TW201336995A - 鯊肌醇之製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供從葡萄糖等便宜且普遍存在之原料,以一階段之步驟即可生產鯊肌醇之工業性製造方法。另,提供經由該製造方法獲得之新穎鯊肌醇衍生物。本發明之鯊肌醇係經由保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇脫氫酶基因及鯊肌醇脫氫酶基因之轉形微生物,以一階段從葡萄糖發酵生產者。經由該發酵,亦提供與葡萄糖等糖類結合之鯊肌醇衍生物。
Description
本發明係有關在製造鯊肌醇中基因重組技術之應用。尤其是有關從葡萄糖等普遍存在之原料,經由一階段之步驟即可生產鯊肌醇之轉形體及利用該轉形體之鯊肌醇之工業性製造方法。又,本發明係有關可經由上述轉形體生產之鯊肌醇衍生物及其製造方法及從該衍生物製造鯊肌醇之方法。
鯊肌醇(scyllo-inositol;順式-1,3,5-反式-2,4,6-環己六醇)為肌醇之光學惰性異構體之一種,為自古以來在動物及植物中發現之化合物。惟,近年來,鯊肌醇所具有之種種生理活性廣受注目。
例如,於非專利文獻1報告鯊肌醇具有類澱粉蛋白β蛋白質凝集抑制作用,該作用教示鯊肌醇在治療阿滋海默症中之潛在有用性。又,於專利文獻1申請將鯊肌醇作為有效成分之血糖值降低劑之專利。因此,將鯊肌醇工業性生產有明確之必要性存在。
古典之生產方法為將鯊肌醇從植物體萃取出或將肌肉肌醇作為原料,化學合成該化合物(非專利文獻2及3、專利文獻2等)。惟,近年來進行研究利用天然型微生物或源自微生物之
酵素,更有效率生產鯊肌醇之方法。
於專利文獻3揭示將屬於農桿菌(Agrobacterium)屬之微生物以含有肌肉肌醇之培養基培養,在培養液中生成肌醇立體異構體或將屬於農桿菌屬之微生物菌體或菌體處理物與肌肉肌醇作用,生成肌醇立體異構體之方法。經由該等之異構體化,將肌肉肌醇轉換為鯊肌醇、手性-肌醇(chiro-inositol:D體與L體之混合物)及新-肌醇(neo-inositol)之混合物。
於專利文獻4記載,使假單細胞菌sp.AB10064株(FERMP-18330)或乙酸桿菌sp.AB10253株(FERMP-18868)對肌肉肌醇作用,將肌肉肌醇轉換為鯊肌糖(scyllo-inosose)。另,嚐試將經由此生成之鯊肌糖以硼氫化鈉還原,合成鯊肌醇,惟,該還原處理根本上生成之鯊肌醇只作為與肌肉肌醇(亦即,回復原料之逆反應)之混合物。因此,於專利文獻4記載之鯊肌醇製造方法,必需邊反覆操作經由微生物之肌肉肌醇轉換為鯊肌糖及經由硼氫化鈉之還原處理,而逐漸增加鯊肌醇之含量。
於專利文獻5揭示使用肌肉肌醇作為原料,在將從
肌肉肌醇生成之鯊肌糖之肌肉肌醇2-脫氫酶(EC1.1.1.18)、將鯊肌糖立體選擇性還原為鯊肌醇之鯊肌醇脫氫酶及NAD+或NADP+混合之溶液中進行酵素轉換反應將肌肉肌醇轉換為鯊肌醇之鯊肌醇製造方法。於該文獻,從肌肉肌醇轉換為鯊肌醇之收量基數為31%。
因此,上述之任一文獻均為有關將肌肉肌醇作為出發原料,生產鯊肌醇之方法,對於重新合成(de novo)之鯊肌醇生合成,亦即從普遍存在之葡萄糖等原料,直接且以一階段步驟生
產鯊肌醇之方法則未教示。
尤其是,原本肌肉肌醇本身即為極有用且貴重的生理活性物質。亦即,由於肌肉肌醇對於大多數高等動物是必要、不可欠缺的物質,因此,廣泛的被利用作為營養食品、飼料、醫藥品等之成分。例如,已知肌肉肌醇在脂肪或膽固醇類之代謝擔任重要的角色,尤其對於高膽固醇血症等之預防或治療有效。
現實上,對於以工業規模製造肌肉肌醇之步驟,有很多改良的提案正在進行。例如,於專利文獻6揭示可將肌肉肌醇分泌至菌體外之念珠菌屬酵母之表現及其利用。於專利文獻7及8分別揭示於上述肌肉肌醇分泌性念珠菌屬酵母中導入賦予對葡萄糖代謝拮抗物質及抗生物質耐性之突變。於專利文獻9、10及11分別亦揭示對於具有肌肉肌醇生產能之念珠菌屬酵母導入賦予對3級胺、六氯環己烷及十六烷基三甲基銨鹽耐性之突變,可提昇肌肉肌醇之收率。於專利文獻12亦相同,揭示對於具有肌肉肌醇生產能之念珠菌屬酵母導入賦予對6-鹵素-6-脫氧葡萄糖耐性之突變。於專利文獻13亦揭示對於具有肌肉肌醇生產能之念珠菌屬酵母導入賦予對鹵化丙酮酸耐性之突變。除此之外,例如於專利文獻14揭示在一連串之肌肉肌醇生合成反應中,在肌醇-1-磷酸合成酶決定反應速度之妥當推論下,將不具有肌肉肌醇分泌能之念珠菌屬酵母單獨經由上述肌醇-1-磷酸合成酶編碼化DNA進行轉形,可賦予該酵母肌肉肌醇生產能,於專利文獻15揭示對於酵母單獨導入在甘油-3-磷酸脫氫酶基因之啟動子控制下存放之肌醇-1-磷酸合成酶編碼化DNA,可提昇該酵母之肌肉肌醇生產性。
上述之事實係對於確立肌肉肌醇之效率且經濟之任
一種生產方法至今依然是重要的技術課題。又,以往技術必需使用貴重且高價位之肌肉肌醇作為原料之鯊肌醇製造方法之低效率性及不經濟性係一目瞭然。
另,於上述之任何一篇文獻,對於鯊肌醇衍生物,尤其是經由糖類衍生物化之鯊肌醇都未揭示亦未教示。
[專利文獻1]日本特開2003-160478號公報
[專利文獻2]西德專利公開公報第3,405,663號公報
[專利文獻3]日本特開平9-140388號公報
[專利文獻4]日本特開2003-102492號公報
[專利文獻5]日本特開2010-187688號公報
[專利文獻6]日本特開平8-00258號公報
[專利文獻7]日本特開平8-38188號公報
[專利文獻8]日本特開平8-89262號公報
[專利文獻9]日本特開平9-117295號公報
[專利文獻10]日本特開平10-42860號公報
[專利文獻11]日本特開平10-42882號公報
[專利文獻12]日本特開平10-42883號公報
[專利文獻13]日本特開2000-41689公報
[專利文獻14]日本特開平9-220093號公報
[專利文獻15]日本特開平10-271995號公報
[非專利文獻1]The Journal of Biological Chemistry,Vol. 275,
No. 24,pp.18495至18502(2000)
[非專利文獻2]藥學雜誌,89卷,1302至1305頁(1969)
[非專利文獻3]Liebigs Ann. Chem.,866至868頁(1985)
因此,本發明之第1課題係關連從葡萄糖等便宜且普遍存在之原料,以一階段之步驟即可生產鯊肌醇之工業性製造方法。另,本發明人等在上述之研究過程中首次發現與糖類結合之本發明之鯊肌醇衍生物。該鯊肌醇衍生物與鯊肌醇原本顯示之水溶性相比,顯示非常優越之水溶性。例如,纖維二糖(D-吡喃葡糖基-(β 1→4)-D-葡萄糖)係顯示比葡萄糖低之溶解性,因而本發明實際觀察得到的見解令人驚訝。因此,本發明之第2課題為提供新穎之鯊肌醇衍生物。
如上所述,最近之任一種研究都是專門關於將肌肉肌醇作為出發原料,將鯊肌醇以酵素反應轉換之方法。上述之任何一篇先前文獻,對於在宿主微生物細胞內機能性重新合成鯊肌醇之生合成系之構築,亦即從葡萄糖等普遍存在之原料直接且以一階段步驟發酵生產鯊肌醇之方法未成功確立。
惟,本發明人等發現表現肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇脫氫酶基因及鯊肌醇脫氫酶基因之轉形體可直接從葡萄糖以一階段發酵生產鯊肌醇。另,本發明
人等在該等轉形體之培養物中發現新穎之鯊肌醇衍生物。
因此,本發明之第1局面為:(1)鯊肌醇及鯊肌醇衍生物之製造方法,其係包含以下步驟之製造方法:1)準備保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇脫氫酶基因及鯊肌醇脫氫酶基因之轉形微生物之步驟;2)在適合上述微生物生育及/或維持之條件下將該微生物與葡萄糖或具有葡萄糖單元之二糖類或多糖類接觸之步驟。
更特定的係於使用轉形體之鯊肌醇及其衍生物之製造方法中,其特徵為該轉形體係表現肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇脫氫酶基因及鯊肌醇脫氫酶基因之上述製造方法。
於上述(1)之培養物中生產之鯊肌醇衍生物為新穎化合物,於該衍生物,葡萄糖與鯊肌醇以β 1→4結合。因此,本發明之一形式為:(2)如上述(1)所述之製造方法,其中,上述之鯊肌醇衍生物為下述構造式表示之化合物:
另,令人驚訝的為經由強化該等轉形體之肌醇單磷
酸酯酶活性,大幅度的提昇鯊肌醇生產能。又,未預期的是於該轉形體,鯊肌醇係以優勢生產,而肌肉肌醇之生產極少。本案優先權日以前之任何一篇先前文獻均未揭示亦未教示為了上述目的而強化肌醇單磷酸酯酶活性。因此,本發明之第2局面為:(3)如上述(1)或(2)所述之製造方法,其中,上述轉形微生物之特徵為具有誘導機能性肌醇單磷酸酯酶過剩生產或肌醇單磷酸酯酶活化之基因重組或變異。
以大腸菌為代表之原核微生物,因其迅速之生育能力或發酵管理之容易度,從工業性發酵生產之觀點而言,具有極大的魅力,同時,從基因重組技術之適用之實績、經確立之安全性之觀點而言,亦具有利點。又,不具有從葡萄糖經過肌肉肌醇生合成鯊肌醇之途徑之多數原核微生物,以使用與基因重組技術連合之合成生物學手段,而具有容易控制鯊肌醇生產性之利點。尤其是大腸菌等原核微生物宿主,由於不具有將作為鯊肌醇生合成途徑之中間體肌肉肌醇加以同化之能力(分解能),使用合成生物學方法更容易。
因此,本發明之較佳形式為:(4)如上述(1)至(3)中任何一項所述之製造方法,其中,上述轉形微生物係源自不具有肌肉肌醇同化能之微生物者,以及(5)如上述(1)至(4)中任何一項所述之製造方法,其中,上述轉形微生物係源自選自由大腸菌、桿菌屬(Bacillus)細菌、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細菌、發酵單孢菌屬(Zymomonas)細
菌所成群組之細菌者。
關於上述(3)之較佳形式,不論宿主微生物是否具有內因性肌醇單磷酸酯酶活性,於該細胞內使過剩生產肌醇單磷酸酯酶,即可強化該細胞之肌醇單磷酸酯酶活性。使用種種公知之技術,可在細胞中過剩生產肌醇單磷酸酯酶。因此,本發明亦包含以下之形式:(6)如上述(3)至(5)中任何一項所述之製造方法,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之過剩生產係經由對於上述轉形微生物進行下述誘導者:a)導入外來肌醇單磷酸酯酶基因、b)增加內因性肌醇單磷酸酯酶基因之複製數、c)在內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區導入變異、d)將內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區以高表現誘導性外來調整區置換、或e)使內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區缺失;及(7)如上述(6)所述之製造方法,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之過剩生產係經由對於上述轉形微生物導入外來肌醇單磷酸酯酶基因進行誘導。
又,宿主細胞具有內因性肌醇單磷酸酯酶基因時,根據以下之形式,亦可強化該細胞之肌醇單磷酸酯酶活性。因此,本發明包含以下之形式:(8)如上述(3)至(5)中任何一項所述之製造方法,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之活化為對於上述轉形微生物進行下述誘導者:
f)在內因性肌醇單磷酸酯酶基因中導入變異、g)將內因性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分或全部置換、h)使內因性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分缺失、i)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之其他蛋白質j)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之化合物之生成。
又,本發明期望用於上述鯊肌醇及其衍生物之製造方法之轉形體。因此,本發明之其他局面為:(9)保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇脫氫酶基因及鯊肌醇脫氫酶基因之轉形微生物。
又,對於本發明第2局面記載之事項及形式,對於本發明上述(9)之轉形體亦適合。該等包含下述者:(10)如上述(9)所述之轉形微生物,其中,上述轉形微生物之特徵為更具有誘導機能性肌醇單磷酸酯酶過剩生產或肌醇單磷酸酯酶活化之基因重組或変異、(11)如上述(9)或(10)所述之轉形微生物,其中,上述轉形微生物之特徵為源自不具有肌肉肌醇同化能之微生物、(12)如上述(9)至(11)中任何一項所述之轉形微生物,其中,上述轉形微生物為源自選自由大腸菌、桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單孢菌屬細菌所成群組之細菌、(13)如上述(10)至(12)中任何一項所述之轉形微生物,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之過剩生產為經由對於上述轉形微生物進行下述誘導者:a)導入外來肌醇單磷酸酯酶基因、b)增加內因性肌醇單磷酸酯酶基因之複製數、
c)在內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區導入變異、d)將內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區以高表現誘導性外來調整區置換、或e)使內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區缺失、(14)如上述(13)所述之轉形微生物,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之過剩生產係經由對於上述轉形微生物導入外來肌醇單磷酸酯酶基因而進行誘導,以及(15)如上述(10)至(12)中任何一項所述之轉形微生物,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之活化係對於上述轉形微生物進行下述誘導者:f)在內因性肌醇單磷酸酯酶基因中導入變異、g)將內因性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分或全部置換、h)使內因性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分缺失、i)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之其他蛋白質j)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之化合物之生成。
本發明之另一局面係關連發現在上述轉形體之培養物中生產之新穎鯊肌醇衍生物。亦即,本發明亦期望:(16)下述構造式表示之化合物:
本發明之鯊肌醇衍生物經由可催化β-糖苷鍵水解反應之酵素,例如經由β-糖苷酶(EC 3.2.1.21)分解,即可容易的生成葡萄糖及鯊肌醇。又,本發明鯊肌醇衍生物所顯示之高水溶性於該等酵素反應中甚為有利。因此,本發明之其他局面為:(17)一種鯊肌醇之製造方法,係將上述(16)之化合物經由可催化β-糖苷鍵水解反應之酵素分解,生成肌醇之方法。
又,本發明為:(18)含有鯊肌醇及上述(16)記載之化合物之組成物。
根據本發明,可效率化的達成經由微生物培養技術之工業性鯊肌醇之生產。又,本發明提供新穎之鯊肌醇衍生物。該衍生物由於水溶性極高,於生產步驟中可提昇每批之生產濃度,於製造相關之製品時之處理性優越。又,可提昇工業性鯊肌醇之生產性。
第1圖表示INO1基因之編碼區(序列編號1)。
第2圖表示suhB基因之編碼區(序列編號3)。
第3圖表示iolG基因之編碼區(序列編號5)。
第4圖表示iolW基因之編碼區(序列編號7)。
第5圖為本發明鯊肌醇衍生物之1H-NMR光譜。圖中,箭頭表示之波峰為源自不純物者。
第6圖為本發明鯊肌醇衍生物之13C-NMR光譜。
第7圖表示本發明之鯊肌醇衍生物經由β-糖苷酶(纖維二糖酶)分解之例。
本發明之第1課題係經由將保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇脫氫酶基因及鯊肌醇脫氫酶基因之轉形微生物,在含有以葡萄糖或具有葡萄糖單元之二糖類或多糖類作為碳源之培養基內發酵,或使該轉形體與上述碳源接觸而解決。亦即,本發明之轉形微生物具有經由在該微生物內重新構築之連續生合成途徑將葡萄糖基質以一階段發酵轉換為鯊肌醇及其衍生物之能力。
典型之將葡萄糖基質轉換為本發明之鯊肌醇(或同時生產之鯊肌醇衍生物。以下,將兩者歸納稱為「本發明之鯊肌醇」。)之生合成途徑包含將葡萄糖基質轉換為重要中間體之肌肉肌醇之部分途徑。
具體而言,為原核微生物宿主時,藉由表現下述觸媒活性,可使該微生物內肌肉肌醇生合成用之部分途徑機能化。
活性1:從適當之碳源生成葡萄糖-6-磷酸之活性;活性2:將葡萄糖-6-磷酸轉換為肌肉肌醇-1-磷酸之活性,亦即,肌醇-1-磷酸合成酶活性;及活性3:將肌肉肌醇-1-磷酸作為基質之磷酸酯酶活性。
惟,由於為活性1生成物之葡萄糖-6-磷酸為微生物普遍生成之代謝中間體,所以不需特意的於轉形體賦予該活性。又,對於活性3,於本發明人等所了解的,適合經由以往基因重
組方法之工業性生產之原核微生物宿主細胞大多數表現內因性肌醇單磷酸酯酶或具有可將肌肉肌醇-1-磷酸作為基質之廣用單磷酸酯酶活性。
另一方面,若檢視活性2,原核微生物不具有肌醇-1-磷酸合成酶基因之例子很多。又,於肌肉肌醇生合成反應中,認為肌醇-1-磷酸合成酶決定反應速度(參照專利文獻14及15)。在原核微生物宿主內為了構築機能性之肌肉肌醇生合成途徑,認為在該細胞中導入外來性肌醇-1-磷酸合成酶基因是非常必要的。
惟,於與本案同時繼續提出申請之日本專利申請第2011-248438號,本發明人等未預期的發現於導入上述外來性肌醇-1-磷酸合成酶基因之轉形體,可強化肌醇單磷酸酯酶活性,大幅度提昇肌肉肌醇生產能。更令人驚訝的是,由後述之實施例可知,本發明之轉形體不僅強化該肌醇單磷酸酯酶活性,以極多量且優勢的生產鯊肌醇,而另一方面幾乎未生產肌肉肌醇,係生產實質量之本發明之鯊肌醇衍生物。因此,對於本發明之轉形體,除了導入上述之外來性肌醇-1-磷酸合成酶基因之外,較好導入誘導機能性肌醇單磷酸酯酶過剩生產或肌醇單磷酸酯酶活化之基因重組或變異。
例如,宿主微生物不論是否具有內因性肌醇單磷酸酯酶活性,使轉形微生物細胞內過剩生產肌醇單磷酸酯酶,即可強化該轉形微生物之肌醇單磷酸酯酶活性。較好可經由對於該轉形微生物導入外來性肌醇單磷酸酯酶基因而誘導肌醇單磷酸酯酶之過剩生產,惟,不只限於此。又,於本說明書中,「外來」或「外來性」之用語係用於指轉形前之宿主微生物不具有經由本發明導
入之基因之情況、實質上未表現經由該基因編碼之酵素之情況、以及根據不同之基因編碼該酵素之胺基酸序列,惟,轉形後未表現對等之內因性酵素活性之情況,以本發明為基礎,在宿主導入基因或核酸序列之意。
接著,對於本發明之轉形體,亦即具有將葡萄糖基質轉換為鯊肌醇(或同時生產之鯊肌醇衍生物)之連續生合成途徑之轉形微生物賦予以下之觸媒活性。
活性4:將肌肉肌醇轉換為2-酮基-肌肉肌醇(肌肉肌糖;2,3,4,5,6-五羥基環己烷-1-酮)之酵素活性;及活性5:將2-酮基-肌肉肌醇轉換為鯊肌醇之酵素活性。
具有上述活性4之酵素可列舉例如在NAD+存在下將肌肉肌醇氧化之肌肉肌醇脫氫酶(酵素編號E.C.1.1.1.18)。又,具有上述活性5之酵素可列舉例如在NADP+存在下將鯊肌醇氧化之鯊肌醇脫氫酶。亦即,本發明中可使用之鯊肌醇脫氫酶在例如NADPH存在下,可將2-酮基-肌肉肌醇轉換為鯊肌醇。該等酵素之詳細說明於後述。
本發明之轉形體係使用種種宿主微生物細胞即可製作。尤其是將原核微生物作為宿主,由於在該宿主細胞內可重新構築本發明鯊肌醇之生合成途徑(亦即,不影響既存之內因性途徑),在合成生物學方法之使用上有極大的魅力。例示之原核微生物為:埃希氏菌、綠膿桿菌、桿菌、芽孢桿菌(Geobacillius)、甲烷單胞菌(Methanomonas)、甲基菌(Methylobacillus)、嗜甲基菌、精蛋白桿菌(Protaminobacter)、嗜甲烷菌、棒狀桿菌、短桿菌、發酵單
孢菌及李斯特菌屬之細菌。於工業之發酵生產中較佳之原核微生物之非限定例示包含大腸菌、桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單孢菌屬細菌。大腸菌由於其迅速之生育能力或發酵管理容易,為本發明宿主微生物之較佳例。又,可作為本發明宿主細胞利用之細胞株可為通常意思之野生型,亦可為營養要求性變異株、抗生物質耐性變異株。另,可作為本發明宿主細胞利用之細胞株亦可為具有與上述變異相關之各種標識基因,且已轉形者。該等變異或基因在本發明轉形體之製作/維持/管理可提供有益之性質。較好經由使用對於氯徽素、安比西林、卡那黴素、四環素等抗生物質顯示耐性之株,可使本發明鯊肌醇之生產簡便地進行。
如上所述,本發明轉形體具有之鯊肌醇生合成途徑包含用於將葡萄糖基質轉換為重要中間體之肌肉肌醇之部分途徑。另,如上所述,由於認為於肌肉肌醇之生合成,肌醇-1-磷酸合成酶決定反應速度,因而於本發明之轉形體要求表現作為第1生物活性之肌醇-1-磷酸合成酶。尤其是由於原核微生物不具有肌醇-1-磷酸合成酶基因之例多,通常導入外來性肌肉肌醇-1-磷酸合成酶基因至本發明轉形體之細胞內而可表現。肌醇-1-磷酸合成酶基因為公知(例如,GenBank Accession Nos.AB032073、AF056325、AF071103、AF078915、AF120146、AF207640、AF284065、BC111160、L23520、U32511),該任何一種均可使用。尤其是源自酵母之INO1基因(序列編號1),為充分知道之肌醇-1-磷酸合成酶基因之例,於本發明亦適合使用。惟,在製作本發明之轉形體中可利用之肌醇-1-磷酸合成酶基因不只限於源自酵母者,亦可為其他真核微生物或源自該等以外之生物者或可為人工合成者,只要在上述宿主微
生物細胞內可表現實質之肌醇-1-磷酸合成酶活性者即可。
因此,可利用於本發明之目的之肌醇-1-磷酸合成酶基因,只要是在上述轉形微生物內可表現實質之肌醇-1-磷酸合成酶活性者即可,可為具有在自然界會發生之所有變異或人工導入之變異及修飾。例如將編碼特定之胺基酸之種種密碼子已知有多餘之密碼子(冗餘碼,redundancy)存在。因此,即使於本發明,亦可利用成為同一胺基酸最終轉譯之代替密碼子。亦即,由於基因編碼簡退化,為了要將某一特定胺基酸編碼,可使用複數之密碼子,因此,胺基酸序列可以任意1組合之類似DNA寡核苷酸編碼。雖然該組合只有唯一成員在天然型酵素之基因序列為相同,但是以不匹配之DNA寡核苷酸在適當之緊縮條件下(例如,3 x SSC、於68℃雜交、2 x SSC、以0.1%SDS及於68℃洗淨),可與天然型序列雜交,而可將編碼天然型序列之DNA鑑定、分離,該等基因亦可利用於本發明。尤其是已知大部分之生物優先使用特定密碼子(最適合之密碼子)之子集(subset)(Gene、Vol.105、第61-72頁、1991等),因而對應宿主微生物進行「編碼子最適化」為有用。
業者應了解於製作本發明之轉形體中,將肌醇-1-磷酸合成酶基因作為「表現匣」導入於宿主微生物細胞內,可獲得更安定、高水平之肌醇-1-磷酸合成酶活性。於本說明書中,「表現匣」係指包含將表現對象之核酸或與表現對象之基因機能性結合之轉錄及翻譯加以調控之核酸序列之核苷酸。典型上,本發明之表現匣包含從編碼序列於5’上流之啟動子序列、於3’下流之終止子序列、根據情況與通常之調節因子機能性結合之狀態,於該等情況,表現對象之核酸或表現對象之基因導入至宿主微生物
中可能表現。
啟動子不論是構造性啟動子或是調節性啟動子,係定義為將RNA聚合酶結合於DNA,開始RNA合成之DNA序列。強啟動子為將mRNA以高頻率開始之啟動子,亦適用於製作本發明之轉形體。對於lac系、trp系、TAC或TRC系、λ噬菌體之主要操作子(operator)及啟動子區、fd編碼蛋白質之控制區、解糖系酵素(例如3-磷酸甘油激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、谷胺酸脫羧酶A、絲胺酸羥基甲基轉移酶之啟動子等,可對應其宿主細胞之性質等加以利用。除了啟動子及終止子序列之外,其他調節因子之例可列舉選擇標識、增幅信號、複製起點等。較佳之調節序列記載於例如“Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185”、Academic Press(1990)。
於上述說明之表現匣係編入由例如質體、噬菌體、轉位子、IS因子、噬粒體(phasmid)、黏質體或由線狀或環狀DNA等形成之載體,並插入宿主微生物中。較好為質體及噬菌體。該等載體可為在宿主微生物中自律複製者,亦可經由染色體複製。較佳之質體為例如大腸菌之pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSI、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λ g t11或pBdCI;桿菌之pUB110、pC194或pBD214;棒狀桿菌屬之pSA77或pAJ667等。其他亦可使用之質體等記載於“Cloning Vectors”,Elsevier,1985。載體中表現匣之導入可經由包含以適當之限制酵素切出、選殖及連接等慣用方法進行。
構築具有如上所述之表現匣之載體後,將該載體導
入宿主微生物中時適用之方法可使用共沈、原生質體融合、電穿孔法、逆轉錄病毒轉染等慣用之選殖法及轉染法。該等例記載於「分子生物學之最新草案(Current Protocols in Molecular Biology)」、F. Ausubel人等、Publ.Wiley Interscience、New York、1997或Sambrook人等「分子選殖:實驗室手冊」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989。
接著,本發明轉形體具有之第2生物活性為肌醇單磷酸酯酶活性。該肌醇單磷酸酯酶活性係在將葡萄糖基質轉換為中間體肌肉肌醇時需要。惟,如前所述,大多數適合經由以往基因重組方法之工業性生產之原核微生物宿主細胞,由於表現內因性肌醇單磷酸酯酶或具有可將肌肉肌醇-1-磷酸作為基質泛用之單磷酸酯酶活性,在本發明之轉形體中不需導入該酵素活性之情況多。惟,以顯示本發明之轉形體經強化之肌醇單磷酸酯酶特別好。亦即,未預期的,本發明之鯊肌醇生產性轉形體藉由強化該肌醇單磷酸酯酶活性,而以極多量且優勢的生產鯊肌醇,且幾乎未生產肌肉肌醇,明瞭係顯著地生產鯊肌醇衍生物。因此,本發明之較佳局面包含在鯊肌醇生產性轉形體內使肌醇單磷酸酯酶過剩生產。
本發明期望之肌醇單磷酸酯酶除了對於肌醇-1-磷酸顯示高基質特異性之外,亦顯示對於廣範之基質可作用之磷酸單酯水解酵素活性,包含可將肌醇-1-磷酸實質水解之蛋白質。典型之肌醇單磷酸酯酶已知有例如肌醇-1-單磷酸酯酶,源自多數生物之該基因(suhB基因)發表於GenBank Accession Nos.ZP_04619988、
YP_001451848等。尤其是源自大腸菌之suhB基因(序列編號3:AAC75586(MG1655))之使用,在將大腸菌作為宿主細胞時為便利。
本發明之轉形體具有之第3生物活性為肌肉肌醇脫氫酶活性。該酵素典型係經由以下之反應,在NAD+存在下將肌肉肌醇轉換為2-酮基-肌肉肌醇。
種種肌肉肌醇脫氫酶基因為公知且可利用。例如,於特開平6-7158號公報記載有在NAD+存在下可將肌肉肌醇轉換為2-酮基-.肌肉肌醇之源自桿菌屬細菌之酵素(EC.1.1.1.18)及其編碼化核酸序列。除此之外,於專利文獻5揭示NAD+非依存型肌肉肌醇脫氫酶,該酵素或許可在製作本發明之轉形體中使用。尤其是源自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)NBRC13719株之iolG基因(下述之序列編號5)之使用便利。
(序列編號5)
本發明之轉形體具有之第4生物活性為鯊肌醇脫氫酶活性。該酵素典型係經由以下之反應,在NADP+存在下將鯊肌醇轉換為2-酮基-肌肉肌醇,在NADPH存在下將2-酮基-肌肉肌醇選擇性還原為鯊肌醇。本發明之轉形體內係利用後者之反應。
種種鯊肌醇脫氫酶基因係公知且可利用。於專利文獻5揭示大腸菌、乙酸菌屬細菌、桿菌屬細菌、農桿菌屬細菌、黃單胞菌屬(Xanthomonas)細菌之鯊肌醇脫氫酶及相關之胺基酸序
列。尤其是源自枯草芽孢桿菌NBRC13719株之iolG基因(下述之序列編號7)之使用便利。
(序列編號7)
對於肌醇-1-磷酸合成酶基因記載之變異或修飾及密碼子最適化以及表現匣、啟動子等之調節子序列及質體等及經由此之轉形之說明,對於所有上述之肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇脫氫酶基因及鯊肌醇脫氫酶基因,該業者應該可容易理解。因此,本發明之轉形體保有含有編碼肌醇-1-磷酸合成酶之核酸之表現匣、含有編碼肌肉肌醇脫氫酶之核酸之表現匣及含有編碼鯊
肌醇脫氫酶之核酸之表現匣之3個表現匣,此種情況,本發明之轉形體存在有內因性肌醇單磷酸酯酶基因。較佳之本發明之轉形體為保有含有具有序列編號1所示核苷酸序列之核酸之表現匣、含有具有序列編號5所示核苷酸序列之核酸之表現匣及含有具有序列編號7所示核苷酸序列之核酸之表現匣。
上述之3個表現匣可配置在1個載體上轉染到宿主微生物,或是配置其中任意2個表現匣之載體與配置剩餘表現匣之載體在宿主微生物中共轉染,亦可分別配置各個表現匣之3個載體在宿主微生物中共轉染。另,亦可將上述3個表現匣中之任意1個以上,編入宿主微生物之基因組中,剩餘之表現匣作為質體存在於該轉形體內。例如,對於將含有肌醇-1-磷酸合成酶編碼化核酸(INO1)之表現匣編入染色體上獲得之大腸菌AKC-017株(BCRC 910573)(FERM P-22180,於2011年10月25日寄存於日本獨立行政法人製品評估技術基盤機構特許生物寄存中心。國際寄存編號:FERM BP-11513),可將配置有含有編碼肌肉肌醇脫氫酶之核酸之表現匣及含有編碼鯊肌醇脫氫酶之核酸之表現匣之質體進行轉染。
另,如反覆記載的,本發明之轉形體顯示經強化之肌醇單磷酸酯酶特別佳。所以,本發明之轉形體除了上述3個表現匣之外,較好保有含有編碼肌醇單磷酸酯酶之核酸之表現匣。因此,較佳之本發明之轉形體可列舉保有含有具有序列編號1所示核苷酸序列之核酸之表現匣、含有具有序列編號3所示核苷酸序列之核酸之表現匣、含有具有序列編號5所示核苷酸序列之核酸之表現匣及含有具有序列編號7所示核苷酸序列之核酸之表現
匣之轉形體。
上述之4個表現匣可配置在1個載體上轉染至宿主微生物或是配置其中任意2個以上表現匣之載體與配置剩餘表現匣之載體在宿主微生物中共轉染,亦可分別配置各個表現匣之4個載體在宿主微生物共轉染。另,亦可將上述4個表現匣中之任意1個以上編入宿主微生物之基因組中,剩餘之表現匣作為質體存在於該轉形體內。例如,對於在染色體上具有含有肌醇-1-磷酸合成酶編碼化核酸(INO1)之表現匣及含有編碼肌醇單磷酸酯酶之核酸(suhB)之表現匣二者之大腸菌AKC-018株(BCRC 910574)(FERM P-22181,於2011年10月25日寄存於獨立行政法人製品評估技術基盤機構特許生物寄存中心。國際寄存編號:FERM BP-11514),可將配置含有編碼肌肉肌醇脫氫酶之核酸之表現匣及含有編碼鯊肌醇脫氫酶之核酸之表現匣之質體轉染。
又,於本發明之較佳轉形體,相關於誘導經強化之肌醇單磷酸酯酶活性之方法可以下述方式進行誘導:使該肌醇單磷酸酯酶過剰生產增加內因性肌醇單磷酸酯酶基因之複製數;在內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區導入變異;將內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區以高表現誘導性外來調整區置換;及使內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區缺失。具體而言,為了達成肌醇單磷酸酯酶之過剰表現,可由含有內因性肌醇單磷酸酯酶基因或經由含有在該內因性基因編碼化區附加適當調整區之表現匣之構築物,將上述宿主微生物轉形而使該轉形體內之該肌醇單磷酸酯酶基因複製數與原本之宿主細胞相比,實質增加,或對於具有內因性肌醇單磷酸酯酶基因之原宿主細胞,藉由染色體之變異、
附加及缺失之公知基因重組技術而實施,或使用變異劑等對染色體任意地進行變異導入而達成。肌醇單磷酸酯酶過剰生產之確認可使用公知之SDS-PAGE分析法等。
另,為了將肌醇單磷酸酯酶活性強化之本發明之另一形式係包含對本發明之轉形體,誘導肌醇單磷酸酯酶之活化。為了該目的,可例示1)在內因性肌醇單磷酸酯酶基因中導入變異、2)將內因性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分或全部置換、3)使內因性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分缺失、4)減少會降低肌醇單磷酸酯酶活性之其他蛋白質及/或5)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之化合物之生成之方法。
關於將上述肌醇單磷酸酯酶活性強化之1)至5)之方法,具體而言,在肌醇單磷酸酯酶之基因實施變異、附加或缺失後,評估編碼該基因之肌醇單磷酸酯酶之活性,可獲得肌醇單磷酸酯酶活性經強化之肌醇單磷酸酯酶。
為了生產本發明之鯊肌醇,以如上述操作獲得之轉形體係在適合生育及/或維持上述轉形體之條件下培養及維持。源自各種宿主微生物細胞之轉形體用之適當培養基組成、培養條件、培養時間於業者為公知。
培養基較好為含有1種以上之碳源、氮源、無機鹽、維生素及根據情況含有微量元素或維生素等微量成分之天然、半合成、合成培養基。惟,使用之培養基並非一定要適當滿足欲培養之轉形微生物之營養要求。另,為了經由本發明之轉形體,容易進行鯊肌醇之重新生合成及鯊肌醇衍生物之生合成,本發明中可使用之培養基係含有葡萄糖或具有葡萄糖單元之二糖類或多糖
類。眾多具有葡萄糖單元之二糖類或多糖類於該業者為周知。該等之非限定例可列舉蔗糖、麥芽糖、乳糖、澱粉、纖維素。又,由於該等在米糠、廢糖蜜、玉蜀黍分解液或纖維素分解液等之生物質中多量含有,較好使用以該等天然資源作為碳源之培養基。又,在轉形體表現有用之附加形質之情況,例如對於抗生物質具有耐性標識時,培養基可含有對應之抗生物質。經由此可降低因發酵中之雜菌導至污染之危險。又,宿主微生物不能將纖維素等碳源同化時,在該宿主微生物實施導入外來基因等公知之基因工學方法,藉此可適應使用該等碳源之鯊肌醇及其衍生物之生產。外來基因可列舉例如纖維素酶基因或澱粉酶基因等。
培養可為分批式,亦可為連續式。又,於任何一種情況亦可為在培養之適當時點追加補給之上述碳源等之形式。另,培養可邊維持適合之溫度、氧濃度、pH等邊繼續培養。通常源自微生物宿主細胞之轉形體適合之培養溫度通常在15℃至45℃、較好在25℃至37℃之範圍。宿主微生物為好氣性時,為了確保發酵中適當之氧濃度,必需進行振盪(燒瓶培養等)、攪拌/通氣(小型發酵罐(jar fermentor)培養等)。該等之培養條件業者可容易地設定。
從上述之培養物將鯊肌醇或其衍生物精製之方法可為將業者公知之精製方法適當組合者。為原核微生物宿主細胞之轉形體時,本發明之鯊肌醇存在於培養上清液中或菌體內,必要時可從培養菌體萃取。從培養菌體萃取時,例如可將培養物離心分離,將上清液與菌體分離,利用均化器同時藉由界面活性劑、有機溶劑、酵素等將菌體破壞。從培養上清液及根據情況之菌體
萃取液將鯊肌醇或其衍生物精製之典型方法可列舉下述實施方式:利用經由調整pH等將蛋白質沈澱之除蛋白質處理、利用活性碳吸附不純物而除去之、利用離子交換樹脂等之層析法等之精製步驟。另,亦可將經層析法分離之畫分乾燥而獲得之固體,從例如水-乙醇系再結晶。當然,根據製品可視目的之純度,刪除一部分之步驟或實施追加之層析法或再結晶等之精製步驟。
本發明第2課題相關之鯊肌醇衍生物具有將葡萄糖殘基與鯊肌醇殘基藉由β 1→4鍵結合之構造,為以下構造式表示者。
上述化合物為新穎之化合物,亦稱為1-O-β-D-吡喃葡糖基-鯊肌醇。
如後述之實施例,本發明之鯊肌醇衍生物經由可催化β-糖苷鍵水解反應之酵素,例如經由β-糖苷酶(EC 3.2.1.21)即可容易分解,容易地生成葡萄糖及鯊肌醇。因此,經由該酵素對於本發明鯊肌醇衍生物之作用,即可生產鯊肌醇。
尤其是,本發明之鯊肌醇衍生物如下述,與原本之鯊肌醇相比,顯示至少4倍以上(25℃,W/V)之水溶性。因此,本發明之鯊肌醇衍生物可從在水性液中以高濃度生產及處理,獲
得本發明之鯊肌醇衍生物,將此以上述酵素處理,生產鯊肌醇之利點多,因此,該等方法為本發明鯊肌醇衍生物之較佳利用方法之一。
為了生產上述之鯊肌醇,將本發明之鯊肌醇衍生物以β-葡糖苷酶等進行酵素性分解,例如只要藉由水或緩衝液(乙酸緩衝液、磷酸緩衝液等),對於本發明鯊肌醇衍生物之溶液添加適當量之酵素,以適當條件及時間於該酵素反應將該溶液保溫即可。於該等目的可有利使用之β-葡糖苷酶有市售品,雖然任何一種都可使用,惟,只要利用例如源自曲黴(Aspergillus)屬之黴之纖維二糖酶(Cellobiase)(SIGMA公司製造)即可。添加之酵素量係參考製造商之指示以本發明鯊肌醇衍生物溶液中之濃度等為基礎適當決定即可。又,反應時之pH值通常在pH4.0至9.0之範圍,主要是使用之酵素最適當之pH即可。反應時之溫度亦只要是使用之酵素之最適溫度範圍即可,例如在約20至50℃之範圍即可。反應時間只要是定量追踪本發明鯊肌醇衍生物之分解率,而設定為本發明之鯊肌醇衍生物全都轉換為鯊肌醇之時點即可。之後,只要將鯊肌醇從反應液中經由再結晶等分離即可。
又,如後述之實施例,將本發明之轉形體在生產鯊肌醇以及實質量之本發明之鯊肌醇衍生物之條件下培養時,可將該轉形體之培養物原狀以上述酵素進行處理或將該培養物以除蛋白質處理或活性碳處理程度進行粗精製後經由酵素處理,即可更提高鯊肌醇之生產性。
又,作為醫藥品、食品、化粧品等之有效成分或機能性成分使用,亦為本發明鯊肌醇衍生物潛在性用途之一。亦即,
如上所述,鯊肌醇之生理活性已明瞭,由於本發明之鯊肌醇衍生物進行酵素性分解,容易生成鯊肌醇,因而期待本發明之鯊肌醇衍生物在生體內進行酵素性分解產生鯊肌醇,在醫藥品等中添加本發明之鯊肌醇衍生物本體為非常有趣之本發明之利用形式。
將以上之說明提供給業者,應可充分實施本發明。以下,以說明為目的,提供實施例,惟,本發明不只限於該等該實施例。又,於本說明書若無特別說明,核苷酸序列以從5’向3’之方向記載。
於本實施例製作保有含有編碼肌醇-1-磷酸合成酶之核酸之表現匣、含有編碼肌肉肌醇脫氫酶之核酸之表現匣及含有編碼鯊肌醇脫氫酶之核酸之表現匣之本發明轉形微生物,藉此研究鯊肌醇之生產能力。
將菌體從經分離之酒精酵母培養液回收,使用Nucleo Spin Tissue(商品名,MACHEREY-NAGEL公司製造)萃取基因組(genome)DNA。使用萃取之基因組DNA為模板(template),經由以下之引子進行聚合酵素鏈鎖反應(PCR)增幅(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(商品名,Takara Bio公司製造),反應條件:98℃ 10秒,55℃ 5秒,72℃ 20秒,28循環)、選殖INO1基因之編碼區(序列編號1)。
前置(Forward):a t g a c a g a a g a t a a t a t t g c t c(序列編號9)
反置(Reverse):t t a c a a c a a t c t c t c t t c g(序列編號10)
接著,獲得之ino1編碼區在下述序列之啟動子之下流可轉錄插入。
啟動子: (序列編號11)
亦即,在質體pNFP-A51(BCRC910572)(FERM P-22182,於2011年10月25日寄存於獨立行政法人製品評估技術基盤機構特許生物寄存中心。國際寄存編號:FERM BP-11515)之多重選殖位插入終止子序列及上述啟動子序列。使導入之啟動子序列之下流連接上述經選殖之ino1編碼區,構築pNFP-D78。將構築之pNFP-D78經由氯化鈣法(參照羊土社 基因工學實驗摘記 上 田村隆明著)在大腸菌AKC-016株(BCRC940653)(FERM P-22104,於2011年4月20日寄存於獨立行政法人製品評估技術基盤機構特許生物寄存中心。國際寄存編號:FERM BP-11512)轉染。經由SDS-PAGE確認在該大腸菌可溶性畫分之肌醇-1-磷酸合成酶之高表現。
將枯草芽孢桿菌(NBRC13719)在LB培養基中(2mL),於30℃振盪培養。培養完成後將菌體從培養液回收,使用Nucleo Spin Tissue(商品名,MACHEREY-NAGEL公司製造)萃取基因組DNA。使用萃取之基因組DNA為模板,經由以下之引子進行聚合
酵素鏈鎖反應(PCR)增幅(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(商品名,Takara Bio公司製造),反應條件:98℃ 10秒,55℃ 5秒,72℃ 20秒,28循環),選殖iolG基因之編碼區(序列編號5)。
前置:a t g a g t t t a c g t a t t g g c g t a a(序列編號12)
反置:t t a g t t t t g a a c t g t t g t a a a a g a t t g
獲得之iolG編碼區在序列編號11之啟動子之下流可轉錄插入。亦即,在上述pNFP-A51之多重選殖位插入終止子序列及上述啟動子序列。使導入之啟動子序列之下流連接上述經選殖之iolG編碼區,構築pNFP-J22。將構築之pNFP-J22經由氯化鈣法(參照羊土社 基因工學實驗摘記 上 田村隆明著)轉染於大腸菌株FERM P-22104。經由SDS-PAGE確認在該大腸菌可溶性畫分之肌肉肌醇脫氫酶之高表現。
將枯草芽孢桿菌(NBRC13719)在LB培養基中(2mL),於30℃振盪培養。培養完成後將菌體從培養液回收,使用Nucleo Spin Tissue(商品名,MACHEREY-NAGEL公司製造)萃取基因組DNA。使用萃取之基因組DNA為模板,經由以下之引子進行聚合酵素鏈鎖反應(PCR)增幅(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(商品名,Takara Bio公司製造),反應條件:98℃ 10秒,55℃ 5秒,72℃ 20秒,28循環),選殖iolW基因之編碼區(序列編號7)。
前置:a t g a t a a c g c t t t t a a a g g g g(序列編號14)
反置:t t a g t g c t c c a g c a t a a t g g(序列編號15)
獲得之iolW編碼區在序列編號11之啟動子之下流
可轉錄插入。亦即,在上述pNFP-A51之多重選殖位插入終止子序列及上述啟動子序列。使導入之啟動子序列之下流連接上述經選殖之iolW編碼區,構築pNFP-J36。將構築之pNFP-J36經由氯化鈣法(參照羊土社 基因工學實驗摘記 上 田村隆明著)轉染於大腸菌株FERM P-22104。經由SDS-PAGE確認在該大腸菌可溶性畫分之鯊肌醇脫氫酶之高表現。
將pNFP-D78以SalI分解,進行平滑末端化及5’末端脫磷酸化。對pNFP-J22中之iolG表現匣及pNFP-J36中之iolW表現匣進行選殖,將兩個表現匣連接於pNFP-D78。取得在與pNFP-D78中之INO1表現匣為順方向連接有iolG表現匣及iolW表現匣之質體。
將依照上述步驟構築之質體在大腸菌AKC-016株(FERM P-22104,於2011年4月20日寄存於獨立行政法人製品評估技術基盤機構特許生物寄存中心。國際寄存編號:FERM BP-11512)使用氯化鈣法(參照羊土社 基因工學實驗摘記 上 田村隆明著)轉染。
將獲得之轉形體在含有安比西林(100mg/L)之LB盤上,於37℃培養1日,使形成菌落。將含有安匹西林(100mg/L)之LB培養基2mL放入15mL容量之試驗管中,從上述盤將菌落用白金耳接種,於37℃以180rpm培養3至5小時至OD(600nm)成為約0.5,將此作為用於本培養之前培養液。
在150mL容量之燒瓶中放入2g/L之葡萄糖及含有100mg/L之安比西林之LB培養基30mL,添加0.6mL之前培養液,進行本培養(鯊肌醇生產試驗)。培養條件如下所述;培養溫度32℃;攪拌180rpm;培養時間16.5小時。
將上述之培養液於4℃以10,000g×10分鐘進行離心分離,將上清液回收,測定培養上清液之鯊肌醇濃度。具體而言,將KS-G(保護管柱)、Sugar KS-801及Sugar KS-802(均為商品名,昭和電工(股)公司製造)連接,以HPLC(檢測器:RI、管柱溫度:70℃、流速:1mL/分鐘),定量培養上清液中之鯊肌醇濃度。定量之結果明瞭在培養上清中生產0.15g/L鯊肌醇,葡萄糖完全被消耗。該結果表示保有含有編碼肌醇-1-磷酸合成酶之核酸之表現匣、含有編碼肌肉肌醇脫氫酶之核酸之表現匣及含有編碼鯊肌醇脫氫酶之核酸之表現匣之3個表現匣,具有內因性肌醇單磷酸酯酶基因(亦即,肌醇單磷酸酯酶未被強化)之本發明之轉形微生物,係從葡萄糖直接且以一階段步驟生產鯊肌醇。
於本實施例製作保有含有編碼肌醇-1-磷酸合成酶之核酸之表現匣、含有編碼肌醇脫氫酶之核酸之表現匣、含有編碼肌肉肌醇脫氫酶之核酸之表現匣及含有編碼鯊肌醇脫氫酶之核酸之表現匣之4個表現匣之本發明轉形微生物,經由此研究鯊肌醇之生產能力。
將大腸菌株W3110(NBRC 12713)在LB培養基中
(2mL),於37℃振盪培養。培養完成後將菌體從培養液回收,使用Nucleo Spin Tissue(商品名,MACHEREY-NAGEL公司製造)以萃取基因組DNA。使用萃取之基因組DNA為模板,經由以下之引子進行聚合酵素鏈鎖反應(PCR)增幅(Prime STAR Max DNA Polymerase(商品名,Takara Bio公司製造),反應條件:98℃ 10秒,55℃ 5秒,72℃ 20秒,28循環)、將suhB基因之編碼區(序列編號3)進行選殖。
前置:a t g c a t c c g a t g c t g a a c(序列編號16)
反置:t t a a c g c t t c a g a g c g t c g(序列編號17)7)
獲得之suhB編碼區在下述序列之啟動子之下流可轉錄插入。
啟動子: (序列編號18)
亦即,在上述pNFP-A51之多重選殖位中插入終點序列及序列編號18之啟動子序列。使導入之啟動子序列之下流連接上述經選殖之suhB編碼區,構築pNFP-A54。將構築之pNFP-A54經由氯化鈣法(參照羊土社 基因工學實驗摘記 上 田村隆明著)轉染於大腸菌株FERM P-22104。經由SDS-PAGE確認在該大腸菌可溶性畫分之肌醇單磷酸酯酶之高表現。
將實施例1製作之pNFP-D78以SalI分解、平滑末端化及5’末端脫磷酸化。選殖pNFP-A54中之suhB表現匣,連
接於pNFP-D78。取得在與pNFP-D78中之INO1表現匣為順方向連接有suhB表現匣之pNFP-G22。接著,將pNFP-G22以SalI分解、平滑末端化及5’末端脫磷酸化。將實施例1製作之pNFP-J22中之iolG表現匣及pNFP-J36中之iolW表現匣進行選殖,將兩個表現匣連接於pNFP-G22。取得在與pNFP-G22中之INO1表現匣及suhB表現匣為順方向連接有iolG表現匣及iolW表現匣之質體。
將依照上述步驟構築之質體在大腸菌AKC-016株(FERM P-22104,於2011年4月20日寄存於獨立行政法人製品評估技術基盤機構特許生物寄存中心。國際寄存編號:FERM BP-11512)使用氯化鈣法(參照羊土社 基因工學實驗摘記 上田村隆明著)轉染。
將獲得之轉形體在含有安比西林(100mg/L)之LB盤上,於37℃培養1日,使形成菌落。將含有安匹西林(100mg/L)之LB培養基2mL放入15mL容量之試驗管,從上述盤將菌落用白金耳接種,於37℃以180rpm培養3至5小時至OD(600nm)成為約0.5,將此作為用於本培養之前培養液。
在150mL容量之燒瓶中放入2g/L之葡萄糖及含有100mg/L之安比西林之LB培養基(表1)30mL,添加0.6mL之前培養液,進行本培養(鯊肌醇生產試驗)。培養條件如下所述;培養溫度32℃;攪拌180rpm;培養時間16.5小時。
將上述之培養液於4℃以10,000g×10分鐘進行離心分離,將上清液回收,測定培養上清液之鯊肌醇濃度。具體而言,將KS-G(保護管柱)、Sugar KS-801及Sugar KS-802(均為商品名,昭和電工(股)公司製造)連接,以HPLC(檢測器:RI、管柱溫度:70℃、流速:1mL/分鐘),定量培養上清液中之鯊肌醇濃度。定量之結果明瞭在培養上清中生產0.09g/L鯊肌醇,葡萄糖完全被消耗。另一方面,在以本合成培養基生產鯊肌醇之條件下則在培養時間為16.5小時之時間點,肌醇單磷酸酯酶活性非強化株則在培養上清液未檢測出鯊肌醇波峰。
因此判定,於本發明之轉形微生物中使肌醇單磷酸酯酶活性強化甚為有利。
將上述2-c)之轉形體在含有安比西林(100mg/L)之LB盤上,於37℃培養1日,使形成菌落。將含有安匹西林(100mg/L)之LB培養基30mL放入15mL容量之燒瓶中,從上述盤將菌落用白金耳接種,於37℃以180rpm培養3至5小時至OD(600nm)成為約0.5,將此作為用於本培養之前培養液。
在1000mL容量之Jar培養裝置(丸菱生物工程(Bioengineering)公司製造)中放入1g/L之葡萄糖及含有100mg/L之安比西林之下述合成培養基(表2)300mL,添加6mL之前培養液,進行本培養(使用Jar裝置之鯊肌醇生產試驗)。培養條件如下所述;培養溫度32℃;培養pH 6.0[下限];添加鹼28%(重量/容量)氨水;攪拌850rpm;通氣1vvm。適當添加成為原料之葡萄糖給料溶液(表3),使培養液中之葡萄糖濃度成為0至5g/L。
培養68小時後將上述之培養液於4℃以10,000g×10分鐘進行離心分離,將上清液回收,測定培養上清液之鯊肌醇濃度。具體而言,將KS-G(保護管柱)、Sugar KS-801及Sugar KS-802(均為商品名,昭和電工(股)公司製造)連接,以HPLC(檢測器:RI、管柱溫度:70℃、流速:1mL/分鐘)定量培養上清液中之鯊肌醇濃度定量。
定量之結果,培養上清液中生產之鯊肌醇,其濃度為前所未有之12.4g/L。另一方面,在精製步驟成為問題之肌肉肌醇,在培養上淸液中幾乎不存在,其濃度在0.1%以下。
將於上述實施例2中使用Jar培養裝置之鯊肌醇生產試驗所獲得之培養上清液以HPLC(管柱:Shodex Asahipak NH2P-50 4E(商品名,昭和電工(股)公司製造)、移動相:水/乙腈=25/75、流速:0.8mL/分鐘、管柱溫度:40℃、檢測器:RI)進行分析,
於培養上清液生產12.4g/L之鯊肌醇之同時,亦生產1.4g/L之鯊肌醇衍生物。分取該鯊肌醇衍生物之波峰,於以下之實驗使用。
將分取之化合物經由以下之NMR分析決定構造。
裝置:Avance600(Bruker Biospin公司製造)
探針:冷凍探針(13C高感度)
測定溫度:18℃(為了防止試料劣化及在1H-NMR時使水信號移動,全部為291K(18℃)。)
溶劑:D2O(ALDRICH公司製造)
內部標準:TSP
1H觀測頻率:600.13MHz
13C觀測頻率:150.92MHz
測定結果及波峰之歸屬如下所述。又,表中,波峰編號「GH-1」表示葡萄糖殘基之1位氫原子。又,「IH-1」表示鯊肌醇殘基之1位氫原子。其他亦相同。
上述之1H-NMR及13C-NMR各自示於第5圖及第6
圖。又,波峰之歸屬經由COSY、CH-COSY、HMBC、J分解二次元NMR確認。
將實施例3獲得之化合物以源自曲黴屬之黴的β-葡萄苷酶之纖維二糖酶(Cellobiase)(SIGMA公司製造)分解。具體而言,將實施例3獲得之化合物於400μL之150mM Bis-Tris緩衝液(pH=7.0),以6mg/mL之濃度溶解。於該溶液中加入25U/mL之纖維二糖酶100μL,於40℃保溫20小時(1200rpm、Bioshaker M.BR022、TAITEC公司製造),進行反應。在反應第0小時、第3小時、第20小時將反應液取樣,以HPLC(管柱:Shodex Asahipak NH2P-50 4E(商品名)、移動相:水/乙腈=25/75、流速:0.8mL/分鐘、管柱溫度:40℃、檢測器:RI)確認反應狀況。
如第7圖表示之結果,從反應開始起第3小時,實
施例3獲得之化合物,亦即本發明之鯊肌醇衍生物幾乎完全分解,生成對應量之葡萄糖及鯊肌醇。又,從反應開始第20小時後,本發明之鯊肌醇衍生物完全被分解。因此,判定本發明之鯊肌醇衍生物經由β-葡糖苷酶即容易被分解。又,從本酵素實驗亦確認本發明之鯊肌醇衍生物之構造決定的正確度。
本發明可利用於鯊肌醇之工業發酵生產。本發明之新穎鯊肌醇衍生物在鯊肌醇的工業性生產亦有用。
本說明書提到之質體及微生物,記載該等係寄存時,任一者都寄存於(寄存機關之名稱)「IPOD獨立行政法人製品評估技術基盤機構特許生物寄存中心(IPOD、NITE)」;(寄存機關收信
人之地址)「日本國郵便編號305-8566茨城県市東1丁目1番地1中央第6」。
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
日本國、獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許生物寄託中心
1. 2011年4月20日、FERM ABP-11512
2. 2011年10月25日、FERM ABP-11513
3. 2011年10月25日、FERM ABP-11514
4. 2011年10月25日、FERM ABP-11515
<110> 旭化成化學股份有限公司(ASAHI KASEI CHEMICALS CORPORATION)
<120> 鯊肌醇之製造方法(METHOD OF PRODUCING SCYLLO-INOSITOL)
<130> F112221-WO-00
<150> JP 2012-020556
<151> 2012-02-02
<150> JP 2012-248490
<151> 2012-11-12
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1602
<212> DNA
<213> 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1602)
<400> 1
<210> 2
<211> 533
<212> PRT
<213> 釀酒酵母
<400> 2
<210> 3
<211> 804
<212> DNA
<213> 大腸桿菌(Escherichia coli)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(804)
<400> 3
<210> 4
<211> 267
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<400> 4
<210> 5
<211> 1035
<212> DNA
<213> 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1035)
<400> 5
<210> 6
<211> 344
<212> PRT
<213> 枯草芽孢桿菌
<400> 6
<210> 7
<211> 1077
<212> DNA
<213> 枯草芽孢桿菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1077)
<400> 7
<210> 8
<211> 358
<212> PRT
<213> 枯草芽孢桿菌
<400> 8
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INO1編碼區用前置PCR引子
<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INO1編碼區用反置PCR引子
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<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INO1編碼序列啟動子
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> iolG編碼區用前置PCR引子
<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> iolG編碼區用反置PCR引子
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> iolW編碼區用前置PCR引子
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<212> DNA
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<220>
<223> iolW編碼區用反置PCR引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> suhB編碼區用前置PCR引子
<400> 16
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> suhB編碼區用反置PCR引子
<400> 17
<210> 18
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> suhB編碼區用啟動子
<400> 18
由於本案的圖僅係序列或數據,並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。
Claims (18)
- 一種鯊肌醇及鯊肌醇衍生物之製造方法,其特徵為包含以下之步驟:1)準備保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇脫氫酶基因及鯊肌醇脫氫酶基因之轉形微生物之步驟;2)在適合上述微生物生育及/或維持之條件下將該微生物與葡萄糖或具有葡萄糖單元之二糖類或多糖類接觸之步驟。
- 如申請專利範圍第1項所述之製造方法,其中,上述鯊肌醇衍生物為下述構造式表示之化合物者:
- 如申請專利範圍第1項或第2項所述之製造方法,其中,上述轉形微生物之特徵為具有誘導機能性肌醇單磷酸酯酶過剩生產或肌醇單磷酸酯酶活化之基因重組或變異。
- 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製造方法,其中,上述轉形微生物係源自不具有肌肉肌醇同化能之微生物者。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之製造方法,其中,上述轉形微生物係源自選自由大腸菌(E.coli)、桿菌屬(Bacillus)細菌、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細菌、發酵單孢 菌屬(Zymomonas)細菌所成群組之細菌者。
- 如申請專利範圍第3項至第5項中任一項所述之製造方法,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之過剩生產係經由對於上述轉形微生物進行下述誘導:a)導入外來肌醇單磷酸酯酶基因、b)增加內因性肌醇單磷酸酯酶基因之複製數、c)在內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區導入變異、d)將內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區以高表現誘導性外來調整區置換、或e)使內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區缺失。
- 如申請專利範圍第6項所述之製造方法,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之過剩生產係經由對於上述轉形微生物導入外來肌醇單磷酸酯酶基因進行誘導者。
- 如申請專利範圍第3項至第5項中任一項所述之製造方法,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之活化係對於上述轉形微生物進行下述誘導者:f)在內因性肌醇單磷酸酯酶基因中導入變異、g)將內因性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分或全部置換、h)使內因性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分缺失、i)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之其他蛋白質、j)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之化合物之生成。
- 一種轉形微生物,其為保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇脫氫酶基因及鯊肌醇脫氫酶基因者。
- 如申請專利範圍第9項所述之轉形微生物,其中,上述轉形微 生物更具有誘導機能性肌醇單磷酸酯酶過剩生產或肌醇單磷酸酯酶活化之基因重組或変異者。
- 如申請專利範圍第9項或第10項所述之轉形微生物,其中,上述轉形微生物係源自不具有肌肉肌醇同化能之微生物者。
- 如申請專利範圍第9項至第11項中任一項所述之轉形微生物,其中,上述轉形微生物為源自選自由大腸菌、桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單孢菌屬細菌所成群組之細菌者。
- 如申請專利範圍第10項至第12項中任一項所述之轉形微生物,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之過剩生產係經由對於上述轉形微生物進行下述誘導者:a)導入外來肌醇單磷酸酯酶基因、b)增加內因性肌醇單磷酸酯酶基因之複製數、c)在內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區導入變異、d)將內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區以高表現誘導性外來調整區置換、或e)使內因性肌醇單磷酸酯酶基因之調整區缺失。
- 如申請專利範圍第13項所述之轉形微生物,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之過剩生產係經由對於上述轉形微生物導入外來肌醇單磷酸酯酶基因而進行誘導者。
- 如申請專利範圍第10項至第12項中任一項所述之轉形微生物,其中,上述肌醇單磷酸酯酶之活化係對於上述轉形微生物進行下述誘導者:f)在內因性肌醇單磷酸酯酶基因中導入變異、g)將內因性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分或全部置換、 h)使內因性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分缺失、i)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之其他蛋白質、j)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之化合物之生成。
- 一種化合物,為具有下述構造式之化合物:
- 一種鯊肌醇之製造方法,係將如申請專利範圍第16項所述之化合物經由可催化β-糖苷鍵水解反應之酵素進行分解,生成鯊肌醇者。
- 一種組成物,係含有鯊肌醇及如申請專利範圍第16項所述之化合物者。
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