JP4410914B2 - Ｌ−キロ−１−イノソースの新規製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、安価なミオ−イノシトール（myo-Inositol）を原料として用い、それ自体が生物活性を有して且つ医薬等の合成用の原料として価値の高いＬ−キロ−１−イノソース（L-chiro-1-Inosose）を、化学合成工程を経ず、微生物の作用下に一段階で製造する新規な方法に関する。さらに、本発明はミオ−イノシトールからＬ−キロ−１−イノソースを生産できる新規な微生物にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミオ−イノシトールは次の平面式（Ａ）
または次の立体構造式（Ａ′）
で表される天然に産する既知の物質である。
【０００３】
また、Ｌ−キロ−１−イノソースは次の平面式（Ｂ−１）
あるいは次の平面式（Ｂ−１′)
または次の立体構造式（Ｂ−２)
あるいは次の立体構造式（Ｂ−２′)
で表される既知の物質である。
【０００４】
なお、Ｌ−キロ−１−イノソースには、式（Ｂ−１）または式（Ｂ−２）で表されてジメチルスルホキシド(DMSO)中で安定であるケトン型構造の化合物と、式（Ｂ−１′）または式（Ｂ−２′）で表されて水溶液中で安定である水和物型構造の化合物とがあることが知られる（例えば「Carbohydr. Res.」76巻121-130頁(1979)および「J. Med. Chem.」36巻3628-3635頁(1993)参照)。
【０００５】
イノソース（Inososes、Pentahydroxycyclohexanones、Alicyclic ketohexoses)は、一般的には、イノシトールの微生物的酸化（A. J. Kluyver ＆ A. B.oezaardt : 「Rec. Trav. Chim.」58巻、956頁、1939年)、酵素的酸化（L. Anderson et al. : 「Arch. Biochem. Biophys.」78巻、518頁、1958年）、白金触媒を用いた空気酸化（K. Heyns and H. Paulsen :「Chem. Ber.」86巻、833頁、1953年）、硝酸等の酸化剤による酸化（T. Posternak : 「Helv. Chim. Acta」19巻、1333頁、1936年)によって合成されることが知られている。
【０００６】
イノシトールのうち、ミオ−イノシトールの微生物的酸化あるいは酵素的酸化で生成するイノソースは、これまでシロ−イノソース（別名：ミオ−２−イノソース）（A. J. Kluyver ＆ A. Boezaardt : 「Rec. Trav. Chim.」58巻、956頁、1939年)、L. Anderson et al. : 「Arch. Biochem. Biophys.」78巻、518頁、1958年)と、Ｌ−エピ−２−イノソース（特願平11-159861号)のみに限られる。ミオ−イノシトールを酸化してＬ−キロ−１−イノソースを生成する能力または活性をもつ微生物はこれまで報告されていない。
【０００７】
上記の式（Ｂ−２）あるいは式（Ｂ−２′）で表されるＬ−キロ−１−イノソースは、式（Ａ）あるいは式（Ａ′）で表されるＤ−ミオ−イノシトールの３位の水酸基が化学的に活性なオキソ基に置換された構造を有している。Ｌ−キロ−１−イノソースは、近年において動物細胞内に存在することが明らかになっている〔M. Whitman等：「Nature」332巻、644頁、1988年〕。Ｌ−キロ−１−イノソースは、その構造上の特性から、機能解明が旺盛に進行しているフォスファチゾルイノシトール−３−リン酸およびイノシトールリン脂質３キナーゼ、あるいはフォスファチジルイノシトール３キナーゼ等ならびにこれらに関連する酵素の研究ツールとして有用な３−置換−１Ｄ−ミオ−イノシトールの合成のための原料となり得ると考えられる〔S. C. Johnson等：「J. Med. Chem.」36巻、3628頁、1993年およびA. P. Kozikowski等 : 「J. Am. Chem. Soc.」112巻、4528頁、1990年〕。また、Ｌ−キロ−１−イノソースはそれ自体が、フォスファチゾルイノシトール合成酵素を弱いながらも阻害する活性をもつという報告がある〔S. C. Johnson等 : 「J. Med. Chem.」36巻、3628頁、1993年〕。また、Ｌ−キロ−１−イノソースは、Ｄ−キロ−イノシトール（略号：DCI）の合成の原料として有用である(米国特許第5,406,005号)。このDCIはインシュリン抵抗性糖尿病(PCT国際公開WO90/10439号公報)、あるいは多嚢胞性卵巣症候群の改善薬〔J. E. Nestler等 : 「NEW Engl. J. Med.」 340巻、1314頁、1999年〕としての利用が期待されている。
【０００８】
上記のＬ−キロ−１−イノソースの化学合成的な製法としては、(1) Ｌ−キロ−１−イノシトールを酸化白金触媒の存在下、空気酸化を行った後、適当な単離工程を経てＬ−キロ−１−イノソースを取得するという報告がある〔T. Posternak : 「Helv. Chim. Acta」29巻、1991頁、1946年〕。また、(2) Ｌ−キロ−イノシトールにブロミン(臭素)を作用させ、適当な単離工程を経てＬ−キロ−１−イノソースを取得するという報告がある〔A. T. Fatiadi : 「Carbohydrate Res.」8巻、135頁、1968年〕。(3) Ｄ−グルクロン酸を出発原料にして化学合成したグルコジアルドースを、アシロイン縮合すると生成する化合物の一つとしてＬ−キロ−１−イノソースが合成されるという報告がある（米国特許第5,406,005号)。これら既知のすべての合成方法の特徴の一つは、必要とされる出発原料が全て光学活性体であることである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら既知であるＬ−キロ−１−イノソースの製造方法は、いずれも工業的規模で実施する方法としては、操作の煩雑さ、環境への影響あるいはコスト面で問題があり、これら従来法は必ずしも満足し得るものではない。従って、工業規模で簡便に且つ効率よくＬ−キロ−１−イノソースを製造でき新しい方法が要望されている。本発明は、このような要望に合致した種々の利点を有してＬ−キロ−１−イノソースを効率良く製造できる新しい方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねてきた。その結果、安価に入手できるミオ−イノシトールに対して、本発明者等により土壌から分離された細菌の新しい菌株であるキサントモナス・エスピーAB10198株を水性の反応媒質中で作用させると、式（Ａ）または式（Ａ′）で表されるミオ−イノシトールの３位の水酸基のみをほぼ選択的に酸化（または脱水素）できて、式（Ｂ−１）あるいは式（Ｂ−１′）、または式（Ｂ−２）あるいは式（Ｂ−２′）で表されるＬ−キロ−１−イノソースが生成することを見出した。この生成されたＬ−キロ−１−イノソースを単離し、核磁気共鳴スペクトル装置、質量分析装置、旋光度計などにより機器分析を実施した結果、この物質は光学純度の高いＬ−キロ−１−イノソースであることが判明した。
【００１１】
更に、ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースに変換できる活性または能力を有する微生物を広く自然界から探索したところ、グラム陰性細菌、例えばシュードモナダセア（Pseudomonadaceae）科のキサントモナス（Xanthomonas）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、およびアセトバクテラセア（Acetobacteraceae）科のアセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、およびリゾビアセア（Rhizobiaceae）科のアグロバクテリウム（Agrobacterium）属、およびエンテロバクテリアセア（Enterobacteriacea）科のエルウィニア（Erwinia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、セラチア（Serratia）属、エルシニア（Yersinia）属、およびパステウレアセア（Pasteurellaceae）科のパステウレラ（Pasteurella）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属等に属するところの分類学的に広範な範囲のグラム陰性細菌のうちに、上記のミオ−イノシトールを酸化してＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる活性または能力を有する菌株が存在することが明らかになった。これらの中でも、ミオ−イノシトールを酸化してＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる高い活性または能力を有する菌株の例として、具体的には、上記のキサントモナス・エスピーAB10198株があり、またこれ以外に、土壌から新たに本発明者等が分離した細菌の新しい菌株であるスフィンゴモナス・エスピーAB10233株があげられる。
【００１２】
上記した知見に基づいて、Ｌ−キロ−１−イノソースの新しい製造方法が本発明では後記のとおり工夫された。すなわち、ミオ−イノシトールならびに通常の炭素源および窒素源を含有する液体培地、あるいは通常の炭素源を特に含有しないでミオ−イノシトール（これの一部が炭素源になる）と窒素源（窒素源が有機質の窒素源である場合、これの一部も培養条件によっては炭素源になる）とを含有する液体培地中で上記のキサントモナス・エスピーAB10198株あるいは、スフィンゴモナス・エスピーAB10233株、等を好気的に培養すると、これにより得られた培養液中で、ミオ−イノシトールからＬ−キロ−１−イノソースを生成させ且つこれを蓄積するようにしてＬ−キロ−１−イノソースを効率良く製造できることが知見された。また、本発明によるＬ−キロ−１−イノソースの新しい製造方法では、得られた培養液中に蓄積したＬ−キロ−１−イノソースは培養液から使用微生物の菌体の除去後に、得られた培養上清液を陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂等のイオン交換樹脂処理あるいは活性炭処理あるいは結晶化操作にかけることにより、あるいはこれら処理の組合せにかけることにより、高純度なＬ−キロ−１−イノソースとして効率良く回収できることが知見された。
【００１３】
従って、第１の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる能力を有する微生物を、ミオ−イノシトールに作用させて、前記ミオ−イノシトールのＬ−キロ−１−イノソースへの変換によりＬ−キロ−１−イノソースを生成することから成ることを特徴とする、Ｌ−キロ−１−イノソースの製造方法が提供される。
【００１４】
本発明方法で使用されるミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる能力を有する微生物は細菌であることができ、また特にグラム陰性細菌であることができる。
【００１５】
本発明方法で使用されるミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる能力を有する微生物は具体的には、グラム陰性細菌であって、シュードモナダセア（Pseudomonadaceae）科のキサントモナス（Xanthomonas）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属またはシュードモナス（Pseudomonas）属の細菌；およびアセトバクテラセア（Acetobacteraceae）科のアセトバクター（Acetobacter）属または、グルコノバクター（Gluconobacter）属の細菌；およびリゾビアセア（Rhizobiaceae）科のアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細菌、およびエンテロバクテリアセア（Enterobacteriacea）科のエルウィニア（Erwinia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、セラチア（Serratia）属またはエルシニア（Yersinia）属の細菌；およびパステウレアセア（Pasteurellaceae）科のパステウレラ（Pasteurella）属またはヘモフィルス（Haemophilus）属の細菌から選ばれるグラム陰性細菌であるのが好ましい。
【００１６】
本発明の方法は、具体的には、以下に示す（Ａ）及び（Ｂ）の２つの実施法で行うことができる。
【００１７】
第１の実施法（Ａ）は、要約すると、上記のミオ−イノシトールを酸化によりＬ−キロ−１−イノソースに変換できる能力または活性を有する微生物を、ミオ−イノシトール並びに炭素源および窒素源を含有する液体培地で好気的に培養して、その培養液中にＬ−キロ−１−イノソースを生成および蓄積させる工程と、得られた培養液から菌体を除去する工程と、得られた培養上清液から、イオン交換樹脂処理、活性炭処理または結晶化操作あるいはそれらの処理などの組合せにより、Ｌ−キロ−１−イノソースを回収する工程とを含む方法である。
【００１８】
次に、本発明方法の第１の実施法（Ａ）を詳しく説明する。
実施法（Ａ）では、先づミオ−イノシトールおよび栄養源を含む液体培地に、所要の変換能を有する微生物を接種して好気的に培養し、それにより、培養液中にＬ−キロ−１−イノソースを生成蓄積させる第１工程が行われる。
【００１９】
この第１工程で用いる液体培地の組成は、目的に達する限り何ら特別の制限はなく、ミオ−イノシトールを含み且つ炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよい。合成培地・天然培地のいずれも使用できる。用いる培地は、炭素源としては、ミオ−イノシトールを0.1％〜30％、より好ましくは15〜25％含有し、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を0.01％〜1.0％、好ましくは0.05％〜0.5％含有するのが望ましい。有機質の栄養源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸等を適当量（0.05％から５％）で含有するのが望ましい。その他必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。培養液の水素イオン濃度はpH４〜10、好ましくはpH５〜９に調整して微生物を培養すると、効率よくミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースに変換できる。
【００２０】
培養条件は、用いる菌株や培地の種類によっても異なる。培養温度は５〜40℃、好ましくは20〜37℃である。また、培養は液体培地を振盪したり、液体培地中に空気を吹き込むなどして好気的に行うのが好ましい。培養期間は培養液中にミオ−イノシトールが完全に消失し、且つ、Ｌ−キロ−１−イノソースが最大の蓄積量を示すまでの期間であるのが良く、通常１〜14日、好ましくは３〜10日である。
【００２１】
次に、得られた培養液から菌体を除去する工程が行われるが、遠心分離法応用できる。
培養上清液から目的物を採取する工程がその後に行われる。これには、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、培養液から菌体を除去した後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、Ｌ−キロ−１−イノソース以外の不純物をほとんど除くことができる。しかし、強塩基性陰イオン交換樹脂のOH-型はＬ−キロ−１−イノソースを化学変化させるので使用することはできない。このようにして、Ｌ−キロ−１−イノソースを専ら含む上清液が得られる。その後、該上清液を濃縮乾固させ、目的物質を粉末として単離することができる。また、再結晶等の方法を用いることにより、さらに高純度の目的物質を単離することができる。
【００２２】
より具体的には、Ｌ−キロ−１−イノソースが蓄積した培養上清液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）C-20(H+型)の充填カラムに通過させて通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併し、その合併された水溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）A-368S（遊離塩基型）の充填カラムに通過させ通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、ここで得られた通過液及び洗浄液を合併して、Ｌ−キロ−１−イノソースを含む且つそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を収得するのが好ましい。この水溶液を減圧下に濃縮、乾固すると、ほぼ純粋なＬ−キロ−１−イノソースの白色粉末を得ることができる。
【００２３】
本発明方法の第２の実施法（Ｂ）は、要約すると、上記の変換能を有する微生物を培養する工程と、得られた培養物から該微生物の菌体を分離する工程と、該菌体を、溶解されたミオ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地に加える工程と、該緩衝液または液体培地中で菌体をミオ−イノシトールと反応させ、得られた反応液中にＬ−キロ−１−イノソースを生成させる工程と、反応液中に生成蓄積させたＬ−キロ−１−イノソースを反応液から、イオン交換樹脂処理、活性炭処理または結晶化操作あるいはそれらの処理などの組合せにより、回収する工程を含む方法である。
【００２４】
次に、本発明方法の第２の実施法（Ｂ）を詳しく説明する。
実施法（Ｂ）では、先づ、所要の変換能を有する微生物を培養する工程が行われる。次いで、得られた培養液から菌体を分離する工程が行われる。集菌すなわち菌体の分離は、培養液から遠心分離、濾過等公知の方法により行えばよい。
【００２５】
菌体としては、実施法（Ａ）により得た培養液から分離して集めた菌体を用いてもよい。また、前記微生物を別途に適当な培養条件で培養して得た菌体を用いてもよい。
【００２６】
得られた菌体をミオ−イノシトールと反応させる工程が更に行われる。この工程では、反応媒質として、液体培地、緩衝液が用いられる。液体培地としては、実施法（Ａ）で用いた培地と同様のものを用いてもよく、あるいは別途に前記微生物を培養した液体培地をそのまま用いても良い。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド（Good's）のCHES緩衝液などを10〜500mM、好ましくは20〜100mMの濃度で用いるのがよい。液体培地また緩衝液に溶解されたミオ−イノシトールの溶液中のミオ−イノシトール濃度は0.1〜30％程度とするのが好ましい。
【００２７】
反応条件は、用いる菌株や培地、緩衝液の種類によって異なる。反応温度は５〜60℃、好ましくは10〜45℃であり、反応時間は１〜50時間、好ましくは３〜48時間であり、液体培地または緩衝液のpH２〜10、好ましくは３〜９である。
反応終了後には、得られた培養液または反応液から菌体を分離する工程が行われる。さらに、得られた培養上清液または反応液ろ液からＬ−キロ−１−イノソースを回収する工程が行われる。目的物質を単離する方法は実施法（Ａ）と同様に行えばよい。
【００２８】
本発明方法において使用する微生物は、ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースに変換する能力または活性を有する微生物であればいずれの菌株でも使用できる。具体的に例示すると、前述したようにミオ−イノシトールからＬ−キロ−１−イノソース生産できる能力を有する細菌は多種存在するが、例えば本発明者らが分離した前記のAB10198株およびAB10233株は、本発明方法に最も有効に使用される菌株の例である。これら２つの菌株の菌学的性質を後記の表1a、表1b、表1cに記載した。
【００２９】
なお、これら菌株の同定の当たっては、新細菌培地学講座（第２版、近代出版）、医学細菌同定の手引き（第２版、近代出版）、細菌学実習提要（丸善）に準じて実験を行い、そして得られた実験結果を「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）１巻、1984年及び「Microbiology and Immunology」34巻、99頁、1990年、「International J. Systematic Bacteriology」45巻、334頁、1995年等に掲載されている最近の学術論文を参考に判断して、細菌の同定を行った。
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【００３３】
AB10198株の主な性状は、次のとおりである。本菌株はコロニーが黄色の色素を帯びるグラム陰性の桿菌で、大きさは0.3〜0.5×0.5〜1.6μｍ。本菌株はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であり、グルコースを好気的に分解し酸を生成する。本菌株は栄養要求性があり、最少培地にメチオニンを添加すると本菌株は良好に生育する。本菌株の細胞のユビキノン分子種はQ8で、DNAのGC含量は65％であった。
【００３４】
これらの菌学的性質を総合して、本菌株はAB10198株は、キサントモナス（Xanthomonas）属に属する菌株であると判断した。「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）１巻、199頁、1984年によると、キサントモナス属細菌には５種のスペシーズ（キサントモナス・カンペストリス；キサントモナス・フラガリアエ；キサントモナス・アルブリネンス；キサントモナス・アキソノポディス；キサントモナス・アメリザ）が知られている。AB10198株の菌学的性状を上記の既知のスペシーズと比較検討した結果、AB10198株はキサントモナス・カンペストリスに最も近縁の種とであると考えられた。しかし、本菌株の菌学的性質はキサントモナス・カンペストリスに完全には一致しなかったので、本AB10198株を公知のものと区別するため、キサントモナス・エスピーAB10198株と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究にFERM P-17893として、寄託した（寄託日は2000年6月12日）。
【００３５】
また、AB10233株の主な性状は次のとおりである。本菌株はコロニーが淡黄色の色素を帯びるグラム陰性の桿菌で、大きさは0.4〜0.8×0.4〜1.6μｍ。本菌株はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であり、グルコースを好気的に分解し酸を生成する。最少培地での本菌株の生育は良好で、栄養要求性が無い。細胞のユビキノン分子種はQ10で、DNAのGC含量は64％であった。また、菌体脂肪酸に２−ヒドロキシ−テトラデカン酸を有し、更に菌体脂質としてスフィンゴ脂質を有していた。これらの菌学的性質を総合すると、本菌株は「Microbiology and Immunology」34巻、99頁、1990年、「International J. Systematic Bacteriology」45巻、334頁、1995年等に記載されているスフィンゴモナス（Sphingomonas）属に最も近縁な細菌であると考えられる。スフィンゴモナス属は上記論文(「Microbiology and Immunology」34巻、99頁、1990年）において初じめて新属として提唱され、現在まで少くとも１２種が提案されている。しかし、AB10233株は、その菌学的性質においてそれらに完全には合致しなかったので、本菌株を公知のものと区別するため、スフィンゴモナス・エスピーAB10233と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17894として寄託した（寄託日は2000年6月12日）。
【００３６】
上記のAB10198株およびAB10233株は、上記のように有用であって新規な微生物である。従って、第２の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17893の受託番号で寄託されたキサントモナス（Xanthomonas）・エスピーAB10198株が提供される。
【００３７】
また、第３の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17894の受託番号で寄託されたスフィンゴモナス（Sphingomonas）・エスピーAB10233株が提供される。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、医農薬合成原料として有用な純度の高いＬ−キロ−１−イノソースを工業的生産の規模レベルで安価に且つ効率よく簡便に製造することができる。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を実施例について具体的に説明する。
実施例１
本発明の実施法（Ａ）によるＬ−キロ−１−イノソースの製造例（１）
（１）Ｌ−キロ−１−イノソースの生成（第１例）
ミオ−イノシトール 15.0％（総量150ｇ）、酵母エキス 0.375％、
（NH4)2SO4 0.1％、K2HPO4 0.18％、KH2PO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.01％を含むpH７の液体培地１リットル（L)を、100mlずつ500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌された液体培地を含む各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーAB10198株（FERM P-17893）を接種し、27℃で５日間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（8,000rpm、20分間）し、上清を培養上清液として得た。
【００４０】
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−キロ−１−イノソースが141mg/mlの濃度で生成していることがわかった。これは、Ｌ−キロ−１−イノソースへのミオ−イノシトールの変換率が95％であることを示す。
【００４１】
なお、この時の培養液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。上記で生成されたＬ−キロ−１−イノソースの変換率は、次の計算式により求めた。
【００４２】
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム：Wakosil 5NH2 : 4.6×250mm
カラム温度 : 20℃
検出器 : RI DETECTER ECR-7515A (ERMA CR. INC.)
注入量 : 20μｌ
溶媒 : アセトニトリル−水＝４：１
溶出時間 : Ｌ−キロ−１−イノソース ; 16.5分
【００４３】
（２）Ｌ−キロ−１−イノソースの生成（第２例）
ミオ−イノシトール 20.0％（総量200ｇ）、グルコース 0.5％、酵母エキス 0.45％、（NH4)2SO4 0.1％、K2HPO4 0.18％、KH2PO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.01％を含むpH７の液体培地１リットルを、100mlずつ500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。さらにオートクレーブ滅菌が終了した各フラスコにグルコースが0.5％濃度になるようにグルコースを追加した。各々の三角フラスコにスフィンゴモナス・エスピーAB10233株（FERM P-17894）を接種し、27℃で６日間振とう培養した。培養液を遠心分離（8,000rpm、20分間）し、上清を培養上清液として得た。
【００４４】
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−キロ−１−イノソースが196mg/mlの濃度で生成している(Ｌ−キロ−１−イノソースへのミオ−イノシトールの変換率99％）ことがわかった。この時の培養液中にミオ−イノシトール及びグルコースは検出されなかった。
なお、上記のＬ−キロ−１−イノソースの変換率は、上記の計算式により求めた。
【００４５】
（３）Ｌ−キロ−１−イノソースの回収と単離
実施例１（１）で得た培養上清液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）C-20(H+型) 150mlを充填したカラム(内径3.5cm、長さ30cm)に通過させた。その後このカラムに200mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。ここで得られたカラム通過液及び洗浄液を合併し、その合併した水溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）A-368S（遊離塩基型）400mlを充填したカラム(内径５cm、長さ50cm)に通過させた。その後このカラムに500mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。
【００４６】
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併した水溶液中には上記Ｌ−キロ−１−イノソースが含有され、それ以外の不純物はほとんど存在していなかった。
【００４７】
上記により得たＬ−キロ−１−イノソース水溶液を減圧下で濃縮乾固したところ、ほぼ純粋な精製品のＬ−キロ−１−イノソースの白色粉末135ｇを得た（通算収率82％）。
【００４８】
なお、上記したＬ−キロ−１−イノソースの通算収率は次の計算式により求めた。
【００４９】
実施例２
本発明の実施法（Ａ）によるＬ−キロ−１−イノソースの製造例（２）
（１）種培養物の調製
ミオ−イノシトール 2.0％、酵母エキス 0.2％、（NH4）2SO4 0.1％、
K2HPO4 0.7％、KH2PO4 0.2％、MgSO4・7H2O 0.01％を含むpH７の液体培地100mlを500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌された液体培地を含む各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーAB10198株（FERM P-17893）を接種し、27℃で１日間振とう培養した。得られた培養液を種培養物とした。
【００５０】
（２）４Ｌ容ジャーファーメンターによるＬ−キロ−１−イノソースの製造
ミオ−イノシトール 15.0％（総量375ｇ）、酵母エキス 0.375％、（NH4)2SO4 0.1％、K2HPO4 0.18％、KH2PO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.01％を含むpH７の液体培地2.5リットルを、４Ｌ容ジャーファーメタンーに分注し、オートクレーブ滅菌した。このジャーファーメンターに導入された液体培地に対して、キサントモナス・エスピーAB10198株の、上記（１）で調製した種培養物25mlを接種した。この時、培養温度は27℃、通気量は1vvm、回転数は200rpmで培養を好気的に実施した。培養は３日間行い、培養期間中のpHを5M NaOH水溶液及び3M 塩酸でpH７±0.2に自動調整した。４日間培養後の培養液を遠心分離（8,000rpm、20分間）し、上清を培養上清液として得た。
【００５１】
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより前記と同様の条件で分析した。この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−キロ−１−イノソースが138mg/mlの濃度で生成しているＬ−キロ−１−イノソースへの(ミオ−イノシトールの変換率93％）ことがわかった。
【００５２】
培養上清液からのＬ−キロ−１−イノソースの回収と単離は、実施例１（３）に記載した方法に準じて行い、としてＬ−キロ−１−イノソースの精製品の289ｇ（通算収率78％）を得た。
【００５３】
なお、上記のＬ−キロ−１−イノソースの変換率は、上記の実施例１（１）に準じて求め、また通算収率は次の計算により求めた。
【００５４】
実施例３
本発明の実施法（Ｂ）によるＬ−キロ−１−イノソースの製造例
（１）菌体の生産
ミオ−イノシトール 0.5％、（NH4)2SO4 0.1％、K2HPO4 0.7％、KH2PO4 0.2％、MgSO4・7H2O 0.01％を含むpH７の液体培地２Ｌ(リットル)を500ml容のバッフル付き三角フラスコに10mlずつ分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌された培地を含む各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーAB10198株を接種し、27℃で３日間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を得た。得られた菌体を0.05M リン酸緩衝液（pH7.0)200mlで洗浄後、再度遠心分離し、洗浄菌体を得た。
【００５５】
（２）Ｌ−キロ−１−イノソースの製造
上記により得られた洗浄菌体30ｇを、溶解されたミオ−イノシトール４ｇを含有した0.05M リン酸緩衝液（pH7.0）400ml(ミオ−イノシトール濃度10mg/ml)中に加えた。得られた混合物を、30℃、24時間緩やかにスターラーで攪拌しながら菌体をミオ−イノシトールに反応させた。反応終了後、反応液から菌体を除き、こうして得た反応液ろ液を液体クロマトグラフィーにより分析したところ、生成されたＬ−キロ−１−イノソースが7.5mg/mlの濃度で生成され(Ｌ−キロ−１−イノソースのミオ−イノシトールの変換率75.8％)蓄積していた。反応液ろ液からのＬ−キロ−１−イノソースの回収と単離は、実施例１（３）に記載した方法に準じて行い、精製品のＬ−キロ−１−イノソースを白色粉末として2.8g(収率70％）を得た。
なお、上記のＬ−キロ−１−イノソースの変換率は、上記実施例１（１）の計算式にて求め、また収率は次の計算式により求めた。
【発明の属する技術分野】
本発明は、安価なミオ−イノシトール（myo-Inositol）を原料として用い、それ自体が生物活性を有して且つ医薬等の合成用の原料として価値の高いＬ−キロ−１−イノソース（L-chiro-1-Inosose）を、化学合成工程を経ず、微生物の作用下に一段階で製造する新規な方法に関する。さらに、本発明はミオ−イノシトールからＬ−キロ−１−イノソースを生産できる新規な微生物にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミオ−イノシトールは次の平面式（Ａ）
【０００３】
また、Ｌ−キロ−１−イノソースは次の平面式（Ｂ−１）
【０００４】
なお、Ｌ−キロ−１−イノソースには、式（Ｂ−１）または式（Ｂ−２）で表されてジメチルスルホキシド(DMSO)中で安定であるケトン型構造の化合物と、式（Ｂ−１′）または式（Ｂ−２′）で表されて水溶液中で安定である水和物型構造の化合物とがあることが知られる（例えば「Carbohydr. Res.」76巻121-130頁(1979)および「J. Med. Chem.」36巻3628-3635頁(1993)参照)。
【０００５】
イノソース（Inososes、Pentahydroxycyclohexanones、Alicyclic ketohexoses)は、一般的には、イノシトールの微生物的酸化（A. J. Kluyver ＆ A. B.oezaardt : 「Rec. Trav. Chim.」58巻、956頁、1939年)、酵素的酸化（L. Anderson et al. : 「Arch. Biochem. Biophys.」78巻、518頁、1958年）、白金触媒を用いた空気酸化（K. Heyns and H. Paulsen :「Chem. Ber.」86巻、833頁、1953年）、硝酸等の酸化剤による酸化（T. Posternak : 「Helv. Chim. Acta」19巻、1333頁、1936年)によって合成されることが知られている。
【０００６】
イノシトールのうち、ミオ−イノシトールの微生物的酸化あるいは酵素的酸化で生成するイノソースは、これまでシロ−イノソース（別名：ミオ−２−イノソース）（A. J. Kluyver ＆ A. Boezaardt : 「Rec. Trav. Chim.」58巻、956頁、1939年)、L. Anderson et al. : 「Arch. Biochem. Biophys.」78巻、518頁、1958年)と、Ｌ−エピ−２−イノソース（特願平11-159861号)のみに限られる。ミオ−イノシトールを酸化してＬ−キロ−１−イノソースを生成する能力または活性をもつ微生物はこれまで報告されていない。
【０００７】
上記の式（Ｂ−２）あるいは式（Ｂ−２′）で表されるＬ−キロ−１−イノソースは、式（Ａ）あるいは式（Ａ′）で表されるＤ−ミオ−イノシトールの３位の水酸基が化学的に活性なオキソ基に置換された構造を有している。Ｌ−キロ−１−イノソースは、近年において動物細胞内に存在することが明らかになっている〔M. Whitman等：「Nature」332巻、644頁、1988年〕。Ｌ−キロ−１−イノソースは、その構造上の特性から、機能解明が旺盛に進行しているフォスファチゾルイノシトール−３−リン酸およびイノシトールリン脂質３キナーゼ、あるいはフォスファチジルイノシトール３キナーゼ等ならびにこれらに関連する酵素の研究ツールとして有用な３−置換−１Ｄ−ミオ−イノシトールの合成のための原料となり得ると考えられる〔S. C. Johnson等：「J. Med. Chem.」36巻、3628頁、1993年およびA. P. Kozikowski等 : 「J. Am. Chem. Soc.」112巻、4528頁、1990年〕。また、Ｌ−キロ−１−イノソースはそれ自体が、フォスファチゾルイノシトール合成酵素を弱いながらも阻害する活性をもつという報告がある〔S. C. Johnson等 : 「J. Med. Chem.」36巻、3628頁、1993年〕。また、Ｌ−キロ−１−イノソースは、Ｄ−キロ−イノシトール（略号：DCI）の合成の原料として有用である(米国特許第5,406,005号)。このDCIはインシュリン抵抗性糖尿病(PCT国際公開WO90/10439号公報)、あるいは多嚢胞性卵巣症候群の改善薬〔J. E. Nestler等 : 「NEW Engl. J. Med.」 340巻、1314頁、1999年〕としての利用が期待されている。
【０００８】
上記のＬ−キロ−１−イノソースの化学合成的な製法としては、(1) Ｌ−キロ−１−イノシトールを酸化白金触媒の存在下、空気酸化を行った後、適当な単離工程を経てＬ−キロ−１−イノソースを取得するという報告がある〔T. Posternak : 「Helv. Chim. Acta」29巻、1991頁、1946年〕。また、(2) Ｌ−キロ−イノシトールにブロミン(臭素)を作用させ、適当な単離工程を経てＬ−キロ−１−イノソースを取得するという報告がある〔A. T. Fatiadi : 「Carbohydrate Res.」8巻、135頁、1968年〕。(3) Ｄ−グルクロン酸を出発原料にして化学合成したグルコジアルドースを、アシロイン縮合すると生成する化合物の一つとしてＬ−キロ−１−イノソースが合成されるという報告がある（米国特許第5,406,005号)。これら既知のすべての合成方法の特徴の一つは、必要とされる出発原料が全て光学活性体であることである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら既知であるＬ−キロ−１−イノソースの製造方法は、いずれも工業的規模で実施する方法としては、操作の煩雑さ、環境への影響あるいはコスト面で問題があり、これら従来法は必ずしも満足し得るものではない。従って、工業規模で簡便に且つ効率よくＬ−キロ−１−イノソースを製造でき新しい方法が要望されている。本発明は、このような要望に合致した種々の利点を有してＬ−キロ−１−イノソースを効率良く製造できる新しい方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねてきた。その結果、安価に入手できるミオ−イノシトールに対して、本発明者等により土壌から分離された細菌の新しい菌株であるキサントモナス・エスピーAB10198株を水性の反応媒質中で作用させると、式（Ａ）または式（Ａ′）で表されるミオ−イノシトールの３位の水酸基のみをほぼ選択的に酸化（または脱水素）できて、式（Ｂ−１）あるいは式（Ｂ−１′）、または式（Ｂ−２）あるいは式（Ｂ−２′）で表されるＬ−キロ−１−イノソースが生成することを見出した。この生成されたＬ−キロ−１−イノソースを単離し、核磁気共鳴スペクトル装置、質量分析装置、旋光度計などにより機器分析を実施した結果、この物質は光学純度の高いＬ−キロ−１−イノソースであることが判明した。
【００１１】
更に、ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースに変換できる活性または能力を有する微生物を広く自然界から探索したところ、グラム陰性細菌、例えばシュードモナダセア（Pseudomonadaceae）科のキサントモナス（Xanthomonas）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、およびアセトバクテラセア（Acetobacteraceae）科のアセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、およびリゾビアセア（Rhizobiaceae）科のアグロバクテリウム（Agrobacterium）属、およびエンテロバクテリアセア（Enterobacteriacea）科のエルウィニア（Erwinia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、セラチア（Serratia）属、エルシニア（Yersinia）属、およびパステウレアセア（Pasteurellaceae）科のパステウレラ（Pasteurella）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属等に属するところの分類学的に広範な範囲のグラム陰性細菌のうちに、上記のミオ−イノシトールを酸化してＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる活性または能力を有する菌株が存在することが明らかになった。これらの中でも、ミオ−イノシトールを酸化してＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる高い活性または能力を有する菌株の例として、具体的には、上記のキサントモナス・エスピーAB10198株があり、またこれ以外に、土壌から新たに本発明者等が分離した細菌の新しい菌株であるスフィンゴモナス・エスピーAB10233株があげられる。
【００１２】
上記した知見に基づいて、Ｌ−キロ−１−イノソースの新しい製造方法が本発明では後記のとおり工夫された。すなわち、ミオ−イノシトールならびに通常の炭素源および窒素源を含有する液体培地、あるいは通常の炭素源を特に含有しないでミオ−イノシトール（これの一部が炭素源になる）と窒素源（窒素源が有機質の窒素源である場合、これの一部も培養条件によっては炭素源になる）とを含有する液体培地中で上記のキサントモナス・エスピーAB10198株あるいは、スフィンゴモナス・エスピーAB10233株、等を好気的に培養すると、これにより得られた培養液中で、ミオ−イノシトールからＬ−キロ−１−イノソースを生成させ且つこれを蓄積するようにしてＬ−キロ−１−イノソースを効率良く製造できることが知見された。また、本発明によるＬ−キロ−１−イノソースの新しい製造方法では、得られた培養液中に蓄積したＬ−キロ−１−イノソースは培養液から使用微生物の菌体の除去後に、得られた培養上清液を陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂等のイオン交換樹脂処理あるいは活性炭処理あるいは結晶化操作にかけることにより、あるいはこれら処理の組合せにかけることにより、高純度なＬ−キロ−１−イノソースとして効率良く回収できることが知見された。
【００１３】
従って、第１の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる能力を有する微生物を、ミオ−イノシトールに作用させて、前記ミオ−イノシトールのＬ−キロ−１−イノソースへの変換によりＬ−キロ−１−イノソースを生成することから成ることを特徴とする、Ｌ−キロ−１−イノソースの製造方法が提供される。
【００１４】
本発明方法で使用されるミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる能力を有する微生物は細菌であることができ、また特にグラム陰性細菌であることができる。
【００１５】
本発明方法で使用されるミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる能力を有する微生物は具体的には、グラム陰性細菌であって、シュードモナダセア（Pseudomonadaceae）科のキサントモナス（Xanthomonas）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属またはシュードモナス（Pseudomonas）属の細菌；およびアセトバクテラセア（Acetobacteraceae）科のアセトバクター（Acetobacter）属または、グルコノバクター（Gluconobacter）属の細菌；およびリゾビアセア（Rhizobiaceae）科のアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細菌、およびエンテロバクテリアセア（Enterobacteriacea）科のエルウィニア（Erwinia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、セラチア（Serratia）属またはエルシニア（Yersinia）属の細菌；およびパステウレアセア（Pasteurellaceae）科のパステウレラ（Pasteurella）属またはヘモフィルス（Haemophilus）属の細菌から選ばれるグラム陰性細菌であるのが好ましい。
【００１６】
本発明の方法は、具体的には、以下に示す（Ａ）及び（Ｂ）の２つの実施法で行うことができる。
【００１７】
第１の実施法（Ａ）は、要約すると、上記のミオ−イノシトールを酸化によりＬ−キロ−１−イノソースに変換できる能力または活性を有する微生物を、ミオ−イノシトール並びに炭素源および窒素源を含有する液体培地で好気的に培養して、その培養液中にＬ−キロ−１−イノソースを生成および蓄積させる工程と、得られた培養液から菌体を除去する工程と、得られた培養上清液から、イオン交換樹脂処理、活性炭処理または結晶化操作あるいはそれらの処理などの組合せにより、Ｌ−キロ−１−イノソースを回収する工程とを含む方法である。
【００１８】
次に、本発明方法の第１の実施法（Ａ）を詳しく説明する。
実施法（Ａ）では、先づミオ−イノシトールおよび栄養源を含む液体培地に、所要の変換能を有する微生物を接種して好気的に培養し、それにより、培養液中にＬ−キロ−１−イノソースを生成蓄積させる第１工程が行われる。
【００１９】
この第１工程で用いる液体培地の組成は、目的に達する限り何ら特別の制限はなく、ミオ−イノシトールを含み且つ炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよい。合成培地・天然培地のいずれも使用できる。用いる培地は、炭素源としては、ミオ−イノシトールを0.1％〜30％、より好ましくは15〜25％含有し、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を0.01％〜1.0％、好ましくは0.05％〜0.5％含有するのが望ましい。有機質の栄養源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸等を適当量（0.05％から５％）で含有するのが望ましい。その他必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。培養液の水素イオン濃度はpH４〜10、好ましくはpH５〜９に調整して微生物を培養すると、効率よくミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースに変換できる。
【００２０】
培養条件は、用いる菌株や培地の種類によっても異なる。培養温度は５〜40℃、好ましくは20〜37℃である。また、培養は液体培地を振盪したり、液体培地中に空気を吹き込むなどして好気的に行うのが好ましい。培養期間は培養液中にミオ−イノシトールが完全に消失し、且つ、Ｌ−キロ−１−イノソースが最大の蓄積量を示すまでの期間であるのが良く、通常１〜14日、好ましくは３〜10日である。
【００２１】
次に、得られた培養液から菌体を除去する工程が行われるが、遠心分離法応用できる。
培養上清液から目的物を採取する工程がその後に行われる。これには、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、培養液から菌体を除去した後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、Ｌ−キロ−１−イノソース以外の不純物をほとんど除くことができる。しかし、強塩基性陰イオン交換樹脂のOH-型はＬ−キロ−１−イノソースを化学変化させるので使用することはできない。このようにして、Ｌ−キロ−１−イノソースを専ら含む上清液が得られる。その後、該上清液を濃縮乾固させ、目的物質を粉末として単離することができる。また、再結晶等の方法を用いることにより、さらに高純度の目的物質を単離することができる。
【００２２】
より具体的には、Ｌ−キロ−１−イノソースが蓄積した培養上清液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）C-20(H+型)の充填カラムに通過させて通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併し、その合併された水溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）A-368S（遊離塩基型）の充填カラムに通過させ通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、ここで得られた通過液及び洗浄液を合併して、Ｌ−キロ−１−イノソースを含む且つそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を収得するのが好ましい。この水溶液を減圧下に濃縮、乾固すると、ほぼ純粋なＬ−キロ−１−イノソースの白色粉末を得ることができる。
【００２３】
本発明方法の第２の実施法（Ｂ）は、要約すると、上記の変換能を有する微生物を培養する工程と、得られた培養物から該微生物の菌体を分離する工程と、該菌体を、溶解されたミオ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地に加える工程と、該緩衝液または液体培地中で菌体をミオ−イノシトールと反応させ、得られた反応液中にＬ−キロ−１−イノソースを生成させる工程と、反応液中に生成蓄積させたＬ−キロ−１−イノソースを反応液から、イオン交換樹脂処理、活性炭処理または結晶化操作あるいはそれらの処理などの組合せにより、回収する工程を含む方法である。
【００２４】
次に、本発明方法の第２の実施法（Ｂ）を詳しく説明する。
実施法（Ｂ）では、先づ、所要の変換能を有する微生物を培養する工程が行われる。次いで、得られた培養液から菌体を分離する工程が行われる。集菌すなわち菌体の分離は、培養液から遠心分離、濾過等公知の方法により行えばよい。
【００２５】
菌体としては、実施法（Ａ）により得た培養液から分離して集めた菌体を用いてもよい。また、前記微生物を別途に適当な培養条件で培養して得た菌体を用いてもよい。
【００２６】
得られた菌体をミオ−イノシトールと反応させる工程が更に行われる。この工程では、反応媒質として、液体培地、緩衝液が用いられる。液体培地としては、実施法（Ａ）で用いた培地と同様のものを用いてもよく、あるいは別途に前記微生物を培養した液体培地をそのまま用いても良い。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド（Good's）のCHES緩衝液などを10〜500mM、好ましくは20〜100mMの濃度で用いるのがよい。液体培地また緩衝液に溶解されたミオ−イノシトールの溶液中のミオ−イノシトール濃度は0.1〜30％程度とするのが好ましい。
【００２７】
反応条件は、用いる菌株や培地、緩衝液の種類によって異なる。反応温度は５〜60℃、好ましくは10〜45℃であり、反応時間は１〜50時間、好ましくは３〜48時間であり、液体培地または緩衝液のpH２〜10、好ましくは３〜９である。
反応終了後には、得られた培養液または反応液から菌体を分離する工程が行われる。さらに、得られた培養上清液または反応液ろ液からＬ−キロ−１−イノソースを回収する工程が行われる。目的物質を単離する方法は実施法（Ａ）と同様に行えばよい。
【００２８】
本発明方法において使用する微生物は、ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースに変換する能力または活性を有する微生物であればいずれの菌株でも使用できる。具体的に例示すると、前述したようにミオ−イノシトールからＬ−キロ−１−イノソース生産できる能力を有する細菌は多種存在するが、例えば本発明者らが分離した前記のAB10198株およびAB10233株は、本発明方法に最も有効に使用される菌株の例である。これら２つの菌株の菌学的性質を後記の表1a、表1b、表1cに記載した。
【００２９】
なお、これら菌株の同定の当たっては、新細菌培地学講座（第２版、近代出版）、医学細菌同定の手引き（第２版、近代出版）、細菌学実習提要（丸善）に準じて実験を行い、そして得られた実験結果を「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）１巻、1984年及び「Microbiology and Immunology」34巻、99頁、1990年、「International J. Systematic Bacteriology」45巻、334頁、1995年等に掲載されている最近の学術論文を参考に判断して、細菌の同定を行った。
【００３０】
AB10198株の主な性状は、次のとおりである。本菌株はコロニーが黄色の色素を帯びるグラム陰性の桿菌で、大きさは0.3〜0.5×0.5〜1.6μｍ。本菌株はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であり、グルコースを好気的に分解し酸を生成する。本菌株は栄養要求性があり、最少培地にメチオニンを添加すると本菌株は良好に生育する。本菌株の細胞のユビキノン分子種はQ8で、DNAのGC含量は65％であった。
【００３４】
これらの菌学的性質を総合して、本菌株はAB10198株は、キサントモナス（Xanthomonas）属に属する菌株であると判断した。「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）１巻、199頁、1984年によると、キサントモナス属細菌には５種のスペシーズ（キサントモナス・カンペストリス；キサントモナス・フラガリアエ；キサントモナス・アルブリネンス；キサントモナス・アキソノポディス；キサントモナス・アメリザ）が知られている。AB10198株の菌学的性状を上記の既知のスペシーズと比較検討した結果、AB10198株はキサントモナス・カンペストリスに最も近縁の種とであると考えられた。しかし、本菌株の菌学的性質はキサントモナス・カンペストリスに完全には一致しなかったので、本AB10198株を公知のものと区別するため、キサントモナス・エスピーAB10198株と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究にFERM P-17893として、寄託した（寄託日は2000年6月12日）。
【００３５】
また、AB10233株の主な性状は次のとおりである。本菌株はコロニーが淡黄色の色素を帯びるグラム陰性の桿菌で、大きさは0.4〜0.8×0.4〜1.6μｍ。本菌株はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であり、グルコースを好気的に分解し酸を生成する。最少培地での本菌株の生育は良好で、栄養要求性が無い。細胞のユビキノン分子種はQ10で、DNAのGC含量は64％であった。また、菌体脂肪酸に２−ヒドロキシ−テトラデカン酸を有し、更に菌体脂質としてスフィンゴ脂質を有していた。これらの菌学的性質を総合すると、本菌株は「Microbiology and Immunology」34巻、99頁、1990年、「International J. Systematic Bacteriology」45巻、334頁、1995年等に記載されているスフィンゴモナス（Sphingomonas）属に最も近縁な細菌であると考えられる。スフィンゴモナス属は上記論文(「Microbiology and Immunology」34巻、99頁、1990年）において初じめて新属として提唱され、現在まで少くとも１２種が提案されている。しかし、AB10233株は、その菌学的性質においてそれらに完全には合致しなかったので、本菌株を公知のものと区別するため、スフィンゴモナス・エスピーAB10233と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17894として寄託した（寄託日は2000年6月12日）。
【００３６】
上記のAB10198株およびAB10233株は、上記のように有用であって新規な微生物である。従って、第２の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17893の受託番号で寄託されたキサントモナス（Xanthomonas）・エスピーAB10198株が提供される。
【００３７】
また、第３の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17894の受託番号で寄託されたスフィンゴモナス（Sphingomonas）・エスピーAB10233株が提供される。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、医農薬合成原料として有用な純度の高いＬ−キロ−１−イノソースを工業的生産の規模レベルで安価に且つ効率よく簡便に製造することができる。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を実施例について具体的に説明する。
実施例１
本発明の実施法（Ａ）によるＬ−キロ−１−イノソースの製造例（１）
（１）Ｌ−キロ−１−イノソースの生成（第１例）
ミオ−イノシトール 15.0％（総量150ｇ）、酵母エキス 0.375％、
（NH4)2SO4 0.1％、K2HPO4 0.18％、KH2PO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.01％を含むpH７の液体培地１リットル（L)を、100mlずつ500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌された液体培地を含む各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーAB10198株（FERM P-17893）を接種し、27℃で５日間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（8,000rpm、20分間）し、上清を培養上清液として得た。
【００４０】
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−キロ−１−イノソースが141mg/mlの濃度で生成していることがわかった。これは、Ｌ−キロ−１−イノソースへのミオ−イノシトールの変換率が95％であることを示す。
【００４１】
なお、この時の培養液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。上記で生成されたＬ−キロ−１−イノソースの変換率は、次の計算式により求めた。
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム：Wakosil 5NH2 : 4.6×250mm
カラム温度 : 20℃
検出器 : RI DETECTER ECR-7515A (ERMA CR. INC.)
注入量 : 20μｌ
溶媒 : アセトニトリル−水＝４：１
溶出時間 : Ｌ−キロ−１−イノソース ; 16.5分
【００４３】
（２）Ｌ−キロ−１−イノソースの生成（第２例）
ミオ−イノシトール 20.0％（総量200ｇ）、グルコース 0.5％、酵母エキス 0.45％、（NH4)2SO4 0.1％、K2HPO4 0.18％、KH2PO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.01％を含むpH７の液体培地１リットルを、100mlずつ500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。さらにオートクレーブ滅菌が終了した各フラスコにグルコースが0.5％濃度になるようにグルコースを追加した。各々の三角フラスコにスフィンゴモナス・エスピーAB10233株（FERM P-17894）を接種し、27℃で６日間振とう培養した。培養液を遠心分離（8,000rpm、20分間）し、上清を培養上清液として得た。
【００４４】
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−キロ−１−イノソースが196mg/mlの濃度で生成している(Ｌ−キロ−１−イノソースへのミオ−イノシトールの変換率99％）ことがわかった。この時の培養液中にミオ−イノシトール及びグルコースは検出されなかった。
なお、上記のＬ−キロ−１−イノソースの変換率は、上記の計算式により求めた。
【００４５】
（３）Ｌ−キロ−１−イノソースの回収と単離
実施例１（１）で得た培養上清液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）C-20(H+型) 150mlを充填したカラム(内径3.5cm、長さ30cm)に通過させた。その後このカラムに200mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。ここで得られたカラム通過液及び洗浄液を合併し、その合併した水溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）A-368S（遊離塩基型）400mlを充填したカラム(内径５cm、長さ50cm)に通過させた。その後このカラムに500mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。
【００４６】
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併した水溶液中には上記Ｌ−キロ−１−イノソースが含有され、それ以外の不純物はほとんど存在していなかった。
【００４７】
上記により得たＬ−キロ−１−イノソース水溶液を減圧下で濃縮乾固したところ、ほぼ純粋な精製品のＬ−キロ−１−イノソースの白色粉末135ｇを得た（通算収率82％）。
【００４８】
なお、上記したＬ−キロ−１−イノソースの通算収率は次の計算式により求めた。
実施例２
本発明の実施法（Ａ）によるＬ−キロ−１−イノソースの製造例（２）
（１）種培養物の調製
ミオ−イノシトール 2.0％、酵母エキス 0.2％、（NH4）2SO4 0.1％、
K2HPO4 0.7％、KH2PO4 0.2％、MgSO4・7H2O 0.01％を含むpH７の液体培地100mlを500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌された液体培地を含む各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーAB10198株（FERM P-17893）を接種し、27℃で１日間振とう培養した。得られた培養液を種培養物とした。
【００５０】
（２）４Ｌ容ジャーファーメンターによるＬ−キロ−１−イノソースの製造
ミオ−イノシトール 15.0％（総量375ｇ）、酵母エキス 0.375％、（NH4)2SO4 0.1％、K2HPO4 0.18％、KH2PO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.01％を含むpH７の液体培地2.5リットルを、４Ｌ容ジャーファーメタンーに分注し、オートクレーブ滅菌した。このジャーファーメンターに導入された液体培地に対して、キサントモナス・エスピーAB10198株の、上記（１）で調製した種培養物25mlを接種した。この時、培養温度は27℃、通気量は1vvm、回転数は200rpmで培養を好気的に実施した。培養は３日間行い、培養期間中のpHを5M NaOH水溶液及び3M 塩酸でpH７±0.2に自動調整した。４日間培養後の培養液を遠心分離（8,000rpm、20分間）し、上清を培養上清液として得た。
【００５１】
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより前記と同様の条件で分析した。この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−キロ−１−イノソースが138mg/mlの濃度で生成しているＬ−キロ−１−イノソースへの(ミオ−イノシトールの変換率93％）ことがわかった。
【００５２】
培養上清液からのＬ−キロ−１−イノソースの回収と単離は、実施例１（３）に記載した方法に準じて行い、としてＬ−キロ−１−イノソースの精製品の289ｇ（通算収率78％）を得た。
【００５３】
なお、上記のＬ−キロ−１−イノソースの変換率は、上記の実施例１（１）に準じて求め、また通算収率は次の計算により求めた。
実施例３
本発明の実施法（Ｂ）によるＬ−キロ−１−イノソースの製造例
（１）菌体の生産
ミオ−イノシトール 0.5％、（NH4)2SO4 0.1％、K2HPO4 0.7％、KH2PO4 0.2％、MgSO4・7H2O 0.01％を含むpH７の液体培地２Ｌ(リットル)を500ml容のバッフル付き三角フラスコに10mlずつ分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌された培地を含む各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーAB10198株を接種し、27℃で３日間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を得た。得られた菌体を0.05M リン酸緩衝液（pH7.0)200mlで洗浄後、再度遠心分離し、洗浄菌体を得た。
【００５５】
（２）Ｌ−キロ−１−イノソースの製造
上記により得られた洗浄菌体30ｇを、溶解されたミオ−イノシトール４ｇを含有した0.05M リン酸緩衝液（pH7.0）400ml(ミオ−イノシトール濃度10mg/ml)中に加えた。得られた混合物を、30℃、24時間緩やかにスターラーで攪拌しながら菌体をミオ−イノシトールに反応させた。反応終了後、反応液から菌体を除き、こうして得た反応液ろ液を液体クロマトグラフィーにより分析したところ、生成されたＬ−キロ−１−イノソースが7.5mg/mlの濃度で生成され(Ｌ−キロ−１−イノソースのミオ−イノシトールの変換率75.8％)蓄積していた。反応液ろ液からのＬ−キロ−１−イノソースの回収と単離は、実施例１（３）に記載した方法に準じて行い、精製品のＬ−キロ−１−イノソースを白色粉末として2.8g(収率70％）を得た。
なお、上記のＬ−キロ−１−イノソースの変換率は、上記実施例１（１）の計算式にて求め、また収率は次の計算式により求めた。
Claims (7)
- ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる能力を有するキサントモナス（Xanthomonas）属又はスフィンゴモナス（Sphingomonas）属に属する微生物を、ミオ−イノシトールに作用させて、前記ミオ−イノシトールのＬ−キロ−１−イノソースへの変換によりＬ−キロ−１−イノソースを生成することから成ることを特徴とする、Ｌ−キロ−１−イノソースの製造方法。
- 請求項１に記載のミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる能力を有する微生物が、キサントモナス（Xanthomonas）・エスピーAB10198株（FERM P-17893として寄託）あるいはスフィンゴモナス（Sphingomonas）・エスピーAB10233株（FERM P-17894として寄託）である請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載のミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる能力を有するキサントモナス-属又はスフィンゴモナス-属に属する微生物を、ミオ−イノシトールならびに炭素源および窒素源を含有する液体培地で好気的に培養して、その培養液中において該微生物をミオ−イノシトールに作用させ、そして培養液中にＬ−キロ−１−イノソースを生成および蓄積させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載のミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる能力を有するキサントモナス-属又はスフィンゴモナス-属に属する微生物を培養する工程と、得られた培養物から該微生物の菌体を分離する工程と、該菌体を、溶解されたミオ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地よりなる水性媒質に加える工程と、該水性媒質中で該菌体をミオ−イノシトールと反応させ、得られた反応液中にＬ−キロ−１−イノソースを生成させる工程とを含む、請求項１に記載の方法。
- 請求項３または請求項４記載の方法により、キサントモナス属又はスフィンゴモナス属に属する微生物とミオ−イノシトールとの反応により生成、蓄積させたＬ−キロ−１−イノソースを含有する培養液または反応液を収得し、さらに該培養液または反応液から、菌体を除去して、菌体を除去されたＬ−キロ−１−イノソースを含有する培養上清液または反応液ろ液を収得し、その後に該培養上清液または反応液ろ液を、イオン交換樹脂または活性炭処理または結晶化操作あるいはこれらの組合せの処理にかけ、この処理により、高純度のＬ−キロ−１−イノソースを該培養上清液または反応液ろ液から回収することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17893の受託番号で寄託されたキサントモナス（Xanthomonas）・エスピーAB10198株。
- ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17894の受託番号で寄託されたスフィンゴモナス（Sphingomonas）・エスピーAB10233株。
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