CN110283808A - 一种褐藻胶裂解酶的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种褐藻胶裂解酶的培养方法,包括种子的活化、发酵和纯化。该褐藻胶裂解酶的培养方法,采用的种子培养基和发酵培养基营养均衡全面、营养功效成分多重交叉,更有利于微生物的生长,提高了褐藻胶裂解酶的产率和活性,从而降低成本,提高了经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及酶培养技术领域,具体涉及一种褐藻胶裂解酶的培养方法。
背景技术
褐藻胶是一种从海洋褐藻中提取的多糖,在食品、医药、日用化工等行业都有普遍的应用,但由于其粘度高,水溶性低,不易被人体吸收,在应用方面受到一定的限制。褐藻胶寡糖是褐藻胶经降解得到的聚合度2~10的低聚糖,由于水溶性好,容易被人体吸收,因此其在医药领域具有较高的应用价值。研究表明褐藻胶寡糖具有神经保护、抗哮喘、抑菌、增强免疫力、抗肿瘤、降血糖血脂、抗凝血及促生长等活性,并且能有效抵抗人体衰老,是一种极具开发潜力的低聚糖。
现有技术中褐藻胶寡糖的制备方法主要有酶降解法、物理和化学降解法。物理法操作简单,无污染,节约试剂,可以有效的切断大分子链,但是降解所得的极限分子质量较大,不易制备出分子量较小的寡糖。化学降解法包括酸降解法及氧化降解法,酸解法降解速度慢,需要高温高压,降解效率低,活性较高的寡糖含量不高,且会对环境造成污染。氧化降解法反应过程简单,成本较低,但降解条件剧烈且对寡糖的还原端有一定的破坏作用。而酶解法是一种条件温和可控性强和特异性高的生物降解方法,具有降解产物活性高、产物专一性好、反应条件温和、无污染等诸多优势。
目前,我国对褐藻胶裂解酶的研究比较基础,国内外的研究也主要集中于菌种分离、基因工程菌的构建及酶学性质的改善、酶解产物的构效等方面,而有关褐藻胶裂解酶的培养工艺研究较少,直接制约了酶解法制备褐藻胶寡糖的得率。因此,研究一种提高褐藻胶裂解酶的产量和活性的培养方法成为市场亟需。
发明内容
本发明的发明目的是,针对上述问题,提供一种褐藻胶裂解酶的培养方法,简化了工艺步骤,缩短了生产时间,且提高了得率。
为达到上述目的,本发明所采用的技术方案是:
一种褐藻胶裂解酶的培养方法,包括以下步骤:
S1.种子的活化
将褐藻胶裂解酶菌株的斜面培养物接种至种子培养基中,于28~32℃、120rpm条件下培养14~16h至对数生长期,得种子液。
S2.发酵
将所述种子液以0.2%的接种量转接发酵培养基,于28~32℃、120rpm条件下培养48h,得发酵液。
所述发酵培养基包括以下组分:酵母膏0.8~1.2g/L,蛋白胨4.5~5.5g/L,乳化橄榄油5~7g/,右旋糖酐L1~3g/L,柠檬酸铁0.1~0.3g/L,NaCl 18~20g/L,MgCl2 5~7g/L,KCl 0.5~0.6g/L,Na2SO4 3~4g/L,CaCl2 1.2~2.0g/L,Na2CO3 0.1~0.2g/L,KBr 0.05~0.1g/L,SrCl2 32~35mg/L,H3BO3 21~23mg/L,NaSiO3 3~5mg/L,NaF 2~3mg/L,NH4NO31.2~1.8mg/L,Na2HPO4 6~10mg/L,溶剂为蒸馏水。
S3.纯化
将所述发酵液经高速离心获取上清液,得到褐藻胶裂解酶酶液;然后将所述褐藻胶裂解酶酶液采用Bio-GelP-6凝胶柱,以0.2mol/L碳酸氢铵为洗脱液,流速为0.4mL/min进行洗脱,透析、干燥得褐藻胶裂解酶。
优选的,步骤S1中,所述褐藻胶裂解酶菌株来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC,保藏编号:23821。
优选的,步骤S1中,所述种子培养基为:海藻酸钠5~8g/L,D-山梨醇蛋白胨5~7g/L,乳化橄榄油3~5g/,酵母粉1~3g/L,NaCl 30~40g/L,MgSO4·7H2O 1~3g/L,K2HPO4 2~5g/L,FeSO4·7H2O 0.01~0.05g/L,(NH4)2SO4 5~8g/L,溶剂为蒸馏水。
优选的,所述种子培养基的pH为7~8。
优选的,步骤S1中,所述种子培养基为:海藻酸钠6g/L,D-山梨醇蛋白胨6g/L,乳化橄榄油4g/,酵母粉2g/L,NaCl 35/L,MgSO4·7H2O 2g/L,K2HPO4 3g/L,FeSO4·7H2O 0.03g/L,(NH4)2SO4 6g/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.5。
优选的,所述培养基的pH值为7~8。
优选的,步骤S2中,所述发酵培养基包括以下组分:酵母膏1g/L,蛋白胨5g/L,乳化橄榄油6g/,右旋糖酐L 2g/L,柠檬酸铁0.1g/L,NaCl 19.5g/L,MgCl2 6g/L,KCl 0.55g/L,Na2SO4 3.2g/L,CaCl2 1.8g/L,Na2CO3 0.16g/L,KBr 0.08g/L,SrCl2 34mg/L,H3BO3 22mg/L,NaSiO3 4mg/L,NaF 2.5mg/L,NH4NO3 1.6mg/L,Na2HPO4 8mg/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.6。
由于采用上述技术方案,本发明具有以下有益效果:
1.本发明的褐藻胶裂解酶的培养方法,提高了褐藻胶裂解酶的活性,从而提高了酶解法制备褐藻胶寡糖的得率,降低而来成本,提高了经济效益。
采用的种子培养基和发酵培养基营养均衡全面、营养功效成分多重交叉,更有利于微生物的生长,提高了褐藻胶裂解酶的产率和活性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
一种褐藻胶裂解酶的培养方法,
一、材料与方法
1、菌株
褐藻胶裂解酶来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC,保藏编号:23821。
2、种子培养基
海藻酸钠6g/L,D-山梨醇蛋白胨6g/L,乳化橄榄油4g/,酵母粉2g/L,NaCl 35/L,MgSO4·7H2O 2g/L,K2HPO4 3g/L,FeSO4·7H2O 0.03g/L,(NH4)2SO4 6g/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.5。
3、发酵培养基
酵母膏1g/L,蛋白胨5g/L,乳化橄榄油6g/L,右旋糖酐L 2g/L,柠檬酸铁0.1g/L,NaCl 19.5g/L,MgCl2 6g/L,KCl 0.55g/L,Na2SO4 3.2g/L,CaCl2 1.8g/L,Na2CO3 0.16g/L,KBr 0.08g/L,SrCl2 34mg/L,H3BO3 22mg/L,NaSiO3 4mg/L,NaF 2.5mg/L,NH4NO3 1.6mg/L,Na2HPO4 8mg/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.6。
二、试验方法
1、培养
S1.种子的活化
将褐藻胶裂解酶菌株的斜面培养物接种至种子培养基中,于28~32℃、120rpm条件下培养14~16h至对数生长期,得种子液;
S2.发酵
将所述种子液以0.2%的接种量转接发酵培养基,于28~32℃、120rpm条件下培养48h,得发酵液;
S3.纯化
将所述发酵液经高速离心获取上清液,得到褐藻胶裂解酶酶液;然后将所述褐藻胶裂解酶酶液采用Bio-GelP-6凝胶柱,以0.2mol/L碳酸氢铵为洗脱液,流速为0.4mL/min进行洗脱,透析、干燥得褐藻胶裂解酶。
2、酶活力的测定
酶活测定方法采用紫外吸收法。数据见表1。
对比例1
一种褐藻胶裂解酶的培养方法,
一、材料与方法
1、菌株
褐藻胶裂解酶来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC,保藏编号:23821。
2、种子培养基
海藻酸钠6g/L,D-山梨醇蛋白胨6g/L,乳化橄榄油4g/,酵母粉2g/L,NaCl 35/L,MgSO4·7H2O 2g/L,K2HPO4 3g/L,FeSO4·7H2O 0.03g/L,(NH4)2SO4 6g/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.5。
3、发酵培养基
酵母膏1g/L,蛋白胨5g/L,右旋糖酐L 2g/L,柠檬酸铁0.1g/L,NaCl 19.5g/L,MgCl2 6g/L,KCl 0.55g/L,Na2SO4 3.2g/L,CaCl2 1.8g/L,Na2CO3 0.16g/L,KBr 0.08g/L,SrCl2 34mg/L,H3BO3 22mg/L,NaSiO3 4mg/L,NaF 2.5mg/L,NH4NO3 1.6mg/L,Na2HPO4 8mg/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.6。
二、试验方法
1、培养,同实施例1。
2、酶活力的测定
酶活测定方法采用紫外吸收法。数据见表1。
对比例2
一种褐藻胶裂解酶的培养方法,
一、材料与方法
1、菌株
褐藻胶裂解酶来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC,保藏编号:23821。
2、种子培养基
海藻酸钠6g/L,D-山梨醇蛋白胨6g/L,乳化橄榄油4g/,酵母粉2g/L,NaCl 35/L,MgSO4·7H2O 2g/L,K2HPO4 3g/L,FeSO4·7H2O 0.03g/L,(NH4)2SO4 6g/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.5。
3、发酵培养基
酵母膏1g/L,蛋白胨5g/L,乳化橄榄油6g/,柠檬酸铁0.1g/L,NaCl 19.5g/L,MgCl26g/L,KCl 0.55g/L,Na2SO4 3.2g/L,CaCl2 1.8g/L,Na2CO3 0.16g/L,KBr 0.08g/L,SrCl234mg/L,H3BO3 22mg/L,NaSiO3 4mg/L,NaF 2.5mg/L,NH4NO3 1.6mg/L,Na2HPO4 8mg/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.6。
二、试验方法
1、培养,同实施例1。
2、酶活力的测定
酶活测定方法采用紫外吸收法。数据见表1。
对比例3
一种褐藻胶裂解酶的培养方法,
一、材料与方法
1、菌株
褐藻胶裂解酶来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC,保藏编号:23821。
2、种子培养基
海藻酸钠6g/L,D-山梨醇蛋白胨6g/L,乳化橄榄油4g/,酵母粉2g/L,NaCl 35/L,MgSO4·7H2O 2g/L,K2HPO4 3g/L,FeSO4·7H2O 0.03g/L,(NH4)2SO4 6g/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.5。
3、发酵培养基
酵母膏1g/L,蛋白胨5g/L,乳化橄榄油6g/,右旋糖酐L 2g/L,NaCl 19.5g/L,MgCl26g/L,KCl 0.55g/L,Na2SO4 3.2g/L,CaCl2 1.8g/L,Na2CO3 0.16g/L,KBr 0.08g/L,SrCl234mg/L,H3BO3 22mg/L,NaSiO3 4mg/L,NaF 2.5mg/L,NH4NO3 1.6mg/L,Na2HPO4 8mg/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.6。
二、试验方法
1、培养,同实施例1。
2、酶活力的测定
酶活测定方法采用紫外吸收法。数据见表1。
对比例4
一、材料与方法
1、菌株
褐藻胶裂解酶来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC,保藏编号:23821。
2、种子培养基
海藻酸钠6g/L,D-山梨醇蛋白胨6g/L,酵母粉2g/L,NaCl 35/L,MgSO4·7H2O 2g/L,K2HPO4 3g/L,FeSO4·7H2O 0.03g/L,(NH4)2SO4 6g/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.5。
3、发酵培养基
酵母膏1g/L,蛋白胨5g/L,乳化橄榄油6g/,柠檬酸铁0.1g/L,右旋糖酐L 2g/L,NaCl 19.5g/L,MgCl2 6g/L,KCl 0.55g/L,Na2SO4 3.2g/L,CaCl2 1.8g/L,Na2CO3 0.16g/L,KBr 0.08g/L,SrCl2 34mg/L,H3BO3 22mg/L,NaSiO3 4mg/L,NaF 2.5mg/L,NH4NO3 1.6mg/L,Na2HPO4 8mg/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.6。
二、试验方法
1、培养,同实施例1。
2、酶活力的测定
酶活测定方法采用紫外吸收法。数据见表1。
表1活性对比
方法 | 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 多比例4 |
活性U/g | 80000 | 35000 | 30000 | 38000 | 40000 |
从实施例1、对比例1-4及表1数据可以看出,对比例1(发酵培养基少乳化橄榄油)、对比例2(发酵培养基少右旋糖酐)、对比例3(发酵培养基少柠檬酸铁)、对比例4(种子培养基少乳化橄榄油)均影响最中培养的褐藻胶裂解酶的活性,说明本申请采用的种子培养基和发酵培养基营养均衡全面、营养功效成分多重交叉,更有利于微生物的生长,提高了褐藻胶裂解酶的产率和活性。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明,但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围。凡本发明所提示的技术构思下所完成的同等变化或修饰变更,均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (7)
1.一种褐藻胶裂解酶的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.种子的活化
将褐藻胶裂解酶菌株的斜面培养物接种至种子培养基中,于28~32℃、120rpm条件下培养14~16h至对数生长期,得种子液;
S2.发酵
将所述种子液以0.2%的接种量转接发酵培养基,于28~32℃、120rpm条件下培养48h,得发酵液;
所述发酵培养基包括以下组分:酵母膏0.8~1.2g/L,蛋白胨4.5~5.5g/L,乳化橄榄油5~7g/L,右旋糖酐L1~3g/L,柠檬酸铁0.1~0.3g/L,NaCl18~20g/L,MgCl25~7g/L,KCl0.5~0.6g/L,Na2SO43~4g/L,CaCl21.2~2.0g/L,Na2CO30.1~0.2g/L,KBr0.05~0.1g/L,SrCl232~35mg/L,H3BO321~23mg/L,NaSiO33~5mg/L,NaF2~3mg/L,NH4NO31.2~1.8mg/L,Na2HPO46~10mg/L,溶剂为蒸馏水;
S3.纯化
将所述发酵液经高速离心获取上清液,得到褐藻胶裂解酶酶液;然后将所述褐藻胶裂解酶酶液采用Bio-Gel P-6凝胶柱,以0.2mol/L碳酸氢铵为洗脱液,流速为0.4mL/min进行洗脱,透析、干燥得褐藻胶裂解酶。
2.根据权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的培养方法,其特征在于,步骤S1中,所述褐藻胶裂解酶菌株来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC,保藏编号:23821。
3.根据权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的培养方法,其特征在于,步骤S1中,所述种子培养基为:海藻酸钠5~8g/L,D-山梨醇蛋白胨5~7g/L,乳化橄榄油3~5g/,酵母粉1~3g/L,NaCl30~40g/L,MgSO4·7H2O1~3g/L,K2HPO42~5g/L,FeSO4·7H2O0.01~0.05g/L,(NH4)2SO45~8g/L,溶剂为蒸馏水。
4.根据权利要求3所述的褐藻胶裂解酶的培养方法,其特征在于,所述种子培养基的pH为7~8。
5.根据权利要求4所述的褐藻胶裂解酶的培养方法,其特征在于,步骤S1中,所述种子培养基为:海藻酸钠6g/L,D-山梨醇蛋白胨6g/L,乳化橄榄油4g/,酵母粉2g/L,NaCl35/L,MgSO4·7H2O2g/L,K2HPO43g/L,FeSO4·7H2O0.03g/L,(NH4)2SO46g/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.5。
6.根据权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的培养方法,其特征在于,所述培养基的pH值为7~8。
7.根据权利要求6所述的褐藻胶裂解酶的培养方法,其特征在于,步骤S2中,所述发酵培养基包括以下组分:酵母膏1g/L,蛋白胨5g/L,乳化橄榄油6g/,右旋糖酐L2g/L,柠檬酸铁0.1g/L,NaCl19.5g/L,MgCl26g/L,KCl0.55g/L,Na2SO43.2g/L,CaCl21.8g/L,Na2CO30.16g/L,KBr0.08g/L,SrCl234mg/L,H3BO322mg/L,NaSiO34mg/L,NaF2.5mg/L,NH4NO31.6mg/L,Na2HPO48mg/L,溶剂为蒸馏水,pH为7.6。
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