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Beschreibung
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Die Erfindung betrifft neue Glycerinkinase und ihre Herstellung.
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Glycerinkinase ist in der Vergangenheit als Enzym bekannt geworden,
das die folgende Reaktion katalysiert.
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Reaktion: ATP + Glycerin
+ L-a-Glycerophosphat (EC 2.7.1.30 ATP : Glycerinphosphattransferase, empfohlener
Name: Glycerinkinase).
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Die bis heute bekannten Glyerinkinasen (im folgenden wird die Glycerinkinase
als GK bezeichnet) sind Enzyme aus Candida mycoderma (Biochem. Z., 329, 320 (1957),
ibid., 333, 471 (1961)), Enzyme aus Escherichia coli (J. Biol. Chem., 242, 1030
(1967)) und Enzyme aus Schweineleber (Method in Enzymology, Band5, 476 (1962), Biochem.
Z., 329, 320 (1957), J. Biol. Chem., 211, 951 (1954)).
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Es wurde gefunden, daß ein Streptomyces-Stamm A 2408, der aus einer
Bodenprobe des Sojabohnenfelds in Kakegawa-shi Shizuoka-ken, Japan, isoliert worden
ist, in seinen Zellen ein Enzym erzeugt, welches die Reaktion mit Glycerin und ATP
zur Bildung von ADP und L-a-Glycerophosphat katalysiert. Elektrophoretisch wurde
ein homogenes Enzym in gereinigter Form isoliert. Das Enzym gehört zur GK-Gruppe,
seine physikochemischen und biochemischen Eigenschaften sind bis jetzt jedoch noch
nicht bekannt und somit ist es ein neues GK.
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Die taxonomischen Eigenschaften des Streptomyces-Stamms A 2408 sind
wie folgt: I. Morphologische Eigenschaften: Die Farbe der Lufthyphen, die gereifte
Sporen tragen, ist bräunlich-grau bis gräülich-braun. Gelblich-braunes Substratmycelium.
Es bildet ein gelblich-braunes lösliches Pigment.
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Beobachtungen auf einem anorganischen Stärkeagar bei 300C während
10 Tagen sind wie folgt. Man beobachtet die gleichen morphologischen Merkmale wie
auf Hafermehlagar und Glycerin/ Asparagin-Agar.
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Die Lufthyphen besitzen einen Durchmesser von 0,6 bis 0,8 sie sind
gerade oder wellenförmig, wachsen mit einfacher Verzweigur.g und bilden viele Sporenketten.
Die Sporenketten bilden Spiralen mit losen 3 bis 5 Spiren in Form von Haken, Schlingen
oder Schlangen.
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Die Form der Sporen ist kugelförmig oder oval, 0,8 bis 1,0 x 1,O bis
1,5 p m, Oberflächen mit Stacheln.
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Die Substratmycelien sind verzweigt, sie wachsen wellenförmig oder
schlangenförmig, 0,5 bis 0,6 pm Durchmesser und üblicherweise kein Aufspalten der
Hyphen und Tragen von Sporen.
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Keine Bildung von Geiselsporen und Sporenträgern.
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II. Zusammensetzung der Diaminopimersäure: L-Diaminopimersäure wird
nachgewiesen.
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III. Eigenschaften auf verschiedenen Medien: Die Beobachtungen erfolgten
auf verschiedenen Medien bei 30 0C während 20 Tagen, wie es in Tabelle I (die Farbangabe
beruht auf "Color Harmony Manual, 4. Auflage 1958 (Container Corp. of America, USA))
erläutert wird.
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IV. Physiologische Eigenschaften: 1) Wachstumstemperatur: 12 bis 450C
2) Verflüssigung von Gelatine: positiv 3) Stärkehydrolyse: positiv 4) Magermilch:
Peptonisierung positiv, Koagulation negativ 5) Bildung von melaminartigem Pigment:
negativ 6) Ausnutzung der Kohlenstoffquellen: Ausnutzen: L-Arabinose, D-Fructose,
D-Glucose, i-Inosit, D-Mannit, Raffinose, L-Rhamnose, Saccharose und D-Xylose.
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Wie zuvor erläutert, gehört der erfindungsgemäße Mikroorganismusstamm
A 2408 zu Streptomyces wegen seiner Eigenschaften, daß das Luftmycelium ein Sporenkettenwachstum
von einem nicht-geteilten wahren Substratmycelium zeigt, dem Durchmesser des Myceliums
und der Sporengröße und der L-Art der Diaminopimelinsäure. Der Stamm A 2408 besitzt
die folgenden Eigenschaften. Die Farbe des Luftmyceliums ist bräunlich-grau bis
gräulich-braun. Die Sporenkette ist lose 3 bis 5 aufgespulte Spiralen. Die Oberfläche
der Sporen besitzt Dornen. Die Farbe des Substratmyceliums ist gelblich-braun.Bildung
von gelblich-braunem löslichen Pigment. Die Ausnutzung von Zucker ist weit. Keine
Bildung
von melaminartigem Pigment. Diese Eigenschaften können als
Streptomyces canus zugeordnet werden (Heinemann et al.) (AntibicLlos and Chemotherapy,
3, 1239 bis 1242 91953)) in International Streptomyces Project (ISP) (Inter. J.
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System. Bacteriol., 18 (2), 95 (1968)). Ein Vergleich mit dem erfindungsgemaßen
Stamm A 2408 und Streptomyces canus ISP 5017 zeigt die Ähnlichkeit der morphologischen,
Züchtungs- und physiologischen Eigenschaften.
Tabelle I Medium Wachstzum
Farbe des Substrat- Luftmycelium lösloches Pigment Saccharose/Nitrat- mäßig bis
goldbraun (3 pi) mäßig bis gut: keines Agar gut hellbraun (3 ec) Glucose/Asparagin-
mäßig senfbraun (2 pi) schlecht bis mä- keines Agar ßig: natur (3 dc) bis hellbraun
(3 ec) Glacerin/Aspargin- gut nelkenbraun (3 pl) bis gut: beige (3 ge) keines Agar
goldbraun (3 pi) bis beige-braun (3 ig) Stärke/anorgani- gut goldbraun (3 pi) bis
gut: beige (3 ge) keines sches Salz-Agar nelkennbraun (3 pl) bis silbergrau (3 fe)
Tylosin-Agar gut goldbraun (3 pi) bis gut: beige (3 ge) keines bis hellnelkenbraun
(3 pl) bis beige-braun braun (4 ng) Hafermehl-Agar gut goldbraun (3 pi) gut: beige
(3 ge) keines bis beige-braun (3 ig) Hefeextrakt/Malz- gut goldbraun (3 pi) bis
gut: natur (3 dc) keines extrakt-Agar bis silbergrau (3 fe) Glycerin/Nitrat- gut
nelkenbraun (3 pl) gut: natur (3 dc) nelkenbraun (3 pl) Agar bis beige (3 ge) Glycerin/Starke/
gut nelkenbraun (3 pl) gut: natur (3 dc) nelkenbraun (3 pl) Glutamat-Agar bis verschleitert
lohfarben (2 ge) Benett-Agar gut goldbraun (3 pi) gut: natur (3 dc) keines bis silbergrau
(3 fe)
Fortsetzung Tabelle I Emerson-Agar mäßig senfgold (2 pe)
wenig: weiß (a) keines Nähragar mäßig bis farblos bis hellgelb keines keines wenig
(2 ea)
Der erfindungsgemäße Stamm A 2408 wird somit als Streptomyces
canus A 2408 bezeichnet. Dieser Stamm wurde im Institute for Microbial Industry
and Technology, Japan, als Hinterlegungsstelle unter der FERM-Nr. 4977 hinterlegt.
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Es wurde gefunden, daß GK, das durch Streptomyces canus A 2408 gebildet
wird, ein neues Enzym ist, das die im folgenden erläuterten physikochemischen und
biochemischen Eigenschaften aufweist.
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GK kann als Forschungsreagenz oder diagnostisches Reagenz für den
Metabolismus von Triglycerid in einem Körperfluid, wie Serum, verwendet werden.
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Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neues
GK und ein Verfahren zu seiner Herstellung zur Verfügung zu stellen.
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Als Mikroorganismus kann bei der vorliegenden Erfindung beispielsweise
Streptomyces verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf diesen Mikroorganismus
beschränkt und es können der erfindungsgemäße GK-produzierende Mikroorganismus und
seine Mutantenstämme verwendet werden.
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Neues GK kann erzeugt werden, indem man GK-liefernde Mikroorganismen,
wie den GK-erzeugenden Mikroorganismus, der zum Genus Streptomyces gehört, in einem
an sich bekannten Medium für die Enzymerzeugung kultiviert. Die Züchtung ist normalerweise
eine flüssige Züchtung und eine eingetauchte Belüftungskultur ist für die industrielle
Produktion geeignet. Es können übliche Nährmedien für Mikroorganismen verwendet
werden.
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Als Kohlenstoffquellen können assimilierbare Kohlenstoffquellen, besonders
bevorzugt Glycerin, verwendet werden.
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Andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke,
Melassen, können ebenfalls verwendet werden.
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Als Stickstoffquellen können assimilierbare Stickstoffquellen, wie
Maisquellwasser, Sojabohnenpulver bzw. Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, trockene
Hefe, Caseinhydrolysat, Hefeextrakt, Fischmehlextrakt und Pepton, verwendet werden.
Gegebenenfalls können Phosphat, Sulfat und anorganische Salze von Magnesium, Calcium,
Kalium, Eisen, Mangan oder Zink verwendet werden.
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Die Züchtungstemperatur kann entsprechend den Bedingungen für das
Wachstum von Mikroorganismen und die Bildung von GK ausgewählt werden und sie beträgt
bevorzugt 25 bis 300C.
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Die Züchtungszeit hängt von den Bedingungen ab und die Züchtung sollte
bei der maximalen Produktion von GK beendet werden. Sie dauert im allgemeinen 1
bis 3 Tage.
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Das erfindungsgemäße Enzym kann aus Mycelien isoliert werden. Die
Kulturbrühe wird zum Sammeln des gezüchteten Nyceliums, das mit Ultraschall beschallt
worden ist, zentrifugiert, wobei man eine überstehende Lösung erhält.
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Die überstehende Lösung wird unter Verwendung von Ammoniumsulfat (das
im folgenden als AS bezeichnet wird) oder Natriumsulfat zur Abtrennung der Verunreinigungen
ausgesalzt. Nachdem das überstehende Material ausgesalzt wurde, wir.d es zentrifugiert,
wobei man einen GK enthaltenden Niederschlag erhält. Das ausgefällte GK wird weiter
durch Entsalzen mit Sephadex G-25 (Warenzeichen, Pharmacia Co.), Biogel P-2 (Warenzeichen,
Biorad Corp.) durch eine Dialysemembran oder ein Hohlfilter gereinigt. Dann wird
eine
Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose durchführen. Die
so erhaltene GK-Fraktion wird entsalzt und durch eine Ultrafiltrationsmembran, wie
Amicon E;I-50 (Warenzeichen, Amicon Co.) konzentriert. Die entsalzte Fraktion wird
einer Adsorptionschromatographie, wie unter Verwendung einer Calciumphosphatgelsäule,
zur Abtrennung der Verunreinigungen unterworfen. Anschließend wird mit einem Gradienten
unter Verwendung eines Phosphatpuffers eluiert. Die GK enthaltende Fraktion wird
entsalzt und durch eine Ultrafiltrationsmembran, wie Amicon XM-50, konzentriert.
Das Konzentrat wird der Gelchromatographie unter Verwendung von Biogel P-200 (Biorad
Co.) oder Sephadex G-150 (Pharmacia Co.) unterworfen. Dann wird die GK-Fraktion
lyophilisiert.
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Das gemäß dem obigen Reinigungsverfahren erhaltene GK besitzt die
folgenden physikochemischen und biochemischen Eigenschaften: (A) Enzymassay: 0,2M-Tris-HCl-Puffer
(pH 9,0) 0,4 ml 0,1 M-Glycerin 0,05 ml 10 mM ATP 0,1 ml 10 mM i4gCl2 0,1 ml 0,25%
Nitrotetrazoliumblau 0,1 ml 1% Rinderserumalbumin 0,14 ml 10 mM NAD 0,1 ml 0,05%
Phenazinmethosulfat 0,01 ml Glycerophosphatdehydrogenase (Böhringer Co., 2 mg/ml,
65 U/mg) 5 µl Das obige Gemisch (1 ml) wird bei 370C während 5 min preinkubiert
und eine GK-Lösung (50 µl) (verdünnt mit GL-
Puffer (10 mM Phosphatpuffer,
der 10 mM Glycerin enthält, pH 7,5)) wird zugegeben und dann wird bei 370C während
10 min inkubiert. Die Reaktion wird beendet, indem man O,1N-HCl zugibt, und dann
wird bei 550 nm zur Bestimmung der Absorption (A550 nm) analysiert.
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Eine Einheit GK wird so definiert, daß sie 1 Mol Glycero-3-phosphat
pro min freisetzt.
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Die Enzymaktivität wird durch die folgende Gleichung berechnet: Enzymaktivität
(U/ml) = AA x Verdünnungsverhältnis x 1/4 0,05 x 10 =## x Verdünnungsverhältnis
(B) Physikochemische und biochemische Eigenschaften: Enzymwirkung: Sie katalysiert
mindestens die folgende Reaktion.
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Molekulargewicht: 72000 +- 7200 72000: bestimmt durch Sephadex G-100
65000: bestimmt durch SDS-Polyacrylamid Isoelektrischer Punkt: pH 4,5 Km-Wert: Glycerin:
4,8 x 10 5 M Dihydroxyaceton: 6,6 x 10-4 M D-Glyceraldehyd: 3,5 x 10 4 M ATP: 2
x 10-4 M
Substratspezifizität: (1) Spezifizität für Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat
und D-Glyceraldehyd: Asayverfahren: Reaktionsgemisch: 0,2M-Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)
0,4 ml 0, 1N-Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat oder D-Glyceraldehyd 0,05 ml 10 mM
ATP 0,1 ml 10 mM MgCl2 0,1 ml destilliertes Wasser 0,3 ml 0,95 ml des Reaktionsgemisches
werden bei 370C während 3 min preinkubiert und die Enzymlösung (gelöst in 10 mM
Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,05 ml) wird zugegeben. Dann wird bei 370C während 10 min
inkubiert. Die Reaktion wird beendet, indem man 3 min kocht. Nach dem Abkühlen auf
370C wird die Menge an ADP analysiert. ADP wird analysiert, indem man eine ADP-Analyselösung
(2,0 ml) zugibt, die das folgende Gemisch enthält: 0,1M-Phosphatpuffer (pH 7,5)
0,1 ml 0,2M-Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 7,5) 0,1 ml Peroxidase (0,5 mg/ml)
0,1 ml ;),296 Phenol O,1 ml 0,3% 4-Aminoantipyrin 0,1 ml 10 mM MnCl2 0,05 ml 10mM
Thiaminpyrophosphat 0,03 ml 1 mM FAD 0,01 ml 10 mM Phosphoenolpyruvat 0,1 ml
Pyruvatoxidase
(100 U/ml; Toyo Jozo Co.) 0,05 ml Pyruvatkinase (4400 U/ml; Sigma Chem. Co.) 1 pl
destilliertes Wasser 1,26 ml Das Reaktionsgemisch wird bei 370C während 15 min inkubiert.
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Die gemessene Farbe wird bei 550 nm zur Berechnung der Substratspezifizität
gemessen.
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Substrat relative Aktivität Glycerin 10096 Dihydroxyaceton 74% D-Glyceraldehyd
2026 (2) Spezifische Aktivität für das Nukleotid: ATP > CTP > ITP # GTP, UTP
Analyseverfahren: Bei dem obigen Analyseverfahren (1) werden 10 mM ATP durch CTP,
ITP' GTP und UTP ersetzt und dann wird das gebildete Glycero-3-phosphat gemessen.
Wie im folgenden erläutert, können alle analysierten Nukleotide ein Substrat sein.
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Es wurde eine besonders hohe Spezifizität für ATP und CTP beobachtet.
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Substrat relative Aktivität (%) ATP 100 CTP 92 ITP 47 GTP 19 UTP
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Optimaler H: pH 9 bis 10, wie in Figur 1 dargestellt.
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(In der Figur o-o: Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6 bis 7,5), .-.:
Tris-HCl-Puffer (pH 7 bis 9), -: Phosphatpuffer (pH 6 bis 8), #-#; Glycin-NaOH-Puffer
(pH 9 bis 10,5)).
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pH-Stabilität: pH 5,5 bis 10, wie in Figur 2 dargestellt.
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Dimethylglutaratpuffer (pH 4 bis 7) und Glycin-NaOH-Puffer (pH 10
bis 10,5), die je 10 mM Glycerin enthalten, werden verwendet. Die Inkubation wird
bei 370C während 60min durchgeführt.
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Einfluß auf Metallionen und p-Chlormercuribenzoat (PCMB): Reagenz
Konzentration relativ+ Aktivität (%)II ohne Mg + mit 1 mM Mg keines # 5 100 MgCl2
1,0 mM 100 100 CaCl2 1,0 mM O 54 MnCl2 1,O mM 6 14 PCMB 5,0 x 106 M - 13 PCMB 7,5
x 1C M -Das erfindungsgemäße GK wird durch Mg++ aktiviert und durch Ca++ und Mn++
inhibiert. 7,5 x 10-6 M PCMB inhibieren die Aktivität des erfindungsgemäßen GK vollständig.
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Wärmestabilität: stabil bis zu 450C, wie in Figur 3 dargestellt.
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Analyse: 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,8), der 10 mM Glycerin enthält.
Inkubation bei 45 bis 75 0C jeweils während 10 min.
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Wie zuvor erläutert, gehört das erfindungsgemäße Enzym zu einer Enzymklasse,
die die Reaktion Glycerin und ATP zu ADP und L-a-Glycerat katalysiert.
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Ein Vergleich mit der bekannten Glycerinkinase von Candida mycoderma
GK (im folgenden als C.My.-GK bezeichnet), Escherichia coli GK (im folgenden als
E.Co-GK bezeichnet) und Schweineherz-GK (im folgenden als Pig.-GK bezeichnet) und
der erfindungsgemäßen GK ist wie folgt.
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Molekulargewicht von E.Co-GK beträgt 300000 und von C.My.-GK 250000
(Tetrameres: Molekulargewicht von 60000), wohingegen das erfindungsgemäße GK ein
Monomer mit einem Molekulargewicht von etwa 70000 ist. Die pH-Stabilität ist pH
6,5 bis 7 für E.Co-GK, pH 4,5 bis 5,5 für Pig4K und pH 6,7 für C.My.-GK, hingegen
pH 5,5 bis 10 für das erfindungsgemäße GK. Da Reaktionen, die ATP erfordern, zweiwertige
Metallionen benötigen, erfordert das obige GK ebenfalls Mg++.
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Jedoch kann Min++ für E.Co-GK und Pig.-GK ersetzt werden, wohingegen
Mn++ das erfindungsgemäße GK stark inhibiert.
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Außerdem unterscheiden sich die Substratspezifizitäten voneinander.
E.Co.-GK zeigt fast die doppelt starke Aktivität für Dihydroxyacetonphosphat, verglichen
mit der von Glycerin, wohingegen das erfindungsgemäße GK eine höhere Spezifizität
für Glycerin zeigt als für Dihydroxyacetonphosphat.
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E.Co-GK wirkt nur für ATP und das erfindungsgemäße GK für ATP und
CTP, ebenfalls für ITP, GTP und UTP. Als Folge des Molekulargewichts, der pH-Stabilität,
des Erfordernisses von zweiwertigen Metallionen und der Substratspezifizität läßt
sich beweisen, daß die erfindungsgemäße Glycerinkinase eine neue GK ist.
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Die erfindungsgemäße GK kann für diagnostisches Enzym verwendet werden.
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Beispielsweise kann die erfindungsgemäße GK zur Analyse von Triglycerid
und Glycerin verwendet werden, indem man mit Triglycerid und Lipoproteinlipase umsetzt,
das Reaktionsgemisch mit GK und ATP unter Bildung von Glycero-3-phosphat inkubiert,
das weiter mit Glycero-3-phosphatoxidase inkubiert wird, und dann wird der verbrauchte
Sauerstoff oder das freigesetzte Wasserstoffperoxid gemessen.
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Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.
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Beispiel 100 ml eines Mediums (pH 7,0), das 1,0% Pepton, 1,5% Glycerin,
0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4 und 0,2096 KCl enthält, wird in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben
gegeben und bei 120 0C 20 min lang sterilisiert. Es wird dann mit Streptomyces canus
A 2408 FERM-P Nr. 4977 inokuliert. Anschließend wird bei 260C während 3 Tagen gezüch
tet. Die Kulturbrühe wird in ein 30-l-Kolbenfermentationsgefäß gegeben, das das
gleiche Medium (20 1) enthält, und aerob bei 260C während 40 h kultiviert (300 Upm,
Belüftung 20 1/min). 2 1 Kulturbrühe werden bei 40C zum Sammeln des Myceliums zentrifugiert
(15000 Upm, 10 min). Das Mycelium wird in GL-Puffer (800 ml) suspendiert und bei
OOC während 5 min durch eine Ultraschallvorrichtung (Kubota Insonator 200M, Warenzeichen)
beschallt.
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Die Lösung wird bei 40C während 10 min bei 15000 Upm zentrifugiert,
um überstehendes Material (760 ml) zu erhalten. Nach der Zugabe einer 5%igen Protaminlösung
(23,0 ml)
werden die Verunreinigungen durch Zentrifugieren bei
40C und 5000 Upm während 10 min prezitipiert. Gesättigte Ammoniumsulfptlösung (pH
7,5, 1125 ml) wird zu dem überstehenden Material (750 ml) gegeben und dann wird
bei 40C und 15000 Upm während 10 min zum Sammeln des Prezipitats zentrifugiert.
Gesättigte AS (pH 7,5, 37,2 ml) wird zu der Lösung des Prezipitats in 62 ml GL-Puffer
zur Ausfällung der Verunreinigungen gegeben. Uberstehendes Material (82 ml) wird
durch Zentrifugieren bei 40C und 15000 Upm während 10 min erhalten. Dann wird gesättigte
AS (pH 7,5, 20,5 ml) zugegeben. Anschließend wird bei 40C und 15000 Upm während
10 min zentrifugiert. Man erhält einen Niederschlag.
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Der Niederschlag wird in GL-Puffer (11,0 ml) gelöst und die Lösung
wird auf eine Säule von Sephadex G-25 (3 x 30 cm), die mit dem gleichen Puffer gepackt
ist, gegeben, dann wird mit dem gleichen Puffer bei 250 C und einer Strömungsrate
von 40 ml/h eluiert. Fraktionen, die Absorptionen bei 280 nm zeigen, werden gesammelt
(etwa 21 ml). Diese gibt man auf eine Säule aus DEAE-Cellulose (2,2 x 17 cm), die
mit GL-Puffer gepackt worden ist. Dann wird mit GL-Puffer (80 ml) (Strömungsrate
25 ml/h, 5,8 ml/Fraktion) gewaschen.
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Danach werden die Verunreinigungen mit GL-Puffer, der 0,1M-KCl enthält,
(Strömungsrate 25 ml/h, 5,8 ml/Fraktion) eluiert. Die aktiven Fraktionen Nr. 63
bis 79 werden durch lineare Gradientenelution mit GL-Puffer, der 200 ml qlM-KC1
enthält, und GL-Puffer, der 200 ml 0,4M-KCl enthält, eluiert (Strömungsrate 25 ml/h,
pro Fraktion 5,8 ml). Das vereinigte aktive Eluat (98 ml) wird entsalzt und mit
Amicon XM-50 bei 40C während 4 h konzentriert. Man erhält eine konzentrierte Lösung
(10 ml). Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Calciumphosphatgel (2,0 x 17,2 cm),
die mit GL-Puffer gepackt ist, gegeben. Dann wird mit GL-
Puffer
(100 ml) gewaschen und mit einem linearen Gradienten von GL-Puffer 200 ml bis 100
mM Phosphatpuffer, der 200 ml 100 mM Glycerin enthält, eluiert (Strömungsrate 25
ml/h, eine Fraktion 6 ml). Die aktiven Fraktionen 48 bis 58 werden gesammelt und
die vereinigte Lösung wird mit Amicon XI4-50 konzentriert. Man erhält 2 ml Konzentrat.
Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Biogel P-200 (3 x 60 cm), die mit GL-Puffer
gepackt ist, gegeben. Es wird mit dem gleichen Puffer (Strömungsrate 25 ml/h, eine
Fraktion 6 ml) eluiert.
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Die aktiven Fraktionen Nr. 17 bis 20 werden gesammelt. Sie werden
vereinigt und lyophilisiert. Man erhält gereinigte GK (spezifische Aktivität: 57,6
U/mg, 16,9 mg-Protein).
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4. Erläuterung der Zeichnungen: Figur 1: optimale pH-Kurve für das
erfindungsgemäße GK.
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Figur 2: pH-Stabilitätskurve für das erfindungsgemäße GK.
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Figur 3: Wärmestabilitätskurve für das erfindungsgemäße GK.
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e e r s e i t e