASS-KSAAW»VPTDK
Exemplo 15 <Produção de cilo-inositol utilizando a enzima da presente invenção> 0 processo de produção da presente invenção requer dois tipos de enzimas, mio-inositol 2-desidrogenase e a enzima da presente invenção. Aqui, vai mostrar-se um exemplo que utiliza uma enzima recombinante de mio-inositol 2-desidrogenase que é um produto do gene BG10669 derivado de 168 ATCC23857 de Bacillus subtilis e uma enzima recombinante da enzima da presente invenção codificada pelo ADN da presente invenção (gene ydgJ derivado de K12 de Escherichia coli: SEQ ID NO: 1).
Primeiro, para se obter uma enzima recombinante de mio-inositol 2-desidrogenase que é um produto do gene BG10669 derivado de 168 ATCC23857 de Bacillus subtilis, realizou-se a 86
Realizou-se a RCP utilizando experiência que se segue, iniciadores que têm as sequências que se seguem para a clonagem do gene BG10669 derivado de 168 de Bacillus subtilis para a expressar como a enzima recombinante.
SEQ ID NO: 25: BG10669-F 5'-ttgggatccgatgagtttacgtattggcgtaattg-3'
SEQ ID No. 26: BG10669-R 5'-aaactgcagttagttttgaactgttgtaaaagattgata-3'
Para a RCP, utilizou-se a solução da reacção de Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. E preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 χ tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN matriz, 1 μΐ de cada solução de iniciador 10 μΜ e 0,5 μΐ de Takara ExTaq por meio da adição de água de tal modo que tenha um volume de 50 μΐ, seguido da camada de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos),
hibridação (53 °C, 1 minuto) e elongação (72 °C, 1 minuto) , que se repetiram 35 vezes utilizando um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700). A RCP descrita antes amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,0 kpb. Depois da reacção, o óleo mineral em camadas foi extraído com 0,3 ml de hexano e repetiu-se uma operação de eliminação da camada de três vezes, seguida da redução da pressão para 1 minuto, para assim eliminar o óleo mineral. A partir de 50 μΐ da solução de reacção assim obtida, purificou-se o fragmento da RCP utilizando GENECLEAN (Bio 101) . Especificamente, adicionou-se 300 μΐ de uma solução de Nal incluída no estojo e misturou-se e adicionou-se 10 μΐ de uma solução de pérolas de vidro e misturou-se. Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C 87 durante 15 minutos e centrifugou-se para precipitar as pérolas de vidro nas quais o fragmento de ADN foi absorvido e depois eliminou-se o sobrenadante. Depois adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem incluída no estojo à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a mistura para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem utilizando a nova solução de lavagem foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro e pressão reduzida e adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão. Aqueceu-se a mistura para 55°C durante 15 minutos e centrifugou-se para se obter 12 μΐ do sobrenadante contendo o fragmento de ADN.
Realizou-se uma operação de inserção do fragmento de ADN purificado num vector de expressão, como se segue.
Especificamente, adicionou-se 0,5 pg de um plasmido de expressão (pUC118: fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.)), 1 μΐ de cada uma das enzimas de restrição BamHI e PstI daTakara Shuzo Co., Ltd. e 2 μΐ de 10 x tampão K, que é um tampão de enzima de restrição da Takara Shuzo Co., Ltd., a 10 μΐ da solução de fragmento de ADN e adicionou-se água esterilizada de modo a que a mistura ficasse com um volume de 20 μΐ, seguida de mistura. Deixou-se a solução reaccional reagir a 36 °C durante 2 horas. Depois da reacção das enzimas de restrição, isolou-se o fragmento de ADN e o vector de expressão com GENECLEAN e ligaram-se um ao outro. Especificamente, adicionou-se 300 μΐ da solução de Nal incluída no estojo e misturou-se em 20 μΐ da solução reaccional das enzimas de restrição e misturou-se e adicionou-se depois 10 μΐ da solução de pérolas de vidro e misturou-se. Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C durante 15 88 minutos e depois centrifugou-se para precipitar as pérolas de vidro nas quais o fragmento de ADN e o vector de expressão estavam adsorvidos e eliminou-se o sobrenadante. Depois, adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem, incluida no estojo, à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a suspensão para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem utilizando a nova solução de lavagem foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro e pressão reduzida e, após a secagem, adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão. Aqueceu-se a mistura para 55 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para se obter 12 μΐ do sobrenadante contendo o fragmento de ADN e o vector de expressão. O processo eliminou pequenos fragmentos de ADN que tinham uma dimensão de cerca de 50 pb ou menos e que tinham sido gerados pelas enzimas de restrição, para se obter assim o fragmento de ADN com interesse e o vector de expressão.
Adicionou-se 10 μΐ de uma solução de ligação de Takara do estojo-I (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 10 μΐ da solução assim preparada e deixou-se a mistura reagir a 16 °C durante 1 hora. Utilizou-se a solução para transformar as células concorrentes (Takara Shuzo Co., Ltd.: DH5a). Especificamente, adicionou-se-lhe 5 μΐ de uma solução reaccional de ligação a 60 μΐ de uma solução de células concorrentes não congeladas a 89 4 °C e misturou-se deixou-se a 0 °C durante 30 minutos e a 42 °C durante 45 segundos e a 0 °C durante 2 minutos. Adicionou-se-lhe 500 μΐ de uma solução de SOC (2 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, NaCl 10 mM, glicose 20 mM, MgSCb 10 mM, e MgCl2 10 mM) seguida da recuperação da cultura a 36 °C durante 1 hora. Aplicou-se 100 μΐ da solução de cultura ao meio de agar LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % NaCl, a pH 7,0, 1,5 % de agar) contendo 50 yg/ml de ampicilina, 40 yg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyil-p-D-galactósido) e IPTG (tiogalacto-piranósido) 1 mM. Realizou-se depois a cultura a 37 °C durante 16 horas. A cultura originou Escherichia coli transformada por introdução dos plasmidos descritos antes, sob a forma de colónias brancas e seleccionaram-se as colónias. As colónias assim separadas da Escherichia coli transformada foram postas em cultura num meio liquido LB contendo ampicilina (50 pg/ml). A partir das células de cultura da Escherichia coli transformada, separou-se o ADN de plasmido e purificou-se utilizando um estojo de purificação de plasmido (Estojo midi do filtro de plasmido QIA, QIAGEN). O ADN do plasmido assim obtido confirmou ter um fragmento de AND com uma dimensão de cerca de 1,0 pb, que corresponde ao gene de interesse BG10669.
Em seguida, para confirmar a actividade de cilo-inositol 2-desidrogenase, transferiram-se as células isoladas para 30 garrafas de 100 ml de meio LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7,0) contendo 50 yg/ml de ampicilina e fez-se uma cultura a 36 °C durante 7 horas. Adicionou-se 0,3 ml de uma solução de tiogalacto- 90 piranósido 200 mM a cada uma das soluções da cultura e depois colocaram-se as células em cultura a 36 °C durante 3 horas. Depois de a cultura estar completa, recolheram-se as células por centrifugação e lavaram-se uma vez com uma solução salina fisiológica. Depois, fez-se uma suspensão de células lavadas em 3 ml de uma solução de Triton X-100 a 0,6% e dividiram-se as células por ondas ultra-sónicas a 4 °C. Centrifugou-se a solução e retirou-se 84 ml do sobrenadante (solução da enzima). Adicionou-se 36 g de sulfato de amónio ao sobrenadante para salinizar as proteínas a 4 °C. Recolheram-se as proteínas resultantes por centrifugação e eliminou-se o sobrenadante. Dissolveram-se os precipitados em 75 ml de tampão de Tris 20 mM (pH 7,0), e centrifugou-se novamente a solução. Aplicou-se o sobrenadante numa coluna Sephadex G-25 (Pharmacia K.K.) (400ml) equilibrada com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e realizou-se a eluição com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0). Realizou-se a eluição com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e dessalinizou-se o produto da eluição. Os processos originaram 105 ml de uma solução de enzima impura do produto do gene BG10669.
Mediu-se a actividade de redução da mio-inositol 2-desidrogenase como se descreve a seguir. Mistura-se 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADH, 1% de cilo-inosose) com 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos. Imediatamente depois da reacção, adicionou-se 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de um tubo de ensaio preparado utilizando água em vez da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340 nm. A solução da enzima foi diluída conforme necessário e confirmou-se que a enzima tinha uma actividade para reduzir cilo-inosose. Por outro lado, para medir a actividade de oxidação, misturou-se 50 μΐ de uma solução de reacção (1 % de 91 mio-inositol ou cilo-inositol, tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 0,002 % de NAD+, 0,002 % de diaforase e 0,01 % de azul de nitrotetrazólio) com 50 μΐ de uma solução de enzima e mediu-se o aumento da absorvência a 545 a 25 °C de três em três minutos utilizando um leitor de microplacas. Calculou-se a taxa de reacção a partir dos aumentos da absorvência nos tempos respectivos. Como resultado, confirmou-se que a enzima preparada tem actividade para oxidar mio-inositol mas não tem actividade para oxidar cilo-inositol. A solução da enzima mio-inositol 2-desidrogenase assim preparada e a solução da enzima impura cilo-inositol desidrogenase preparada no exemplo 11 (105 ml da solução da enzima preparada a partir de 3 de uma solução de cultura (escala de 30 vezes)) foram utilizadas para realizar a reacção para converter mio-inositol em cilo-inositol. Para preparar uma solução da reacção, misturou-se 200 g de mio-inositol, 70 ml de 5 % de cilo-inosose, 130 mg de C0CI2 e 250 mg de MgSCh 7H2O e ajustou-se o volume para 750 ml por meio de aquecimento até 50 °C para dissolver mio-inositol. A solução foi arrefecida para 36 °C e ajustou-se para pH 8,0 com uma solução aquosa de NaOH IN e ajustou-se o volume para 790 ml por meio da adição de água. Adicionou-se 105 ml de uma solução da enzima impura de mio-inositol 2-desidrogenase, 105 ml de uma solução da enzima impura de cilo-inositol desidrogenase e 70 mg de NADP + a 36 °C e manteve-se a temperatura da solução, com um volume de cerca de 1 L, a 36 °C, seguida da reacção com uma ligeira agitação. A solução reaccional gradualmente torna-se ácida, por isso ajustou-se para o pH 8,0 com NaOH IN. 42 Horas mais tarde, geraram-se os cristais de cilo-inositol na solução de reacção, de modo a obter-se uma solução reaccional branca. Filtrou-se a solução utilizando um filtro de papel para recolher a cilo-inositol cristalina (peso húmido 73 g). Adicionou-se ao sólido 3 L de 92 água e o sólido dissolveu-se a 50 °C. Ajustou-se o volume da mistura para 4,5 L por adição de água e arrefeceu-se a mistura para a temperatura ambiente. Centrifugou-se a solução resultante (8.000 rpm, 20 minutos) para eliminar as matérias insolúveis e fez-se passar o sobrenadante através de uma coluna cheia com 100 ml de uma resina permutadora de catiões de bases fortes, uma coluna cheia com 100 ml de uma resina permutadora de aniões de ácido fortes e uma coluna cheia com 50 ml de carvão activado, por esta ordem, para assim se obter cada um dos produtos eluidos. Depois, faz-se passar 500 ml de água através de cada uma das colunas para as lavar, para assim se obter, de cada uma, uma solução de lavagem. Misturaram-se e concentraram-se os produtos eluidos e a solução de lavagem e concentraram-se.
Como resultado da concentração, os microcristais começaram a cristalizar à medida que o volume da solução se tornou mais pequeno e concentrou-se a solução até o peso do conteúdo ser da ordem de 130 g. Arrefeceram-se as soluções concentradas para 4 °C e deixou-se em repouso durante a noite. Depois, filtraram-se as substâncias pastosas e lavaram-se os cristais de cilo-inositol do papel do filtro com uma pequena quantidade de água, seguida de secagem a 105 °C durante 3 hr. 0 cilo-inositol resultante tinha a forma de cristais brancos (61 g) a análise de RMN e de CLAR revelaram que os cristais não continham outras impurezas e tinham uma pureza de 99 % ou mais. O rendimento de mio-inositol foi de 31 %. Entretanto, a solução de reacção que tinha sido separada por filtração também podia ser utilizada e quando se dissolveu 64 g de mio-inositolm cristalizou mais cilo-inositol cristalina.
Exemplo 16 93 <Formação do complexo de cilo-inositol/ácido bórico e estudo das condições de formação>
Dissolveu-se 100 g de pó cilo-inosose em 500 ml de água quente e arrefeceu-se a solução para a temperatura ambiente. Depois, adicionou-se água de tal maneira que a solução tinha um volume de 900 ml. Ajustou-se o pH da solução para 7,5 com uma solução aquosa 5N de NaOH e adicionou-se mais água de modo a ter-se um volume de 1 L.
Adicionou-se, gradualmente, 5,9 g de NaBH4 à solução, durante 15 minutos , com agitação, para se realizar uma reacção de redução A temperatura da solução reaccional aumentou até 38 °C devido ao calor da reacção. 30 Minutos mais tarde, dissolveu-se 67,5 g de ácido bórico e 72,2 g de NaCl na solução reaccional que tinha sido arrefecida para 32 °C, para preparar assim uma solução em que se formou o complexo. O pH da solução era de 5.9.
Em seguida, distribuiu-se 100 ml da solução, na qual se tinha formado o complexo e com o pH ajustado para 6,0 por meio de uma solução aquosa 8N de NaOH, num recipiente de plástico de 200 ml com uma tampa e distribuiu-se 100 ml da solução, na qual se tinha formado o complexo e com o pH ajustado para 7,0 por meio de uma solução aquosa 8N de NaOH, da mesma maneira que antes. Além disso, distribuiu-se cada uma das soluções de 100 ml, na qual se tinha formado o complexo e tendo sido ajustado o pH de cada uma delas para pH 8,0, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 12,0 ou 12,8.
Nessas soluções com o pH ajustado, começaram a formar-se, gradualmente precipitados. Separaram-se os precipitados por filtração em cada um dos dias seguintes e ajustou-se o filtrado para um pH pré-determinada com uma solução aquosa 8N 94 de NaOH e depois voltaram ao recipiente original. Os precipitados resultantes foram secos e pesados. Se todo o cilo-inositol, gerado pela redução, forma um complexo de cilo-inositol/ácido bórico e se obtêm sob a forma de precipitados, o peso dos precipitados seria de 61,8 g. Por isso, o peso dos precipitados obtidos a partir das respectivas soluções com os pH ajustados foram integradas nos dias seguintes e os valores obtidos dividindo os valores integrados pelo rendimento teórico (61,8 g) foram definidas como as taxas de recuperação dos precipitados do complexo de cilo-inositol/ácido bórico.
Os valores assim obtidos estão ilustrados a seguir.
As partes sombreadas no quadro mostram um grupo de ensaio da taxa de recuperação de mais do que 90 %.
Quadro 7 pH do tratamento Taxa de recuperação do complexo de cilo-inositol/ácido bórico Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 6 9, 4% 17, 9% 25, 5% 32,4% 38, 6% 44,2% 49,2% 7 21,7% 38,4% 51,2% 61,1% 68,7% 74, 6% 79, 1% 8 42,4% 65,7% 78, 6% 85, 6% 89,5% 91, 6% 92,8% 9 66, 9% 86, 3% 91, 9% 93, 6% 94,0% 94,2% 94,2% 9,5 82, 9% 92, 9% 94,1% 94,2% 94,2% 94,2% 94,2% 10 57,5% 79, 9% 88, 6% 92,1% 93, 4% 93, 9% 94,1% 10,5 41,5% 64,7% 77,7% 85, 0% 89, 0% 91,3% 94, 6% 11 36, 8% 59, 2% 72,8% 81,2% 86, 3% 89, 4% 91,3% 12 29, 2% 49, 4% 63,3% 72, 9% 79, 5% 84,1% 87,2% 12,8 25,4% 44,0% 57, 6% 67,5% 74,7% 80,0% 83, 8%
Como se mostrou no quadro 7, o grupo de ensaio do tratamento a pH de 9,5 foi o mais apropriado para a formação 95 da precipitação do complexo de cilo-inositol/ácido bórico. As taxas de recuperação dos grupos de ensaio de pH 9,0, pH 9,5 e pH 10,0 atingiram uma taxa de recuperação de 90 % ou mais no 4o dia e verificou-se que a taxa de recuperação se torna constante a 94 % mesmo se se alargar o período de ensaio. A análise por RMN para o filtrado do grupo de ensaio de pH 9,5 no 7o dia revelou que 5, 9 % (p/v) de mio-inositol e cerca de 0,2% (p/v) de cilo-inositol permaneceram em solução. Isto é, verificou-se que o complexo pode ser retirado sob a forma de um precipitado pelo processo da presente invenção no caso em que a concentração do complexo de cilo-inositol/ácido bórico é de 0,2 % (p/v) ou mais.
Exemplo 17 <Processo de formação da mistura de redução do complexo de cilo-inositol/ácido bórico e dissolução do complexo e depois libertação e dessalinização do cilo-inositol utilizando uma resina permutadora de iões>
Dissolveu-se 10 g (56 mmole) de pó cilo-inosose em 50 ml de água quente e arrefeceu-se a solução para a temperatura ambiente. Depois, adicionou-se água de modo a ter um volume de 90 ml. Ajustou-se o pH da solução para 7,5 com uma solução aquosa 5N de NaOH e adicionou-se mais água de modo a ter-se um volume de 100 mL.
Adicionou-se, gradualmente, 0,59 g de NaBH4 à solução, durante 15 minutos, com agitação, para se realizar uma reacção de redução. A temperatura da solução reaccional aumentou até 36°C devido ao calor da reacção. 30 minutos mais 96 tarde, dissolveu-se 6,75 g de ácido bórico e 7,22 g de NaCl na solução reaccional arrefecida para 31 °C, para preparar assim uma solução em que se formou o complexo. Em seguida, ajustou-se o pH da solução em que se formou o complexo para pH 9,5 com uma solução aquosa 5N de NaOH e manteve-se a solução a pH 9,5 com uma solução aquosa 5N de NaOH com um equipamento padrão e agitação. 3 Dias mais tarde, filtraram-se os precipitados contidos na solução em que se formou o complexo e lavou-se com uma pequena quantidade de água, seguida de secagem, para assim se obter 5,71 g (20,5 mmole) de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico.
Adicionou-se 230 ml de ácido clorídrico 1,05N a 5,71 g do complexo de cilo-inositol/ácido bórico resultante para dissolver o complexo de cilo-inositol/ácido bórico e assim obteve-se uma solução dissolvida. A solução dissolvida era uma solução ácida 0,2N. Em seguida, fez-se passar a solução dissolvida resultante através de uma coluna cheia com 200 ml de uma resina permutadora de iões de um ácido forte (Duolite C20, do tipo H+, Sumitomo Chemical Co., Ltd.) a uma velocidade de fluxo de 2 ml/min e fez-se passar então o fluido eluído resultante através de uma coluna cheia com 400 ml de uma resina permutadora de iões de uma base forte (Duolite A116, do tipo OH", Sumitomo Chemical Co., Ltd.). Concentrou-se o produto eluído resultante, para se obter assim 3,52 g (19.5 mmole) de pó branco. A análise por RMN revelou que o pó branco era cilo-inositol. Entretanto, o rendimento de cilo-inositol a partir de cilo-inosose foi de 35 %. 97
Exemplo 18 <Processo de formação de vim complexo de cilo-inositol/ácido bórico a partir de uma mistura de redução de cilo-inosose e dissolução do complexo e depois libertação e cristalização do cilo-inositol por meio da precipitação do dissolvente orgânico>
Como matéria-prima, utilizou-se 5,71 g (20,5 mmole) de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico que tinha sido preparado a partir de lOg (56 mmole) de pó de cilo-inosose da mesma maneira que no exemplo 17.
Adicionou-se 5,71 g de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico a um frasco cónico de 100 ml com uma tampa com um agitador e adicionou-se 22,8 ml de ácido clorídrico para preparar uma suspensão. Depois de se completar a agitação durante 1 hora, adicionou-se-lhe 23 ml de metanol e agitou-se ainda mais a mistura. 5 Horas mais tarde, filtrou-se a suspensão e lavaram-se os sólidos com uma pequena quantidade de metanol e secou-se para se obter assim 3,58 g (20,0 mmole) de cilo-inositol impuro.
Depois, dissolveu-se 3,58 g do cilo-inositol impuro resultante em 230 ml de água e adicionou-se 20 ml de uma resina permutadora de iões de ácidos fortes (Duolite C20/do tipo H+) e 4 0 ml de uma resina permutadora de iões de bases fortes (Duolite A116/do tipo 0H+) seguido de agitação. Depois de se completar a agitação durante 30 minutos, as resinas permutadora de iões foram separadas por filtração e concentrou-se o filtrado resultante para se obter assim 3,41 g (18,9 mmole) de pó branco. A análise por RMN revelou que o pó branco era cilo-inositol. Entretanto, o rendimento de cilo-inositol a partir de cilo-inosose foi de 34 %. 98
Exemplo 19 <Processo de redução de cilo-inosose e em seguida libertação directa e cristalização de cilo-inositol>
Dissolveu-se 5 g (28 mmole) de pó de cilo-inosose em 40 ml de água quente e arrefeceu-se a solução para a temperatura ambiente. Ajustou-se o pH da solução para 7,5 com uma solução aquosa 5N de NaOH e adicionou-se mais água de modo a ter-se um volume de 45 mL.
Adicionou-se, gradualmente, 0,29 g de NaBH4 à solução, durante 15 minutos, com agitação, para se realizar uma reacção de redução. A temperatura da solução reaccional aumentou até 37 °C devido ao calor da reacção. 30 Minutos mais tarde, ajustou-se o pH da solução reaccional que tinha sido arrefecida para 30 °C para um pH de 1,0 com ácido clorídrico 5N. Depois, adicionou-se água para se obter um volume de 50 ml, para se preparar assim uma solução ácida 0,1 N. Em seguida, adicionou-se 25 ml de metanol à solução com agitação. 10 Minutos mais tarde, a solução tornou-se gradualmente opaca e agitou-se a suspensão durante 24 horas. 24 Horas mais tarde, filtrou-se a suspensão e lavou-se com uma pequena quantidade de metanol e depois secou-se para se obter assim 1,55 g (8,6 mmole) de cilo-inositol impuro.
Depois, dissolveu-se 1,55 g do cilo-inositol impuro resultante em 120 ml de água e adicionou-se 10 ml de uma resina permutadora de iões de ácidos fortes (Duolite C20/do tipo H+) e 40 ml de uma resina permutadora de iões de bases 99 fortes (Duolite A116/do tipo 0H+) seguido de agitação. Depois de se completar a agitação durante 30 minutos, as resinas permutadora de iões foram separadas por filtração e concentrou-se o filtrado resultante para se obter assim 1,51 g (8,3 mmole) de pó branco. A análise por RMN revelou que o pó branco era cilo-inositol. Entretanto, o rendimento de cilo-inositol a partir de cilo-inosose foi de 30 %.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
De acordo com a presente invenção, o cilo-inositol que está disponível como um fármaco pode ser directamente produzido a partir do mio-inositol barato apenas por meio da conversão de microrganismos ou por meio de uma reacção enzimática e pode-se produzir eficientemente cilo-inositol. Entretanto, o processo de produção da presente invenção tem uma vantagem de dificilmente gerar isómeros.
Quando se utiliza mio-inositol 2 desidrogenase, independente de NAD+ da presente invenção, a cilo-inosose pode ser produzida sem adicionar NAD+ a uma solução reaccional. Além disso, pode-se obter facilmente e eficientemente um cilo-inositol de elevada pureza, por meio da redução da cilo-inosose resultante.
De acordo com a presente invenção, pode-se formar com eficiência um complexo de cilo-inositol/ácido bórico a partir de uma mistura que contém cilo-inositol e açúcares neutros para além do cilo-inositol e pode-se obter, com eficiência, cilo-inosito de elevada pureza a partir do complexo de cilo-inositol/ácido bórico por meio de uma operação fácil. Tampão de tris (pH 7,0). Depois o produto eluido foi fraccionado em fracções e purificado. Depois, essas três soluções de enzima 100 com actividade de cilo-inositol foram concentradas separadamente utilizando um ultra-filtro e as soluções concentradas foram carregadas numa coluna de filtração com gel (Tosoh Corporation: 2000 SWXL), respectivamente. Depois, purificaram-se os produtos eluidos com tampão de fosfato 20 mM (pH 7,0) complementado com NaCl 200 mM. As soluções assim purificadas foram submetidas a electroforese com SDS e gel e corou-se o gel depois da electroforese com uma solução de coloração de azul brilhante de Coomassie (Rapid CBB ΚΑΝΤΟ: fabricado pela Kanto Chemical Co., Inc.) e depois descorou-se. Mediu-se a pureza das bandas com interesse medindo as bandas azuis de proteinas utilizando um densitómetro (fabricado pela ATTO Corporation) e verificou-se que a pureza de cada fracção foi de 85 % ou mais.
Exemplo 10 <Purificação da enzima da presente invenção produzida por K12 ATCC 10798 de Escherichia coli e análise do seu terminal N>
Distribuiu-se 3 L de meio de caldo LB (1 % de Bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7,0) contendo 0,5 % de L-sorbose em aliquotas de 100 ml em 30 peças de frascos de Sakaguchi de 500 ml, seguida da esterilização utilizando uma autoclave. Inoculou-se um aro de platina com uma cultura inclinada de K12 de Escherichia coli K em cada frasco cónico e fez-se a cultura do microrganismo a 36 °C durante 1 dia utilizando um agitador reciproco (135 rpm). Depois da cultura, a solução da cultura foi recolhida e centrifugada (8.000 rpm, 20 minutos), para assim se obterem células (peso liquido 32 g). As células foram novamente suspensas em 100 ml de água e foram divididas por ondas ultra-sónicas a 10 °C ou menos. A solução de lise indicou um pH de 6,8 e ajustou-se a solução para pH 7,0 com uma solução 101 IN de NaOH e depois centrifugou-se (16.000 rpm, 20 minutos) para separar o sobrenadante. Em seguida, adicionou-se MgSCb de modo que o sobrenadante contenha Mg2+ 2 mM e carregou-se a solução numa coluna Blue-Toyopearl (Tosoh Corporation: 20 ml) Depois, fez-se passar, através de uma coluna, 50 ml de tampão Tris 20 mM (pH 7,0) complementado com Mg2+ 2 mM para lavá-la. Em seguida, fez-se passar, através de uma coluna, 50 ml de tampão Tris 20 mM (pH 7,0) complementado com KC1 1 mM para eluir as proteínas adsorvidas. Em seguida, concentrou-se o produto eluido utilizando um ultra-filtro (corte a PM 30.000) e adicionou-se 50 ml de tampão de Tris 20 mM (a pH 7,0) à solução concentrada, seguida novamente de concentração, para se obter uma solução concentrada dessalinizada. Em seguida, carregou-se a solução concentrada dessalinizada numa coluna de DEAE Toyopearl (Tosoh Corporation: 20 ml) realizou-se a eluição com uma solução com um gradiente de concentração linear de NaCl de 0 mM a 500 mM em tampão de Tris 20 mM (pH 7,0). O produto eluido foi fraccionado em fracções. Mediu-se a actividade da cilo-inositol desidrogenase de cada uma das soluções fraccionadas e verificou-se que a fracção eluida com 300 mM tinha actividade. A medição da actividade foi realizada da mesma maneira que no exemplo 9 e mediu-se a diminuição da absorvência a 340 nm. A solução da enzima foi diluido conforme necessário. A fracção eluida com NaCl 300 mM foi dessalinizada utilizando novamente um ultra-filtro e o produto resultante foi carregado numa coluna DEAE Toyopearl (Tosoh Corporation: 20 ml) Depois, realizou-se a eluição com uma solução com um gradiente de concentração linear de 250 mM a 350 mM de NaCl em tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e realizou-se a purificação repetindo as operações de fraccionamento do produto eluido três vezes para eliminar as proteínas contaminantes. Depois, 102 essa solução de enzima com actividade de cilo-inositol desidrogenase foi concentrada utilizando um ultra-filtro e as soluções concentradas foram carregadas numa coluna de filtração com gel (Tosoh Corporation: 2000 SWXL). Purificou-se o produto eluido com tampão de fosfato 20 mM (pH 7,0) complementado com NaCl 200 mM. A enzima assim purificada foi submetida a electroforese com SDS em gel e depois retirou-se o gel e transferiram-se para uma membrana de PVDF (Immobilon PSQ: fabricada pela Millipore Corporation) com a mesma dimensão do gel utilizando um electro-traçador (fabricado pela Funakoshi Co., Ltd.). Depois, retira-se a membrana de PVDF e cora-se com uma solução corante de azul brilhante de Coomassie (Rapid CBB ΚΑΝΤΟ: fabricado pela Kanto Chemical Co., Inc.) e depois descorou-se. Mediu-se a pureza utilizando um densitómetro da mesma maneira que no exemplo 9 e pureza foi de 40 %. Além disso, cortou-se a porção correspondente à proteina-alvo para eliminar proteínas indesejáveis, obtendo-se assim uma enzima da presente invenção com uma elevada pureza.
Em seguida, a enzima da presente invenção com uma elevada pureza que existe na membrana de PVDF foi analisada utilizando um analisador dos aminoácidos do terminal N (Hewlett-Packard Company). Como resultado, detectou-se uma sequência de serina-ácido aspártico-asparagina-isoleucina-arginina. O ADN que codifica uma proteína que tem essa sequência foi pesquisado na base de dados da sequência inteira de Escherichia coli (nome da base de dados "Colibri") e o gene ydgJ (ou o gene bl624) estava emparelhado. O produto do gene, do gene ydgj, tinha sido previsto como uma das oxidoredutases, mas o seu substrato e o produto eram desconhecidos. 103
Exemplo 11 <Isolamento e expressão do ADN da presente invenção derivada de K12 ATCC10798 da Escherichia coli>
Para se obter o gene ydgJ que foi assumido como codificando a enzima da presente invenção, primeiro, extraiu-se o genoma completo de K12 de Escherichia coli a ser utilizado como matriz, como se segue. Inoculou-se um aro de platina com K12 de Escherichia coli, que tinha estado em cultura num meio LB inclinado (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7.0, 1,5 % de agar) , em 100 ml de um meio LB num frasco (1 % de bacto- triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7.0) e fez-se uma cultura aeróbica durante 8 horas a 36 °C, seguida de uma recolha de células. Adicionou-se aos péletes de células 15 ml de uma solução salina-EDTA (NaCl 0,15 M, EDTA 0,1 M, a pH 8,0) e 50 mg de lisozima e fez-se uma suspensão de células, seguida da reacção a 37 °C durante 2 horas. Depois do tratamento, adicionou-se à solução 0,5 ml de SDS a 25 % para fazer a lise completa das células e adicionou-se 3 ml de fenol às proteínas desnaturadas, seguida de centrifugação. Retirou-se o sobrenadante e adicionou-se 20 ml de 2-propanol à solução para se obter o ADN genómico impuro. O ADN genómico impuro obtido precipitou por centrifugação e eliminou-se o sobrenadante, seguido de secagem a pressão reduzida. O ADN genómico impuro anidro foi depois dissolvido em 3 ml de uma solução de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, a pH 8,0) e depois adicionou-se 0,01 mg de ARNase, seguido da reacção a 36 °C durante 2 horas para degradar o ARN. Depois, adicionou-se 0,01 mg de proteínase K e deixou-se a mistura reagir a 36 °C durante 2 horas para degradar as proteínas. Em seguida, adicionou-se 1 ml de uma solução mista de fenol-clorofórmio (1:1) e agitou-se 104 lentamente a mistura para desnaturar a RNAase e a proteinase K. Separou-se a mistura em duas fases por centrifugação e retirou-se a camada superior (uma fase aquosa) e ajustou-se para o pH para 5,2 por meio da adição de 0,3 ml de uma solução 3 M de acetato de sódio. Adicionou-se à solução 3 ml de 2-propanol para se obter ADN genómico. O ADN genómico obtido precipitou por centrifugação e eliminou-se o sobrenadante, seguido de secagem a pressão reduzida. O ADN genómico anidro foi dissolvido em 3 ml de uma solução de TE e repetiu-se novamente o processo da operação de adição de 1 ml de uma solução mista de fenol-clorofórmio (1:1) com a operação de dissolução do ADN em 3 ml da solução de TE, seguido de centrifugação. Da mesma maneira que anteriormente, adicionou-se um volume igual de 2-propanol ao sobrenadante a pH 5.2, para assim preparar uma solução de ADN genómico d K12 de Escherichia coli. O ADN genómico assim obtido foi utilizado como uma solução matriz do ADN para a RCP.
Clonou-se um fragmento que derivou de K12 de Escherichia coli e que contém um sitio de ligação do ribossoma (SLR) do gene ydgJ e realizou-se a RCP utilizando iniciadores com as sequências que se seguem para expressar o gene sob a forma de uma enzima recombinante.
SEQ ID No. 15: ydgj-F 5'-cattcaagcttaatgagaggcaatgacatgagcg-3' SEQ ID No. 16: ydgj-R 5'-tcggaattcttcatgcaaggcacaaagtcgc-3'
Para a RCP, utilizou-se a solução da reacção de Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. E preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 χ tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN matriz, 1 μΐ de uma solução de iniciador 10 μΜ e 0.5 μΐ de Takara ExTaq por meio da adição de água de tal modo que tenha um volume de 5 0 μΐ, seguido da camada de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, 105
um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (55 °C, 1 minuto) e elongação (72 °C, 1 minuto) , que se repetiram 35 vezes utilizando um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700). A RCP descrita antes amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,0 kpb. Depois da reacção, o óleo mineral em camadas foi extraído com 0,3 ml de hexano e eliminou-se a camada de hexano. Repetiu-se este processo três vezes, seguido de redução da pressão durante um minuto, para assim eliminar o óleo mineral. A partir de 50 μΐ da solução de reacção assim obtida, purificou-se o fragmento da RCP utilizando GENECLEAN (Bio 101). Especificamente, adicionou-se 300 μΐ de uma solução de Nal incluída no estojo e misturou-se e adicionou-se 10 μΐ de uma solução de pedras de vidro e misturou-se. Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para precipitar as pérolas de vidro nas quais o fragmento de ADN estava adsorvido e eliminou-se o sobrenadante. Depois adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem incluída no estojo à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a mistura para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem utilizando a nova solução de lavagem foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro e pressão reduzida e, após a secagem, adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão. Aqueceu-se a mistura para 55 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para se obter 12 μΐ de um sobrenadante contendo o fragmento de ADN.
Realizou-se uma operação de inserção do fragmento de ADN purificado num vector de expressão, como se segue. Especificamente, adicionou-se 0,5 yg de um plasmido de 106 expressão (pUC119: Fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.)), 1 μΐ de enzimas de restrição HindIII e EcoRI daTakara Shuzo Co., Ltd. e 2 μΐ de 10 x tampão K, que é um tampão de enzima de restrição da Takara Shuzo Co., Ltd., a 10 μΐ da solução de fragmento de AND e adicionou-se água esterilizada de modo a que a mistura ficasse com um volume de 20 μΐ, seguida de mistura. Deixou-se a solução reaccional reagir a 36 °C durante 2 horas. Depois da reacção das enzimas de restrição, isolou-se o fragmento de ADN e o vector de expressão com GENECLEAN e ligaram-se um ao outro. Especificamente, adicionou-se 300 μΐ da solução de Nal incluída no estojo e misturou-se em 20 μΐ da solução reaccional das enzimas de restrição e adicionou-se-lhe 10 μΐ da solução de pérolas de vidro e misturou-se. Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C durante 15 minutos e depois centrifugou-se para precipitar as pérolas de vidro nas quais o fragmento de ADN e o vector de expressão estavam adsorvidos e eliminou-se o sobrenadante. Depois, adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem, incluída no estojo, à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a suspensão para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem utilizando a nova solução de lavagem foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro e pressão reduzida e, após a secagem, adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão. Aqueceu-se a mistura para 55 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para se obter 12 μΐ de um sobrenadante contendo o fragmento de ADN e o vector de expressão. O processo eliminou pequenos fragmentos de ADN que tinham uma dimensão de cerca de 50 pb ou menos e que tinham sido gerados pelas enzimas de 107 restrição, para se obter assim o fragmento de ADN com interesse e o vector de expressão.
Adicionou-se 10 μΐ da solução de ligação de Takara do estojo-I (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 10 μΐ da solução assim preparada e deixou-se a mistura reagir a 16°C durante 1 hora.
Utilizou-se a solução para transformar as células concorrentes (Takara Shuzo Co., Ltd.: DH5cx) . Especif icamente, adicionou-se-lhe 5 μΐ de uma solução reaccional de ligação e misturou-se em 60 μΐ de uma solução de células concorrentes não congeladas a 4 °C e deixou-se a 0 °C durante 30 minutos e depois a 42 °C durante 45 segundos e a 0 °C durante 2 minutos. Adicionou-se-lhe 500 μΐ de uma solução de SOC (2 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, NaCl 10 mM, glicose 20 mM, MgS04 10 mM, e MgCl2 10 mM) seguida da recuperação da cultura a 36 °C durante 1 hora. Aplicou-se 100 μΐ da solução de cultura num meio de agar LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % NaCl, a pH 7,0, 1,5 % de agar) contendo 50 pg/ml de ampicilina, 40 pg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyil-p-D-galactósido) e IPTG (tio-galactopiranósido) 1 mM. Realizou-se depois a cultura a 37 °C durante 16 horas. A cultura originou Escherichia coli transformada por introdução do plasmido descrito antes, sob a forma de colónias brancas e seleccionaram-se as colónias. As colónias assim separadas da Escherichia coli transformada foram postas em cultura em meio liquido LB contendo ampicilina (50 pg/ml). A partir das células de cultura da Escherichia coli transformada, separou-se um ADN de plasmido e purificou-se utilizando um estojo de purificação de plasmido (Estojo midi do filtro de plasmido QIA, QIAGEN). O 108 ADN do plasmido assim obtido confirmou ter um fragmento de AND com uma dimensão de cerca de 1,0 kpb, que correspondem ao gene de interesse ydgJ.
Em seguida, para confirmar a actividade de cilo-inositol desidrogenase, transferiram-se as estirpes microbianas isoladas como estirpes para 100 ml de meio LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH
7.0) contendo 50 yg/ml de ampicilina e fez-se uma cultura a 36 °C durante 7 horas. Adicionou-se 0,3 ml de uma solução de tiogalactopiranósido 200 mM à solução da cultura e depois colocaram-se as células em cultura a 36 °C durante 3 horas. Depois de a cultura estar completa, recolheram-se as células por centrifugação e lavaram-se uma vez com uma solução salina fisiológica. Depois, fez-se uma suspensão de células lavadas em 3 ml de uma solução de Triton X-100 a 0,6% e dividiram-se as células por ondas ultra-sónicas a 4 °C. Centrifugou-se a solução e retirou-se 2,8 ml do sobrenadante (solução da enzima). Adicionou-se 1,2 g de sulfato de amónio ao sobrenadante para salinizar as proteínas a 4 °C. Recolheram-se as proteínas salinizadas por centrifugação (15.000 rpm, 20 min) e eliminou-se o sobrenadante. Dissolveram-se os precipitados em 2,5 ml de tampão de Tris 20 mM (pH 7,0), e centrifugou-se novamente a solução (15.000 rpm, 20 min). Aplicou-se o sobrenadante a uma coluna Sephadex G-25 (Pharmacia K.K.: 14 ml) equilibrada com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0). Realizou-se a eluição com tampão de Tris 20 mM (pH 7.0) e dessalinizou-se o produto da eluição. O processo originou 3,5 ml de uma solução de enzima impura do produto do gene ydgJ.
Mediu-se a actividade de cilo-inosito desidrogenase como se segue: misturou-se 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADPH e 1 % de cilo-inosose) 109 e 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos e depois adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água, seguida da medição da absorvência a 340 nm. Mediu-se a diminuição da absorvência, a 340 nm, com base num valor em branco para a solução de ensaio obtida utilizando água em vez da solução de enzima. A solução da enzima foi diluido conforme necessário.
Entretanto, o produto da reacção da enzima foi medido como se segue: Deixou-se reagir 10 mg de cilo-inosose, 40 mg de NADPH e 10U da enzima em 1,0 ml de tampão de Tris 100 mM (pH 8,0) a 36 °C durante 4 horas e realizou-se um tratamento por aquecimento a 80 °C durante 10 min, seguido de arrefecimento. Depois, adicionou-se 100 μΐ de uma resina permutadora de catiões de uma base forte, 100 μΐ de uma resina permutadora de aniões de um ácido forte e 10 mg de carvão activado e agitou-se a mistura e centrifugou-se. Depois, diluiu-se, 2 vezes, o sobrenadante e fizeram-se as medições por CLAR (Shodex Asahipak NH2P-50 4E Φ 4,6 χ 250 mm: Shodex) utilizando um detector RI nas condições de uma temperatura de coluna de 40 °C e uma velocidade de fluxo da fase móvel de 1,5 ml (acetonitrilo a 80 %) . Como resultado, verificou-se que o produto do gene ydgJ tinha uma elevada actividade de cilo-inositol desidrogenase e 100 % do produto era cilo-inositol obtido por redução, enquanto o mio-inositol, que é um dos seus isómeros, não foi detectado. Como resultado, verificou-se que a solução de uma enzima recombinante derivada do gene ydgJ tinha uma elevada actividade de cilo-inositol desidrogenase e o produto do gene foi cilo-inositol desidrogenase. Entretanto, no produto obtido pela reacção de redução da cilo-inosose, detectou-se apenas cilo-inositol e verificou-se que a enzima reduzia especificamente, sob o ponto de vista estereoquímico, a cilo-inosose em cilo-inositol. Entretanto, a sequência do gene 110 ydgJ está ilustrado na SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 2.
Exemplo 12 <Isolamento e expressão de um homólogo de ADN estimada a partir da homologia com o gene ydgJ de Escherichia coli e as suas propriedades> A partir da estimativa da estrutura tri-dimensional do produto do gene ydgJ de Escherichia coli com base na sequência de aminoácidos, estimou-se que o produto pertencia à família das oxidoredutases de glicose-frutose. A família também inclui mio-inositol 2-desidrogenase (EC 1.1.1.18) e verificou-se que a sequência envolvida numa ligação de NAD na sequência de aminoácidos tinha uma elevada homologia. Além disso, a identificação da sequência de aminoácidos de um sítio envolvido na ligação do substrato por análise de estrutura com raios X da oxidoredutase de glicose-frutose e a pesquisa de proteínas que tinham parcialmente a mesma sequência de aminoácidos e são homólogas com o produto do gene ydgJ revelaram que há proteínas homólogas em muitas bactérias gram-negativas e bactérias gram-positivas. A partir dessas bactérias, pesquisaram-se ADNs homólogos com base na homologia do gene ydgJ de Escherichia coli. Como resultado, verificou-se que o gene ydgJ de Escherichia coli tem homologia com o gene Atu4375 e o gene Atu3234 no genoma de C58 ATCC33970 de Agrobacterium tumefacience, o gene BG14057 no genoma de 168 ATCC23857 de Bacillus subtili, o gene
Xcc3438 no genoma de ATCC33913 de Xanthomonas campestris pv. campestri , e o gene Atu4375 e o gene Atu3234 no genoma de AB 10121 FERM P-17383 de Agrobacterium sp. que é conhecida como um microrganismo com capacidade para converter directamente 111 mio-inositol em cilo-inositol. Por isso, esses ADNs foram isolados e expressos.
Para se obter os ADNs candidatos descritos antes, os genomas totais de C58 ATCC33970 de Agrobacterium tumefaciens, 168 ATCC23857 de Bacillus subtilis, ATCC33913 de Xanthomonas campestris pv. campestris, e AB10121 FERM P-17383 de
Agrobacterium sp. A serem utilizados como matrizes foram extraidos como se segue. Para C58 de Agrobacterium tumefacience, Xanthomonas campestris pv. campestris e AB10121 de Agrobacterium sp. fez-se uma cultura em aro de platina, de C58 de Agrobacterium tumefacience, Xanthomonas campestris pv. campestris e ABI0121 de Agrobacterium sp. que tinham estado em cultura num meio LB inclinado (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7.0, 1,5 % de agar) e inoculou-se em 100 ml de um meio LB num frasco (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de
NaCl, a pH 7.0) e fez-se uma cultura aeróbia durante 18 horas a 27°C, seguida de uma recolhas. Adicionou-se, aos péletes de células, 15 ml de uma solução salina de EDTA (NaCl 0,15 M, EDTA 0,1 M, a pH 8,0) e 50 mg de lisozima e fez-se uma suspensão de células, seguida da reacção a 37 °C durante 2 horas. Depois do tratamento, adicionou-se à solução 0,5 ml de SDS a 25 % para fazer a lise completa das células e adicionou-se 3 ml de fenol às proteinas desnaturadas. Depois, centrifugou-se a solução e retirou-se o sobrenadante. 112
Adicionou-se 20 ml de 2-propanol à solução para se obter o AND genómico impuro. O ADN genómico impuro obtido precipitou por centrifugação e eliminou-se o sobrenadante, seguido de secagem a pressão reduzida. Depois, o ADN genómico impuro anidro foi depois dissolvido em 3 ml de uma solução de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, a pH 8,0) e depois adicionou-se 0,01 mg de ARNase e deixou-se reagir a 36 °C durante 2 horas para degradar o ARN. Depois, adicionou-se 0,01 mg de proteinase K e deixou-se reagir a 36 °C durante 2 horas para degradar as proteínas. Em seguida, adicionou-se 1 ml de uma solução mista de fenol-clorofórmio (1:1) e agitou-se lentamente a mistura para desnaturar a RNAase e a proteinase K. Separou-se a mistura em duas fases por centrifugação e retirou-se a camada superior (uma fase aquosa) e ajustou-se para o pH para 5,2 por meio da adição de 0,3 ml de uma solução 3 M de acetato de sódio. Adicionou-se 3 ml de 2-propanol à solução para se obter o ADN genómico. O ADN genómico obtido precipitou por centrifugação e eliminou-se o sobrenadante, seguido de secagem a pressão reduzida. O ADN genómico anidro foi dissolvido em 3 ml de uma solução de TE e repetiu-se novamente o processo da operação de adição de 1 ml de uma solução mista de fenol-clorofórmio (1:1) com a operação de dissolução do ADN em 3 ml da solução de TE, seguido de centrifugação. Depois, da mesma maneira que antes, adicionou-se um volume igual de 2-propanol ao sobrenadante a pH 5,2, para assim preparar soluções dos ADNs genómicos de C58 de Agrobacterium tumefacience, Xanthomonas campestris pv. campestris e AB 10121 de Agrobacterium sp., respectivamente. Os ADNs genómicos assim obtidos foram utilizados como uma solução matriz do ADN para a RCP. 168 ATCC23857 de Bacillus subtilis num aro de platina que tinham estado em cultura num meio LB inclinado (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a 113
ρΗ 7.0, 1,5 % de agar) e inoculou-se em 100 ml de um meio LB num frasco (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7,0) e fez-se uma cultura aeróbia durante 18 horas a 36 °C. Depois, adicionou-se 1 ml do meio a 100 ml de um meio LB de um frasco preparado como anteriormente e fez-se uma cultura dos microrganismos durante 4 horas, seguida de uma recolha. Depois da recolha, extraiu-se o genoma total da mesma maneira que no processo utilizado para a Agrobacterium.
Em seguida, realizou-se uma RCP utilizando iniciadores com as sequências de clonagem que se seguem do gene Atu4375 e do gene Atu3234 no genoma de C58 de Agrobacterium tumefacience, o gene Atu4375 e o gene Atu3234 no genoma de AB10121 de Agrobacterium sp. e o gene Xcc3438 no genoma de Xanthomonas campestris pv. campestris (incluindo todos SLR), para as expressar como enzimas recombinantes. SEQ ID No. 17: Atu4375-F 5'-ggcggatccmgaaagggatagtcatgtcct-3' SEQ ID No. 18: Atu4375-F 5'-attggaagcttcgaggctgcoacctag-3' SEQ ID No. 19: Atu3234-F 5'-ttgggatcctttcaggggaaatattatggc-3' SEQ ID No. 20: Atu3234-R 5'-gccgcaagcttgttttacagcttcac-3' SEQ ID No. 23: Xcc3438-F 5'-tcggaattcgcgttgcggtgaatcgttttcaatg-3' SEQ ID No. 24: Xcc3438-R 5'-ataagaagcttgctcagtcgctgctgttgccttc-3'
Realizou-se a RCP utilizando iniciadores com as sequências para clonagem que se seguem do gene BG14057 no genoma 168 de Bacillus subtilis (incluindo SLR) para o expressar como uma enzima recombinante. O "a" na posição 10 do terminal 5' é originalmente "t" mas é alterado para "a" para a expressão em Escherichia coli. SEQ ID No. 21: BG14057-F 5'-aggaattcgatgataacgcttttaaaggggagaa-3' SEQ ID No. 22: BG14057-R 5'-tttctgcagtttagtgctccagcataatggttcg-3' 114
Para a RCP, utilizou-se a solução da reacção de Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. E preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 * tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN matriz, 1 μΐ de uma solução de iniciador 10 μΜ e 0.5 μΐ de Takara ExTaq por meio da adição de água de tal modo que tenha um volume de 5 0 μΐ, seguido da camada de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (52 °C, 55 °C ou 58 °C (ver quadro 3), 1 minuto) e elongação (72 °C, 1 minuto), que se repetiram 35 vezes utilizando um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700). A RCP descrita antes amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,1 kpb.
Quadro 3: Lista da temperatura de hibridação
Temperatura de hibridação 55 °C 55 °C 52 °C 52 °C 55 °C 58 °C
Genes-alvo
Para o gene Atu4375 de C58 de Agrobacterium tumefaclence ATCC33970
Para o gene Atu4375 de AB10121 FERM P- 17383 de Agrobacierium
Para o gene Atu3234 de C58 ATCC33970 de Agrobacterium tumefaclence
Para o gene Atu3234 de AB 10121 FERM P-17383 de Agrobacterium
Para o gene BG 14057 de 168 ATCC23857 de Bacillus subtílís
Para o gene Xcc3438 de ATCC33913 de Xanthomonas campestris pv.
Campestris
Depois da reacção, o óleo mineral em camadas foi extraído com 0,3 ml de hexano e eliminou-se a camada de hexano. Repetiu-se este processo três vezes, seguido de redução da pressão durante um minuto, para assim eliminar o óleo mineral. A partir de 50 μΐ da solução de reacção assim obtida, purificaram-se os fragmentos da RCP utilizando GENECLEAN (Bio 101). Especificamente, adicionou-se 300 μΐ de uma solução de Nal incluída no estojo e misturou-se e adicionou-se 10 μΐ de uma solução de pérolas de vidro e misturou-se. Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para precipitar as pérolas de vidro nas quais os fragmentos de ADN estavam adsorvida e eliminou- 115 se o sobrenadante. Depois adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem incluída no estojo à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a mistura para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem utilizando a nova solução de lavagem foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro e pressão reduzida e, após a secagem, adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão. Aqueceu-se a mistura para 55 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para se obter 12 μΐ de um sobrenadante contendo os fragmentos de ADN.
Realizou-se uma operação de inserção do fragmento de ADN purificado em cada uma das combinações, como se segue. Especificamente, adicionou-se 0,5 pg de um plasmido de expressão (pUC118: fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.)), 1 μΐ de dois tipos de enzimas de restrição da Takara Shuzo Co., Ltd. e 2 μΐ de 10 x tampão K, que é uma solução tampão de enzima de restrição da Takara Shuzo Co., Ltd., a 10 μΐ da solução de fragmento de ADN e adicionou-se água esterilizada de modo a que a mistura ficasse com um volume de 20 μΐ, seguida de mistura. Deixou-se a solução reaccional reagir a 36 °C durante 2 horas. Como o gene Atu3234 da estirpe AB10121 contém um sítio HindIII, não se realizou o tratamento com enzimas de restrição e, depois do isolamento, ligou-se a um vector pT7Blue (fabricado pela Novagen). 116
Quadro 4: Lista dos plasmidos de expressão e das enzimas de restrição utilizadas
Genes-alvo Plasmidos de Enzimas de restrição expressão utilizadas
Gene Atu4375 de C58 de A.tume. pUCl18 BamHI, Hind III/tampão K Gene Atu4375 de AB 10121 pUCl18 BamH I, Hind III/tampão K Gene Atu3234 de C58 de A.tume. pUCl18 BamHI, Hind III/tampão K Gene Atu3234 de AB 10121 pT7Blue Não usado Gene BG14057 de 168 de B.sub. pUCl18 EcoR I, Pst I/tampão H Gene Xcc3438 de X. camp. pIJCl 18 EcoR I, Hind III/tampão K
Depois da reacção das enzimas de restrição, isolou-se o fragmento de ADN e o vector de expressão com GENECLEAN e ligaram-se um ao outro. Especificamente, adicionou-se 300 μΐ da solução de Nal incluida no estojo e misturou-se em 20 μΐ da solução reaccional das enzimas de restrição e misturou-se e adicionou-se 10 μΐ da solução de pérolas de vidro e misturou-se. Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C durante 15 minutos e depois centrifugou-se para precipitar as pérolas de vidro nas quais o fragmento de ADN e o vector de expressão estavam adsorvidos e eliminou-se o sobrenadante. Depois, adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem, incluida no estojo, à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a suspensão para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem utilizando a nova solução de lavagem foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro e pressão reduzida e, após a secagem, adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão. Aqueceu-se a mistura para 55 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para se obter 12 μΐ de um sobrenadante contendo o fragmento de ADN e o vector de expressão. O processo eliminou pequenos fragmentos de ADN que tinham uma dimensão de cerca de 50 pb ou menos e que tinham 117 sido gerados pelas enzimas de restrição, para se obter assim o fragmento de ADN com interesse e o vector de expressão.
Adicionou-se 10 μΐ da solução de ligação de Takara do estojo-I (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 10 μΐ da solução assim preparada e deixou-se a mistura reagir a 16 °C durante 1 hora. Utilizou-se a solução para transformar as células concorrentes (Takara Shuzo Co., Ltd.: DH5a). Especificamente, adicionou-se-lhe 5 μΐ de uma solução reaccional de ligação a 60 μΐ de uma solução de células concorrentes não congeladas a 4 °C e misturou-se deixou-se a 0 °C durante 30 minutos e depois a 42 °C durante 45 segundos e a 0 °C durante 2 minutos. Adicionou-se-lhe 500 μΐ de uma solução de SOC (2 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, NaCl 10 mM, glicose 20 mM, MgS04 10 mM, e MgCl2 10 mM) seguida da recuperação da cultura a 36 °C durante 1 hora. Aplicou-se 100 μΐ da solução de cultura a um meio de agar LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % NaCl, a pH 7,0, 1,5 % de agar) contendo 50 pg/ml de ampicilina, 40 pg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyil-p-D-galactósido) e IPTG (tio-galactopiranósido) 1 mM. Realizou-se depois a cultura a 37 °C durante 16 horas. A cultura originou Escherichia coli transformada por introdução do plasmido descrito antes, sob a forma de colónias brancas e seleccionaram-se as colónias. As colónias assim separadas da Escherichia coli transformada foram postas em cultura num meio liquido LB contendo 118 ampicilina (50 yg/ml). A partir das células de cultura da Escherichia coli transformada, separou-se um ADN de plasmido e purificou-se utilizando um estojo de purificação de plasmido (Estojo midi do filtro de plasmido QIA, QIAGEN). O ADN do plasmido assim obtido confirmou para cada um ter um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,0 a 1,1 kpb, que corresponde ao ADN de interesse.
Em seguida, para confirmar a actividade de cilo-inositol desidrogenase, transferiram-se as estirpes microbianas isoladas como estirpes para 100 ml de meio LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7,0) contendo 50 yg/ml de ampicilina e fez-se uma cultura a 36 °C durante 7 horas. Adicionou-se 0,3 ml de uma solução de tiogalactopiranósido 200 mM à solução da cultura e depois colocaram-se as células em cultura a 36 °C durante 3 horas. Depois de a cultura estar completa, recolheram-se as células por centrifugação e lavaram-se uma vez com uma solução salina fisiológica. Depois, fez-se uma suspensão de células lavadas em 3 ml de uma solução de Triton X-100 a 0,6% e dividiram-se as células por ondas ultra-sónicas a 4 °C. Centrifugou-se a solução e retirou-se 2,8 ml do sobrenadante (solução da enzima). Adicionou-se 1,2 g de sulfato de amónio ao sobrenadante para salificar as proteínas a 4 °C. Recolheram-se as proteínas salificadas por centrifugação e eliminou-se o sobrenadante. Dissolveram-se os precipitados em 2,5 ml de tampão de Tris 20 mM (pH 7,0), e centrifugou-se novamente a solução. Aplicou-se o sobrenadante numa coluna Sephadex G-25 (14 ml) equilibrada com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) . Realizou-se a eluição com uma solução tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e dessalinizou-se o produto da eluição. O processo originou 3,5 ml de uma solução de enzima impura do produto do gene ydgJ. 119
Mediu-se a actividade de cilo-inosito desidrogenase como se segue: misturou-se 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADPH e 1 % de cilo-inosose) e 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos e depois adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água, seguida da medição da absorvência a 340 nm. Mediu-se a diminuição da absorvência, a 340 nm, com base num valor em branco para a solução de ensaio obtida utilizando água em vez da solução de enzima. A solução da enzima foi diluído conforme necessário.
Entretanto, o produto da reacção da enzima foi medido como se segue: Deixou-se reagir 10 mg de cilo-inosose, 40 mg de NADPH e 10U da enzima em 1,0 ml de tampão de Tris 100 mM (pH 8,0) a 36 °C durante 4 horas e realizou-se um tratamento por aquecimento a 80 °C durante 10 min, seguido de arrefecimento. Depois, adicionou-se 100 μΐ de uma resina permutadora de catiões de uma base forte, 100 μΐ de uma resina permutadora de aniões de um ácido forte e 10 mg de carvão activado e agitou-se a mistura e centrifugou-se. Depois, diluiu-se, 2 vezes, o sobrenadante e fizeram-se as medições por CLAR (Shodex Asahipak NH2P-50 4E Φ 4,6 χ 250 mm: Shodex) utilizando um detector RI nas condições de uma temperatura de coluna de 40 °C e uma velocidade de fluxo da fase móvel de 1,5 ml (acetonitrilo a 80 %) . Como resultado, verificou-se que o produto do gene Atu4375 e o produto do gene Atu3234 de C58 de Agrobacterium tumefacience, o produto do gene BG 14057 de 168 de Bacillus subtilis, o produto do gene Xcc3438 de Xanthomonas campestris pv. campestris e o produto do gene Atu4375 e o produto do gene Atu3234 da estirpe AB 10121 tinha uma elevada actividade de enzima e 100 % do produto era cilo-inositol obtida por redução, enquanto o mio-inositol, que é um seu isómero, não foi detectado. Como resultado verificou-se que as enzimas recombinantes derivadas 120 dos genes mencionados têm uma elevada actividade de cilo-inositol desidrogenase os produtos gene eram cilo-inositol desidrogenase. Entretanto, nos produtos obtidos pela reacção de redução da cilo-inosose, detectou-se apenas cilo-inositol e verificou-se que as enzimas reduziam especificamente, sob o ponto de vista estereoquímico, a cilo-inosose em cilo-inositol . A sequência do gene Atu4375 derivada de C58 de Agrobacterium tumefacience está ilustrada na SEQ ID NO: 3, a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 4, a sequência do gene Atu3234 está ilustrada na SEQ ID NO: 5 e a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 6. Entretanto, a sequência do gene BG14057 derivada de 168 de Bacillus subtilis 168 está ilustrada na SEQ ID NO: 7, a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 8, a sequência do gene Atu4375 derivado de AB 10121 está ilustrada na SEQ ID NO: 9, a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 10, a sequência do gene Atu3234 está ilustrada na SEQ ID NO: 11, a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 12, a sequência do gene Xcc3438 derivado de Xanthomonas campestris pv. campestris está ilustrada na SEQ ID NO: 13 e a sequência de aminoácidos correspondente está ilustrada na SEQ ID NO: 14. Entretanto, a partir dos resultados da análise da sequência de nucleótidos de um plasmido incluindo o gene Atu4375 e o gene Atu3234 de AB10121 (Hokkaido System Science Co., Ltd.), a homologia entre o gene Atu4375 de C58 de Agrobacterium tumefacience e o gene Atu4375 de AB10121 foi de 89 % para a sequência de nucleótidos e 96 % para a sequência de aminoácidos, embora a homologia entre o gene Atu3234 de C58 de Agrobacterium tumefacience e o gene Atu3234 de AB10121 foi 121 de 87 % para a sequência de nucleótidos e 95 % para a sequência de aminoácidos.
Exemplo 13 <Isolamento do ADN que codifica SIDHl que é produzido a partir de AB10281 FERM BP-10119 de Acetobacter sp.>
Das enzimas purificadas, aplicou-se uma solução de enzima contendo SIDHl numa membrana de PVDF (Immobilon PSQ: fabricada pela Millipore Corporation) e absorvida na membrana de PVDF. Depois, retira-se a membrana de PVDF e cora-se com corante de azul brilhante de Coomassie (Rapid CBB ΚΑΝΤΟ: Fabricado pela ΚΑΝΤΟ CHEMICAL CO., INC.), descorou-se e secou-se, seguido da análise com um analisador de aminoácido do terminal N (fabricado pela Hewlett-Packard Development Company). Como resultado, a partir do terminal N, uma sequência
Met-Lis-Arg-Lis-Leu-Arg-Ile-Gli-Leu-Ile-Gli-Ser-Gli-Fen-Met-Gli-Arg-Tre-His-Ala-Fen-Gli-Tir-Ser foi identificada. Depois previu-se uma sequência de AND que codifica uma sequência de aminoácidos e em seguida construiram-se dois tipos de iniciadores. SEQ ID NO: 29: SIDH1-F1 atgaarcgnaarytncgiatyggyytiatygg SEQ ID NO: 30: SIDH1-F2 ggyttyatgggycgnacicaygcittyggyta
Em seguida, com base nas sequências de nucleótidos das várias cilo-inositol desidrogenases obtidas nos exemplos 10 a 12, prepararam-se os dois iniciadores que se seguem incluindo as regiões de elevado consenso dentro das sequências. SEQ ID NO: 31: SIDH1-B1 ggyttrtcrmmgayracrtgrstrcc SEQ ID NO: 32: SIDH1-B2 artgwrirtgrttgggigt 122
Entretanto, como ADN genómico de AB10281 a ser utilizado como matriz, preparou-se uma solução de ADN genómico de AB10281 utilizando os péletes de células (peso húmido cerca de 400 mg) preparados no exemplo 9, da mesma maneira que o processo de preparação de ADN descrito no exemplo 12.
Para a RCP, utilizou-se a solução da reacção de Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. E preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 χ tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN-matriz, 1 μΐ de cada uma das soluções de iniciador a 10 μΜ (SIDH1-F1 e SIDH1-B1) e 0.5 μΐ de Takara ExTaq por meio da adição de água de tal modo que tenha um volume de 50 μΐ, seguido da camada de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, utilizou-se um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700) e fez-se um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (50 °C, 30 segundos) e elongação (72 °C, 1 minuto), repetido 35 vezes. A electroforese revelou que a RCP descrita antes amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 0,3 kpb. Além disso, a banda na posição de 0,3 kpb foi retirada do gel, utilizou-se uma parte de uma solução de gel homogeneizada como matriz (2 μΐ) e preparou-se uma solução de reacção com a mesma composição tal como descrito antes excepto no facto de ser mudado a combinação de iniciadores para SIDH1-F2 e SIDH1-B2. Para a reacção, utilizou-se um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700) e fez-se um ciclo de três etapas: desnaturaçãon (94 °C, 30 segundos), hibridação (46 °C, 30 123 segundos) e elongação (72 °C, 1 minuto), repetido 35 vezes. A electroforese revelou que a RCP amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 0,25 kpb. O fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 0,25 kpb foi retirado do gel e purificou-se o fragmento da RCP utilizando GENECLEAN (fabricado pela BiolOl) . Especificamente, da mesma maneira que o processo de purificação descrito no exemplo 12 excepto no facto de o gel estar dissolvido numa solução de Nal, obteve-se 12 μΐ de uma solução do fragmento de ADN.
Em seguida, ligou-se o fragmento de ADN purificado a um vector pT7Blue. Especificamente, adicionou-se 0,5 yg do vector pT7Blue e 10 μΐ da solução de ligação de Takara do estojo-I (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 10 μΐ da solução de fragmento de ADN e deixou-se a mistura reagir a 16°C durante 1 hora. Utilizou-se a solução para transformar as células concorrentes (DH5a, Takara Shuzo Co., Ltd.) A operação de transformação e isolamento de um plasmido dos transformantes foi realizada da mesma maneira que no exemplo 12.
Submeteu-se o plasmido obtido a uma análise da sequência de nucleótidos (Hokkaido System Science Co., Ltd.) utilizando iniciadores universais (R-20mer e U-19mer) e revelou-se cerca de um terço da semi-região inicial da sequência de nucleótidos de um gene que codifica a enzima.
Depois, para determinar o comprimento completo da sequência de nucleótidos, digeriu-se completamente o ADN 124 genómico de AB 10281 com uma enzima de restrição BamHI e a solução de fragmento de ADN foi purificada utilizando GENECLEAN (fabricado pela BiolOl), seguida da auto-ligação do fragmento. Especificamente, adicionou-se 10 μΐ da solução de ligação de Takara do estojo-I (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 10 μΐ da solução de fragmento de ADN assim preparada e deixou-se a mistura reagir a 16°C durante 1 hora. Depois da reacção, purificou-se o ADN utilizando GENECLEAN (fabricado pela BiolOl) e utilizou-se a solução como uma solução do ADN-matriz para a RCP inversa.
Em seguida, com base no cerca de um terço de metade da região inicial da sequência de nucleótidos revelada, prepararam-se os três iniciadores que se seguem e realizou-se a RCP inversa. SEQ ID NO: 33: SIDH1-INV-F gctcgtcaacgatcctgaaattgat SEQ ID No: 34: SIDH1-INV-B ttcgctgcagcttcatcggaaatat SEQ ID No: 35: SIDH1-INVF3 cccttcaatttccgggcgggt
Para a RCP inversa, utilizou-se a solução da reacção de Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. E preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 χ tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN-matriz, 1 μΐ de cada uma das soluções de iniciador a 10 μΜ (uma combinação de SIDH1-INV-B ou uma combinação de SIDH1-INV-F e SIDH1-INV3) e 0,5 μΐ de Takara ExTaq por meio da adição de água de tal modo que tenha um volume de 50 μΐ, seguido da camada de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, utilizou-se um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700) e fez-se um ciclo de três 125
etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (50 °C, 1 minuto) e elongação (72 °C, 2 minutos), repetido 35 vezes. A electroforese revelou que os fragmentos de ADN amplificados pela RCP descrita antes tinham dimensões de cerca de 2,7 kpb e cerca de 1,8 kpb. Depois, as bandas nas posições de cerca de 2,7 kpb e cerca de 1,8 kpb foram retiradas do gel e os fragmentos de RCP foram purificados utilizando GENECLEAN (fabricado pela BiolOl] l , para se obter assim 10 μΐ de soluções de fragmentos de ADN. Os dois fragmentos de ADN resultantes foram submetidos à análise das sequências de nucleótidos (Hokkaido System Science Co., Ltd.) utilizando os iniciadores utilizados na RCP para determinar toda a sequência de nucleótidos dos genes que codificam a enzima.
Em seguida, realizou-se a RCP utilizando iniciadores com as sequências que se seguem para a clonagem do gene SIDH1 (incluindo um sitio de SLR) derivada da estirpe AB10281 para a sua expressão como enzima recombinante. SEQ ID NO: 36: 281 SIDH1-F gctggatcccgcccttattgtgaata SEQ ID No: 37: 281SIDH1-R tatgaattcgttatgccttctcatgctgtcg
Para a RCP, utilizou-se a solução da reacção de Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. E preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 χ tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN matriz, 1 μΐ de cada solução de iniciador 10 μΜ e 0.5 μΐ de Takara ExTaq por meio da adição de água de tal modo que tenha um volume de 50 μΐ, seguido da camada de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (55 °C, 1 minuto) e elongação (72 °C, 1 minuto) , 126 que se repetiram 35 vezes utilizando um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700). A RCP descrita antes amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,2 kpb.
Purificou-se o fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,2 kpb utilizando GENECLEAN (fabricado pela BiolOl), par assim se obter 12 μΐ de uma solução de fragmento de ADN. Para um processo para inserir o fragmento de ADN num vector de expressão, adicionou-se 0,5 yg de um plasmido de expressão (pUC119), 1 μΐ das enzimas de restrição (BamHI, EcoRI) da Takara Shuzo Co., Ltd., e 2 μΐ de 10 χ tampão K para as enzimas de restrição da Takara Shuzo Co., Ltd. a 10 μΐ de uma solução de um fragmento de ADN e adicionou-se água esterilizada de modo a ter um volume de 20 μΐ, seguindo-se a sua mistura. Deixou-se a solução reaccional reagir a 36 °C durante 2 horas. A recolha do fragmento de ADN da solução de reacção, realizaram-se a purificação, reacção de ligação e transformação das células concorrentes (DH5a, Takara Shuzo Co., Ltd.) da mesma maneira que no exemplo 12. Além disso, a expressão da cilo-inositol desidrogenase e a medição da actividade realizaram-se da mesma maneira que no exemplo 12 e identificou-se o produto do gene como cilo-inositol desidrogenase.
Como resultado, a sequência de nucleótidos de um gene que codifica SIDH1 derivado da estirpe AB10281 está ilustrada na SEQ ID NO: 27, enquanto a sua sequência de aminoácidos está ilustrada na SEQ ID NO: 28.
Exemplo 14 127 <Estudo das propriedades da enzima da presente invenção, de vários tipos de cilo-inositol desidrogenase> 0 processo que se segue foi realizado para estudar as propriedades enzimáticas de SIDH1, SIDH2 e SIDH3 derivadas da estirpe AB10281, que tinham sido obtidas pela purificação enzimática do exemplo 9; o produto do gene ydgJ derivado de Escherichia coli, que tinha sido obtido como uma enzima recombinante no exemplo 11; e os produtos dos genes Atu4375 e Atu3234 de C58 de Agrobacterium tumefacience, o produto do gene BG 14057 de 168 de Bacillus subtilis, o produto do gene Xcc3438 de Xanthomonas campestris pv. campestris e os produtos dos genes Atu4375 e Atu3234 da estirpe AB10121, tendo todos eles sido obtidos como enzimas recombinantes no exemplo 12 e os resultados estão ilustrados no quadro 5. O quadro 6 mostra a homologia na sequência de aminoácidos. A homologia de apenas os aminoácidos comuns a todas as sequências foi baixa (cerca de 5 %) , mas a homologia, incluindo aminoácidos com propriedades similares, foi alta, particularmente nos dominios de ligação de NAD ou de NADP em cerca de 30 % da sequência do terminal N. Além disso, a sequência de lisina-prolina em direcção ao centro da sequência, envolvida na ligação de nicotinamida, que é um sitio de reacção de oxiredução de NAD ou NADP, estava altamente conservada. A asparagina na 27a posição em direcção ao terminal C da sequência de lisina-prolina e a sequência de ácido aspártico-(3 aminoácidos)-histidina próxima do centro da sequência estavam também altamente conservadas, por isso são consideradas como sequências importantes envolvidas na ligação do substrato a partir das estruturas tri-dimensionais estimadas. No quadro, as sequências comuns estão representadas pelo simbolo os aminoácidos com propriedades similares estão representados pelo simbolo 128 ou o símbolo e a asparagina na 27a posição em direcção ao terminal C a partir da sequência de lisina-prolina e a sequência de ácido aspártico-(3 aminoácidos)-histidina, próxima do centro da sequência, estão representadas por sombreado.
Na comparação dos pesos moleculares, o peso molecular da enzima da presente invenção, derivada de AB 10281 foi calculado com base nos resultados da SDS-PAGE utilizando um marcador de peso molecular (padrão de pré-coloração (tipo de gama larga): fabricado pela Bio-Rad Laboratories, Inc.), enquanto os pesos moleculares das outras enzimas da presente invenção foram estimados a partir dos comprimentos completos dos genes. Como resultado, os pesos moleculares das enzimas da presente invenção (SIDH1, SIDH2 e SIDH3) derivadas de AB10281, que tinham sido obtidas pela purificação da enzima, foram de 46 k Dalton, 42 k Dalton, e 40 k Dalton, respectivamente. Entretanto, o peso molecular da enzima da presente invenção derivada do gene ydgJ de K12 de Escherichia coli, que se tinha obtido como uma enzima recombinante no exemplo 11, foi de 38,2 k Dalton; os pesos moleculares das enzimas da presente invenção derivadas do gene Atu4375 e do gene Atu3234 de C58 de Agrobacterium tumefacience, que se tinham obtido como enzimas recombinantes no exemplo 12, foram de 41,3 k Dalton e 42,4 k Dalton, respectivamente; os pesos moleculares das enzimas da presente invenção derivadas do gene BG14057 de 168 de Bacillus subtilis, do gene Xcc3438 de Xanthomonas campestris pv. campestris e do gene Atu4375 e do gene Atu3234 de AB10121 foram de 40,1 k Dalton, 38,5 k Dalton, 41,4 k Dalton e 42,5 k Dalton, respectivamente. Isto é, verificou-se que as enzimas da presente invenção, cilo-inositol desidrogenase, tinham um peso molecular de 38 a 46 k Dalton. 129
As propriedades de associação da enzima da presente invenção foram determinadas por: medição da actividade de fracções obtidas por fraccionamento utilizando uma coluna de filtração em gel (Tosoh Corporation: 2000SWXL); calculando o peso molecular das fracções dos correspondentes pesos moleculares; e dividindo os valores calculados pelos pesos moleculares da enzima. Os valores resultantes foram representados como números inteiros. Como resultado, verificou-se que as enzimas da presente invenção, as cilo-inositol desidrogenases, têm um peso molecular de 80 k a 110 k Dalton e considerou-se que formavam dimeros e trimeros em condições de não desnaturação. A selectividade de coenzima da enzima da presente invenção foi determinada por: misturando 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADPH ou NADH e 1 % de cilo-inosose) com 5 μΐ de uma solução de enzima e deixando reaqir a 36 °C durante 30 minutos. Depois da reacção, adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de uma solução de ensaio preparada utilizando água em vez da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340 nm. A solução da enzima foi diluído conforme necessário. Os resultados indicam que as cilo-inositol desidrogenases das enzimas da presente invenção foram capazes de utilizar como co-enzimas tanto NADPH como NADH, mas têm a actividade relativa da coenzima como se mostra no quadro 5. Foi revelado que muitas enzimas têm uma elevada reactividade com NADPH. O pH óptimo das enzimas da presente invenção foi determinada por: mistura de 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de fosfatos 200 mM (pH 5,0 a 9,0), 2 % de NADPH e 1 % de cilo-inosose) com 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se a mistura reagir a 36 °C durante 30 minutos. Depois da 130 reacção, adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de uma solução de ensaio preparada utilizando água em vez da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340 nm. A solução da enzima foi diluido conforme necessário. Como resultado, verificou-se que as enzimas da presente invenção, as cilo-inositol desidrogenases, têm um pH óptimo como se mostra no quadro 5. Isto é, verificou-se que as enzimas da presente invenção reagem num amplo intervalo de pH 5 a 9. Entretanto, também foi revelado que há enzimas que têm actividade máxima do lado ácido (pH próximo de 6) , enzimas que têm uma actividade máxima numa região neutra (pH a cerca de 6,5 a 7,5) e enzimas que têm uma actividade máxima do lado alcalino (pH a cerca de 7,5 a 9). A termoestabilidade das enzimas da presente invenção foi determinada por: tratamento de uma solução de enzima, a uma temperatura pré-determinada, durante 10 min; arrefecimento da solução; mistura da solução de enzima com 5 μΐ de uma solução de reacção (tampão de fosfato 200 mM (pH 5,0 a 9,0), 2 % de NADPH e 1 % de cilo-inosose) ; e deixando a mistura reagir a 36 °C durante 30 min. Depois, adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de uma solução de ensaio preparada utilizando água em vez da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340 nm. A solução da enzima foi diluido conforme necessário. A actividade de um grupo tratado a 20 °C durante 10 min foi definida como sendo de 100 % e compararam-se as actividades relativas. Como resultado, verificou-se que a termoestabilidade das enzimas da presente invenção, cilo-inositol desidrogenase, varia consoante as enzimas como se mostra no quadro 5 e verificou-se que a estabilidade varia no intervalo de 40 a 60 °C consoante as enzimas. 131
Os efeitos do metal pesado nas enzimas da presente invenção foram determinadas por: mistura de 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADPH e 1 % de cilo-inosose e 2M de metal pesado) com 5 μΐ de uma solução da enzima; e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos. Depois da reacção, adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de uma solução de ensaio preparada utilizando água em vez da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340 nm. A solução da enzima foi diluida conforme necessário. Utilizaram-se como sais metálicos: CaCl2, C0CI2, ZnSC>4, MgSC>4, SnCl2, NÍCI2 e MnS04. A actividade do grupo a que não foi adicionado nada foi definida como 100 % e compararam-se as actividades relativas. Como resultado, como se mostra no quadro 5, as enzimas da presente invenção, as cilo-inositol desidrogenases, foram activadas pelo menos na presença do ião Co 2+ e inibidas na presença do ião Sn2+. A maior parte das enzimas foram inibidas na presença do ião Zn 2+, pelo contrário, a enzima derivada de 168 de Bacillus subtilis foi activada na presença do ião Zn2+.
Os valores de Km das enzimas da presente invenção, para cilo-inosose foram determinadas por: mistura de 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADPH e 0,001 a 2,5 % de cilo-inosose) com 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos. Depois da reacção, adicionou-se imediatamente 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de uma solução de ensaio preparada utilizando água em vez da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340 nm. A solução da enzima foi diluida conforme necessário. Os valores de Km foram calculados por meio de um gráfico reciproco. Como resultado, como se mostra no quadro 5, verificou-se que as enzimas da presente 132 invenção, cilo-inositol desidrogenase, têm valores de Km no intervalo de 2,6 a 12,6 mM. A especificidade do substrato das enzimas da presente invenção foi determinada medindo a actividade relativa de oxidação no que respeita à reactividade ao cilo-inositol. Os isómeros de inositol incluem cilo-inositol (Cl), mio-inositol (MI), D-quiro-inositol (DCI), L-quiro-inositol (LQI), epi-inositol (EI), muco-inositol (Mui), alo-inositol (AI) e neo-inositol (NI) . 0 quadro 5 mostra o grupo de isómeros com os quais as enzimas mostram uma actividade relativa não inferior a 70 %, um grupo de isómeros com os quais as enzimas mostram uma actividade relativa não inferior a 70 % e não inferior a 20 % e um grupo de isómeros com os quais as enzimas mostram uma actividade relativa não inferior a 20 %.
Determinou-se a especificidade do substrato por meio de: a mistura de 50 μΐ de uma solução reaccional (isómeros com 1 % de inositol (ou apenas 0,4 % de neo-inositol), tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 0,002 % de NADP+, 0,002 % de diaforase e 0,01 % de azul de nitrotetrazólio) com 50 μΐ de uma solução de enzima; e fez-se a medição do aumento da absorvência a 545 nm a 25 °C de três em três minutos utilizando um leitor de micro-placas. Calculou-se a taxa de reacção a partir dos aumentos da absorvência nos tempos respectivos. Como resultado, verificou-se que a especificidade do substrato varia ligeiramente consoante os tipos de enzimas e da correlação com as estruturas dos isómeros de inositol, também se verificou que essas enzimas têm pelo menos actividade de cilo-inositol desidrogenase e actividade de mio-inositol desidrogenase.
Quadro 5: Lista das propriedades de cilo-inositol desidrogenase
Estirpes E. coli Acetobacter sp. Bacillus sub. Estirpe K12 (ATCC10 7 98) AB10281 (FERM P-18868) Estirpe 168 133
(ATCC23857) Nome do gene ou da enzima Gene ydgJ SIDH1 SIDH2 SIDH3 Gene BG14057 Peso molecular kDalton 38.2k 4 6k(SDS-PAGE) 42k(SDS-PAGE) 40k(SDS-PAGE) 40, lk Propriedade de associação Dimero Trimero Dimero Dimero Dimero Termoestabi-lidade Estável a 45°C ou menos Estável a 45°C ou menos Estável a 60°C ou menos Estável a 60°C ou menos Estável a 40°C ou menos Actividade relativa da coenzima NADPH:NADH =100:9 NADPH:NADH =100:112 NADPH:NADH =100:1 NADPH:NADH =100:3 NADPH:NADH =100:52 pH óptimo pH 7,5-9,0 pH 5,5-6,5 pH 5,5-6,5 pH 5,5-6,5 pH 7,0-8,5 Efeitos de metais pesados: activação Co Co Co Co, Mn Co, Mn.Zn Efeitos de metais pesados: inibição forte Sn, Zn Sn, Zn Sn, Zn Sn, Zn Sn Produto da reacção de redução Apenas SIS -► SI Apenas CIS -► SI Apenas CIS -► SI Apenas CIS -► SI Apenas CIS -► SI Valores de Km para cilo-inosose 3,9mM 7,6mM 10,6mM 12,6mM 3,5mM Extracto especifico Actividade relativa (70% ou mais) SI,MI,DCI SI SI SI SI,MI Extracto especifico Actividade relativa (20 a 70%) LCI,EI,Mui MI MI MI DCI,EI,AI,NI Extracto especifico Actividade relativa (inferior a 20%) AI,NI DCI,LCI,EI, Mui,AI,NI DCI,LCI,EI, Mui,AI,NI DCI,LCI,EI, Mui,AI,NI LCI, Mui Estirpe C5 8 (ATCC3 3 97 0) AB10121 (FERM P-17383) pv.Campestris (ATCC33913 ) Nome do gene ou da enzima Gene Atu4375 Gene Atu3234 Gene Atu4375 Gene Atu3234 Gene Xcc3438 kDalton 41, 3k 42,4k 41, 4k 42,5k 38,5k Propriedade de associação Dimero Dimero Dimero Dimero Dimero Termoestabi-lidade Estável a 50°C ou menos Estável a 40°C ou menos Estável a 50°C ou menos Estável a 40°C ou menos Estável a 40°C ou menos Actividade relativa da coenzima NADPH:NADH =100:9 NADPH:NADH =100:18 NADPH:NADH =100:6 NADPH:NADH =100:20 NADPH:NADH =100:34 pH óptimo pH 6,5-8,5 pH 7,0-8,5 pH 6,5-8,5 pH 7,0-8,5 pH 6,5-7,5 Efeitos de metais pesados: activação Co, Mn Co,Mn,Ca Co, Mn Co,Mn,Ca Co Efeitos de metais pesados: inibição forte Sn, Zn Sn, Zn Sn, Zn Sn, Zn Sn, Zn Produto da reacção de redução Apenas CIS -► SI Apenas CIS -► SI Apenas CIS -► SI Apenas CIS -► SI Apenas CIS -► SI Valores de Km para cilo-inosose 9,2 mM 2,6 mM 9,8 mM 3, 1 mM 9,1 mM Extracto especifico Actividade relativa (70% ou mais) SI,MI,DCI,EI SI,MI,DCI,EI,LCI SI,MI,DCI,EI SI,MI,DCI,EI,LCI SI,DCI Extracto especifico Actividade LCI,Mui Mui LCI,Mui Mui MI 134 relativa (20 a 70%) Extracto especifico Actividade relativa (inferior a 20%) AI, NI AI, NI AI, NI AI,NI EI,LCI.Mul, AI,NI Abreviaturas CIS:cilo-inosose, Cl :Cilo-inositol, MI:Mio-in inositol, Mui:Muco-inositol, AI:Alo-inositol, NI:Neo-inosit ositol, DQI:D-quiro ol -inositol, LQI:L-quiro-inositol, EI:Epi- E.ooN.ydgj — X. caap.Xco3<38 ΡΟΏ^ΥΙ^ΑΑΠΙΒΑΒΑβΙΑΡΡΡν-^^ β sufc. 8G140S7 A. tí8*e.Atu437S áBí0l2IAtu43?5 A tune. Atu3234 A8!C!2IAtu3234 ASÍ02SISICH1 PS~W6SlfUmKIA£S JREeWLPV-ÍAE£6fNV{Rf !BWOSK8«T«Bt---Íi-YREAADAI ÍXXftE{^TAA^iYP^e^AaAF?0AAVRSS^TSriV6mi™ íí-YREAÀfcM ΪΛΚί«6Ι»ΑΑβΒΗΥΜ«>®>&* ^
——-1ΚΛ i BfARYlIiM^aHMJ^IWftAfiLS lOTtyET IHASS-KSAAISCVPWK
E. coti.ydg^ - X. caap* Xcc343B 0~-~~ 8.sub.8S1405? A. tue*. Atu4375 A8lO!2ÍAtt43?5 —-- A. tuee. kttútM - Α&10ΐ2ϊ*Ι*ί323« -
ASlÔIStSiOHl tOXKSftQHEKA
Exemplo 15 <Produção de cilo—inositol utilizando a enzima da presente invenção> 0 processo de produção da presente invenção requer dois tipos de enzimas, mio-inositol 2-desidrogenase e a enzima da presente invenção. Aqui, vai mostrar-se um exemplo que utiliza uma enzima recombinante de mio-inositol 2-desidrogenase que é um produto do gene BG 10669 derivado de 168 ATCC23857 de Bacillus subtilis e uma enzima recombinante da enzima da presente invenção codificada pelo ADN da presente invenção (gene ydgJ derivado de K12 de Escherichia coli: SEQ ID NO: 1). 135
Primeiro, para se obter uma enzima recombinante de mio-inositol 2-desidrogenase, que é um produto do gene BG10669 derivado de 168 ATCC23857 de Bacillus subtilis, realizou-se a experiência que se segue. Realizou-se a RCP utilizando iniciadores com as sequências que se seguem para a clonagem do gene BG10669 derivado de 168 de Bacillus subtilis para o expressar como uma enzima recombinante.
SEQ ID NO: 25: BG10669-F 5'-ttgggatccgatgagtttacgtattggcgtaattg-3'
SEQ ID No. 26: BG10669-R 5'-aaactgcagttagttttgaactgttgtaaaagattgata-3'
Para a RCP, utilizou-se a solução da reacção de Ex taq da Takara Shuzo Co., Ltd. e preparou-se uma solução com uma composição de 5 μΐ de 10 x tampão de Takara ExTaq, 4 μΐ de uma mistura de dNTP, 30 ng do ADN-matriz, 1 μΐ de cada solução de iniciador 10 μΜ e 0,5 μΐ de Takara ExTaq, por meio da adição de água de tal modo que se tivesse um volume de 50 μΐ, seguido da formação de camadas de 30 μΐ de óleo mineral. Para a reacção, um ciclo de três etapas: desnaturação (94 °C, 30 segundos), hibridação (53 °C, 1 minuto) e elongação (72 °C, 1 minuto), que se repetiram 35 vezes utilizando um amplificador de RCP (ASTEC Co., Ltd., PC-700). A RCP descrita antes amplificou um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,0 kpb. Depois da reacção, o óleo mineral em camadas foi extraído com 0,3 ml de hexano e repetiu-se, três vezes, uma operação de eliminação da camada de hexano seguida da redução da pressão durante 1 minuto, para assim eliminar o óleo mineral. A partir de 50 μΐ da solução de reacção assim 136 obtida, purificou-se o fragmento da RCP utilizando GENECLEAN (Bio 101). Especificamente, adicionou-se 300 μΐ de uma solução de Nal incluida no estojo e misturou-se e adicionou-se 10 μΐ de uma solução de pérolas de vidro e misturou-se. Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para precipitar as pérolas de vidro nas quais o fragmento de ADN estava adsorvido e depois eliminou-se o sobrenadante. Depois adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem, incluida no estojo, à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a mistura para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem, utilizando a nova solução de lavagem, foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro a pressão reduzida e adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão com as pérolas.
Aqueceu-se a mistura para 55 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para se obter assim 2 μΐ do sobrenadante contendo o fragmento de ADN.
Realizou-se uma operação de inserção do fragmento de ADN purificado num vector de expressão, como se segue.
Especificamente, adicionou-se 0,5 pg de um plasmido de expressão (pUC118: fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.)), 1 μΐ de cada uma das enzimas de restrição BamHI e PstI da Takara Shuzo Co., Ltd. e 2 μΐ de 10 χ tampão K, que é um tampão de enzima de restrição da Takara Shuzo Co., Ltd., a 10 μΐ da solução de fragmento de ADN e adicionou-se água esterilizada de modo a que a mistura ficasse com um volume de 20 μΐ, seguida de mistura. Deixou-se a solução reaccional reagir a 36 °C durante 2 horas. Depois da reacção das enzimas de restrição, isolou-se o fragmento de ADN e o vector de 137 expressão com GENECLEAN e ligaram-se um ao outro. Especificamente, adicionou-se 300 μΐ da solução de Nal incluída no estojo a 20 μΐ da solução reaccional das enzimas de restrição e misturou-se e adicionou-se depois 10 μΐ da solução de pérolas de vidro e misturou-se. Deixou-se a mistura em repouso a 4 °C durante 15 minutos e depois centrifugou-se para precipitar as pérolas de vidro nas quais o fragmento de ADN e o vector de expressão estavam adsorvidos e eliminou-se o sobrenadante. Depois, adicionou-se 500 μΐ da nova solução de lavagem, incluída no estojo, à suspensão de pérolas de vidro e centrifugou-se a suspensão para eliminar o sobrenadante. A operação de lavagem utilizando a nova solução de lavagem foi repetida três vezes. Depois, secaram-se as pérolas de vidro a pressão reduzida e, após a secagem, adicionou-se 15 μΐ de água esterilizada para fazer uma suspensão com elas. Aqueceu-se a mistura para 55 °C durante 15 minutos e centrifugou-se para se obter assim 12 μΐ do sobrenadante contendo o fragmento de ADN e o vector de expressão. O processo eliminou pequenos fragmentos de ADN que tinham uma dimensão de cerca de 50 pb ou menos e que tinham sido gerados pelas enzimas de restrição, para se obter assim o fragmento de ADN com interesse e o vector de expressão.
Adicionou-se 10 μΐ de uma solução de ligação de Takara do estojo-I (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 10 μΐ da solução assim preparada e deixou-se a mistura reagir a 16 °C durante 1 138 hora. Utilizou-se a solução para transformar as células concorrentes (Takara Shuzo Co., Ltd.: DH5a). Especificamente, adicionou-se-lhe 5 μΐ de uma solução reaccional de ligação a 60 μΐ de uma solução de células concorrentes não congeladas a 4 °C e misturou-se e deixou-se a 0 °C durante 30 minutos e a
42 °C durante 45 segundos e a 0 °C durante 2 minutos. Adicionou-se-lhe 500 μΐ de uma solução de SOC (2 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, NaCl 10 mM, glicose 2 0 mM, MgSCh 10 mM e MgCl2 10 mM) seguida da recuperação da cultura a 36 °C durante 1 hora. Aplicou-se 100 μΐ da solução de cultura num meio de agar LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7,0, 1,5 % de agar) contendo 50 pg/ml de ampicilina, 40 pg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyil^-D-galactósido) e IPTG (tiogalactopiranósido) 1 mM. Realizou-se depois a cultura a 37 °C durante 16 horas. A cultura originou Escherichia coli transformada por introdução dos plasmidos descritos antes, sob a forma de colónias brancas e seleccionaram-se as colónias. As colónias assim separadas da Escherichia coli transformada foram postas em cultura num meio liquido LB contendo ampicilina (50 pg/ml). A partir das células de cultura da Escherichia coli transformada, separou-se o ADN de plasmido e purificou-se utilizando um estojo de purificação de plasmido (estojo midi de filtro de plasmido QIA, QIAGEN). O ADN do plasmido assim obtido confirmou ter um fragmento de ADN com uma dimensão de cerca de 1,0 kpb, que corresponde ao gene de interesse BG 10669.
Em seguida, para confirmar a actividade de cilo-inositol 2-desidrogenase, transferiram-se as células isoladas, sob a 139 forma de colónias, para 30 garrafas de 100 ml de meio LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de
NaCl, a pH 7,0) contendo 50 yg/ml de ampicilina e fez-se uma cultura a 36 °C durante 7 horas. Adicionou-se 0,3 ml de uma solução de tiogalactopiranósido 200 mM a cada 100 ml das soluções da cultura e depois colocaram-se as células em cultura a 36 °C durante 3 horas. Depois de a cultura estar completa, recolheram-se as células por centrifugação e lavaram-se uma vez com uma solução salina fisiológica. Depois, fez-se uma suspensão das células lavadas em 3 ml de uma solução de Triton X-100 a 0,6 % e dividiram-se as células por ondas ultra-sónicas a 4 °C. Centrifugou-se a solução e retirou-se 84 ml do sobrenadante (solução da enzima). Adicionou-se 36 g de sulfato de amónio ao sobrenadante para salificar as proteinas a 4 °C. Recolheram-se as proteínas resultantes por centrifugação e eliminou-se o sobrenadante. Dissolveram-se os precipitados em 75 ml de tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e centrifugou-se novamente a solução. Aplicou-se o sobrenadante numa coluna Sephadex G-25 (Pharmacia K.K.) (400ml) equilibrada com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e realizou-se a eluição com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0). Realizou-se a eluição com tampão de Tris 20 mM (pH 7,0) e dessalinizou-se o produto da eluição. Os processos originaram 105 ml de uma solução de enzima impura do produto do gene BG10669.
Mediu-se a actividade de redução da mio-inositol 2-desidrogenase como se descreve a seguir. Misturou-se 5 μΐ de uma solução reaccional (tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 2 % de NADH, 1 % de cilo-inosose) com 5 μΐ de uma solução da enzima e deixou-se reagir a 36 °C durante 30 minutos. Imediatamente depois da reacção, adicionou-se 500 μΐ de água e mediu-se a absorvência a 340 nm. A partir do valor em branco de um tubo de ensaio preparado utilizando água em vez 140 da solução de enzima, mediu-se a diminuição da absorvência a 340 nm. A solução da enzima foi diluída conforme necessário e confirmou-se que a enzima tinha uma actividade para reduzir cilo-inosose. Por outro lado, para medir a actividade de oxidação, misturou-se 50 μΐ de uma solução de reacção (1 % de mio-inositol ou cilo-inositol, tampão de Tris 200 mM (pH 8,0), 0,002 % de NAD+, 0,002 % de diaforase e 0,01 % de azul de nitrotetrazólio) com 50 μΐ de uma solução de enzima e mediu-se o aumento da absorvência a 545 nm a 25 °C, de três em três minutos, utilizando um leitor de microplacas. Calculou-se a taxa de reacção a partir dos aumentos da absorvência nos tempos respectivos. Como resultado, confirmou-se que a enzima preparada tem actividade para oxidar mio-inositol mas não tem actividade para oxidar cilo-inositol . A solução da enzima mio-inositol 2-desidrogenase assim preparada e a solução da enzima impura cilo-inositol desidrogenase preparada no exemplo 11 (105 ml da solução da enzima preparada a partir de 3 L de uma solução de cultura (escala de 30 vezes)) foram utilizadas para realizar a reacção para converter mio-inositol em cilo-inositol. Para preparar uma solução da reacção, misturou-se 200 g de mio-inositol, 70 ml de cilo-inosose a 5 %, 130 mg de C0CI2 e 250 mg de MgS04 7H20 e ajustou-se o volume para 750 ml por meio da adição de água, seguida de aquecimento até 50 °C para dissolver o mio-inositol. A solução foi arrefecida para 36 °C e ajustou-se para pH 8,0 com uma solução aquosa de NaOH IN e ajustou-se o volume para 7 90 ml por meio da adição de água. Adicionou-se 105 ml de uma solução da enzima impura de mio-inositol 2-desidrogenase, 105 ml de uma solução da enzima impura de cilo-inositol desidrogenase e 70 mg de NADP +, a 36 °C e manteve-se a temperatura da solução com um volume de cerca de 1 L, a 36 °C, seguida da reacção com uma ligeira agitação. A solução reaccional gradualmente tornou-se ácida, 141 por isso ajustou-se para o pH 8,0 com NaOH IN. 42 Horas mais tarde, geraram-se os cristais de cilo-inositol na solução de reacção, de modo a obter-se uma solução reaccional branca. Filtrou-se a solução utilizando um filtro de papel para recolher a cilo-inositol cristalina (peso húmido 73 g). Adicionou-se ao sólido 3 L de água e o sólido dissolveu-se a 50 °C. Ajustou-se o volume da mistura para 4,5 L por adição de água e arrefeceu-se a mistura para a temperatura ambiente. Centrifugou-se a solução resultante (8.000 rpm, 20 minutos) para eliminar as matérias insolúveis e fez-se passar o sobrenadante através de uma coluna cheia com 100 ml de uma resina permutadora de catiões de bases fortes, uma coluna cheia com 100 ml de uma resina permutadora de aniões de ácido fortes e uma coluna cheia com 50 ml de carvão activado, por esta ordem, para assim se obter cada um dos produtos eluidos. Depois, faz-se passar 500 ml de água através de cada uma das colunas para as lavar, para assim se obter, de cada uma, uma solução de lavagem. Misturaram-se e concentraram-se os produtos eluidos e a solução de lavagem.
Como resultado da concentração, os microcristais começaram a cristalizar à medida que o volume da solução se tornou mais pequeno e concentrou-se a solução até o peso do conteúdo ser da ordem de 130 g. Arrefeceu-se a solução concentrada para 4 °C e deixou-se em repouso durante a noite. Depois, filtraram-se as substâncias pastosas e lavaram-se os cristais de cilo-inositol do papel do filtro com uma pequena quantidade de água, seguida de secagem a 105 °C durante 3 hr. O cilo-inositol resultante tinha a forma de cristais brancos (61 g) e a análise de RMN e de CLAR revelaram que os cristais não continham outras impurezas e tinham uma pureza de 99 % ou mais. O rendimento de mio-inositol foi de 31 %. Entretanto, a solução de reacção que tinha sido separada por filtração 142 também podia ser utilizada e quando se dissolveu 64 g de mio-inositol, cristalizou mais cilo-inositol cristalino.
Exemplo 16 <Formação do complexo de cilo-inositol/ácido bórico e estudo das condições de formação
Dissolveu-se 100 g de pó de cilo-inosose em 500 ml de água quente e arrefeceu-se a solução para a temperatura ambiente. Depois, adicionou-se água de tal maneira que a solução tivesse um volume de 900 ml. Ajustou-se o pH da solução para 7,5 com uma solução aquosa 5N de NaOH e adicionou-se mais água de modo a ter-se um volume de 1 L.
Adicionou-se, gradualmente, 5,9 g de NaBH4, em pó, à solução, durante 15 minutos, com agitação, para se realizar uma reacção de redução. A temperatura da solução reaccional aumentou até 38 °C devido ao calor da reacção. 30 Minutos mais tarde, dissolveu-se 67,5 g de ácido bórico e 72,2 g de NaCl na solução reaccional que tinha sido arrefecida para 32 °C, para se preparar assim uma solução em que se formou o complexo. O pH da solução era de 5,9.
Em seguida, distribuiu-se 100 ml da solução, na qual se tinha formado o complexo e com o pH ajustado para 6,0 por meio de uma solução aquosa 8N de NaOH, num recipiente de plástico de 200 ml com uma tampa e distribuiu-se 100 ml da solução, na qual se tinha formado o complexo e com o pH ajustado para 7,0 por meio de uma solução aquosa 8N de NaOH, da mesma maneira que antes. Além disso, distribuiu-se cada uma das soluções de 100 ml, na qual se tinha formado o complexo e tendo sido ajustado o pH de cada uma delas para pH 8,0, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 12,0 ou 12,8. 143
Nessas soluções com o pH ajustado, começaram a formar-se, gradualmente precipitados. Separaram-se os precipitados por filtração em cada um dos dias seguintes e ajustou-se o filtrado para um pH pré-determinado com uma solução aquosa 8N de NaOH e depois voltaram ao recipiente original. Os precipitados resultantes foram secos e pesados. Se todo o cilo-inositol, gerado pela redução, forma um complexo de cilo-inositol/ácido bórico e se se obtêm sob a forma de precipitados, o peso dos precipitados seria de 61,8 g. Por isso, o peso dos precipitados obtidos a partir das respectivas soluções com os pH ajustados foram integradas nos dias seguintes e os valores obtidos dividindo os valores integrados pelo rendimento teórico (61,8 g) foram definidos como as taxas de recuperação dos precipitados do complexo de cilo-inositol/ácido bórico.
Os valores assim obtidos estão ilustrados a seguir. As partes sombreadas no quadro mostram um grupo de ensaio com uma taxa de recuperação de mais do que 90 %.
Quadro 7: pH do tratamento Taxa cie recuperação do complexo de cilo-inositol/ácido bórico Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 6 9, 4% 17, 9% 25,5% 32,4% 38, 6% 44,2% 49,2% 7 21,7% 38,4% 51,2% 61,1% 68,7% 74, 6% 79,1% 8 42,4% 65,7% 78, 6% 85, 6% 89, 5% 91, 6% 92,8% 9 66, 9% 86, 3% 91, 9% 93, 6% 93, 6% 94,2% 94,2% 9,5 82, 9% 92, 9% 94,1% 94,2% 94,2% 94,2% 94,2% 10 57,5% 79, 9% 88, 6% 92,1% 93,4% 93, 9% 94,1% 10,5 41,5% 64,7% 77,7% 85, 0% 89, 0% 91,3% 92, 6% 11 36, 8% 59, 2% 72,8% 81,2% 86, 3% 89, 4% 91,3% 12 29, 2% 49, 4% 63,3% 72, 9% 79, 5% 84,1% 87,2% 144 pH do tratamento Taxa de recuperação do complexo de cilo-inositol/ácido bórico Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 12,8 25,4% 44,0% 57, 6% 67,5% 74,7% 80,0% 83,8%
Como se mostra no quadro 7, o grupo de ensaio de tratamento a pH de 9,5 foi o mais apropriado para a formação de precipitados do complexo de cilo-inositol/ácido bórico. As taxas de recuperação dos grupos de ensaio de pH 9,0, pH 9,5 e pH 10,0 atingiram uma taxa de recuperação de 90 % ou mais no 4o dia e verificou-se que a taxa de recuperação se torna constante a 94 % mesmo se se alargar o periodo de ensaio. A análise por RMN para o filtrado do grupo de ensaio de pH 9,5 no 7o dia revelou que 5,9 % (p/v) de mio-inositol e cerca de 0,2% (p/v) de cilo-inositol permaneceram em solução. Isto é, verificou-se que o complexo pode ser retirado sob a forma de um precipitado pelo processo da presente invenção no caso em que a concentração do complexo de cilo-inositol/ácido bórico é de 0,2 % (p/v) ou mais.
Exemplo 17 <Processo de formação do complexo de cilo-inositol/ácido bórico a partir da mistura de redução e dissolução do complexo e depois libertação e dessalinização do cilo-inositol utilizando uma resina permutadora de iões>
Dissolveu-se 10 g (56 mmole) de pó de cilo-inosose em 50 ml de água quente e arrefeceu-se a solução para a temperatura ambiente. Depois, adicionou-se água de modo a obter-se um volume de 90 ml. Ajustou-se o pH da solução para 7,5 com uma solução aquosa 5N de NaOH e adicionou-se mais água de modo a obter-se um volume de 100 mL. 145
Adicionou-se, gradualmente, à solução 0,59 g de NaBH4 em pó, durante 15 minutos, com agitação, para se realizar uma reacção de redução. A temperatura da solução reaccional aumentou até 3 °C devido ao calor da reacção. 30 Minutos mais tarde, dissolveu-se 6,75 g de ácido bórico e 7,22 g de NaCl na solução reaccional arrefecida para 31 9C, para preparar assim uma solução em que se formou o complexo. Em seguida, ajustou-se o pH da solução em que se formou o complexo para pH 9,5 com uma solução aquosa 5N de NaOH e manteve-se a solução a pH 9,5 com uma solução aquosa 5N de NaOH com um equipamento padrão com agitação. 3 Dias mais tarde, filtraram-se os precipitados contidos na solução em que se formou o complexo e lavou-se com uma pequena quantidade de água, seguida de secagem, para assim se obter 5,71 g (20,5 mmole) de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico.
Adicionou-se 230 ml de uma solução de ácido clorídrico 1,05 N a 5,71 g do complexo de cilo-inositol/ácido bórico resultante para dissolver o complexo de cilo-inositol/ácido bórico e assim obteve-se uma solução dissolvida. A solução dissolvida era uma solução ácida 0,2N. Em seguida, fez-se passar a solução dissolvida resultante através de uma coluna cheia com 200 ml de uma resina permutadora de iões de um ácido forte (Duolite C20, do tipo H+, Sumitomo Chemical Co., Ltd.) a uma velocidade de fluxo de 2 ml/min e fez-se passar então o fluido eluido resultante através de uma coluna cheia 146 com 400 ml de uma resina permutadora de iões de uma base forte (Duolite A116, do tipo OH-, Sumitomo Chemical Co., Ltd.)· Concentrou-se o produto eluido resultante, para se obter assim 3,52 g (19,5 mmole) de um pó branco. A análise por RMN revelou que o pó branco era cilo-inositol. Entretanto, o rendimento de cilo-inositol a partir de cilo-inosose foi de 35 %.
Exemplo 18 <Processo de formação de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico a partir de uma mistura de redução de cilo-inosose e dissolução do complexo e depois libertação e cristalização do cilo-inositol por meio da precipitação do dissolvente orgânico>
Como matéria-prima, utilizou-se 5,71 g (20,5 mmole) de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico que tinha sido preparado a partir de 10 g (56 mmole) de pó de cilo-inosose da mesma maneira que no exemplo 17.
Adicionou-se 5,71 g de um complexo de cilo-inositol/ácido bórico a um frasco cónico de 100 ml com uma tampa com um agitador e adicionou-se 22,8 ml de uma solução de ácido clorídrico 1,83 N para preparar uma suspensão. Depois de se completar a agitação durante 1 hora, adicionou-se-lhe 23 ml de metanol e agitou-se ainda mais a mistura. 5 Horas mais tarde, filtrou-se a suspensão e lavaram-se os sólidos com uma pequena quantidade de metanol e secou-se para se obter assim 3,58 g (20,0 mmole) de cilo-inositol impuro.
Depois, dissolveu-se 3,58 g do cilo-inositol impuro resultante em 230 ml de água e adicionou-se 20 ml de uma resina permutadora de iões de ácidos fortes (Duolite C20/do 147 tipo H+) e 40 ml de uma resina permutadora de iões de bases fortes (Duolite A116/do tipo OH") seguida de agitação. Depois de se completar a agitação durante 30 minutos, as resinas permutadora de iões foram separadas por filtração e concentrou-se o filtrado resultante para se obter assim 3,41 g (18,9 mmole) de um pó branco. A análise por RMN revelou que o pó branco era cilo-inositol. Entretanto, o rendimento de cilo-inositol a partir de cilo-inosose foi de 34 %.
Exemplo 19 <Processo de redução de cilo-inosose e em seguida libertação directa e cristalização de cilo-inositol>
Dissolveu-se 5 g (28 mmole) de pó de cilo-inosose em 40 ml de água quente e arrefeceu-se a solução para a temperatura ambiente. Ajustou-se o pH da solução para 7,5 com uma solução aquosa 5N de NaOH e adicionou-se mais água de modo a obter-se um volume de 45 mL.
Adicionou-se, gradualmente, 0,29 g de NaBH4 à solução, durante 15 minutos, com agitação, para se realizar uma reacção de redução. A temperatura da solução reaccional aumentou até 37 °C devido ao calor da reacção. 30 Minutos mais tarde, ajustou-se o pH da solução reaccional que tinha sido arrefecida para 30 °C para um pH de 1,0 com ácido cloridrico 5N. Depois, adicionou-se água para se obter um volume de 50 ml, para se preparar assim uma solução ácida 0,1N. Em seguida, adicionou-se 25 ml de metanol à solução com agitação. 10 Minutos mais tarde, a solução tornou-se 148 gradualmente opaca e agitou-se ainda a suspensão durante 24 horas. 24 Horas mais tarde, filtrou-se a suspensão e lavou-se com uma pequena quantidade de metanol e depois secou-se para se obter assim 1,55 g (8,6 mmole) de cilo-inositol impuro.
Depois, dissolveu-se 1,55 g do cilo-inositol impuro resultante em 120 ml de água e adicionou-se 10 ml de uma resina permutadora de iões de ácidos fortes (Duolite C20/do tipo H+) e 20 ml de uma resina permutadora de iões de bases fortes (Duolite A116/do tipo OH+) , seguido de agitação. Depois de se completar a agitação durante 30 minutos, as resinas permutadora de iões foram separadas por filtração e concentrou-se o filtrado resultante para se obter assim 1,51 g (8,3 mmole) de um pó branco. A análise por RMN revelou que o pó branco era cilo-inositol. Entretanto, o rendimento de cilo-inositol a partir de cilo-inosose foi de 30 %.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
De acordo com a presente invenção, o cilo-inositol que está disponível como um fármaco pode ser directamente e eficientemente produzido, a partir do mio-inositol, que é barato, apenas por meio da conversão de microrganismos ou por meio de uma reacção enzimática. Entretanto, o processo de produção da presente invenção tem a vantagem de dificilmente gerar isómeros.
Quando se utiliza mio-inositol 2 desidrogenase, independente de NAD+ da presente invenção, a cilo-inosose pode ser produzida sem adicionar NAD+ à solução reaccional. Além disso, pode-se obter facilmente e eficientemente cilo-inositol de elevada pureza, por meio da redução da cilo-inosose resultante. De acordo com a presente invenção, pode-se formar com eficiência um complexo de cilo-inositol/ácido 149 bórico a partir de uma mistura que contém cilo-inositol e açúcares com efic complexo operação LISTA DE <110> <12 0> <130> <150> <151> <150> <151> <150> <151> <150> <151> <160> <17 0> <210> <211> <212> <213> neutros para além do cilo-inositol e pode-se obter iência cilo-inositol de elevada pureza a partir do de cilo-inositol/ácido bórico por meio de uma fácil.
SEQUÊNCIAS
Hokko CHEMICAL INDUSTRY CO. , LTD.
PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE CILO-INOSITOL 572-C42 04 JP2003-353490 2003-10-14 JP2003-353491 2003- 10-14 JP2004-18128 2004- 1-27 JP2 004-194088 2004-6-30 37
Patentln versão 3.1 1 1041
ADN
Escherichia coli 150 <220>
<221> CDS <222> (1) .. (1041) <223> <400> 1 atg age gac aac ate cgt gtt ggg ttg att ggg tat ggt tat gcg age 43 8et 1 Ser Asp Asn Me r Arg Va! SIV Leu lie 10 Gly Tyr síy Tyr Ala 15 gaa Ser 1 833 acc ttc cat 5 gcg ccc ctg att gcg ggc acg ccc ggg cag ctg 96 lys Thr Pha His Ata Pro Leu 11« Ala 61y Thr Pro Sly Sln 8tu teu 20 25 30 144 gcg gta ate tcc age agt gat gaa aca aaa gta aaa gee gac tgg cca Ala Vai He Ser Ser Ser Asp Slu Thr Lys Vat Lys Ala Asp Trp Pro 35 40 45 182 acg gtt acg gtt gtc tet gag ccg aag cat ctg ttt aac gat ccc aac Thr Vat Thr Vai Vai Ser Slu Pro Lys His Leu Phe Asn Asp Pro Asn 50 50 ata gee ctg att gtc att cct aca ccc aac Ife Asp Leu 1 íe Vat He Pro Thr Pro Asn $5 70 gee aaa gcg gcg ctt gag gcg ggt aaa cat Ala Lys Ata Aís Leu G fu Ala Gfy Lys Hís 85 90 ttt acc gtg aca ctg tea caa gcg cga gag Phe Thr Vai Thr leu Ser Gin Ala Arg Glu 100 !Õ5 age ctg ggg cgt gtg ctg tet gta ttc cat Ser Leu Sly Arg Vai Leu Ser Vai Phe Hís 115 120 gat ttc ttg acg cta aaa ggt tta etc gcg Asp Phe Leu Thr Leu Lys Sly Leu Leu Ala 130 135 gtt gct tac ttt gag tet cat ttt gac ege Vai Ala Tyr Phe Slu Ser His Phe Asp Arg 145 150 gat cgt tgg cgt gaa cag ggc ggc cca ggc Asp Arg Trp Arg Slu Gin Gly 6ly Pro Gfy 165 170 +** «•a* gat acc cat ttc ccg tta 240 Asp Thr Hís Phe Pro teu 75 80 gtg gtc gtt gat aaa ccc 288 Vai Vai Vai Aep lys Pro 95 ctg gat gcg ctg gca aaa 336 teu Asp Ala Leu Ala lys 110 aac cgt ege tgg gat age 384 Asn Arg Arg Trp Asp Ser
12S gee ggc gtg ctg ggt gaa 432 Slu Sly Vai Leu Oiy 61u 140 ttc cgt ccg cag gtg ege 480 Phe Arg Pro Olrt Va! Arg 155 160 egc ggt ate tgg tac gat 528 Ser Sly lie Irp Tyr Asp 175 ΠιΜ» ****** 441· 44>s 151 age çag gea ate cag gta atg gag ttg att gag ctg ggc ato gaa tec 1008 Ser Gin Ala {te Gin Vai 8et Gl u Leu He Gíu Leu Giy He Gíu Ser 325 330 335 gee aaa eat ege gci act ttg t*e ctt «ca tga 1041 Aia lys His Arg A ia Thr Leu Cys Leu Ata 340 345 <210> 2 <211> 346 <212> PRT <213> Escherichia <4 0 0> 2 «et Ser Asp km He Arg Vai Giy Leu He Giy lyr Giy Tyr Ata Ser t 5 10 15 Lys Thr Phe His Ata Pro Leu He Aia Sly Thr Pro Gly Gin Glu Leu 20 25 30 Aia Vai lie Ser Ser Ser Asp Gíu Ihr Lys Vai lys Aia Asp Trp Pro 35 40 45 Thr Vai íbr Vai Vai Ser Gtu Pro Lys His Leu Phe Asn Asp Pro Asn so 55 60 He Asp Lm He Vai He Pro Thr Pro Asn Asp Ihr His Phe Pro Leu 65 70 75 80 ASa Lvs Ala Ala Leu Giu Aia Giy Lys His Vai Vai Vai Asp Lys Pro ÂSp Met Arg Asp 8Jy Vai leu Thr Arg Vai Giu Gí V Giu Glu Arg Vai 275 280 285 Glu G iu Thr leu leu Thr VaS Pro Gly Asn lyr Pro Ata lyr lyr Ala 290 295 300 Ala i Se Arg Asp Alâ leu Asn fily Asp Gty 6iu Asn Pro Vat Pro Ala 305 3ÍQ 315 320 Ser Gin Ala 1 Se Gin Vai ílet Glu leu He Giu Leu Gly 1 Iõ Glu Ser 325 330 335 Ala lys Hís Arg ASa Thr leu Cys leu Ala 340 345 <210> 3 153
<211> 1170 <212> ADN <213> Agrobacterium tumefacience <220>
<221> CDS <222> (1).. (1170) <223> <400> 3 atg tcc tcc get sca aag aaa ttc gat agt ege ege att cgt etc ggt 48 ítet Ser Ser Ala Thr lys lys Phe Asp Ser Arg Arg Ne Arg Leu Gly t 5 to 15 8tg gtc ggc ggc ggt cag ggc gee ttc att ggc gcg gtg cat ege ate 05 ítet Vai Giy Giy Gly Sln Gly Ala Phe He Giy Aia Vai His Arg Me 20 25 30 gcg gee cgg ctg gat gac cgt tae gag ctg gtg gee gga gcg ctt tcc 144 Ala Ala Arg Leu Asp Asp Arg Tyr Glu Leu Vai Aia Giy Ala Leu Ser 35 40 45 tcc gat ccc gcg cgt gee gee gee teg gea aca ctg etc ggc att geg 192 Ser Asp Pro Aia Arg Ala Ala Aia Ser Ala Thr Leu Leu Gly Me Ala 50 55 $0 ccg g«g ege tcc tat gee teg ttc geg gac stg gcg gcg set geg gee 240 Pro Gtu Arg Ser Tyr Ala Ser Phe Glu Asp tôet Aia Aia Thr Glu Aia 65 70 75 80 ggc Gly cgg gag gat ggc ate gag gea gtc gee ate gtc acc ccc aac cat 238 Arg Glu Asp 6ty He Glu Ala Vai Ala iie Vai Thr Pro Asn His 35 90 05 ctg cat ttt gee ccg tcc aag gee ttt etc gaa gee ggc ate eac gtc 336 leu His Phe Ata Pro Ser Lys Aia Phe Leu Glu Aia Gly Me His Vai too 105 110 ate tgc gac aag ccg gtg acc gcg acg. ctg gaa gaa gcg aag gea ctg 384 lie Cys Asp Lys Pro Vai Thr Ala Thr leu Giu Glu Ala lys Ala Leu 154
Ala m f Se Vai Arg Aia Ser Asp Ser Leu Phe Vai Leu Thr Bis Asn 130 135 140 tac acc ggt tac gee atg etg egg cag atg cgc gag atg ate gct gaa 480 Tyr Thr Giy Tyr Ala Met Leu Arg Gin «et Arg Gíu tóet 1 íe Aia Glu 145 ISO 155 ieo «e gee att ggc aag etg cgc cat gtc cag gee gaa tat gcg cag gac 528 Siy Ala 1 Se Gíy Lys Leu Arg Bis Vai Gin Aia Glu Tyr Ata Sín Asp 165 170 175 tgg etg aec gaa gcg gte m asa aee ggc gea aaa ggt gcg gaa tgg 575 Irp Leu Thr Gfu Aia Vai Giu Lys Thr Siy Afa Lys Giy ASa Giu Trp 180 185 190 cgc acc gac ccc age cgc tcc ggt gcg ggc ggc gee ate ggc gat ate 624 Arg Thr Asp Pro Ser Arg Ser Gíy Ala Siy Síy Aia lie Giy Asp 1 Íe JS5 20Ô 2Ô5 ggc 3Ct eac gee ttc 33C gct gct gee ttt gtg acg ggt gaa ate ccc 672 Ôíy Thr Hl s Aia Phe Asn Ala Aia Aia Phe Vai Thr Giy Giu He Pro 210 215 220 age agt ctt tat gcg gat cie açg teg ttt gtg ccg ggc egg cag etg 720 Ser Ser Leu Tyr Aia Asp leu Thr Ser Phe Vai Pro Giy Arg Gin Leu 225 230 235 240 gat gac âgc gee aat att ctt ttg cgt tac gae agt gge gee aag ggc 768 Asp Asp Ser Aia Asp Ite leu Leu Arg Tyr Asp Ser Giy Ala Lys Gíy 245 250 255 ate etc tee eca aee Câfi ate etc ír^n aat ffaâ aat «titt ot» toa SI6 L 5 5
Vai Gly He Asp He 385
<210> 4 <211> 389 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefacience <400> 4
Set Ser Ser Ala Thr Lys Lys Phe Asp Ser Arg Arg He Arg Leu Cly í 5 10 15 Het Vai Oiy Oiy Gty Oln Oiy Ala Phe He oiy Aia Vai His Arg i ie 20 25 30 Aia Ala Ârg Leu Asp Asp Arg Tyr Glu teu Vai Ala Oiy Ala Leu Ser 35 40 45 Ser Asp Pro Ala Arg Ala Ala Ala Ser Ala Thr Leu Leu Gly He Ala 50 55 60 Pro Glu Arg Ser Tyr Ala Ser Phe Glu Asp Ret Ala Ala Thr Glu Ala 65 70 75 80 m Arg Gfu Asp Gly lie Olu Aiâ Vai Ata He Vai Thr Pro Asn His 85 00 95 Leu His Phe Ai a Pro Ser Lys Ala Phe Leu Gfu Aia Oiy f te Hís Vai 100 105 HO
Thr Ârg Asn Gly Ata Gly Ala Gly Ala Ala Ala Asn Ârg Vai Ser Arg 305 310 315 320 Vai Pro Ser Gly His Pro 61 u Gly Tyr Leu Glu Sly Phe Ala Thr l le 325 330 335 Tyr Arg 61 u Ala Ala Asp Ala lie lie Ata Lys Arg Glu Gly Glu Thr 340 345 350 Ala Ala 61 y Slu Vai He Tyr Pro Gly Met Glu Asp Gly Leu Ala Gly 355 360 365 teu Ala Phe Me Asp Ala Ala Vai Arg Ser Ser Gtn Thr Ser Thr Trp 370 375 380 Vai Gly fie Asp He 385 <210> 5 157
<211> 1188 <212> ADN <213> Agrobacterium tumefacience <22 0>
<221> CDS <222> (1) .. (1188) <223> <400> 5 atg gct att gaa gga aag aca acc gac gtg gcg aac aag cgg att ege 48 Hot Ala 1 is Glu Giy lys Thr Thr Asp Vat Ala Asn Lys Arg He Arg 1 5 10 15 etc ggc atg gtc ggc KC ggt teg ggc gea ttc ate ggc ggc gtt cat 06 Leu Gly Hat Vai 8fy Sly Gly Ser Sly Ala Phe I le Gly Giy Vai His 20 25 30 ege atg gea gcg cgg ctc gac aat ege ttc gat ctc gtg gcg ggg gee 144 Arg ílet Ala Ala Arg leu Asp Asn Arg Phe Asp Leu Vai Ala Gly Ala 35 40 45 ctg tcc teg aca ccg gaa aaa tcc cta gct tcc ggg cgt gag ctg ggg 192 Leu Ser Ser Thr Pro 6lu Lys Ser Leu Ala Ser Siy Arg Siu Leu Giy SO 55 60 ctc gac tet gag cgt tgc tac ggc teg ttt gaa gaa atg gee gaa aaa 240 lau Âsp Ser Glu Arg Cys Tyr Sly Ser Phe Glu 6 Eu Bet Ala Glu Lys $5 70 75 80 gaa gcg ctg ege gag gat ggt ate gag gcg gtg gcg ate gtc acc ccc 288 Glu Ala Leu Arg Glu Asp Sly lie Glu Ata Vai Ala He Vai Thr Pro 85 $0 05 aac cat gtg cac tat ccc gct gea aag gee ttc ctg gag ege ggc ate 336 Asn His Vai Hís Tyr Pro Ala Ala Lys Ata Phe teu Glu Arg Gly Me 100 105 110 cat gtc ate tgc gac aag ccg ctg act tcc aat gaa gac gcg aaa 384 His Vai Me Cys Asp Lys Pro Leu Thr Ser Asn Leu Glu Asp Ala Lys MS 120 125 aag ctg aag gac gtg gee gat aag gee gat gcg ctg ttc ate ctg acg 432 Lys Leu Lys Asp Vaf Aia Asp Lys Ala Asp Aia Leu Phe Me Leu Thr 130 135 140 cat aac tac acc ggt tat CCS atg gtg cgf cat gcg ege gag ctg gtg 480 His Asn Tyr Thr Giy Tyr Pro Bet Vai Arg His Ala Arg Glu leu Vai 145 ISO 155 160 gag gee ggt gea ctc ggc aat ate cgt ctg gtg caa atg gaa tat ccg 528 Glu Ala Gly Aia leu Sly Asn He Arg Leu Vat Gin ttet Gfu Tyr Pro 165 170 175 cag gac tgg ctg acg gag gcg gtg gaa cag ace ggc gcg aaa cag gea 576 Gin Asp Trp Leu Thr Glu Aia Vai Glu Gin Thr Gly Ala Lys Gin Aia ISO 185 190 gtc tgg cgt acc gat ccg gee caa tet ggc gtt ggc ggt tcc acc ggt 624 Vaf Trp Arg Thr Asp Pro Ala Gin Ser Gly Vai Gly Giy Ser Thr Giy 195 200 205 gac ate ggc acc cat gee tat aat ctc ggc tgc ttc att tcc ggt ctc 672 Asp Me Gly Thr His Ala Tyr Asn Lau Gly Cys Phe He Ser Gly Leu 210 215 220 gaa gcg gat gag ctg gcg gcg gat gtg cat acc ttc gtc gaa ggc cgt 720 Siu Ala -Asp Glu Leu Ata Ala Asp Vai His Thr Phe Vai Glu Giy Arg 158 1188 370 375 380 tca ggc aag aag aat ggc ggc tgg gtg aag ctg taa Ser Gly Lys tys Asn Gty Gty Trp Vai lys Leu 385 390 395
<210> 6 <211> 395 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefacience <400> 6
Met Áia íie mu Gíy Lys Thr Thr Asp Vai Aia Asn Lys Arg } te Arg 1 5 10 15 Uu Gty $et Va! Siy Sly Gly Ser Gly Ata Phe Me Gty Gly Vat His 20 25 30 Arg Het Ala Ata Arg Leu Asp Asn Arg Phe Asp Leu Vat Ata Gty Ata 35 40 45 leu Ser Ser Thr Pre Glu Lys Ser Leu Ata Ser Qiy Arg 6tu Leu Gty 50 55 60 Leu Asp Ser Gtu Arg Cys Tyr Gly Ser Phe Gtu Gtu Met Ala Glu tys 65 70 75 SO mu Ala Leu Arg Gly Asp Gly lie 6ÍU Ata Vat Ata Me Vai Thr Pro A*—. m * 11^ t \±i — 05 T. - il. 11. 1 ... 90 11. rn_ . 1 . λ *... * .. ... 95 λ t. . * t .
Leu Glu Trp Thr 6ín Ata Asp Pro Asn Tyr leu Trp Phe Thr Lys leu 2SO 2S5 300 6ty Glu Pro Lys Gtn Leu lie Thr Arg Síy Síy Ata Síy AU Sly Aia 305 310 31S 320 Ala Ala Ala Arg Vsi Ihr Arg lie Pro Ser OSy Hts Pro GIíí Síy Tyr 325 330 335 leu Giu Aia Phe Ais Thr He Tyr Thr Oíu Ata Aia Hís Aia He Otu 340 345 350 Aís Arg Arg Thr Síy Ser Ais leu Asp Lys Aís Vai He Tyr Pro Thr 355 3S0 355 Vsi Asp Asp Sly Vai Lys 6iy Vaí Ais Phe Vai Thr Ata Cys He 8tu 370 375 380 Ser 0iy Lys Lys Asn Qiy Síy Trp Vai Lys Leu 385 390 38$ 160 <210> 7
<211> 1077 <212> ADN <213> Bacillus subtilis <22 0>
<221> CDS <222> (1).. (1077) <223> <400> 7
ttg ata acg ctt tta aag ggg aga aga aaa gtg gat acg ate aag gtt 48 Itet Me Thr leu leu lys ôfy Arg Arg lys Vai Asp Thr Me Lys Vai I 5 10 15 gga ata tta gga tac gga ttg tcc ggt tet gtt ttt cac ggg ccg ctg 96 Giy Ha leu Giy Tyr 6ly leu Ser Giy Ser Vai Phe His Siy Pro Leu 20 25 30 ctg gat gtt ctg gat gaa tat caa ate age aaa ate atg aca tea cgg 144 leu Asp Vai leu Asp Sltf Tyr Gin Ua Ser Lys Me Set Thr Ser Arg 35 40 45 aca gaa gaa gtg aaa cgg gat ttt oca gat gct gag gtt gta cat gag 192 Thr Giu Gki Vai lys Arg Asp Phe Pro Asp Aia Giu Vai Vai His Giu 50 55 60 ctt gaâ gaa ate aca aat gac cet gee att gag ctt gtc att gtc acc 240 leu Glu Giu Me thr Asn Asp Pro Ala Me Glu leu Vai Me Vai Thr 65 70 75 80 acc ccg age ggc ctt cat tac gag cat act atg gea tgc ata cag gee 288 Thr Pro Ser Giy leu His tyr Glu His Thr 8et Aia Cys Me Gin Aia 85 90 95 gga aaa cat gtt gtg atg gaa aaa cca atg aca gea acg gee gaa gag 336 6ly Lys Hís Va! Vai Hat Glu lys Pro Set Thr Ala Thr Aia Giu Giu 100 105 MO ggg gaa aca tta aaa agg gct gee Gly Giu Thr leu lys Arg Aia Ala 115 120 gta tat cat aac cga ege tgg gat Vai Tyr His Asn Arg Arg Trp Asp 130 135 ctg ate tet gag gga tcc ctt gaa leu i ia Ser Glu Giy Ser leu Giu 145 150 tat aac ege tac aga cet gaa gtt Tyr Asn Arg Tyr Arg Pro Giu Vai 165 ggc act gee act ggt acg ctg tat Õiy Thr Ala Thr Giy Thr Leu Tyr 160 caa acc ctg cat ttg ttt ggg atg 6ln Thr leu His leu Phe Giy Set 195 200 atg gee cag cgg gaa aat gee gaa 8et Ala Gin Arg Giu Asn Aia Giu 210 215 »4e itef »«<¥ ΛΛ 4 gat gaa aaa ggc gta tta tta age Asp Glu Lys Gly Vai Uu Leu Ser 125 aac gat ttt tta acg att aaa aag Asn Asp Phe Leu Thr He lys Lys 140 gat ate aat ÔC3 tat caa gtt tcc Asp Me Asn Thr Tyr Gin Vai Ser 155 160 caa gee cgg tgg cgg gaa aaa gaa Gin Ala Arg Trp Arg Giu Lys Giu 170 175 gat etc ggc tcc cac ate ata gac Asp leu Giy Ser His He He Asp ÍS5 190 cet aaa gee gtg act gea aac gtg Pro Lys Ala Vai Thr Ata Asn Vat 205 acg gtt gac tat ttt cat tta acc Thr Vai Asp Tyr Phe His leu Thr «*+ Ato 220 A. 384 432 480 528 576 624 672
<210> 8 <211> 358 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <4Ο0> 8
Met 1 i te Thr Leu Leu £ Lys Gíy Arg Arg Lys |rt Vat Asp Thr i te Lys fc Vai 1 6!y i te Leu 6!y Tyr Gty Leu Ser Gty IU Ser Vat Phe His Gty Pro Leu 20 25 30 leu Asp Vai Leu Asp Giu Tyr Gin i te Ser Lys tie Met Thr Ser Arg 35 40 45 Thr G!u Giu Vai lys Arg Asp Phe Pro Asp Ata Gtu Vai Vat His Giu 50 55 60 Leu ôiu Glu i te Thr Asn Asp Pro Ata t te Gtu Leu Vai t ie Vat Thr 65 70 75 80 Thr Pro Ser ôiy Leu His Tyr Giu His Thr Met Ata Cys t te Gin Ala 85 90 95 G iy lys Bis Vat Vai Met Gtu Lys Pro Met Thr Afa Thr Ata Giu Giu 100 105 HO GSy m u Thr teu Lys Arg Ata Aía Asp Gtu Lys Gly Vat Leu Leu Ser 115 120 125 Vai Tyr His Asn Arg Arg Trp Asp Asn Asp Phe Leu Thr t te Lys Lys lie Arg Siu 8iy Aia Ala leu Pro Vai Thr Ala 6iu 6lu Qly lie Asn 325 330 335
Vai He Arg He He δΙυ Ala Aia Met Giu Ser Ser lys Giu lys Arg 340 345 350
Thr He iet leu Giu His 355 <211> 1170 <212> ADN <213> Agrobacterium sp. <22 0> <221> CDS <222> (1).. (1170) <223> 163 <400> 9 atg tee tcc gea cca aaa aaa ttc gac age ege cgt ate Ggt etc gga 48 ííet Ser Ser Ala Pro Lys Lys Phe Asp Ser Arg Arg Me Arg Leu Gly 1 5 10 15 atg gte ggc ggc ggt cag ggc gee ttt ate ggt gcg gtg cac ege ata 95 mt Vai Gly Gly GSy 01o oiy Ata Phe 1 te Gly Ala Vai His Arg t le 20 25 30 gcg gee cgg ctg gat gac cgt tac gag etc gtg gee gga gcg ctt tee 144 Ala Ala Arg Leu Asp Asp Arg Tyr Glu Leu Vai Ala Giy Ala Leu Ser 35 40 45 tcc gat ccc gcg cgt gcg gee gct teg gea acc ctg etc ggc ate gcg 192 Ser Ase Pro Ata Arg Ata Ala Ata Ser Ata Thr Leu Leu Gly Me Ata 50 55 50 ccg gag cgt tcc tat gee tea ttc gag gag atg gct gcg gea gag gee 240 Pro Glu Arg Ser Tyr Ata Ser Phe Glu Glu Hat Ala Ala Ala Glu Ala 65 70 75 80 «t cga gac gac ggt ate gag gea gtc gee ate gtg acg ccc aat cac 288 Giy Arg Asp Asp Gly Me Glu Ala Vat Ata i la Vai Thr Pro Asn His 85 90 95 cte cat ttt gcg ccc tea aag gee ttt etc gag gee ggt att cac gtc 336 teu His Phe Ala Pro Ser Lys Ata Phe Leu Glu Ata Gly Me His Vai 100 105 110 ate tge gac aag cct Cte acc gcg aca ctt gag gaa gea aag gcg ctg 384 ile Cys Asp Lys Pro Vat Thr Ala Thr Leu Glu Glu Ata Lys Ala Leu 115 120 125 gee gag ate gtc agg gcg teg gac age ctg ttt gtc ctg acg cat aat 432 Ala 6iu Me Vai Arg Ala Ser Asp Ser Leu Phe Vat Leu Thr His Asn 130 135 140 tac acc ggc tac gee atg ctg cgg cag atg cgg cag atg gtg gct gat 480 lyr Th r 6ly Tyr Ala Hat Leu Arg Gin Met Arg Gin ílet Vat Ala Asp 145 150 155 160 gga gee att ggc aag ctg ege cac gtt cag gee gaa tat gee cag gac 528 Gly Ala Me Giy Lys leu Arg His Vai Gin Ala Glu Tyr Ala Gtn Asp 165 170 175 tgg ctg acc gag gcg gtt gag aag acc ggt gcg aag ggg gcg gaa tgg 576 Trp leu Thr Glu Ala Vai Glu lys Thr Gly Ala Lys Giy Ala Glu Trp 180 185 190 ege acc gat ccc age ege tcc ggc gcg ggc ggg gee ate ggc gat ate 624 Arg íhr Asp Pro Ser Arg Ser GSy Ala Gly Gly Ala Me Gly Asp Me 195 200 205 ggc acc cac gee ttc aac gct gee gee ttc gtt acc ggt gaa ate ccg 672 Gly Thr His Ala Phe Asn Ala Ala Ala Phe Vai Thr Gly Glu I te Pro 210 215 220 aag agt ctt tat gee gac ctg acc tet ttc gtg ccg ggc cgg cag ctg 720 Lys Ser leu lyr Ala Asp Leu Thr Ser Phe Vai Pro Gly Arg Gin leu 225 230 235 240 gat gac age gee aat att ctt ttg cgt tae gaa age ggc gee aag ggc 768 Asp Asp Ser Ala Asn Me Leu Leu Arg Tyr Glu Ser Gly Ala lys Gly 245 250 255 atg ctt tgg gea age cag ate gea gtc ggc aat gaa aac gcg ctg teg 816 UaS 1 ft>1 A U » 1 * A » ~ w-, t ΛΙι. « A.. AU t ... 164
<210> 10 <211> 389 <212> PRT <213> Agrobacterium sp. <4 0 0> 10 let Ser Ser Ata Pro lys lys Phe Asp Ser Arg Arg t te Arg leu Gty t 5 10 15 iet Vat Gíy Gíy Gíy Gin Gty Ata Phe 1 te Gíy Ata Vat His Arg t te 20 25 30 Aia Ata Arg leu Asp Asp Arg Tyr Glu leu Vat Ata Gty Aia leu Ser 35 40 45 Ser Asp Pro Ata Arg Ala Ala Ala Ser Ata Thr leu leu Gty l ie Ata 50 55 60 Pro Stu Arg Ser Tyr Ata Ser Phe mu Giu ttet Ata Ata Ata Glu Ata e§ 70 75 80 Gty Arg Asp Asp Gty 1 te 6iu Ala Vat Ata t te Vat Thr Pro Asn His 85 90 §5 leu His Phe Ata Pro Ser lys Ala Phe leu Giu Ata Gty I le His Vat 100 105 110 1 te Cys Asp Lys Pro Vai Thr Ala Thr leu Glu Gtu Ata lys Ala leu A I ^ 115 u* 1 L ^ ^ Ai,. t.. 120 í . .. a . . nt. . <* . i 125 » fi. >1' . 165
Tyr Arg 6lu AU Afa Asp Ata He He Ata lys Arg Giu Gíy lys Ala 340 34S 350
Aja Ata 6fy SSu Vat He Tyr Pro 6ty fet 6iu Asp Gly Leu Aía Sly 355 360 365
Leu Ala Phe ISe Asp Ala Ata Vai Arg Ser Ser Gin Thr Ser Thr Trp 370 375 380
He Asn tle Asp 1 le 385
<212> ADN <213> Agrobacterium sp. <22 0>
<221> CDS <222> (1).. (1188) <223> 166 <4 Ο 0> 11 ate gct att gaa gga aag aca aec gac aag gcg aac aag cgg att cgc 48 «et Ala lie Glu Gly Lys Thr Thr Asp Lys Ala Asn lys Arg He Arg 1 5 10 15 96 etc ggc atg gtg ggc gft ggt tet ggt gee ttt ate ggt ggt gtt esc teu Gly «et Vai Oiy Gly Gly Ser Gly Ala Phe tte Gty Gty Vai His 20 25 30 144 cgc atg gcg gcg cgg ctc gac aat cgt tte gat etc gtg gea ggg gcg Arg «et Ala Ala Arg leu Asp Asn Arg Phe Asp Leu Vai Ata Gly Ala 35 40 45 i AO ctg tet tcg ÔCC ccg gaa aaa tec ctc gee tce ggc cgt gaa ctg ggg 192 leu Ser Ser Thr Pro Glu lys Ser leu Ala Ser Gly Arg Giu leu Gly 50 55 60 240 ctc gat ccc m cgt tgc tac ggc tcg tte gag gag atg gee gaa aag leu A$p Pro Gíu Arg Cys Tyr Gly Ser Phe Giu Giu «et Ala Giu lys 65 70 75 80 2 88 gag gcg cta cgc gag gat ggc ata gag gcg gtg gcg ate gtc acg ccc ÔÍU Ala leu Arg Giu Asp Oiy lie Olu Ata Vai Ala Me Vai Thr Pro 85 90 95 336 aac C3C gtg cat tat ccg gcg gcg aag gcg ttt ctg gag cgt ggc ate Asn His Vai His Tyr Pro Ala Ala lys Ala Phe Leu Glu Arg Gly ! le 100 105 110 cat gtc ate tgc gac aag ccg ctg aec tce aat ctg gaa gac gcg aag 384 His Vai 11« Cys Asp lys Pro Leu Thr Ser Asn Leu Giu Asp Ala lys tis 120 125 aag ctg aag gac gtc gee gac aag gee gat gcg ctg tte ate ctg acg 432 Lys leu lys Asp Vai Ata Asp lys Ala Asp Ala leu Phe Me Leu Thr 130 135 140 cat aat tae acc ggc tat ccg atg gtg Cgg cat gea cgg gaa ctg gtg 480 His Asn Tyr Thr Gly Tyr Pro «et Vat Arg Hjs Ais Arg Giu leu Vai 145 150 155 160 gaa tcg ggc gct ctc ggc acg ate cgt ctg gtg cag atg gag tat ccg 528 Giu Ser Gty Aia leu Oiy Thr 1 íe Arg Leu Vai Gin Set Glu Tyr Pro 165 170 175 cag gac tgg ctg gcg gaa ccc ate gag cag acg ggc gee aaa cag gct 5?Ç Gin Asp Trp leu Ala Giu Pro Me Glu Gin Thr Gly Ata Lys Gin Ala 180 185 190 gtc tgg cgc acc gac ccg gee caa tcc ggt gcg ggt ggt tcc aca ggc 624 Vai Trp Arg Thr Asp Pro Ala Gin Ser Gly Aia Gty Gty Ser Thr Gty 195 200 205 gat ate ggc acg cat gee tat aat ctc ggc tgc tte att tcc ggt ctg 672 Asp Me Gly Thr His Aia Tyr Asn leu Gly Cys Phe tíe Ser Gly leu 210 215 220 gaa gtc gac gaa ctg gcg gea gat gtg cat acc ttt gtc gaa ggc cgc 720 Giu Vai Asp Giu leu Ata Aia Asp Vai His Thr Phe Va i Glu Gly Arg 225 230 235 240 cgg ctg gac gac aat gcg cat gtg atg ctg cgt tte aag ocg «*g ggt 768 Arg Leu Asp Asp Asn Ais His Vai «et Leu Arg Phe lys Pro lys Gly 245 250 265 mu» Λ + # 4** " .w4* oic
<210> 12 <211> 395 <212> PRT <213> Agrobacterium sp. <4 0 0> 12
Met Ala He Glu Gly Lys Thr Thr Asp lys Ala Asn Lys Arg He Arg 1 5 10 15 Leu Giy Mèt Vaf Gly Gly Gly Ser Gly Ala Phe t le Gly Gly Vai His 20 25 30 Arg Set Ala Ala Arg leu Asp Asn Arg Phe Asp Leu Vai Ala Gly Ala 35 40 45 Leu Ser Ser Thr Pro Glu Lys Ser Leu Ala Ser Gly Arg Glu Leu Gly 50 55 60 Leu Asp Pro Glu Arg Cys Tyr Gly Ser Phe Glu Glu Set Ata Glu lys 65 70 75 80 Glu Ala Leu Arg Glu Asp Gly 1 le Glu Ala Vai Ata He Vai Thr Pro 85 90 95 Âsn His Vai His Tyr Pro Ala Ala lys Ala Phe Leu Glu Arg Gly He »nn tns ffO 168
Ala A!a Ais Arg Vai Thr Arg 325 teu βlu Ala Phe Ala Thr fie 3«
Afa Arg Arg Thr GΪy Ser Vai 355
Vai Asp Asp 6ly Vai Lys SÍy 370 375
Ser 6ly lys Lys Asn 61 y Vai 385 390
<210> 13 <211> 1059 <212> ADN 1 íe Pro Ser Gly His Pro Oiti 6iy Tyr 330 335 Tyr Thr Olu Ala Ala His Ala He 6iu 345 350 Leu Asp Lys Ala Vai f te Tyr Pro Thr 360 365 Vai Ala Phe Vai Thr Ala Cys He 6!u 380
Trp Vai lys Leu 395 169 <213> Xanthomonas campestris pv. campestris <220>
<221> CDS <222> (D · · (1059) <223> <400> 13 atg cct aaa coe ttc aat Ctg gee gtc gtc gge tat gge tat gtt gge 48 «et Pro Lys Pro Phe Asn Leu Aia Vai Vai Gty Tyr Gty Tyr Vai Gty 1 5 ÍO 15 ege acc ttc cac gea ccg ctg ate gee age acg ccc gge ctg cag ttg 96 Are Thr Phe His Aia Pro Leu He Aia Ser Thr Pro Siy teu Gin Leu 20 25 30 ca c age gtg gtg teg tcc asg ecg cag caa ccg cag gcg gac ttc ege 144 Hi$ Ser Vai Vai Ser Ser Lys Pro Oin Gin Pro Gin Aia Asp Phe Arg 3$ 40 45 gag gtg ege gtg ctg ccc gac ctg gag gct gea ctg gee gac ccg gcg 192 Giu Vai Arg Vai Leu Pro Asp Leu Giu Ata Aia leu Aia Asp Pro Aia 50 55 60 ctg gat gcg gtg gtc ate gee 3Cg ccc aae cag acc cat gcg ccc atg 240 leu Αερ Aia Vaí Vai He Aia Thr Pro Asn Gin Thr His Aia Pro ítet €5 70 75 80 gcg ctg cag gea ctg gcg gee gge aag cac gtg ctg gtg gat aaa ccc 28$ Ai 3 Leu Siri Aia Leu Aia Ala Giy Lys His Vai leu Vaí Asp Lys Pro $5 00 95 ttc gee ctg gat gee gea cag gct ege acc gtg gtg gac gee gee gea 336 Phe Aia Leu Asp AJa Ata Gin Aia Arg Thr Vai Vai Asp Ata Aia Aia )00 105 HO eag gee gge aag stc gtc age gtg ttc cag aae ege cgt tgg gat gcg 384 Giu Ala Síy Lys Me Vai Ser Vat Phe Gin Asn Arg Arg Trp Asp Aia I1S 120 125 gac ttc etc acc gtg cgg ege ttg ate gaa gac gge caa ctg gge gag 432
Asp Phe leu Thr Vaí Arg Arg Leu He no 135 gtg gtg gag ttc cat teg eae ttc gac Vai Vai Giu Phe His Ser His Phe Asp 145 150 gac ege tgg ege gaa age gat ate ccc Asp Arg Trp Arg Giu Ser Asp He Pro 165 ctg ggg ccg cat ctg ctg gac cag gcg leu Siy Pro His Leu leu Asp Gin Ata 180 185 cag gcg ate age gea gac Ctg cag ege 6in Aia He Ser Aia Asp Leu Gin Arg 195 200 gac gat tac ttc aae gtg gtg ctg ege Asp Asp Tyr Phe Asn Vai Vaí Leu Arg 210 215 ctg cac gee gge teg ctg gtg gee gac leu His Aia Síy Ser leu Vai Ala Asp 225 230 cac gge acg ege gge age tat etc aag Riw Thr A ro Riu w Tvr t «Ml 1 vs*
Glu Asp Giy Gin leu Giy Giu 140 cgg tat ege ecg cag gtg ege 480 Arg Tyr Arg Pro Gin Vai Arg 155 160 gge gee ggg ctg tgg tac gac 528 Giy Ala Giy Leu Trp Tyr Asp 170 175 ttg cag ttg ttc gge atg ccg 576 leu Gin leu Phe Giy 8et Pro 190 cag ege acc cag gcg ege age 624 Gin Arg Thr Gin Aia Arg Ser 205 tat ccc ege ttg cgg gtg ate $72 Tyr Pro Arg Leu Arg Vai He 220 gge age ctg ege ttc gee gtg 720 Síy Ser Leu Arg Phe Ala Vai 235 240 768 cat gge gee gat acg cag gaa Riu Aerv Thr «ir* Ri**
<210> 14 <211> 352 <212> PRT <213> Xanthomonas campestris ρν. campestris <4 0 0> 14
Met Pro Lys Pro Phe Asn leu Aia Vai Vaí Gly Tyr Gly Tyr Vai Giy I 5 10 15 Arg thr Phe His Ata Pro Leu Ue Aia Ser Thr Pro Gly Leu Gin teu 20 25 30 Hts Ser Vai Vai Ser Ser Lys Pro 61 n Gin Pro Gin Ala Asp Phe Arg 35 40 4$ filu Vai Arg Vai leu Pro Asp leu Giu Aia Aia Leu Aia Asp Pro Aia 50 55 60 Leu Asp Ala VaJ Vai He Ala Thr Pro Asn Gin Thr His Ala Pro Met 65 70 75 80 Ala Leu Gin Afa Leu Ala Ala Gly Lys Hts Vai Leu Vai Asp Lys Pro 85 §0 95 Phe Ala Leu Asp Ala Ala Gin Ala Arg Thr Vai Vai Asp Ala Aia Aia 100 Í05 110 Glu Ala Gly Lys He Vaí Ser Vai Phe Gin Asn Arg Arg Trp Asp Aia 115 120 125 Asp Phe Leu Thr Vai Arg Arg Leu He Giu Asp Gly Gin Leu Gly Giu 171 <210> 15 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 15 172 34 cattcaagct taatgagagg caatgacatg agcg <210> 16 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 16 tcggaattct tcatgcaagg cacaaagtcg c 31 <210> 17 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 17 ggcggatcct ttgaaaggga tagtcatgtc ct 32 <210> 18 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador 173 <400> 18 attggaagct tcgattggct gcgacctag <210> 19 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 19 ttgggatcct ttcaggggaa atattatggc <210> 20 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 20 gccgcaagct tgttttacag cttcac <210> 21 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial 174 <22 0> <223> iniciador <400> 21 aggaattcga tgataacgct tttaaagggg agaa 34 <210> 22 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 22 tttctgcagt ttagtgctcc agcataatgg ttcg 34 <210> 23 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 23 tcggaattcg cgttgcggtg aatcgttttc aatg 34
<210> 24 <211> 34 <212> ADN 175 <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 24 ataagaagct tgctcagtcg ctgctgttgc cttc 34 <210> 25 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 25 ttgggatccg atgagtttac gtattggcgt aattg 35 <210> 26 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 26 aaactgcagt tagttttgaa ctgttgtaaa agattgata 39 <210> 27 <211> 1179 176 <212> ADN <213> Acetobacter sp. <22 0>
<221> CDS <222> (1).. (1179) <223> <400> 27 atg acc aaa cgt aaa ttg cgc att ggc ctg att ggc agt ggg ttc atg 48 ííet Thr Lys Arg Lys Uu Arg t le Giy teu Me 6íy Ser 6!y phe líet * S 10 is ggg cgc acc cac gcc ttt ggc tat tca acc gcg tcc cgt gtg ttt gat 96
Gly Arg Thr His Ala Phe Gly Tyr Ser Thr Ala Ser Arg Vai Ph8 Asp
20 25 3Q ctt ccg ttt C8g ccg gag cíg acg tgc ctg gct gat att tcc gat gaa 144
Leu Pro Phe Gin Pr o Glu Leu Thr Cys Leu Ala Asp He Ser Asp Glu 35 40 45 gct gca gcg aag gcg gcg gat gct ctg gga ttt gcc cgt tcc acc agt 192
Alã Ala Ala Lys Ala Ala Asp Ala Leu Giy Phe Ala Arg Ser Thr Ser 50 55 60 gac tgg cgt acg ctc gtc aac gat cct gaa att gat gtg gtg aat ate 240
Asp Trp Arg Thr Leu Vai Asn Asp Pro Gfu lie Asp Vai Vai Asn He 65 70 75 80 acg gcg cct aat gcc ttt cat aaa gaa atg gcg tta gca gcg att gct 288
Thr Ala Pro Asn Ala Phe Hís Lys Glu Set Ala teu Ala Ala lie Ata 85 90 95 gcg ggc aag cat gtc tat tgt gaa aag ccc ctt gcg eca ctt gca gcc 336
Ata Gly Lys Hís Vai Tyr Cys Glu Lys Pro Leu Ata Pro Leu Ala Ala 100 105 H0 gat gct cgc gaa atg gca gaa gcg gct gag gca aag ggc gta aaa aea 384 gcc Ctt gca acg gct gaa ttt ctt atg ggg cct gcc gca ggc gct ate 624 Ala teu Aía Thr Ala Giu Phe Leu Set Giy Pro Ata Ale Giy At a lie 1S5 200 205 acg cag gtg atg ggg gst tgt gtg acg gtc ate aeg acg cgg ccg gat 672 Thr Gin Vai Set Giy Asp Cys Vai Thr Vai lie Lys Thr Arg Pro Asp 210 215 220 |gt m ggl gga acg cgg get gta gaa gtg gac gat att gge cgc gcg 720 Giy Lys Giy Giy Thr Arg Ala Vai Giu Vai Asp Asp I le Giy Arg Ala 225 230 235 240 ctt ctg cgc ttt gag 331 ggg gcg aeg gga teg gtt gag gga aac tgg 768 Ua teu Arg Phe Giu Asn Gty Aía Thr Giy Ser Vai 61« Giy Asn Trp 245 250 255 stt gct acc ggc cgc acc atg cag cat gac ttt gag gta tae ggc aca 816 1 Se Ais Thr Giy Arg Thr Set Gin His Asp Phe Giu Vai Tyr Giy Thr 260 265 270 aaa ggt gca ctt gcc ttt set cag caa cga ttt aac gag ttg cat ttc 864 lys Gty Ala Leu Ala Phe Thr Gin Gin Arg Phe Asn Gtu teu His Phe 275 280 285 ttc tca age acc gat gea cgc ggc cgc aaa ggg ttc cgg cgt att gaa 912 Phe Ser Ser Thr A$p Aía Arg Giy Arg lys Gty Phe Arg Arg íle Giu 290 295 300 gcg gga cca gag cat gcg ccc tat ggc Ctg ttc tgc gtg gea ecg ggg 960 Ata Giy Pro Gtu His Aía Prc Tyr Giy Leu Phe Cys Vai Ata Pro Gty
<210> 28 <211> 392 <212> PRT <213> Acetobacter sp. <400> 28
Set Thr Lys Arg Lys Leu Arg Me Gly Leu Me Gíy Ser Gly Phe 8et
1 5 10 15 Gly Arg Thr His Ala Phe Gly Tyr Ser Thr Ala Ser Arg Vai Phe Asp 20 25 30 Leu Pro Phe Gin Pro Giu teu Thr Cys Leu Ala Asp Me Ser Asp Glu 35 40 45 Ata Ala Ala Lys Ata Ala Asp Ala Leu Gly Phe Ala Arg Ser Thr Ser SO 55 60 Asp Trp Arg Thr Leu Vai Asn Asp Pro Gtu Me Asp Vai Vai Asn Me 65 ?0 75 80 Thr Ala Pro Asn Ala Phe Hís Lys Glu Set Ala Leu Ala Ala He Aia 85 00 95 Ala Sly Lys His Vai Tyr Cys Glu Lys Pro leu Aia Pro Leu Ala Aia 100 105 110 Asp Ala Arg m Met Ala Giu Ata Ala Glu Aia Lys Gly Vat lys Thr 115 120 125 Gin Vai siy Phe Asn Tyr Leu Cys Asn Pro Set Leu Ala Leu Ala Arg 130 135 140 Asp (fet Me Ata Ala Gly Gtu Leu Gly Giu Me Arg Gly Tyr Arg Gly 145 150 155 160 Leu Hís Ala Glu Asp Tyr Set Ala Asp Ala Ser Ser Pro Phe Thr Phe tfiR no 1*K 179 385 3S0 <210> 29 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <22 0> <221> misc feature 180 <222> (9). (15) <223> n=a. t. g ou c <22 0> <221> misc feature <222> (18). (27) <223> n=inosina <4 0 0> 29 32 atgaarcgna arytncgnat yggyytnaty gg 32 <210> 30 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <22 0> <221> <222> caracteristicas variadas <223> <22 0> n=a, t, g ou c <221> caracteristicas variadas <222> (18) (24) <223> n=inosina <4 0 0> 30 32 ggyttyatgg gycgnacnca ygcnttyggy <210> 31 181 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 31 ggyttrtcrm mgayracrtg rstrcc 26 <210> 32 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <22 0> <221> caracteristicas variadas <222> (7). (17) <223> n=inosina <4 0 0> 32 artgwrnrtg rttgggngt 19 <210> 33 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador 182 <4Ο0> 33 gctcgtcaac gatcctgaaa ttgat 25 <210> 34 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 34 ttcgctgcag cttcatcgga aatat 25 <210> 35 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 35 cccttcaatt tccgggcggg t 21 <210> 36 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador 183 <4Ο0> 36 gctggatccc gcccttattg tgaata 26 <210> 37 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 37 tatgaattcg ttatgccttc tcatgctgtc g 31
Lisboa, 14 de Maio de 2010. 184
Claims (6)
- REIVINDICAÇÕES 1. Processo para produzir cilo-inositol caracterizado pelo facto de compreender: permitir que um microrganismo capaz de converter mio-inositol em cilo-inositol e pertencendo ao género Acetobacter reaja com mio-inositol numa solução contendo mio-inositol para produzir e acumular cilo-inositol na solução; e recolher o cilo-inositol da solução.
- 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a solução que contém o mio-inositol ser um meio liquido contendo mio-inositol e por se deixar o microrganismo reagir com mio-inositol fazendo uma cultura do microrganismo no meio liquido.
- 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se deixar reagir as células obtidas, por meio da cultura do microrganismo com mio-inositol na solução.
- 4. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o microrganismo ser um microrganismo que pertence a Acetobacter cerevisiae ou Acetobacter malorum.
- 5. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o microrganismo ser a estirpe AB10281 (FERM B.P-10119) de Acetobacter sp. ou uma estirpe mutante daquela. 1
- 6. Estirpe AB10281 (FERM BP-10119) de Acetobacter sp. ou uma para estirpe que é mutante dela com uma capacidade converter mio-inositol em cilo-inositol. Lisboa, 14 de Maio de 2010. 2
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003353491 | 2003-10-14 | ||
| JP2003353490 | 2003-10-14 | ||
| JP2004018128 | 2004-01-27 | ||
| JP2004194088 | 2004-06-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT1674578E true PT1674578E (pt) | 2010-05-21 |
Family
ID=34437726
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT80199870T PT2058390E (pt) | 2003-10-14 | 2004-10-14 | Processo para a produção de cilo-inositol |
| PT04817164T PT1674578E (pt) | 2003-10-14 | 2004-10-14 | Processo para a produção de cilo-inositol |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT80199870T PT2058390E (pt) | 2003-10-14 | 2004-10-14 | Processo para a produção de cilo-inositol |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7745671B2 (pt) |
| EP (3) | EP1674578B1 (pt) |
| JP (3) | JP4526485B2 (pt) |
| KR (3) | KR101314079B1 (pt) |
| AT (1) | ATE458042T1 (pt) |
| CA (3) | CA2542560C (pt) |
| DE (1) | DE602004025596D1 (pt) |
| DK (2) | DK1674578T3 (pt) |
| ES (2) | ES2341964T3 (pt) |
| PT (2) | PT2058390E (pt) |
| WO (1) | WO2005035774A1 (pt) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7521481B2 (en) | 2003-02-27 | 2009-04-21 | Mclaurin Joanne | Methods of preventing, treating and diagnosing disorders of protein aggregation |
| ZA200704872B (en) * | 2004-11-17 | 2008-12-31 | Mclaurin Joanne | Compositions comprising scyllo-inositol derivatives and methods to treat disorders of protein aggregation |
| JP4761763B2 (ja) * | 2004-12-16 | 2011-08-31 | 北興化学工業株式会社 | ホウ酸選択的結合物質およびホウ酸の除去又は回収方法 |
| JP4659545B2 (ja) * | 2005-07-20 | 2011-03-30 | 北興化学工業株式会社 | シロ−イノソースの製造方法 |
| WO2007119108A2 (en) * | 2005-10-13 | 2007-10-25 | Waratah Pharmaceuticals Inc. | Inositol derivatives and their uses in the treatment of diseases characterized by abnormal protein folding or aggregation or amyloid formation, deposition, accumulation or persistence |
| US20070197452A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-08-23 | Mclaurin Joanne | Treatment of amyloid-related diseases |
| CA2642647A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-11-15 | Joanne Mclaurin | Compositions and methods for treatment of disorders of protein aggregation |
| WO2007101353A1 (en) * | 2006-03-09 | 2007-09-13 | Waratah Pharmaceuticals Inc. | A cyclohexane polyalcohol formulation for treatment of disorders of protein aggregation |
| US20110028719A1 (en) * | 2006-05-19 | 2011-02-03 | Jacek Slon-Usakiewicz | Screening methods for amyloid beta modulators |
| JP5101841B2 (ja) * | 2006-06-15 | 2012-12-19 | オルガノ株式会社 | 高分子多孔質体の製造方法 |
| US20100173960A1 (en) * | 2006-09-21 | 2010-07-08 | Antonio Cruz | The Combination of a Cyclohexanehexol and a NSAID for the Treatment of Neurodegenerative Diseases |
| JP2010510254A (ja) * | 2006-11-24 | 2010-04-02 | ワラタ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | アルツハイマー病および関連の神経変性疾患のための併用処置 |
| EP2114151A4 (en) * | 2007-03-01 | 2010-03-17 | Concourse Health Sciences Llc | INOSITOL NIACINATE ISOMERS AND USES THEREOF |
| US20110105626A1 (en) * | 2007-04-12 | 2011-05-05 | Mclaurin Joanne | Use of cyclohexanehexol derivatives for the treatment of polyglutamine diseases |
| US20100331267A1 (en) * | 2007-04-12 | 2010-12-30 | Mclaurin Joanne | Use of cyclohexanehexol derivatives in the treatment of alpha-synucleinopathies |
| ES2425264T3 (es) * | 2007-04-12 | 2013-10-14 | Waratah Pharmaceuticals, Inc. | Uso de derivados de ciclohexanohexol en el tratamiento de enfermedades oculares |
| US20100144891A1 (en) * | 2007-04-12 | 2010-06-10 | Mclaurin Joanne | Use of cyclohexanehexol derivatives in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis |
| WO2010040232A1 (en) * | 2008-10-09 | 2010-04-15 | Waratah Pharmaceuticals Inc. | Use of scyllo-inositols for the treatment of macular degeneration-related disorders |
| US8962287B2 (en) * | 2008-10-31 | 2015-02-24 | National University Corporation Kobe University | Scyllo-inositol-producing cell and scyllo-inositol production method using said cells |
| US8372367B2 (en) * | 2009-10-26 | 2013-02-12 | Emc Metals Corporation | System and method for recovering boron values from plant tailings |
| AU2011215616A1 (en) * | 2010-02-15 | 2012-09-06 | Transition Therapeutics Ireland Limited | Process for the preparation of scyllo-Inositol |
| WO2012051395A1 (en) | 2010-10-13 | 2012-04-19 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of synthesis of scyllitol and related compounds |
| JP2014515408A (ja) | 2011-06-03 | 2014-06-30 | エラン ファーマシューティカルズ，リミティド ライアビリティー カンパニー | 行動及び精神障害の治療のためのシロ−イノシトール |
| US9505795B2 (en) | 2012-02-02 | 2016-11-29 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Method for producing scyllo-inositol |
| KR102017776B1 (ko) * | 2012-12-17 | 2019-09-03 | 주식회사 디와이내츄럴 | 휴면 세포 전환법을 이용한 ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법 |
| US10017537B2 (en) * | 2013-04-15 | 2018-07-10 | Korea Institute Of Science And Technology | Peptide selectively binding to graphitic materials and volatile organic compounds |
| EP3085782B1 (en) * | 2013-12-16 | 2019-08-14 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | 2-deoxy-scyllo-inosose reductase |
| WO2017029353A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Transition Therapeutics Ireland Limited | Treatment of behaviors in dementia patients |
| CN114181045B (zh) * | 2021-12-02 | 2024-04-26 | 吉林海资生物工程技术有限公司 | 一种球形无水肌醇的制备方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3405663A1 (de) | 1984-02-17 | 1985-08-22 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren zur herstellung von scyllo-inosit |
| DE3642999A1 (de) | 1986-12-17 | 1988-06-30 | Merck Patent Gmbh | Scyllo-inositverbindungen |
| JP2984043B2 (ja) | 1990-09-18 | 1999-11-29 | 旭化成工業株式会社 | ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
| JPH05192163A (ja) | 1991-09-30 | 1993-08-03 | Suntory Ltd | イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子 |
| JP3251976B2 (ja) | 1992-06-23 | 2002-01-28 | 旭化成株式会社 | ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを生産する実質上純粋な微生物 |
| US5412080A (en) | 1993-08-25 | 1995-05-02 | President And Fellow Of Harvard College | Enterobactin compounds |
| JP3630344B2 (ja) * | 1995-11-17 | 2005-03-16 | 北興化学工業株式会社 | イノシトール立体異性体の製造方法 |
| JP3944333B2 (ja) * | 1999-06-25 | 2007-07-11 | 北興化学工業株式会社 | Ｄ−キロ−イノシトールの新規製造方法 |
| JP3981597B2 (ja) * | 2001-06-25 | 2007-09-26 | 北興化学工業株式会社 | シロ−イノソースの製造法及びシロ−イノシトールの製造法 |
-
2004
- 2004-10-14 KR KR1020127019981A patent/KR101314079B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2004-10-14 DK DK04817164.9T patent/DK1674578T3/da active
- 2004-10-14 US US10/576,030 patent/US7745671B2/en active Active
- 2004-10-14 DE DE602004025596T patent/DE602004025596D1/de active Active
- 2004-10-14 EP EP04817164A patent/EP1674578B1/en active Active
- 2004-10-14 WO PCT/JP2004/015174 patent/WO2005035774A1/ja active Application Filing
- 2004-10-14 DK DK08019987.0T patent/DK2058390T3/da active
- 2004-10-14 EP EP10182641A patent/EP2298870A1/en not_active Withdrawn
- 2004-10-14 CA CA2542560A patent/CA2542560C/en active Active
- 2004-10-14 PT PT80199870T patent/PT2058390E/pt unknown
- 2004-10-14 PT PT04817164T patent/PT1674578E/pt unknown
- 2004-10-14 KR KR1020107026017A patent/KR101173148B1/ko active IP Right Grant
- 2004-10-14 AT AT04817164T patent/ATE458042T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-10-14 KR KR1020067009224A patent/KR101191675B1/ko active IP Right Grant
- 2004-10-14 ES ES04817164T patent/ES2341964T3/es active Active
- 2004-10-14 CA CA2852842A patent/CA2852842A1/en not_active Abandoned
- 2004-10-14 EP EP08019987A patent/EP2058390B1/en active Active
- 2004-10-14 CA CA2774930A patent/CA2774930C/en active Active
- 2004-10-14 ES ES08019987T patent/ES2404554T3/es active Active
- 2004-10-14 JP JP2005514651A patent/JP4526485B2/ja active Active
-
2010
- 2010-02-25 US US12/712,635 patent/US8409833B2/en active Active
- 2010-04-02 JP JP2010086459A patent/JP5122599B2/ja active Active
-
2012
- 2012-07-19 JP JP2012160384A patent/JP5674724B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-03-08 US US13/791,172 patent/US8715974B2/en active Active
-
2014
- 2014-03-25 US US14/224,645 patent/US20140322775A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PT1674578E (pt) | Processo para a produção de cilo-inositol | |
| EP0029329B1 (en) | Enzyme inhibitor produced by cultivation of a streptomyces microorganism, a process for producing it and a culture of the microorganism | |
| KR101395971B1 (ko) | 1,2-프로판디올의 발효에 의한 생산을 위한 기질로서의 수크로스의 사용 | |
| KR20140143109A (ko) | 타가토스의 제조방법 | |
| EP2357222A1 (en) | Scyllo-inositol-producing cell and scyllo-inositol production method using said cells | |
| JP4333088B2 (ja) | グルコノバクター属細菌の新規遺伝子及び目的物質の製造法 | |
| CN100513574C (zh) | 鲨肌醇的制备方法 | |
| US7365192B2 (en) | Preparation method of valienamine from acarbose and/or acarbose derivatives using trifluoroacetic acid | |
| KR101282331B1 (ko) | 신규한 라이보스-6-인산 이성화효소 또는 그 돌연변이체에 의한 알로스 생산 | |
| PT91171B (pt) | Processo para obtencao, isolamento e purificacao de epidermina | |
| JP5856402B2 (ja) | ラフィノースの精製方法 | |
| KR20120058473A (ko) | 신규한 라이보스-6-인산 이성화효소 또는 그 돌연변이체에 의한 알로스 생산 | |
| JP2002281986A (ja) | エリスロース還元酵素、その遺伝子、並びに該遺伝子を導入した細胞 | |
| JPS6232199B2 (pt) |