KR101437391B1 - 락토바실러스 유산균의 배양방법 및 이를 이용한 휘발성 지방산의 생산방법 - Google Patents

락토바실러스 유산균의 배양방법 및 이를 이용한 휘발성 지방산의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 해결과제는 일반배지에 이스트추출물과 무수포도당을 혼합하여 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균의 배양과 증식이 쉽고, 값싼 배지에서 대량배양할 수 있는 락토바실러스 유산균의 배양방법에 관한 것이고, 이를 이용하여 슬러지에 접종하여 가용화 시켜줌으로서 우수한 휘발성 지방산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 유산균 제제의 제조방법은, 이스트추출물, 무수포도당을 첨가된 배지에 유산균인 락토바실러스 브레비스(L. brevis)를 배양하여 유산균 배양액을 제조하는 단계와, 배양된 유산균 배양액을 건조하는 단계와, 건조된 유산균 배양액을 분쇄하여 유산균 분말을 생성하는 단계를 포함하며, 상기 유산균 분말에 악취 저감제로서 전체 혼합중량을 기준으로 임산 건조물인 솔잎 2.5중량%, 감잎 가루 2.5중량%를 혼합한 것을 특징으로 한다.

Description

락토바실러스 유산균의 배양방법 및 이를 이용한 휘발성 지방산의 생산방법{Culture method of lactobacillus lactic acid bacteria and the volatile fatty acids production method based on the culture}
본 발명은 락토바실러스 유산균의 배양방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 일반배지에 이스트추출물과 무수포도당을 혼합하여 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균의 배양과 증식이 쉽고, 값싼 배지에서 대량배양할 수 있는 락토바실러스 유산균의 배양방법 및 이를 이용한 휘발성 지방산의 생산방법에 관한 것이다.
하수슬러지 중의 탈질, 탈인공정은 미생물의 성장을 기본으로 하는 공정이며, 탈질, 탈인이 효과적으로 이루어지기 위해서는 적절한 COD(또는 BOD) : 질소의 비가 유지되어야 하며, 이를 위해서는 처리조에 탄소원을 별도로 제공하는 것이 일반적이다. 그러나, 이 경우 탄소원의 공급으로 인한 비용 상승을 피할 수 없다는 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 폐수처리 시스템 자체 내에서 탄소원이 자급되도록 하는 방안으로, 생슬러지의 미생물 발효를 통해 유기산을 생성하여 이것을 탈질 및 탈인 미생물의 성장을 위한 탄소원으로 사용하는 방법이 개발되었다.
예를 들면, 공개특허 제2011-90365호 “곡류 발효물을 포함하는 녹화용 식생 기반토”는 유산균을 이용하여 토양 속 유해한 균주의 생장을 억제하고 무해한 균주의 생장을 촉진하여 식물이 건강하게 성장할 수 있는 녹화용 식생기반토를 제공하기 위한 것인데, 유산균이 포함된 곡물 발효물을 이용함으로써 하수슬러지나 펄프슬러지에서 발생하는 악취를 제거하고, 이런 유기물 분해를 촉진하여 식물에게 필요한 영양분을 공급할 수 있는 녹화용 식생기반토를 제공하기 위한 것으로, 상기 발명에서 사용한 유산균은 락토바실러스 브크레니(L.Buchneri)와 락토바실러스 파라카세이(L.Paracasei)이며, 유산균이 첨가된 기반토로서 본 발명인 하수슬러지 가용화를 위한 유산균 제제와는 사용 용도와 성질이 다르다.
또, 공개특허 제2012-82306호“유기성 폐기물을 이용한 토양개량용 칼슘비료 제조 방법”은 음식물 쓰레기 등의 식품 부산물, 계분, 돈분 등의 축산 배설물, 하수슬러지 및 도축 부산물과 같은 유기성 폐기물을 이용한 토양개량용 칼슘비료의 제조방법에 관한 것으로, 유용미생물을 교반기에 투입하여 혼합한 후, 유화제와 함께 칼슘 비료를 제조하는 방법이다.
또 공개특허 제2011-55333호 “유기성 폐기물의 폐수 처리용 조성물, 이를 이용한 유기성 폐기물의 폐수 처리방법 및 이에 의해 제조된 양액”은 농축조로 들어가는 침전슬러지에 미생물 혼합균주를 투여하여 농축한 후 반송관으로 이송시키는 복합미생물 투여단계 및 반송관으로 이송되는 침전슬러지를 폭기조로 투여하는 단계를 포함하는 폐수처리 방법인데, 이때 미생물 혼합균주는 인위적인 것이 아니라, 축산폐수 또는 음폐수 내의 광합성균, 유산균, 효모균, 방선균을 포함한다.
하지만, 현재까지 개발된 방법들은 생슬러지의 단순발효 방법으로, 유기산의 생성효율이 낮아서 필요한 양의 탄소원을 제공하기에는 부족하다는 문제가 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은, 일반배지에 이스트추출물과 무수포도당을 혼합하여 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균의 배양과 증식이 쉽고, 값싼 배지에서 대량배양할 수 있는 락토바실러스 유산균의 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균 종균제를 일차 슬러지를 대상으로 가용화시켜 휘발성 지방산을 생산할 수 있는 휘발성 지방산의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 유산균 제제의 제조방법(배양방법)은, 이스트추출물, 무수포도당을 첨가된 배지에 유산균인 락토바실러스 브레비스(L. brevis)를 배양하여 유산균 배양액을 제조하는 단계와; 배양된 유산균 배양액을 건조하는 단계와; 건조된 유산균 배양액을 분쇄하여 유산균 분말을 생성하는 단계를 포함하며, 상기 유산균 분말에 악취 저감제로서 전체 혼합중량을 기준으로 임산 건조물인 솔잎 2.5중량%, 감잎 가루 2.5중량%를 혼합한 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 배지에 첨가되는 이스트추출물은 2중량%, 무수포도당은 3중량%인 것을 특징으로 한다.
삭제
또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균 분말을 하수처리장 일차 슬러지에 접종하여 가용화시키는 단계와; 유산균이 접종된 슬러지를 배양하여 휘발성 지방산을 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 유산균이 접종된 슬러지는 25℃∼37℃에서 배양하며, 휘발성 지방산은 아세트산인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균을 이스트추출물과 무수포도당이 혼합하여 일반배지에서 배양하여 고가의 상용화배지인 MRS를 사용하지 않고서도 값싼 배지에서 배양과 증식이 쉽고, 대량배양할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균을 하수처리장 일차 슬러지에 접종하여 가용화 시켜줌으로써 우수한 휘발성 지방산을 생산하고 이를 호기 또는 혐기 생물반응조로 공급하여 기존 하수처리공정의 탄소원으로 사용 가능하게 할 수 있는 효과가 있다.
또한, 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균 종균제를 일차 슬러지를 대상으로 가용화시킬 때에 슬러지 내에서 유산균이 생존하는지를 모니터링 할 수도 있다.
도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 유산균 분말로 슬러지의 가용화를 확인하기 위하여 초기와 72시간 후의 SCOD(용해성 화학적 산소요구량) 값을 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 유산균이 접종된 실험군과 접종되지 않은 대조군을 25℃ 및 37℃에서 배양한 후 슬러지의 가용화 산물인 휘발성 지방산 생산량 비교 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
먼저, 통상의 유산균인 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균을 이스트추출물, 무수포도당이 첨가된 배양배지를 사용하여 대량 배양한다. 배양배지에 이스트추출물과 무수포도당을 함께 첨가하면 유산균 배양시 상용화배지(MRS)와 유사한 생장을 얻을 수 있다. 이때, 이스트추출물은 2중량%, 무수포도당은 3중량% 내지 5중량%로 첨가된 배지에 첨가하는 것이 바람직하다. 이스트추출물이 2중량% 미만, 또는 무수포도당이 3중량% 미만이면 유산균의 생장이 낮아지는 문제가 있다. 특히 이스트추출물 2중량%, 무수포도당은 3중량%가 혼합된 배지는 상용화배지(MRS)와 극히 유사하게 유산균의 생장을 얻을 수 있다.
이와 같은 과정을 통해 대량 배양된 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균 배양액은 35∼40℃의 건조기에서 건조한 후 분쇄하여 파우더 형태의 유산균 제제를 제조한다. 한편, 유산균 종균제가 사용되는 슬러지 처리과정에서 발생되는 악취물질을 제거하기 위한 유산균 종균제에 악취제거 흡착제로 솔잎과 감잎을 첨가하는 것이 바람직하다. 이때, 악취제거 흡착제는 전체 혼합중량을 기준으로 솔잎 2.5중량%, 감잎 가루 2.5중량%를 혼합하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명은 이와 같이 제작된 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균 제제를 이용하여 하수처리장의 일차 슬러지로부터 휘발성 지방산, 특히 아세트산을 생산할 수 있다. 즉, 건조된 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균 분말을 하수처리장 일차 슬러지에 접종하여 가용화시키고, 유산균이 접종된 슬러지를 배양하여 휘발성 지방산을 생산할 수 있다. 이때, 유산균이 접종된 슬러지는 약 37℃에서 배양 효율이 높지만, 상온인 25℃에서도 배양할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 비교예에 의거하여 더욱 상세하게 설명한다.
<실시예 1> 탄소 및 질소원으로 무수포도당과 이스트 추출물을 첨가한 배지에서의 유산균주의 생장 확인
유산균인 락토바실러스 브레비스를 기존 상용화배지인 MRS에서 72시간 배양한 균주와 대체배지에서 72시간 자란 균주의 생장을 비교하여 보았다. 대체배지로는 무수포도당을 각각 1, 2, 3, 4, 5중량%가 되도록 첨가하고 동시에 이스트 추출물을 1.2중량% 혹은 2중량%가 되도록 첨가한 배지를 이용하였으며 균주를 접종한 후 37℃에서 72시간 배양한 후 균주의 성장을 건조중량으로 비교하여 [표 1]에 나타내었다.
배지(량) 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 비교예
배지(량) 1%무수포도당 첨가 2%무수포도당 첨가 3%무수포도당 첨가 4%무수포도당 첨가 5%무수포도당 첨가 MRS
(상용화배지)
1.2중량%의 이스트 추출물의 첨가시 건중량 (g/mL)
0.0001
0.0002
0.0009
0.0010
0.0015
0.0021
배지(량) 실시예6 실시예7 실시예8 실시예9 실시예10 비교예
배지(무수포도당 첨가량) 1%무수포도당 첨가 2%무수포도당 첨가 3%무수포도당 첨가 4%무수포도당 첨가 5%무수포도당 첨가 MRS
(상용화배지)
2중량%의 이스트 추출물의 첨가시 건중량 (g/mL)
0.0008
0.0015
0.0020
0.0022
0.0025
0.0021
[표 1]에 나타낸 바와 같이, 이스트추출물 2중량%, 무수포도당 3∼5중량%를 첨가한 배지인 실시예8∼10의 경우 상용화배지와 큰 차이가 없이 생장함을 알 수 있었다.
<실시예 2>
실시예 1의 결과를 바탕으로 이스트추출물을 2중량%, 무수포도당을 3중량% 가량 첨가한 배지에서 전배양한 유산균 락토바실러스 브레비스를 대량 배양한 후 건조한 분말을 일차 슬러지에 접종한 후 혐기적으로 밀봉한 후 슬러지의 가용화를 확인하기 위하여 초기와 72시간 후의 SCOD(용해성 화학적 산소요구량) 값을 측정하여 도 1에 나타내었다.
슬러지 가용화 실험을 위해 500mL 부피의 혈청병을 준비하였다. 혈청병에는 200mL의 1차 슬러지와 L.brevis 분말, 글루코즈, 이스트, 감잎 및 솔잎이 첨가되었다. 글루코즈와 이스트는 L.brevis의 영양원으로 슬러지 내에서 적응할 수 있도록 첨가되었고, 감잎과 솔잎은 탈취 효과에 뛰어난 영향이 있는 것으로 알려져 있다. 대조군은 실험군에서 균을 제외한 모든 성분이 동일하게 첨가되었다. 혈청병의 마개는 고무마개를 이용하였으며 알루미늄 캡을 이용하여 고정하였다. 혈청병의 헤드스페이스는 혐기적 조건을 위해 질소로 치환하였다. 혈청병은 37℃에서 72시간 동안 125rpm으로 교반 배양되었다(혈청병은 온도, 배양시간, 교반속도가 각각 37℃, 72시간, 125rpm 이며 shaking incubator에서 배양되었다).
이후 초기값에서의 반응종료 후의 변화량을 계산한 DDCOD(슬러지 분해도)(%)를 알아보았다. 이때 슬러지 분해도를 계산하는 방법 중 NaOH max 값을 이용한 분해도를 알아 보았다. 또한, 이와 같은 슬러지의 용해도가 첨가되는 배지에 의한 것인지 미생물인 유산균에 의한 것인지 확인해 보기 위하여 배지를 첨가하는 조건과 첨가하지 않는 조건으로 구분하여 실험하여 보았다.
실험결과 도 1에 도시된 바와 같이, 균주를 첨가하지 않은 그룹의 경우, 배지를 첨가하거나 첨가하지 않거나 3일 경과 후 초기 값에 비해 13∼16%가 가용화되는 것으로 나타났다. 반면에 균주가 첨가된 그룹은 배지를 첨가하지 않을 경우 33.4%, 배지를 첨가한 경우 35.8%로 가용화 효율이 나타났다. 즉, 일차 슬러지를 혐기적으로 방치할 경우 슬러지가 일부 소량 분해됨을 알 수 있으나, 유산균이 접종된 후에는 유산균에 의한 슬러지의 분해가 일어나며, 이때 배지의 첨가에 의해 소량 분해도가 향상되지만, 이는 균주의 활성을 향상시키는 조건중 하나이며, 이와 같은 영양물질의 첨가만으로 슬러지가 분해되는 것은 아님을 알 수 있었다.
<실시예 3>
실시예 2의 실험방법에 의거하여 유산균이 접종된 슬러지를 37℃에서 배양하거나, 상온조건을 구현하기 위해 25℃에 배양한 후 72시간 경과된 시료로부터 휘발성 지방산을 검출하여 생산량을 비교하여 도 2의 그래프로 나타내었다. 이때, 대조군으로는 유산균이 접종되지 않은 슬러지를 사용하였다.
시료는 12000rpm으로 10분간 원심분리한 후 실린지 필터로 다시 한번 여과한 여과액을 이용하여 분석하였다. 유기산의 분석은 FID가 장착된 가스크로마토 그래피에서 수행하였다. Graphite carbon pack B 60/80인 Glass packed FFAP (0.3%) column (ID: 3.2 mm, Length: 1.5m)을 이용하였으며, 분석조건은 오븐온도가 130℃에서 분당 10℃로 상승하여 230℃까지 올리며, 주입구 및 검출기의 온도가 230℃, 250℃로 설정하였다. 아래의 그래프는 표준시료를 이용하여 가스크로마토그래피를 실시한 예이다.
Figure 112012088259593-pat00001

도 2의 그래프에 나타난 바와 같이, 유산균이 접종된 실험군은 유산균이 접종되지 않은 대조군에 비하여 비교할 수 없을 정도로 생산량이 높았으며, 유산균이 접종된 실험군은 아세트산이 전체의 65% 가량을 차지하며 나머지 프로피온산, 이소, 노르말-부티르산, 이소, 노르말-발레르산 등이 있다.
이러한 실험결과에서 알 수 있듯이 본 발명은 슬러지 가용화의 산물인 휘발성 지방산 중 아세트산의 생산을 대량으로 촉진할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 4>
실시예 2에서 실시한 방법에 의거하여 유산균, 배지 그리고 부산물 혼합 비율에 따른 가용화 효율을 비교하기 위해 혈청병에 1차 슬러지 200mL에 접종량을 [표 2]와 같이 각각 다르게 접종하였다. RT-PCR을 이용한 슬러지 내의 L.brevis 정량 분석(모니터링)을 위해 실험 시작 1시간 그리고 72시간 후에 시료를 채취하여 분석하였다. 이때, 대조군은 균주를 제외한 접종량이 같도록 하였다.
Control Sample
성분 1 2 1 2
유산균 - - 10 9
배지 - 0.5 - 0.5
부산물 - 0.5 - 0.5
합 0 1 10 10
분석방법
RT-PCR 조건(probe, primer)
본 발명에서는 슬러지에 접종된 L.brevis를 특이적으로 선택할 수 있는 프로브와 프라이머로 슬러지 내의 미생물의 모니터링을 수행하였다. 슬러지에 접종된 브레비스를 RT-PCR로 정량적으로 분석하기 위해 L.brevis를 특이적으로 선택할 수 있는 프로브와 프라이머를 디자인하여 RT-PCR을 수행하였고 조건은 [표 3]과 같다.
항목
프로브 시퀀스 5'-TTTGTAACACCCAAAGCCGGTGA-3'
프라이머 F: 5'-CCGCCCGTCACACCATGAG-3'
R: 5'-TTGGAAGCCCTCAGTCGG-3'
Pre-denaturation 50℃ (2min)
denaturation 95℃ (10min)
Amplification 95℃ (15sec) 40 cycles
Annealing 64℃ (1min)
유산균이 접종되지 않은 대조군에서는 RT-PCR결과 L.brevis가 실험 종료 후에도 탐색되지 않았고 L.brevis가 주입된 실험군에서는 실험 72시간 후에 [표 4] 와 같은 생균수를 얻을 수 있었다. 이는 RT-PCR 기법이 슬러지와 같은 복합적인 유기물 내에서도 L.brevis의 DNA농도를 측정할 수 있을 뿐만 아니라 생균수로의 정량, 정성분석이 가능하므로 하수슬러지 처리 공정에서 L.brevis의 모니터링이 가능한 것으로 판단된다(unit : DNA ng/μL, Cells/mL)
C1 C2 S1 S2
Ct 값 24.5 23.3 16.2 18
DNA농도 - - 194.5 112.3
생균수 - - 2.2E+9 1.3E+9

Claims (7)

  1. 이스트추출물, 무수포도당을 첨가된 배지에 유산균인 락토바실러스 브레비스(L. brevis)를 배양하여 유산균 배양액을 제조하는 단계;
    배양된 유산균 배양액을 건조하는 단계;
    건조된 유산균 배양액을 분쇄하여 유산균 분말을 생성하는 단계;
    를 포함하며, 상기 유산균 분말에 악취 저감제로서 전체 혼합중량을 기준으로 임산 건조물인 솔잎 2.5중량%, 감잎 가루 2.5중량%를 혼합한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 브레비스 유산균 제제의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    배지에 첨가되는 이스트추출물은 2중량%, 무수포도당은 3중량% 인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 브레비스 유산균 제제의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 청구항 1 또는 2의 제조방법으로 제조된 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 유산균 분말을 하수처리장 일차 슬러지에 접종하여 가용화시키는 단계와;
    유산균이 접종된 슬러지를 배양하여 휘발성 지방산을 생산하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 락토바실러스 브레비스 유산균 제제를 이용한 휘발성 지방산의 생산방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    유산균이 접종된 슬러지는 25∼37℃에서 배양하는 것을 특징으로 락토바실러스 브레비스 유산균 제제를 이용한 휘발성 지방산의 생산방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    유산균이 접종된 슬러지는 37℃에서 배양하는 것을 특징으로 락토바실러스 브레비스 유산균 제제를 이용한 휘발성 지방산의 생산방법.
  7. 청구항 4에 있어서,
    휘발성 지방산은 아세트산인 것을 특징으로 락토바실러스 브레비스 유산균 제제를 이용한 휘발성 지방산의 생산방법.
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