JPS6130553B2 - - Google Patents

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JPS6130553B2
JPS6130553B2 JP10456378A JP10456378A JPS6130553B2 JP S6130553 B2 JPS6130553 B2 JP S6130553B2 JP 10456378 A JP10456378 A JP 10456378A JP 10456378 A JP10456378 A JP 10456378A JP S6130553 B2 JPS6130553 B2 JP S6130553B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
medium
yeast
strain
itaconic acid
culture
Prior art date
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Expired
Application number
JP10456378A
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English (en)
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JPS5534017A (en
Inventor
Takeshi Tabuchi
Tadaatsu Nakahara
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsubishi Kasei Corp
Original Assignee
Mitsubishi Kasei Corp
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、酵母を培養してイタコン酸を培地中
に生成せしめ、それを培地中より採取することを
特徴とするイタコン酸の製造方法に関するもので
ある。 これまで、イタコン酸を生産する微生物として
は、古くよりアスペルギルス.イタコニクス
(Aspergillus itaconicus)、アスペルギル.テレ
ウス(Aspergillus terreus)等のカビ類ならび
に甘藷紫紋羽病菌(Helicobasidiummompa)及
びウスチラゴ.ゼアエ(Ustilago zeae)等の不
完全菌等が知られているに過ぎない。本発明者等
は種々の分離源より酵母を分離し、それ等の有機
酸の生産について鋭意検討を重ねてきたが、キヤ
ンデイダ属に属する、ある酵母がこれ迄酵母が生
産するという報告の全くなかつたイタコン酸を著
量に生成蓄積せしめることを発見し本発明を完成
した。 本発明に用いられる酵母は、キヤンデイダ属に
属する酵母であり、その代表的なものはキヤンデ
イダ.スピーシーズ(Candida sp)s―10号株
でありその菌学的性質は以下の通りである。 なお、本菌は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第4606号として寄託されている。 同定法は主にロダー(J.Lodder)編、“ザ イ
ースツ ア タクソノミツク スタデイ(The
Yeasts,A Taxonomic Study),Ed.2”、ノー
ス ホランド(North―Holland Pub.Co.),1970
及びウイツカーハム(L.J.Wickerham),“タクソ
ノミイ オブ イースツ(Taxomomy of
yeast)”,Bull.No.1029,U.S.Dept.Agric.
Washington,D.C.,1951によつた。 麦芽汁培地:25℃3日後、細胞は卵形〜楕円形、
5〜10×2〜4μm.培地は着色しない。小島
(islets)及び沈澱物を形成する。酵母にみられ
る通常の出芽による他、細胞から突出した小歯
(denticles)上に分芽胞子を生ずる(第1図参
照)。 第1図は25℃、3日後における麦芽汁中の細
胞形態を表わす。 麦芽寒天培地:25℃3日後、斜面培養の集落は生
育良好、肉色、平滑、輝光、全縁;培地の着色
なし、10日後集落は肉色〜淡黄色、平滑〜皺
状、粘稠〜膜質、鈍色になり、周縁は乱糸状に
なる。 Dalmau平板培養(Difco酵母形態観察用培地及び
コーン・ミール寒天):真正菌糸(幅1〜2μ
m)、仮性菌糸、分芽胞子を形成する。細胞又
は菌糸から突出した小歯(denticles)がで
き、その上に分芽胞子を形成する場合がある
(第2図および第3図参照)。第2図および第3
図はいずれも細胞又は菌糸から突出した小歯上
に生ずる分芽胞子を表わし、第2図はDifco酵
母形態観察用培地で25℃、4日後のもの、第3
図はコーン・ミール寒天で25℃、10日後のもの
を表わす。 胞子形成:子のう胞子、冬胞子、射出胞子、内生
胞子、分節胞子、厚膜胞子を形成しない。 真正菌糸は“かすがい連結”(Clamp
Connection)を伴わない。 発酵能: グルコース − ガラクトース − シユクロース − マルトース − セロビオース − トレハロース − ラクトース − メリビオース − ラフイノース − メレジトース − イヌリン − 炭素化合物の資化性: グルコース + ガラクトース + L―ソルボース + シヨ糖 + 麦芽糖 + セロビオース + トレハロース + 乳 糖 + メリビオース − ラフイノース + メレジトース + イヌリン + 可溶性デンプン + D―キシロース + L―アラビノース + D―アラビノース − D―リボース − L―ラムノース − エタノール + グリセロース + エリスリトール + アドニトール + ダルシトール − ガラクシトール − D―マンニトール + α―メチル―D―グルコシド + サリシン − コハク酸 + クエン酸 − イノシトール + アルブチンの分解:± 窒素化合物の資化性: 硝酸カリ + 亜硝酸カリ − 硫酸アンモニア + ビタミン欠培地における生育:陽性 デンプン様物質の生産:陰性 37℃における生育:陰性 ウレアーゼ: + DNase: + カロチノイドの生成: + 分離源:樹液 本菌株S―10号菌は子のう胞子及び射出胞子を
形成しないことから子のう菌酵母類又はスボロボ
ロミセス科酵母類ではない。本菌株は真正菌糸、
仮性菌糸、分芽胞子を形成するが、冬胞子及びカ
スガイ連結を形成しないところから、担子菌酵母
類ではなく、不完全菌亜門に属する無胞子酵母類
である。 上記の記載の通り、本菌株の主要な性質(属レ
ベルの性質)は無胞子酵母類のCandida属の属の
記相(diagnosis)を満足する。 Candida属には80種程容認されている(J.
hodder編、前出)が、その内約60種は硝酸塩を
資化しない種であり、残り約20種が硝酸塩を資化
する種である。本菌株は後者に属する、後者に属
するCandida酵母で、本菌株の性質であるところ
の真正菌糸、仮性菌糸をともに形成し、醗酵能陰
性、麦芽糖、シヨ糖、乳糖の資化性がいずれも陽
性である既知種はキヤンデイダ スコツテイー
デイデンス エト ロダー(Candida scottii
Diddens et Lodder)(完全時代ロイコスポリデ
イウム スコツテイー フエル エト アル
Leucosporidium scottii Fell et al.))である
(J.hodder編、前出)。しかし本菌株はC.scottii
は炭素源の資化性パターンがイヌリン、可溶性デ
ンプン、L―ラムノース、ガラクシトール、サリ
シン、コハク酸、イノシトールで異なる。又、小
歯上に分芽胞子を形成するのも本菌株の特徴であ
る。種レベルの同定については既知種とのさらに
詳細な比較検討が必要であるので本菌株はキヤン
デイダ・スピーシーズ(Candida sp.)とす
る。 次に本発明で使用される培地について説明す
る。 先ず炭素源として通常の糖質たとえばグルコー
ス、シユークロース、マルトース、廃糖密、澱粉
等が用いられる。 その添加量は、通常糖として2〜20%、望まし
くは10〜15%である。 次に窒素源としては、例えば塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウムの様なアンモニア体の窒素
及び硝酸カリウム、硝酸ナトリウムの様な硝酸体
の窒素のいずれも利用可能であり、更に尿素、ア
ミノ酸等の有機体の窒素も利用出来る。添加量
は、無機体窒素として0.05〜0.5%程度である。
その他の培地成分としては、燐酸、カリウム、マ
グネシウム等で通常培養に用いられるものであ
る。 又、ビタミンの要求性は特にないが、コーン.
ステイーブ.リカー(C.S.L)の様なビタミン源
を0.05%程度添加すると醗酵が早くなる傾向があ
る。 次に培地のPHは、通常弱酸性のPH3〜6が良
く、好ましくはPH4〜6である。アンモニウム塩
を添加する場合には培養中イタコン酸の生産に伴
つてPHが低下するので、水酸化ナトリウム水溶液
等を適時無菌的に添加するか、あるいは炭酸カル
シウムを初期から添加しておくことにより、PHの
低下を防ぎ培地のPHを上記範囲に保つことが好ま
しい。 培養温度は通常20℃〜35℃、好ましくは26℃〜
30℃である。 本発明の酵母菌の培養は好気的条件下で行なわ
れる。 通常のコルベンを用いた振とう培養法やジヤー
フアーメンター及びタンクを用いた通気撹拌培養
が好ましい。 この様な条件下でイタコン酸生産性の酵母を培
養した場合、短期間の培養で高収率でイタコン酸
が得られる。 培養終了後、通常は硫酸または塩酸でPHを2迄
低下させ、更に遠心分離により酵母菌体を除去し
た後、上澄液を減圧下で濃縮すればイタコン酸が
析出して来る。 なお、本培養に用いられる酵母は天然より分離
された原株、たとえばキヤンデイダSP.S―10号
菌株でもちろん良いが、その単細胞分離株、UV
又はN―メチル―N′―ニトロ―N―ニトロ・グ
アニジン、エチル.メタンスルホネイト、アクリ
フラビン等による突然変異処理等によりイタコン
酸の生産量を飛躍的に向上させることは可能であ
り、その例は実施例3に示した通りである。 次に本発明を実施例によつて説明する。 実施例 1 麦芽エキス培地で3日間26℃でスラント培養し
たキヤンデイダSP S―10号菌株を種培地(グル
コース5%、NH4NO3 0.15% KH2PO4 0.02
%、MgSO4 7H2O 0.05%)で2日間26℃で生育
させた後、グルコース10%、塩化アンモニウム
0.1%、第1リン酸カリウム0.02%、硫酸マグネ
シウム7水塩0.05%、酵母エキス0.05%、炭酸カ
ルシウム5%、水道水(PH,6、120℃、20min
殺菌)なる組成の本培地(炭酸カルシウムは培地
中5%となる量を別途殺菌し、各フラスコに添加
した。)30mlを含む300ml三角フラスコに2ml接種
し、26℃で220r.p.mの回転振とう条件下で6日
間培養した。 培養終了後、培養液に塩酸を加えてPH2とし、
遠沈除菌後、生成したイタコン酸をコツペシヤー
ル(Koppeschaar)法(共立出版〓.微生物工学
講座5「カビの利用工業」P72〜P73、昭和31年
発行、参照)にて定量したところ、培養液1ml当
り、26mgであつた。 次にこの酸性培養液を20ml取り、3000r.p.mで
10分間遠心分離してその上澄液をとり、減圧下60
℃で5ml迄濃縮しイタコン酸の結晶を析出させ、
400mgの粗結晶を得た。 実施例 2 実施例1の方法において、本培養の培地の塩化
アンモニウム0.1%を硝酸カリウム1%とし、更
に炭酸カルシウムを添加しない培地で培養を行な
つた。培養6日後、実施例1と同様の方法で生成
したイタコン酸を測定した結果、イタコン酸の生
成量は12mg/mlであつた。 実施例 3 S―10号菌株を親株として、N―メチル―
N′ニトロ―N―ニトロソグアニジン(以下N.T.G
と略す)による変異処理を行ない、菌株の改良を
行なつた。 実施例1の本培養培地と同一組成の培地で、26
℃、2日間培養した菌体を集菌し、0.05Mリン酸
緩衝液(PH6.5)で2回洗浄後、0.04%N.T.G水溶
液で26℃、20〜40min振とう下に処理した。上記
リン酸緩衝液で2回洗浄後、上記液体培地の組成
に2%寒天及び0.5%炭酸カルシウムを添加した
平板培地で26℃で培養し、生じたコロニーを160
個分離し実施例1の方法で生成イタコン酸量を調
べたところ22株が親株よりも生産量が多かつた。
22株の生産量は表―1に示した。そのうらの最高
株M―45株は6日間の培養で44.6mg/mlの生産量
を示した。なお、このM―45株の菌学的諸性質に
ついて原株であるS―10号菌株との比較を行なつ
た結果、主要な性質は全て原株と同じであつた。
【表】
【表】 【図面の簡単な説明】
第1図〜第3図は、キヤンデイダ・スピーシー
ズS―10号菌の細胞形態図である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 キヤンデイダ属のイタコン酸生産性酵母を培
    養しイタコン酸を培地中に生成せしめ、これを採
    取することを特徴とするイタコン酸の製造方法。
JP10456378A 1978-08-28 1978-08-28 Preparation of itaconic acid Granted JPS5534017A (en)

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JP10456378A JPS5534017A (en) 1978-08-28 1978-08-28 Preparation of itaconic acid

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JPS5534017A JPS5534017A (en) 1980-03-10
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US5231016A (en) * 1988-05-02 1993-07-27 Rhone-Poulenc Chimie Microbiological production of itaconic acid
FR2702492B1 (fr) * 1993-03-12 1995-05-24 Rhone Poulenc Chimie Procédé de production par fermentation d'acide itaconique.
DE102008011854B4 (de) 2008-02-28 2014-02-20 Helmholtz-Zentrum Für Umweltforschung Gmbh - Ufz Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Itaconsäure
LU92409B1 (en) 2014-03-21 2015-09-22 Philipps Universit T Marburg Means and methods for itaconic acid production

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