DK143711B - Fremgangsmaade til fremstilling af lactase med forbedret termostabilitet - Google Patents

Description

143711

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af lactase med forbedret termostabilitet og en optimal enzymaktivitet ved pH ca. 6.

Der har i de senere år været betydelig interesse for at udvikle metoder til reduktion af lactoseindholdet i mælk og produkter afledt af mælk. Denne interesse er blevet forøget ved nylige påvisninger af, at en stor procentdel af den menneskelige befolkning lider af lactasemangel, hvilket enten er en nedarvet egenskab eller et resultat af en ældningsproces. Sådanne lactasemangler fører til forstyrrelser i tarmkanalen, hvor fødens indhold af lactose er højt. Endvidere har man observeret en lignende lactoseintolerance hos visse husdyr.

Hydrolysen af lactose i mælk og produkter afledt af mælk under dannelse af glucose og galactose er et attraktivt mål, ikke bare fordi det ville løse lactoseintolerancepro-blemet, men også fordi det ville forøge sødheden af produkterne og reducere de såkaldte sandagtige texturer i visse mælkeafledte produkter, forårsaget af lactosekrystallisation. Fagfolk har længe erkendt ønskeligheden af at fremkalde denne hydrolyse ved anvendelse af lactase. Trods det forhold, at lactase forekommer relativt udbredt i naturen og produceres af mange mikroorganismer, har anvendelse af lactase ved kommerciel produktion af mælk og produkter afledt af mælk været meget begrænset. En af årsagerne til den begrænsede kommercielle anvendelse af lactase er, at mange af de almindelige lactaser, såsom lactaser afledt af gær, udviser en optimal enzymaktivitet ved temperaturer, der også fører til bakterievækst. Som følge heraf har der været en stigende interesse i at finde lactase med en høj grad af termostabilitet. En sådan termostabil lactase ville tillade udførelse af lactosehydrolysen under betingelser, som er ikke-favorable for væksten af visse bakterier, der hyppigt er til stede i mælk eller produkter afledt af mælk. En så- 2 143711 dan lactase afledt af Streptomyces coelicolor er beskrevet i USA patentskrift nr. 3 816 259. Det er på dette tidspunkt ikke klart, hvorvidt lactase fra S. coelicolor kan anvendes uden risiko, fordi visse medlemmer af denne art har vist sig at producere antibiotika.

Produktionen af lactase af medlemmer af Bacillus-slægten er tidligere beskrevet. Således har P.J. Anema, Biochem.

Biophys. Acta, 89, 495 - 502 (1964) beskrevet isolation af lactase fra B. subtilis. Lactase fra B. megaterium er beskrevet af S.R. Rohlfing og I.P. Crawford, J. Bacteriology 92 (4), 1258-9 (1966). Ingen af disse organismer kan imidlertid betragtes som varmetolerante, og den dannede lactase må i reglen anvendes ved temperaturer under 50° C for at bevare en nyttig enzymaktivitet i længere tid.

Formålet med den foreliggende opfindelse er derfor at angive en fremgangsmåde til fremstilling af en lactase med forbedret termostabilitet, og dette opnås ifølge opfindelsen ved, at man dyrker organismen Bacillus coagulans NRRL B-8100 i et næringsmedium indeholdende lactose og isolerer den således dannede lactase. Denne organisme udviser en optimal vækst ved en temperatur på mindst ca. 45° C og en optimal enzymaktivitet ved pH ca. 6.

Den anvendte organisme er isoleret fra en jordprøve. Dyrkning af organismen i et passende næringsmedium indeholdende lactose fører til dannelsen af den ønskede lactase intracellulært. Der er foretaget en karakteristik af kulturen, og den er identificeret som faldende inden for arten Bacillus coagulans i overensstemmelse med klassifikationen efter Bergey* s Manual of Determinative Bacteriology» 7th Edition. Denne organisme er deponeret i kultursamlingen i U.S.D.A. Northern Regional Research Laboratory under betegnelsen NRRL B-8100. De taxonomiske egenskaber af denne stamme er beskrevet i nedenstående tabel 1.

3 143711 TABEL 1 A. Morphologiske karakteristika: 1. Vegetative stave: Mindre end 0,9 yum i diameter, længden variende i reglen op til 5,0 - 6,0 /um. Enkelte filamenter.

Ingen kæder. Gram-positiv, ensartet farvning. Bevægelig.

2. Sporangier: I reglen ikke opsvulmede, men enkelte opsvulmede sporangier kan findes.

3. Sporer: 0,9 x 1,2 - 1,5 /um, ellipsoi- diske, subterminale indtil terminale.

B. Dyrkningsmæssige karakteristika: 1. Gelatine-agar Ingen hydrolyse, stregkultur: 2. Agarkolonier: Uigennemsigtige, små, runde.

Ikke skelnelige.

3. Agar-skråkulturer: Spredt til moderat vækst. Flad, glat, gennemsigtig.

4. Glucose-agar- Væksten kraftigere end på nærings- skråkultur: agar. Glat, hvid.

5. Glucose-asparagin- Ingen vækst i 24 timer, agarskråkultur: Moderat vækst efter 48 timer.

6. Sure proteose- God vækst, bedre end på næringspept on-agarskrå- agar.

kulturer: 7. Sojabønneagar Moderat vækst, lidt stærkere end skråkulturer: på næringsagar.

8. Skråkultur på Spredt vækst efter 24 timer, agar til opbe- lige så god som næringsagar ved varing: 48 timer.

4 t«711 9. Kødsuppe: Ringe vækst efter 24 timer.

10. Natriumchlorid- Ingen vækst i 7% natriumchlorid. kødsuppe: 11. Mælkeagar streg- Ingen hydrolyse, kultur: 12. Kartoffel: Spredt, tør, rynket.

C. Fysiologiske karakteristika: 1. Under anvendelse af pepton som nitrogenkilde producerede organismen syre, men ingen gasser ud fra glucose, lactose, arabinose, xylose, mannitol og maltose. Neutral reaktion på saccharose og glycerol.

2. pH i glucosenæringsvæske er 5,0 eller mindre på 7 dage.

3. Ingen citratudnyttelse.

4. Tomatgærmælk løb sammen efter 24 timer ved 45° C.

5. Ingen produktion af nitriter fra nitrater.

6. Negativ Voges-Proskauer-test. pH i Voges-Proskauer-væsken var 4,2.

7. Positiv stivelseshydrolyse.

8. Positiv katalasereaktion.

9. Ingen vækst på nitratholdigt medium under anaerobe betingelser. Vækst på glucosenæringsvæske under anaerobe betingelser fører til pH under 5,2 i løbet af 7 dage.

10. Aerob, fakultativt anaerob.

143711 5 11. Minimumstemperatur for væksten, er 25° C. Maksimums-temperaturen for vækst er 60° C. Qptimalvækst ved 45 - 50° C.

Som angivet under de fysiologiske karakteristika i tabel 1 udviser den beskrevne Bacillus-organisme optimal vækst ved temperaturer på ca. 45 - 50° C og kan derfor opfattes som en varmetolerant organisme i sammenligning med andre Bacillus-arter, der udviser optimal vækst ved ca. 37° C.

En varmetolerant Bacillus-organisme defineres her som en organisme, der udviser optimal vækst ved temperaturer på ca. 45° C og derover.

Opfindelsen illustreres nærmere ved nedenstående eksempel. EKSEMPEL

pH-optimum for den af organismen producerede lactase bestemtes ved at analysere hele celler i nærvær af o-nitro-phenyl-β-galactosid (ONPG) som substrat. Man gik frem i det væsentlige som beskrevet af J. Lederberg, J. Bacteriology 60, 381 (1950). Cellerne blev først behandlet med toluen, der anvendtes en phosphatpuffer, og analysetempera-turen var 37° C. Lactaseaktiviteten observeredes i intervallet pH ca. 4,5 - 8,0, med optimal aktivitet ved ca. pH 6,0.

Stabiliteten af lactasen produceret af B. coagulans NRRL B--8100 vurderedes ved at anvendte ONPG som substrat i en modificeret Lederberg-fremgangsmåde. Til denne undersøgelse suspenderedes udvaskede celler i 0,05 M phosphatpuffer ved pH 7,0 i nærvær af ONPG-substratet. Suspensionen holdtes ved 60° C i fire dage, idet prøver periodisk udtoges til bestemmelse af den tilbageværende lactaseaktivitet. Temperaturen ved denne stabilitetsprøve valgfees som tilnærmelsesvis de anvendte temperatumiveauer ved lavtemperatur-pasteurisering. Resultaterne af prøverne er vist i tabel 2.

143711 6 TABEL 2

Tid (timer) Lactaseaktivitet som pct.

- af den oprindelige aktivitet .

0 100 21 . 92 45 51 71 36 99 ' 20

Lactasen produceret af Bacillus coagulans NRRL B-8100 udviser nyttig enzymaktivitet op til 70° C. Optimal aktivitet synes at forekomme ved temperaturer på 60 - 65° C.

Den specielle temperatur, der vælges til gennemførelse af lactosehydrolyse ved anvendelse af dette enzym, vil afhænge noget af det anvendte substratmedium. Generelt foretrækkes imidlertid temperaturer på 45 - 65° C.

Et typisk medium til dyrkning af Bacillus coagulans under produktion af lactase har følgende sammensætning:

Proteose-pepton.......................... 1,0 % Gær ekstrakt.............................. 1,0 %

Kaliumdihydrogenphosphat................. 0,8 %

Lactose (steriliseret separat)........... 2,0 % pH....................................... 6,0 %

Kulturer inkuberes på en roterende ryster i 48 timer ved 45° C. Efter afslutning af inkubationsperioden tilsættes toluen til væsken (0,5 % på volumenbasis), og blandingen omrøres i 30 minutter. Cellerne udvindes derpå ved flok-kulering, som beskrevet i USA patentskrift nr. 3 821 086, og det opnåede flokkulerede celleaggregat tørres ved 55° C. Lactaseaktiviteten af de tørrede aggregerede partikler er 38,5 enheder pr. gram, hvor en enhed defineres som den 143711 7 mængde enzym, der er nødvendig til dannelse af et mikro-mol dextrose pr. minut under prøvebetingelserne. Den anvendte prøvemetode er beskrevet af Weetall et al., Biotechnology and Bioengineering 16, 295 (1974).

Effektiviteten af den af Bacillus coagulans producerede lactase demonstreredes ved hydrolyse af lactose i en sød lagret valle. Organismen dyrkedes, og cellerne udvandtes som beskrevet ovenfor. De tørrede aggregerede partikler frasigtedes, og 5 g af 16 - 20 mesh portionen (0,017 -0,024 /um) hydratiseredes i en 50 $ lactoseopløsning pufret til pH 7,0 med en 0,05 M phosphatpuffer. De hydrati-serede partikler anbragtes derpå i en lille glaskolonne, der holdtes ved en temperatur på 60° C. Gennem denne pakkede kolonne ledtes kontinuerligt en vandig opløsning indeholdende 70 gram af et kommercielt tørret sødt vallepulver pr. liter, idet opløsningen pufredes med 0,05 M phos-phat til pH 7,0. Opløsningen indeholdt ca. 5 vægt-$ lactose, beregnet på laetoseindholdet i den søde valle, og der tilsattes 100 mg/liter methyl-p-benzoat som konserveringsmiddel. Strømningshastigheden gennem kolonnen holdtes på 375 ml/dag, og graden af lactosehydrolyse bestemtes dagligt ved rutineanalyse. Begyndelsesgraden for lactosehydro-lysen viste sig at være 90$. Efter 3 ugers kontinuert drift var hydrolysegraden faldet til 80$.

Det er klart, at den ifølge opfindelsen fremstillede lactase kan anvendes enten til batehvis eller kontinuert behandling af lactoseholdige substrater. Endvidere kan lac-tasen anvendes ved direkte anvendelse af cellerne, eller den kan anvendes i form af det cellefri enzym ved i sig selv kendte metoder.