DE1238422B - Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Glycerokinase - Google Patents

Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Glycerokinase

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DE1238422B DE1960B0060595 DEB0060595A DE1238422B DE 1238422 B DE1238422 B DE 1238422B DE 1960B0060595 DE1960B0060595 DE 1960B0060595 DE B0060595 A DEB0060595 A DE B0060595A DE 1238422 B DE1238422 B DE 1238422B
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glycerokinase
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ammonium sulfate
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Rer Nat Hans Ulrich Bergmey Dr
Dr Rer Nat Guenter Holz
Hans Moellering
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Roche Diagnostics GmbH
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Boehringer Mannheim GmbH
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/12Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)

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Description

  • Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Glycerokinase Nachdem erstmals von B u b 1 i t z und K e n n e d y die Gewinnung eines an Glycerokinase angereicherten Extraktes aus Rattenleber beschrieben worden war (J. Biol. Chem. 211, S. 951 [1954]), gelang W i e 1 a n d und S u y t e r (Biochem. Z. 329, S. 320 [1957]) die Herstellung weitergereinigter Zubereitungen dieses die Phosphorylierungvon Glycerin katalysierenden Enzyms aus Taubenleber. Für eine technische Darstellung der in neuerer Zeit recht bedeutsam gewordenen Glycerokinase kommen diese Methoden natürlich nicht in Betracht, schon im Hinblick auf die beschränkte Menge an diesem Ausgangsmaterial. Auch konnten diese Autoren nur etwa 3,40/, des in der Taubenleber enthaltenen Enzyms in gereinigter Form erhalten.
  • Erfindungsgemäß gelingt es nun, in ergiebigem Maß reine kristallisierte Glycerokinase durch geeignete Aufarbeitung des bei Züchtung von Candida mycoderma (Reess) L o d d e r et v. R i jaus dem Zentralbüro für Schimmelkulturen, Baarn/Holland, auf glycerinhaltigen Nährböden gebildeten Myceliums zu gewinnen.
  • Das neue Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Glycerokinase ist dadurch gekennzeichnet, daß man Candida mycoderma (Reess) L o d d e r et v. R i jaus dem Zentralbüro für Schimmelkulturen, Baarn/Holland, in glycerinhaltigen Nährmedien züchtet und aus dem gebildeten Mycel unter Anwendung an sich für die Gewinnung von Enzymen bekannter Maßnahmen die Glycerokinase isoliert.
  • Die Isolierung der Glycerokinase kann vorgenommen werden,, indem man das Mycel durch Lyophilisierung trocknet, das getrocknete Mycel mittels Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen mit pH-Werten von etwa 6 bis 8 extrahiert, den Extrakt auf etwa 60°C erwärmt und die dabei entstehenden Ausfällungen abtrennt, die so gewonnene Lösung einer Fällung mit Ammoniumsulfat unterwirft, den Niederschlag aus der Ammonsulfat-Fällung mit Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen, enthaltend Ammonsulfat fallender Konzentration und pH-Werte von etwa 6 bis 8, auswäscht, den Niederschlag in Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen mit einem pH-Wert von etwa 6 bis 8 löst, die Lösung entsalzt, die salzfreie Lösung über einen Anionenaustauscher leitet, das adsorbierte Enzym mittels Lösungen starker Elektrolyte in steigender Konzentration eluiert, das Eluat mittels Ammoniumsulfat einer fraktionierten Fällung unterwirft, die enzymreiche Fraktion in Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen mit pH-Werten von etwa 6 bis 8 löst und die Glycerokinase aus der Lösung durch vorsichtiges Zugeben von Ammoniumsulfat auskristallisiert.
  • Die Aktivität des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aus Pilzmycel (250 g) erhaltenen Enzympräparates (144 mg) betrug 101 Internationale Einheiten je Milligramm (Definition der Internationalen Einheiten, s. Biochem. Z. 333, S.471 [1961]). Diese Aktivität ist 6fach höher als die Aktivität des Glycerokinasepräparates, das von W i e 1 a n d und S u y t e r aus Taubenleber gewonnen worden war.
  • Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß nunmehr ein besonders aktives und haltbares Glycerokinasepräparat für wissenschaftliche und technisch präparative Zwecke in praktisch unbegrenzter Menge zur Verfügung gestellt werden kann.
  • Beispiel a) Verwendete Pufferlösungen Lösung I 0,05 M K2HP04; 0,01 M Glycerin; 0,001 M Äthylendiamintetraacetat (EDTA).
  • Lösung 1I 0,01 M K,HP04 (pH 6,7); 0,01 M Glycerin; 0,001 M EDTA; zu 100 ml 31,3 g Ammoniumsulfat.
  • Lösung III: 0,01M K,HP04 (pH 6,7); 0,01 M Glycerin; 0,001 M EDTA; zu 100 ml 25,0 g Ammoniumsulfat.
  • Lösung IV: 0,01 M K,HP04 (pH 6,7); 0,01 M Glycerin; 0,001 M EDTA.
  • Lösung V: 0,01 M K,HP04 (pH 6,7); 0,1 M NaCl. Lösung VI: 0,01 M KIHP04 (pH 6,7); 0,2 M NaCl. Lösung VII: 0,01 M K2HP04 (pH 6,7). Alle Lösungen sind unmittelbar vor Gebrauch anzusetzen.
  • b) Züchtung von Candida mycoderma Ein Medium der folgenden Zusammensetzung: 75 ml Glycerin (etwa 90°/»ig), 8,5 g NH,H,P04, 4 g KCI, 1 g MgS04, 1 g CaCl2, 10 mg FeS04 - 7H20, 10 mg ZnS04 - 7H20, 10 mg CuSO4 - 5H20, 0,4 mg Vitamin B2, 1 mg p-Aminobenzoesäure, 50 V.g Biotin, Leitungswasser ad 101 wird mittels 5°/oigerAmmoniaklösung auf ein pH von 7 eingestellt. Zur Beimpfung dient ein für das obige Nährmedium adaptierter Stamm von Candida mycoderma. Von den Reinkulturen, die auf Schrägagar gehalten werden, wird zunächst eine »Impfkultur« angelegt unter Benutzung des gleichen Nährbodens, der im Hauptansatz Verwendung findet. Nach kräftiger Entwicklung wird mit dieser Kultur der Gäransatz geimpft; die Impfmenge soll etwa 5 bis 10 °/o des Gesamtansatzes ausmachen. Die Kulturdauer beträgt etwa 30 bis 40 Stunden bei kräftiger Belüftung und Raumtemperatur. Der pH-Wert wird laufend mit 5°/»iger Ammoniaklösung zwischen 6,5 und 6,8 gehalten. Nach Beendigung des Wachstums wird das Mycel abfiltriert und durch Lyophilisation getrocknet; Ausbeute etwa 250 g mit der Enzymaktivität von etwa 160 E/g.
  • c) Extraktion des Mycels 250 g des getrockneten Mycels werden in 2500 ml der Lösung I suspendiert. Diese Suspension wird bei 37°C insgesamt 3 Stunden mechanisch gerührt. Sodann wird bei 3000 - g 30 Minuten lang zentrifugiert, worauf der Rückstand mit 1250 ml der gleichen Phosphatlösung 2 Stunden bei 37°C nachextrahiert wird; zentrifugieren wie oben.
  • Die vereinigten Überstände (etwa 3200 ml) enthalten 15 g Gesamt-Protein von der spezifischen Aktivität von etwa 2,8 E/mg.
  • d) Erhitzung des Extraktes 3200 ml Extrakt werden innerhalb von 10 Minuten auf 60°C erwärmt und unter ständigem Rühren 1 Stunde bei dieser Temperatur im Wasserbad belassen. Nach Abkühlen auf 10°C zentrifugiert man das denaturierte Protein ab (30 Minuten bei 3000 - g). Volumen des Überstandes 2920 ml; Gesamtprotein 1,54 g der spezifischen Aktivität von etwa 20 E/mg. e) Ammoniumsulfat-Fraktionierung In den Überstand werden innerhalb von 15 Minuten bei 3'C pro Liter 472 g Ammoniumsulfat eingerührt, worauf der Ansatz 1 Stunde stehengelassen wird; anschließend wird abzentrifugiert (60 Minuten bei 3000 - g).
  • Der gelbgefärbte, trübe Überstand enthält etwa 6 °/o der Gesamtaktivität und wird verworfen. Den Niederschlag suspendiert man in 80 ml Lösung 1I, rührt 15 Minuten im Eisbad und zentrifugiert 15 Minuten bei 18 000 - g in der Kälte. Das Waschwasser enthält etwa 10/0 der Aktivität und wird verworfen. Auf dieselbe Art wird eine zweite Waschung des Niederschlags mit 50 ml Lösung 111 durchgeführt. Hierbei gehen etwa 5 °/o der Enzymaktivität in das Waschwasser. Der Niederschlag wird mit wenig Lösung IV aufgenommen und zentrifugiert (10 Minuten bei 18 000 - g); das Volumen des klaren Filtrates beträgt etwa 40 ml, sein Proteingehalt 820 mg. f) Dialyse und Chromatographie Die aus Verfahrensschritt e) resultierende Lösung wird bei O' C insgesamt 14 Stunden lang gegen die Lösung IV dialysiert, und zwar gegen 21 der Lösung IV bei dreimaligem Wechsel, also dreimal knapp 5 Stunden lang gegen 21 Lösung IV.
  • Für die chromatographische Trennung verwendet man eine Säule von 2,5 cm Durchmesser, die 20 cm hoch mit Diäthylamino-äthyl-cellulose gefüllt ist. Zur Vorbereitung wird der Austauscher mit einer 0,2molaren K2HP04-Lösung gewaschen, bis der pH-Wert des Ablaufes konstant ist; hierauf wird reichlich mit Lösung IV nachgespült. Mit der gleichen Pufferlösung verdünnt man die dialysierte Enzymlösung auf 80 ml (etwa 10 mg Protein/ml) und trägt sie auf die vorbereitete Säule bei 3'C auf; die Tropfgeschwindigkeit beträgt 100 bis 150 ml pro Stunde. Zunächst wird mit Lösung IV nachgewaschen und dann die Elution mit Lösung V begonnen; bei einer Abnahme von 30-ml-Portionen enthalten die ersten acht Fraktionen praktisch keine Aktivität. Die Elution wird jetzt mit Lösung VI fortgeführt und in 15-ml-Fraktionen aufgefangen. Das Glycerokinase-Protein kommt etwa zwischen der fünften und zehnten Fraktion quantitativ von der Säule; 295 mg Protein, dessen spezifische Aktivität etwa 67 E/mg beträgt.
  • g) Ammoniumsulfat-Fraktionierung Zu 85 ml des Eluates gibt man innerhalb von 30 Minuten festes Ammoniumsulfat bis zur Konzentration 1,9 M zu und zentrifugiert 10 Minuten bei 18 000 - g in der Kälte. Der Niederschlag darf nicht mehr als 10 °/o der Enzymaktivität enthalten; er wird verworfen. Geht bei der angegebenen Salzkonzentration zuviel Aktivität in den Niederschlag, so wird dieser noch einmal aus einem Volumen von 30 ml umgefällt. Der Überstand wird nun langsam mit festem Ammonsulfat auf 2,6 M gebracht und wie oben zentrifugiert.
  • h) Kristallisation Den Niederschlag, der die Hauptmenge des Enzyms enthält, löst man mit 20 ml Lösung VII, setzt festes Ammoniumsulfat bis zur Konzentration 1,9 M zu und zentrifugiert von einer geringen Trübung ab. Sodann bringt man den Überstand sehr langsam (Dauer mindestens 1 Stunde) auf einen Gehalt von 2,0 M Ammoniumsulfat. Der Proteingehalt dieser Lösung beträgt 220 mg; die spezifische Aktivität etwa 85 E/mg.
  • Die Enzymlösung hat jetzt einen deutlichen Seidenglanz bekommen, der sich während der nächsten Stunden zusehends verdichtet. Nach 2 Tagen, in deren Verlauf die Lösung ständig mechanisch durchmischt wird, ist das Protein durchkristallisiert. Die Kristalle trennt man durch hochtouriges Zentrifugieren in der Kälte ab, wäscht sie einmal mit 20 ml eiskalter 2,0 M Ammoniumsulfatlösung (pH 6,8) und resuspendiert sie in 20 ml derselben Lösung. Zum Umkristallisieren wird der Suspension vorsichtig so viel Wasser zugesetzt, bis der Seidenglanz eben verschwunden ist (bei etwa 1,7 M Ammoniumsulfat), und erneut festes Ammoniumsulfat bis 1,95 M zugegeben. Über Nacht kristallisiert das Enzym zu 95 °/o. Auf die gleiche Weise werden noch zwei Umkristallisationen angeschlossen und das Enzym zuletzt in 2,2 M Ammoniumsulfatlösung suspendiert. Protein etwa 150 mg von der spezifischen Aktivität von etwa 100 E/mg. Das bedeutet eine Ausbeute von etwa 38 °/a, bezogen auf die Aktivität des Mycels.

Claims (2)

  1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Glycerokinase, dadurch gekennzeichnet, daß man Candida mycoderma (Reess) L o d d e r et v. R i jaus dem Zentralbüro für Schimmelkulturen, Baarn/Holland, in glycerinhaltigen Nährmedien züchtet und aus dem gebildeten Mycel unter Anwendung an sich für die Gewinnung von Enzymen bekannter Maßnahmen die Glycerokinase isoliert.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung der Glycerokinase das Mycel durch Lyophilisierung trocknet, das getrocknete Mycel mittel Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen mit pH-Werten von etwa 6 bis 8 extrahiert, den Extrakt auf etwa 60'C erwärmt und die dabei entstehenden Ausfällungen abtrennt, die so gewonnene Lösung einer Fällung mit Ammoniumsulfat unterwirft, den Niederschlag aus der Ammonsulfat-Fällung mit Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen, enthaltend Ammonsulfat fallender Konzentration und pH-Werte von etwa 6 bis 8, auswäscht, den Niederschlag in Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen mit einem pH-Wert von etwa 6 bis 8 löst, die Lösung entsalzt, die salzfreie Lösung über einen Anionenaustauscher leitet, das adsorbierte Enzym mittels Lösungen starker Elektrolyte in steigender Konzentration eluiert, das Eluat mittels Ammoniumsulfat einer fraktionierten Fällung unterwirft, die enzymreiche Fraktion in Wasser-Glycerin-Puffer-Gemischen mit pH-Werten von etwa 6 bis 8 löst und die Glycerokinase aus der Lösung durch vorsichtiges Zugeben von Ammoniumsulfat auskristallisiert. In Betracht gezogene Druckschriften: O.Hoffmann-Ostenhof, »Enzymologie«, 1954, S. 32 bis 35.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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FR2458583A1 (fr) * 1979-06-06 1981-01-02 Toyo Jozo Kk Nouvelle glycerol kinase et sa production

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FR2458583A1 (fr) * 1979-06-06 1981-01-02 Toyo Jozo Kk Nouvelle glycerol kinase et sa production

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