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Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Glycerokinase Nachdem
erstmals von B u b 1 i t z und K e n n e d y die Gewinnung eines an Glycerokinase
angereicherten Extraktes aus Rattenleber beschrieben worden war (J. Biol. Chem.
211, S. 951 [1954]), gelang W i e 1 a n d und S u y t e r (Biochem. Z. 329, S. 320
[1957]) die Herstellung weitergereinigter Zubereitungen dieses die Phosphorylierungvon
Glycerin katalysierenden Enzyms aus Taubenleber. Für eine technische Darstellung
der in neuerer Zeit recht bedeutsam gewordenen Glycerokinase kommen diese Methoden
natürlich nicht in Betracht, schon im Hinblick auf die beschränkte Menge an diesem
Ausgangsmaterial. Auch konnten diese Autoren nur etwa 3,40/, des in der Taubenleber
enthaltenen Enzyms in gereinigter Form erhalten.
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Erfindungsgemäß gelingt es nun, in ergiebigem Maß reine kristallisierte
Glycerokinase durch geeignete Aufarbeitung des bei Züchtung von Candida mycoderma
(Reess) L o d d e r et v. R i jaus dem Zentralbüro für Schimmelkulturen, Baarn/Holland,
auf glycerinhaltigen Nährböden gebildeten Myceliums zu gewinnen.
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Das neue Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Glycerokinase
ist dadurch gekennzeichnet, daß man Candida mycoderma (Reess) L o d d e r et v.
R i jaus dem Zentralbüro für Schimmelkulturen, Baarn/Holland, in glycerinhaltigen
Nährmedien züchtet und aus dem gebildeten Mycel unter Anwendung an sich für die
Gewinnung von Enzymen bekannter Maßnahmen die Glycerokinase isoliert.
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Die Isolierung der Glycerokinase kann vorgenommen werden,, indem man
das Mycel durch Lyophilisierung trocknet, das getrocknete Mycel mittels Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen
mit pH-Werten von etwa 6 bis 8 extrahiert, den Extrakt auf etwa 60°C erwärmt und
die dabei entstehenden Ausfällungen abtrennt, die so gewonnene Lösung einer Fällung
mit Ammoniumsulfat unterwirft, den Niederschlag aus der Ammonsulfat-Fällung mit
Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen, enthaltend Ammonsulfat fallender Konzentration
und pH-Werte von etwa 6 bis 8, auswäscht, den Niederschlag in Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen
mit einem pH-Wert von etwa 6 bis 8 löst, die Lösung entsalzt, die salzfreie Lösung
über einen Anionenaustauscher leitet, das adsorbierte Enzym mittels Lösungen starker
Elektrolyte in steigender Konzentration eluiert, das Eluat mittels Ammoniumsulfat
einer fraktionierten Fällung unterwirft, die enzymreiche Fraktion in Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen
mit pH-Werten von etwa 6 bis 8 löst und die Glycerokinase aus der Lösung durch vorsichtiges
Zugeben von Ammoniumsulfat auskristallisiert.
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Die Aktivität des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aus Pilzmycel
(250 g) erhaltenen Enzympräparates (144 mg) betrug 101 Internationale Einheiten
je Milligramm (Definition der Internationalen Einheiten, s. Biochem. Z. 333, S.471
[1961]). Diese Aktivität ist 6fach höher als die Aktivität des Glycerokinasepräparates,
das von W i e 1 a n d und S u y t e r aus Taubenleber gewonnen worden war.
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Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist darin zu sehen, daß nunmehr ein besonders aktives und haltbares Glycerokinasepräparat
für wissenschaftliche und technisch präparative Zwecke in praktisch unbegrenzter
Menge zur Verfügung gestellt werden kann.
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Beispiel a) Verwendete Pufferlösungen Lösung I 0,05 M K2HP04; 0,01
M Glycerin; 0,001 M Äthylendiamintetraacetat (EDTA).
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Lösung 1I 0,01 M K,HP04 (pH 6,7); 0,01 M Glycerin; 0,001 M EDTA; zu
100 ml 31,3 g Ammoniumsulfat.
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Lösung III: 0,01M K,HP04 (pH 6,7); 0,01 M Glycerin; 0,001 M
EDTA; zu 100 ml 25,0 g Ammoniumsulfat.
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Lösung IV: 0,01 M K,HP04 (pH 6,7); 0,01 M Glycerin; 0,001 M EDTA.
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Lösung V: 0,01 M K,HP04 (pH 6,7); 0,1 M NaCl. Lösung VI: 0,01 M KIHP04
(pH 6,7); 0,2 M NaCl. Lösung VII: 0,01 M K2HP04 (pH 6,7).
Alle Lösungen
sind unmittelbar vor Gebrauch anzusetzen.
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b) Züchtung von Candida mycoderma Ein Medium der folgenden Zusammensetzung:
75 ml Glycerin (etwa 90°/»ig), 8,5 g NH,H,P04, 4 g KCI, 1 g MgS04, 1 g CaCl2, 10
mg FeS04 - 7H20, 10 mg ZnS04 - 7H20, 10 mg CuSO4 - 5H20, 0,4 mg Vitamin B2, 1 mg
p-Aminobenzoesäure, 50 V.g Biotin, Leitungswasser ad 101 wird mittels 5°/oigerAmmoniaklösung
auf ein pH von 7 eingestellt. Zur Beimpfung dient ein für das obige Nährmedium adaptierter
Stamm von Candida mycoderma. Von den Reinkulturen, die auf Schrägagar gehalten werden,
wird zunächst eine »Impfkultur« angelegt unter Benutzung des gleichen Nährbodens,
der im Hauptansatz Verwendung findet. Nach kräftiger Entwicklung wird mit dieser
Kultur der Gäransatz geimpft; die Impfmenge soll etwa 5 bis 10 °/o des Gesamtansatzes
ausmachen. Die Kulturdauer beträgt etwa 30 bis 40 Stunden bei kräftiger Belüftung
und Raumtemperatur. Der pH-Wert wird laufend mit 5°/»iger Ammoniaklösung zwischen
6,5 und 6,8 gehalten. Nach Beendigung des Wachstums wird das Mycel abfiltriert und
durch Lyophilisation getrocknet; Ausbeute etwa 250 g mit der Enzymaktivität von
etwa 160 E/g.
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c) Extraktion des Mycels 250 g des getrockneten Mycels werden in 2500
ml der Lösung I suspendiert. Diese Suspension wird bei 37°C insgesamt 3 Stunden
mechanisch gerührt. Sodann wird bei 3000 - g 30 Minuten lang zentrifugiert, worauf
der Rückstand mit 1250 ml der gleichen Phosphatlösung 2 Stunden bei 37°C nachextrahiert
wird; zentrifugieren wie oben.
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Die vereinigten Überstände (etwa 3200 ml) enthalten 15 g Gesamt-Protein
von der spezifischen Aktivität von etwa 2,8 E/mg.
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d) Erhitzung des Extraktes 3200 ml Extrakt werden innerhalb von 10
Minuten auf 60°C erwärmt und unter ständigem Rühren 1 Stunde bei dieser Temperatur
im Wasserbad belassen. Nach Abkühlen auf 10°C zentrifugiert man das denaturierte
Protein ab (30 Minuten bei 3000 - g). Volumen des Überstandes 2920 ml; Gesamtprotein
1,54 g der spezifischen Aktivität von etwa 20 E/mg. e) Ammoniumsulfat-Fraktionierung
In den Überstand werden innerhalb von 15 Minuten bei 3'C pro Liter 472 g Ammoniumsulfat
eingerührt, worauf der Ansatz 1 Stunde stehengelassen wird; anschließend wird abzentrifugiert
(60 Minuten bei 3000 - g).
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Der gelbgefärbte, trübe Überstand enthält etwa 6 °/o der Gesamtaktivität
und wird verworfen. Den Niederschlag suspendiert man in 80 ml Lösung 1I, rührt 15
Minuten im Eisbad und zentrifugiert 15 Minuten bei 18 000 - g in der Kälte. Das
Waschwasser enthält etwa 10/0 der Aktivität und wird verworfen. Auf dieselbe
Art wird eine zweite Waschung des Niederschlags mit 50 ml Lösung 111 durchgeführt.
Hierbei gehen etwa 5 °/o der Enzymaktivität in das Waschwasser. Der Niederschlag
wird mit wenig Lösung IV aufgenommen und zentrifugiert (10 Minuten bei 18 000 -
g); das Volumen des klaren Filtrates beträgt etwa 40 ml, sein Proteingehalt 820
mg. f) Dialyse und Chromatographie Die aus Verfahrensschritt e) resultierende Lösung
wird bei O' C insgesamt 14 Stunden lang gegen die Lösung IV dialysiert, und
zwar gegen 21 der Lösung IV bei dreimaligem Wechsel, also dreimal knapp 5 Stunden
lang gegen 21 Lösung IV.
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Für die chromatographische Trennung verwendet man eine Säule von 2,5
cm Durchmesser, die 20 cm hoch mit Diäthylamino-äthyl-cellulose gefüllt ist. Zur
Vorbereitung wird der Austauscher mit einer 0,2molaren K2HP04-Lösung gewaschen,
bis der pH-Wert des Ablaufes konstant ist; hierauf wird reichlich mit Lösung IV
nachgespült. Mit der gleichen Pufferlösung verdünnt man die dialysierte Enzymlösung
auf 80 ml (etwa 10 mg Protein/ml) und trägt sie auf die vorbereitete Säule bei 3'C
auf; die Tropfgeschwindigkeit beträgt 100 bis 150 ml pro Stunde. Zunächst wird mit
Lösung IV nachgewaschen und dann die Elution mit Lösung V begonnen; bei einer Abnahme
von 30-ml-Portionen enthalten die ersten acht Fraktionen praktisch keine Aktivität.
Die Elution wird jetzt mit Lösung VI fortgeführt und in 15-ml-Fraktionen aufgefangen.
Das Glycerokinase-Protein kommt etwa zwischen der fünften und zehnten Fraktion quantitativ
von der Säule; 295 mg Protein, dessen spezifische Aktivität etwa 67 E/mg beträgt.
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g) Ammoniumsulfat-Fraktionierung Zu 85 ml des Eluates gibt man innerhalb
von 30 Minuten festes Ammoniumsulfat bis zur Konzentration 1,9 M zu und zentrifugiert
10 Minuten bei 18 000 - g in der Kälte. Der Niederschlag darf nicht mehr als 10
°/o der Enzymaktivität enthalten; er wird verworfen. Geht bei der angegebenen Salzkonzentration
zuviel Aktivität in den Niederschlag, so wird dieser noch einmal aus einem Volumen
von 30 ml umgefällt. Der Überstand wird nun langsam mit festem Ammonsulfat auf 2,6
M gebracht und wie oben zentrifugiert.
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h) Kristallisation Den Niederschlag, der die Hauptmenge des Enzyms
enthält, löst man mit 20 ml Lösung VII, setzt festes Ammoniumsulfat bis zur Konzentration
1,9 M zu und zentrifugiert von einer geringen Trübung ab. Sodann bringt man den
Überstand sehr langsam (Dauer mindestens 1 Stunde) auf einen Gehalt von 2,0 M Ammoniumsulfat.
Der Proteingehalt dieser Lösung beträgt 220 mg; die spezifische Aktivität etwa 85
E/mg.
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Die Enzymlösung hat jetzt einen deutlichen Seidenglanz bekommen, der
sich während der nächsten Stunden zusehends verdichtet. Nach 2 Tagen, in deren Verlauf
die Lösung ständig mechanisch durchmischt wird, ist das Protein durchkristallisiert.
Die Kristalle trennt man durch hochtouriges Zentrifugieren in der Kälte ab, wäscht
sie einmal mit 20 ml eiskalter 2,0 M Ammoniumsulfatlösung (pH 6,8) und resuspendiert
sie in 20 ml derselben Lösung. Zum Umkristallisieren wird der Suspension vorsichtig
so viel Wasser zugesetzt, bis der Seidenglanz eben verschwunden ist (bei etwa 1,7
M Ammoniumsulfat), und erneut festes Ammoniumsulfat bis 1,95 M zugegeben. Über Nacht
kristallisiert das Enzym zu 95 °/o. Auf die gleiche Weise werden noch zwei Umkristallisationen
angeschlossen und das Enzym zuletzt in 2,2 M Ammoniumsulfatlösung suspendiert. Protein
etwa 150 mg von der spezifischen Aktivität von etwa 100 E/mg. Das bedeutet
eine
Ausbeute von etwa 38 °/a, bezogen auf die Aktivität des Mycels.