KR100719485B1

KR100719485B1 - 혐기 미생물 복합체를 이용한 수소의 제조방법

Info

Publication number: KR100719485B1
Application number: KR1020050032480A
Authority: KR
Inventors: 김미선; 백진숙
Original assignee: 한국에너지기술연구원
Priority date: 2005-04-19
Filing date: 2005-04-19
Publication date: 2007-05-18
Also published as: KR20060110394A

Abstract

본 발명은 수소생산용 혐기 미생물 복합체를 이용한 수소의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하수처리장의 침전조로부터 발생하는 슬러지를 채집하여 일정시간 동안 열처리하는 것으로부터 수소만을 발생할 수 있는 미생물 복합체를 제조하고, 이로부터 얻어지는 미생물 복합체를 이용하여 혐기발효공정에 의해 수소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

미생물 복합체, 수소, 슬러지

Description

혐기 미생물 복합체를 이용한 수소의 제조방법{Producing Mothod of Hydrogen Gas Using Anaerobic Microorganism Complex}

도 1은 본 발명에 따른 하수 슬러지로부터 분리된 미생물 복합체의 성장과 발효 중의 특성을 나타내는 그래프

도 2는 본 발명에 따른 혐기성 미생물 복합체에 의한 혐기 발효 중 생산되는 유기산의 농도 및 종류를 나타내는 그래프

도 3은 본 발명에 따른 바람직한 실시예로서 수소생산이 우수한 경우와 없는 경우의 발효기 내에 존재하는 우점종 미생물의 분석결과

도 4는 본 발명에 따른 혐기성 미생물 복합체를 이용하여 25일간 반 연속배양할 때 발생한 수소 및 배양기 내의 pH 변화 그래프[●: 가스, △: 수소, ■: pH]

도 5는 본 발명에 따른 바람직한 실시예로서 제시되는 두부제조 폐수의 처리장치 구성도

도 6은 본 발명에 따른 혐기성 미생물 복합체가 전분을 이용하여 수소를 생산할 때의 전분의 양 및 pH 변화 그래프

유기물로부터 미생물의 성장과 수소 발생에 필요한 에너지 및 전자를 얻는 혐기 발효에 의한 생물학적 수소생산은 태양광을 이용하는 광합성 세균이나 조류에 의한 수소생산 보다 속도가 빨라서 산업적으로 수소를 대량 생산할 수 있는 기술로 평가되고 있으며, 그 장점은 다음과 같다.

첫째, 관련 혐기 세균은 광합성 미생물에 비해 수소생산 속도가 빠르다.

둘째, 태양광을 이용하는 광합성 미생물과는 달리 어둠조건에서도 발효가 일어나므로 유기물을 기질로 하여 밤ㅇ낮 구별없이 수소를 생산할 수 있다.

셋째, 균체 성장속도가 빨라서 연속 배양이나 대형 시설 등의 유지에 편리하다.

넷째, 식품계 공장 폐수, 음식쓰레기, 농산물 집하장 폐기물등 유기성 폐기물의 처리기술로 활용될 수 있다.

혐기발효를 할 수 있는 세균은 하수 슬러지나 하천 밑바닥과 같은 산소가 부 족한 혐기적 환경을 갖는 자연 생태계에서 미생물이 복합적으로 존재하며, 이러한 미생물 복합체는 생태계를 일정한 조건으로 유지하기 위해 생물학적인 반응을 하고 있다. 즉 이러한 미생물 복합체는 고분자 물질을 액화하는 미생물, 수소를 발생하는 미생물, 수소를 소비하는 미생물, 수소 대사와 관련이 없는 미생물 등으로 구성되어 있다.

혐기 조건에 존재하는 산 생성 세균은 유기물로부터 유기산, 이산화탄소 및 수소를 생성하며, 이 생성물들은 다시 수소를 소비하는 세균에 의해서 메탄과 이산화탄소로 전환된다. 즉, 생성된 수소가스를 소비하는 메탄 세균과 수소가스를 생성하는 산 생성 세균이 혐기 상태에서 공존하면서, 하수 슬러지 내의 수소가스, 메탄가스 및 유기산의 균형을 이루는 자연 상태로 유지된다.

종래 계속적으로 수소를 생성할 목적으로 수행된 많은 연구에서는 수소만을 생산하는 발효기내의 제반 조건을 유지하기 위하여 pH의 조절, 발효기내의 유기물질의 유지, 발효기내의 보유시간, 질소가스의 충진 등의 다양한 처리조작이 실시되었으나 계속적으로 수소를 생산하는 데는 성공하지 못하였다.

또한, 식품공장 폐수, 하수 슬러지, 농산 시장 폐기물 및 음식 쓰레기와 같은 유기성 폐자원은 국내에 가용량이 많은 자원이며, 동시에 2005년부터는 법률로 매립이 금지되는 폐기물이기도 하다.

유기성 폐자원으로부터 생물학적 수소생산은 대체·청정 에너지 생산과 아울러 유기성 폐기물을 처리할 수 있는 기술로써 에너지생산과 환경처리의 두 가지 목적에 부합된다.

일본을 비롯한 선진국에서는 최근 식품 가공폐수 및 슬러지로부터 생물학적으로 수소를 생산하기 위하여 지난 8년간 '환경조화용 수소제조기술개발'이라는 대형 프로젝트가 약 290억원의 규모로 활발히 연구되었다.

식품공장 폐수 중에서도 두부제조 폐수는 대부분이 시장이나 아파트 단지에서 소규모로 만들어져 판매되고 있으며, 제조 중에 발생하는 폐수는 COD, BOD가 각 27,440 mg/ℓ와 9,800 mg/ℓ로 상당히 높아서 수질 오염의 주원인이 되고 있다.

제조공장 자체 내의 폐수처리 시설을 갖춘 곳에서도 폐수 자체가 전분 및 당의 함량이 높고 질소원 농도가 낮아 효율적인 처리가 어려운 것으로 나타나고 있다. 특히 재래식 처리 공정 중 pH를 비롯한 제반 조건이 산 생성균 및 메탄 생성균의 공존이 어려워서 이로 인한 폐수 중 유기물질의 분해가 지연되거나 제한되어 처리효율이 일정하지 않다.

수소생산 세균은 혐기발효조건에서 탄수화물을 이용하여 배양액 중에 각종 유기산, 유기용매를 축적하고 동시에 수소와 이산화탄소를 발생한다. 대표적인 것으로 클로스트리디움 부티리컴(Clostridium butyricum), 클로스트리디움 파스텡리아넘(Cl. pasteurianum), 클로스트리디움 아세티컴(Cl. aceticum), 클로스트리디움 클루이베리(Cl. kluyveri) 및 엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes)이 가장 잘 알려진 혐기발효 수소생산 세균으로, 현재 이들을 이용한 수소생산에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

그러나 이러한 단일 세균을 사용하여 유기성 폐수나 폐기물로부터 수소를 장기적으로 생산하기는 실질적으로 어렵다. 왜냐하면 두부폐수 자체에 이미 많은 미 생물이 존재하기 때문에 수소생산 효율이 낮아지거나 다른 가스가 발생할 수 있기 때문이다. 또한 식품산업 및 농ㆍ수ㆍ축산분야의 고농도 유기폐수는 그 성상자체가 복잡할뿐더러 공정이나 배출 계절에 따른 특성 차이와 크기를 고려하여 폐수별 특성에 관하여 보다 많은 연구가 필요하다.

본 발명은 상기 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위하여 제시되는 것으로,

본 발명의 목적은 하수처리장의 침전조로부터 발생하는 슬러지를 채집하여 일정시간 동안 열처리하는 것으로부터 수소만을 발생할 수 있는 미생물 복합체를 얻고, 이를 이용하여 혐기발효공정을 통해 밤, 낮의 구분없이 안정적이면서 대량으로 수소를 생산하는 방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 수단으로 본 발명은 하수처리장의 침전조에서 발생하는 농축 하수슬러지를 수집하는 단계; 상기 농축 하수슬러지를 열처리하여 수소생성 미생물을 농축하는 단계; 및 상기 농축된 수소생성 미생물을 기질에 첨가하여 혐기발효공정을 이용하여 수소를 생성하는 단계를 포함하는 혐기 미생물 복합체를 이용한 수소의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 열처리 온도는 80℃∼100℃에서 수행되어짐을 특징 으로 하는 혐기 미생물 복합체를 이용한 수소의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 열처리는 85℃∼95℃에서 10∼30분간 1회 동안 수행되어지는 것을 특징으로 하는 혐기 미생물 복합체를 이용한 수소의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 수소가스의 생성 중 연속적으로 반응물의 교반을 수행하거나, 또는/및 생성된 가스를 제거해 주는 단계를 더 포함하는 혐기 미생물 복합체를 이용한 수소의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 하수처리장의 침전조에서 발생하는 농축 하수슬러지를 수집하는 단계; 상기 농축 하수슬러지를 열처리하여 수소생성 미생물을 농축하는 단계; 및 상기 농축된 수소생성 미생물을 기질에 첨가하여 혐기발효공정을 이용하여 수소를 생성하는 단계를 포함하는 혐기 미생물 복합체를 이용한 수소의 제조방법을 포함한다.

이때 하수처리장의 침전조는 바람직하게는 2차 침전조이며, 발생된 농축 하수 슬러지는 메탄생성 미생물과 수소생성 미생물을 모두 포함하고 있다. 본 발명에서는 수소를 소비하는 메탄생성 미생물 내지는 젖산발효와 같은 수소생성을 수반하지 않는 혐기발효에 관여하는 미생물을 사멸시키거나 불활성화시키면서 수소생성 미생물의 활성을 유지시키는 기술에 의해 수소생성 효율을 증진시킬 수 있다.

이를 위하여 본 발명은 하수처리장의 2차 침전조로부터 얻어지는 농축 하수 슬러지를 간단하게 열처리하는 것에 의해 위와 같은 효과를 달성하고자 한다. 이 경우 열처리는 80℃∼100℃에서 수조에서 수행되어지며, 바람직하게는 85℃∼95℃에서 10∼30분간 1회 동안 수행하는 것이 좋다. 이때 과도한 수준의 열처리는 오히려 수소생성 미생물의 활성마저도 사멸 내지는 불활성화 시키는 우려가 있으므로 주의하는 것이 좋다.

상기 과정을 거쳐 얻어지는 본 발명에 따른 미생물 복합체는 혐기균주인 클로스트리디움 속 균주가 우점종을 이루는 것으로 판단되었다. 상기 혐기균주는 당 분해 대사 중 수소와 다양한 유기산을 축적하는 것으로 알려져 있다. 즉, 포도당을 기질로 하여 유기산으로 발효시키는 과정에서 포도당 1몰당 아세트산 발효과정에서는 4몰의 수소가 발생되고, 부틸산 발효과정에서는 2몰의 수소가 얻어진다.

하지만, 2차 침전조로부터 얻어지는 농축 하수 슬러지를 열처리 등의 조작을 거치지 아니하는 경우 슬러지내에는 메탄생성균 내지는 락토바실러스속 균이 다수를 점하게 되어 수소소비 내지는 젖산 발효과정을 수행하게 된다. 1몰의 포도당에 대하여 젖산 발효과정을 수행하게 되면 전혀 수소를 생성하지 않게 된다.

따라서, 본 발명에 따른 2차 침전조로부터 얻어지는 농축 하수 슬러지에 대한 열처리 과정은 이와 같이 수소생성과는 무관한 메탄생성, 젖산발효 등을 수행하는 미생물을 사멸 내지는 불활성화 시키는 과정을 포함한다. 또한, 이와 같은 열처리 과정은 수소생성과 관련된 혐기세균의 사멸 내지는 불활성화에 관여하여서는 아니된다. 이는 앞서 언급한 바와 같이 열처리 조건인 온도 및 시간 등의 조절을 통해 수행되어질 수 있다.

본 발명에 따른 혐기성 미생물 복합체는 유기성 폐수를 처리할 목적으로 사 용되어질 수 있다. 본 발명에 따른 혐기성 미생물 복합체를 수소생산에 이용하는 경우 종래 광합성 미생물에 의한 수소생산 속도보다 빠른 장점을 제공한다.

또한, 태양광을 이용하는 광합성 미생물과는 달리 어두운 조건에서도 발효과정을 수행할 수 있으므로 유기물을 기질로 하여 밤과 낮의 구분 없이 수소를 생산할 수 있게 한다.

또한, 균체의 생장속도가 빨라 연속배양이나 대형 시설 등의 유지에 편리하며, 식품계 공장 폐수, 음식 쓰레기, 농산물 집하장 폐기물 등 유기성 폐기물의 처리에 매우 유용하다.

수소생성을 위한 발효과정 중에 최종적인 수소생산량의 증대를 위해서는 연속적으로 교반 또는 배양기 내에 생산되는 수소가스를 제거해 주는 것이 바람직하다. 연속적인 교반과 가스의 제거는 정치 배양에서 보다 약 1.2 배 정도의 수소생산의 증가를 가져온다. 연속적인 교반이 주는 효과는 배양기 내의 수소가스를 제거하여 수소분압을 낮추는 것과 아울러, 교반을 통해 균체가 배양기 바닥에 가라 앉아 물질 전달 현상이 저해되는 것을 방지 할 수 있다. 이는 배양기를 대형화하는 것에 있어서 매우 중요한 요소이다.

이하에서는 기질로서 유기성 폐기물 중의 하나인 두부제조 폐수를 이용한 수소생산 과정을 소개하면 다음과 같다.

도 5는 두부제조 폐수를 처리하여 수소를 생성하기 위한 장치구성을 나타내고 있다. 두부제조 폐수의 처리를 위한 수소생성장치는 발효기(4), 기질(2), 배출탱크(8), 펌프(3), pH 조절기(7), 알칼리(9), 교반기(6), 가스포집장치(10)를 포함 하고 있다.

먼저, 두부제조 폐수에 균체의 성장을 위한 영양원으로서 효모추출물 2∼5g/ℓ과 염화암모늄 5∼10g/ℓ를 첨가한 후 본 발명에 따라 분리된 혐기 미생물 복합체를 부피비율로 약 10∼20％가 되도록 첨가한다. 이때 pH는 대략 6.8정도의 수준으로 유지시키고, 혐기발효공정을 위하여 아르곤 가스를 약 5∼20분간 치환하여 발효기(4) 내에서 공기를 제거한다.

발효과정은 30∼40℃ 정도에서 수행되며, 발효 중 발생된 가스(수소 포함)와 발효가 종료된 액은 탱크(8)로 이동되고, 이때 가스는 가스포집장치(10)에서 측정된다. 두부제조 폐수는 발효가 진행되면서 수소와 유기산이 생기므로 pH가 계속 저하되므로 이를 방지하기 위하여 pH 프로브를 발효기(4) 내에 설치하고, pH 조절기(7)을 통해 5.5∼6.5 정도로 조절한다.

두부제조 폐수 내의 유기물이 다 소비되면 더 이상 수소가 생산되지 않으므로 새로운 두수제조 폐수를 계속하여 공급한다. 이때 탱크(4)에 수소생산 미생물이 다량으로 존재하므로 새로운 미생물을 추가하여 공급할 필요는 없다.

두부제조 폐수는 전분의 함량이 높아서 분해속도가 느리지만 도 6에 나타낸 바와 같이 pH를 6.5 정도로 조절하면 약 22시간 경과 후 모두 분해시킬 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예 1> 혐기성 미생물 복합체의 제조

실험과정

(1) 하수 슬러지 및 열처리

대전광역시 하수처리장의 2차 침전조에서 발생하는 농축 하수슬러지를 수집하여 53㎖ 시럼 병(serum bottle)에 하수슬러지 20㎖를 채우고 90℃ 수조에서 가스를 제거하며 20분간 가열처리 하였다.

(2) 배양조건

53㎖ 시럼 병에 2㎖(10％) 하수슬러지를 1％ 글루코스가 함유된 PYG 합성배지[K₂HPO₄0.9g; KH₂PO₄0.9g; NaCl 0.9g; (NH₄)SO₄0.9g; MgSO₄0.09g; CaCl₂0.09g; 펩톤 10.0g; 효모 추출물 5.0g; 시스테인ㆍHCl 0.5g; Na₂CO₃ㆍ10H₂O 4.0g; ρ-아미노베노산 100㎍; 바이오틴 10㎍; 포도당 10g] 18㎖에 넣고, 마개로 밀폐한 후 아르곤 가스로 15분간 치환하여 혐기조건을 만들고, 37℃에서 7시간 또는 16시간 간격으로 계대 배양하여 하수 슬러지 균주의 수소생성을 관찰하였다. pH는 초기 7.0으로 하고 이후 조절하지 않았다.

(3) 분석

배양액에서 생성된 수소 함량은 33㎖ 시럼 병의 헤드 공간을 가스-타이트 마이크로시린지로 100㎕ 채취하여 가스 크로마토그라피 (Shimazu 14-B)로 분석하였다. 사용된 칼럼은 300㎜×2㎜ (길이×지름) 글라스로 몰래큘라 시브(Molecular Sieve) 5A (Supelco Inc.)를 충진물질로 사용하였으며, 열전도 검출기(TCD)로 분석 하였다. 발생가스 중 수소 가스 정량을 위한 분석 조건은 칼럼온도 80℃, 주입기 온도 100℃, 검출기 온도 120℃이었으며, 운반가스는 아르곤으로 유속 35㎖/분으로 유지하였다. 배양액 중 균체농도는 자외선-가시광 스펙트로포토미터 (Shimadzu UV-1601)를 파장 660nm에서 측정하였다. 배양액 중 탄소원으로 사용된 포도당 농도는 디나이트로술폰산 (DNS) 방법으로 정량하였다. 포도당을 기질로 한 배양 시, 일정시간 간격으로 채취한 배양액을 10,000g에서 5분간 원심 분리하여 균체와 상등액을 분리한 시료를 환원당 분석에 사용하였다. 시료 1㎖에 DNS 3㎖을 첨가한 후 5분간 100℃에서 끓이고 식힌 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도를 알고 있는 포도당 표준시약으로 표준곡선 식을 만들고 이에 준하여 환원당의 분해를 계산하였다. 배양액의 pH는 pH 미터 (TOA, 모델 30G)로 실온에서 측정하였다

(4) 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)

하수슬러지 내 수소생성균주의 DNA 분석을 위해 미생물군집의 해석을 위한 분자 생물학적 방법으로서 폐수처리나 유기물의 분해시의 평가로 최근 주목을 모으면서 많은 연구가 이뤄지고 있는 PCR-DGGE법을 사용하였다.

PCR로 증폭된 DNA는 Dcode Universal Mutation Detection System(Bio-Rad Laboatories, Hercules, CA)를 이용하여 100V, 60℃에서 6시간 동안 분리하였다. DGGE의 겔은 40∼60％로 요소와 포름아마이드의 혼합제로 농도 구배된 6％ 폴리아마이드겔(아크릴아마이드; N,N'-메틸렌-비스아크릴아마이드 비, 37.5:1[Bio-Rad])을 사용하였다. 전기영동 이후, 겔은 에티디움브로마이드(100㎕/L)로 염색하여 사진을 찍었다(PHC-34, Vilber Lourmat, 프랑스).

(5) PCR 증폭

하수슬러지내 수소생성균주의 DNA는 MO. Bio에서 제조한 울트라클린 DNA 키트를 사용하여 분석하였다. GC 클램프(5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3')를 가진 포워드 프라이머 968f (5'-AACGCGAAGAACCTTAC-3')와 리버스 프라이머 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 Taq 폴리머라제, dNTP 복합체, 10× 버퍼와 혼합 후, 총량 20㎕가 되도록 하여 16S rDNA 증폭을 시도하였다. PCR 반응은 첫 사이클이 시작하기 전에 95℃에서 5분간 가온하고, 이 후 30 사이클은 95℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 90초간 연장반응을 시행하였다. 그리고 완전한 연장을 위해 72℃에서 10분간 지속하였다. DGGE 분석하기 전 0.8％ 아가로스겔에 전기 영동하여 DNA의 증폭여부를 확인하였다.

실험결과

대전광역시 하수처리장의 2차 침전조에서 발생하는 농축 하수슬러지를 수집하고 이를 종균으로 사용하여 수조를 이용해 열처리를 수행한 결과 하수슬러지 내의 메탄생성 미생물은 사멸시키거나 불활성 시키고, 수소생산 미생물만을 농축하는 결과를 나타내었다. 그러나 2∼3번의 계속적인 열처리는 수소생산 세균도 모두 사멸하였다 (표 1).

<표 1> 하수 슬러지 열처리와 발생한 슬러지 복합균에 의한 균체 및 수소생산

		열처리(90℃, 20분)
		-	+	++	+++
균체성장 및 수소생산	1일	○	○	△	×
	2일	○	○	×	×
	3일	×	○	×	×
	4일	×	○	×	×
	~2달	×	○	×	×

○: 균체성장과 수소생산이 우수

△: 균체성장과 수소생산이 약간

×::균체성장과 수소생산이 없슴

-: 하수슬러지를 열처리 하지 않음.

+: 하수슬러지를 한번 열처리 후 종균으로 이용하여 PYG 배지에서 14시간 배양

++: +처리한 배양액을 다시 열처리한 후 PYG 배지에서 14시간 배양

+++: ++처리한 배양액을 다시 열처리한 후 PYG 배지에서 14시간 배양

또한 하수슬러지를 열처리하지 않고 종균으로 사용할 때는 배양 초기에는 수소 생산율이 높았으나, 2일 후에는 혐기 배양조건에서 균체가 성장하지 않고, 수소도 발생하지 않았다.

열처리 결과 분리한 수소생산용 복합균을 "하수 C-1"으로 명명하고, 약 2달간 계대 배양을 하며 수소생산과 균체성장을 관찰한 결과, 분리할 당시 초기상태와 같은 수소생산력을 유지하고 있었다. 즉, 도 1을 참조하면, 1％ 포도당을 함유하는 PYG 합성배지에서 배양 10∼15시간 후 수소생산성은 1.2 ㎖ H₂/mg-건조세포중량이며 이는 2.94 ㎖ H₂/ml-배양액에 해당한다. 균체의 건조중량은 2.2 mg/ml 이고, 초기 pH 7.00은 약 배양 4시간 이후부터 감소하기 시작하여 pH 4.48로 저하하였다.

이 때 발생하는 유기산은 도 2의 결과에 의하면 아세테이트, 락테이트, 부티레이트가 각각 17, 35, 35mM 이었으며, 시간이 경과함에 따라 부티레이트 농도가 높아졌다.

1M 포도당으로부터 산 생성 혐기세균이 약 4M H₂와 2M CO₂ 및 아세테이트를 생산하는 것을 최대 변환율로 가정할 때, 1％ 포도당으로부터는 ℓ-배양액으로부터 약 4.93ℓH₂ 가 최대 발생할 수 있다.

하수 C-1은 2.94㎖ 수소를 발생하여 포도당으로부터 수소로 변환하는 데 약 59％의 효율을 나타내었다. 발생된 유기산은 아세테이트만이 아니라 락테이트와 부티레이트가 혼합되어 있어서 수소생산량에는 차이가 있다고 사료된다. 즉, 포도당이 복합균주의 락토바실러스 속에 의해 락테이트로 전환될 때는 전혀 수소가 발생하지 않고, 부티레이트로 전환될 때는 약 2M 수소가 발생하여 아세테이트로 전환될 때와 비교하여 약 50％만 발생한다 (하기식 참조).

(1) C₆H₁₂O₆ + 2H₂O → 4H₂ + 2CO₂ + 2CH₃COOH

(2) C₆H₁₂O₆ + H₂O → 2CH₃CHOHCOOH

(3) C₆H₁₂O₆ + H₂O → 2H₂ + 2CO₂ + CH₃(CH₂)₂COOH

하수 C-1 복합균은 1％ 포도당을 약 5∼6시간 동안에 거의 모두 소비하여 유기산을 발생하였다. 발생된 산은 주로 아세테이트, 락테이트, 부티레이트이며, 유기용매인 에탄올도 생성되었다. 이는 배양액의 pH를 저하시켜서 배양 3시간에 포도당이 약 33％ 유기산으로 분해되었으며, pH는 5.29로 낮아졌다. 이 때 균체는 1.823g-건조세포중량/L-배양액이 성장했다. 이 복합균은 대수성장기가 약 5시간 계속 되었으며 이때 세대시간은 18분 이었다. 수소발생은 포도당이 분해하여 유기산을 생성하는 시기와 같이 시작되어 포도당 분해가 정지했을 때 수소생산도 중단되었다. 포도당은 87.5％이상 분해되지 않았는데, 이는 배양액의 pH가 이미 4.5까지 낮아져서 복합균 하수 C-1이 더 이상 생육할 수 있는 최저 pH에 도달했기 때문으로 사료된다. 추가 실험에서 배양 중에 pH를 6.8∼7.0으로 유지할 때는 포도당이 모두 분해되었다. 열처리를 하지 않은 하수슬러지 자체를 수소생산을 위한 종균으로 사용할 경우와 열처리 후에 하수슬러지로부터 분리된 복합균 하수 C-1을 배양하면서 미생물군의 분포를 살펴보았다.

도 3에서와 같이 수소를 생산하는 혐기 배양액에 존재하는 미생물은 레인 5, 6, 7에서와 같이 일정하게 밴드 패턴을 보였으며, 이 밴드를 추출하여 PCR로 DNA를 증폭시켜 16S rRNA와 일치하는 유전자를 가진 미생물을 진뱅크 BLAST를 가동하여 가장 확률이 높은 미생물을 찾았다. 수소생산이 우수한 혐기배양액으로부터는 클로스트리디움 속의 균주와 일치하는 혐기균주가 많은 반면 (도 3-E∼G), 수소생산이 되지 않는 배양액으로부터는 락토바실러스 종의 미생물이 다량 검출되었다(도 3-C,D). 이와 같은 결과는 락토바실러스 종의 균주는 일반적으로 포도당으로부터 락테이트와 CO₂를 생산하여 수소가스를 발생하지 않는 당 분해 메커니즘을 갖는 반면 클로스트리디움 종의 균주는 당 분해 대사 중, 수소와 다양한 유기산을 축적하는 것으로 알려진 것과 일치하는 결과이다. 수소를 생산하지 않는 배양액으로부터는 비피도박테리움 종도 일부 검출되었다(도 3-A,B).

가스 생산과 배양 중의 교반 및 가스제거는 총 가스와 수소생산에 영향을 주었다. 배양기내의 공기를 아르곤으로 치환한 후, 배양하기 때문에 발생한 가스 중 수소함량은 배양기내의 복합균이 생산하는 수소농도보다 낮게 측정되었다. 배양 중 연속적인 교반과 배양기 내에 생산되는 가스제거는 정치 배양 보다 약 1.2배 수소생산을 증가시켰다. 연속적인 교반이 배양기 내의 가스를 제거해 주는 것 보다 더 좋은 효과를 보였다. 이와 같은 현상은 교반을 하지 않을 경우, 균체가 배양기 바닥에 가라앉아서 물질 전달 현상이 저해 되는 것으로써 이와 같은 연속적인 교반과 가스제거 효과는 배양기를 대형화함에 있어 중요한 인자로 사료된다.

<표 2> 하수 슬러지로부터 분리된 복합균이 혐기 발효할 때 발효기의 교반과 가스 제거가 수소생산에 주는 영향

	총 가스생산(㎖)	H₂
	총 가스생산(㎖)	함량(％)	비율 (㎖ H₂/㎖ 배양액)
교반× 가스제거×	32.7(±4.22)	36.7(±1.11)	1.77(±0.08)
가스제거만 수행	36.7(±2.89)	43.3(±3.11)	1.85(±0.06)
교반만 수행	48.3	44.5	2.1
교반 및 가스제거 수행	52.7(±7.56)	45.7(±1.11)	2.17(±0.15)

열처리한 슬러지로부터 분리한 복합균주는 pH를 조절하지 않은 조건에서 반연속 배양(HRT=24hr)으로 안정적으로 약 1달간 수소를 생산하였다 (도 4). 생성된 총 가스 중 수소는 평균 60∼70%를 차지하였고, 나머지는 CO₂이었다. 환원당은 18∼20시간 만에 모두 소비되었으나, 편의상 24시간 마다 배지를 교환하였다. 배양 중 pH는 초기에 6.7∼6.8에 이르며 24시간 후 4.5로 낮아졌으며, 균체 농도는 흡광도 3.9∼4.2 로 유지되었다. 환원당 10 g/ℓ는 15∼17시간동안 약 70% 가량 분해 되었고, 유기산 생성으로 pH가 약 4.5로 저하되었으며, 24시간 후 탄소원은 약 3.2∼3.5 g/ℓ 가 남았다. 이는 pH 저하로 인해 분해되지 못하고 배지교환으로 pH가 다시 6.7∼6.8로 상승하면 약 5시간 동안 36% 환원당이 분해되고, 15시간 동안 63%가 분해 되었다.

<실시예 2> 두부제조 폐수의 처리

실험과정

두부제조 후 12 시간이 경과하지 않은 두부제조 폐수 (표 3)에 효모 추출물 3g/ℓ, NH₄Cl 8g/ℓ를 첨가하고, 하수슬러지로부터 분리한 복합균(하수 C-1)을 부피 비율로 약 20％가 되도록 첨가하고, pH를 6.8로 조절한 후에 아르곤가스를 약 10분간 치환하여 발효기(도 5의 부호(4)) 내의 공기를 제거하였다. 발효장치를 도 5에 도시한 바와 같이 설치하고, 37℃에서 배양을 수행하였다. 발생된 가스 (수소 포함)와 발효가 끝난 액은 탱크(8)로 이동하며, 이때 가스는 실린더(10)에서 측정되 었다. 두부제조 폐수는 발효가 진행되면서 수소와 유기산이 생기므로 pH가 계속 저하하는데 이를 막기 위하여 pH 센서를 발효기(4)에 설치하고, pH 조절기(7)를 통해서 5.5로 조절하였다.

두부제조 폐수 내의 유기물이 다 소비되면 더 이상 수소가 생산되지 않으므로 탱크(2)를 설치하여 새로운 두부폐수를 계속 공급하였다. 이 때 탱크(4)에 수소생산 미생물이 다량 존재하기 때문에 새로운 미생물을 공급할 필요는 없다.

두부제조 폐수는 전분의 함량이 높아서 분해속도가 늦지만 도 6에서 나타난 것과 같이 pH를 6.5로 조절하면 약 22 시간 경과 후 모두 분해되었다. 두부 제조폐수(1.4％ 전분 함유, 질소원 첨가)로부터 위 균주를 이용하고, 조건을 최적화하여 1.7ℓH₂/ℓ-폐수를 발생하였으며 이때 발생된 산은 주로 아세테이트, 락테이트, 부티레이트이며, 각각 64, 120, 및 44 mM 이었다.

<표 3> 두부제조 폐수의 조성

환원당 (g/ℓ)	전분 (g/ℓ)	암모니아성 질소 (ppm)	TS (g/ℓ)	SS (g/ℓ)	VS (g/ℓ)	BOD (mg/ℓ)	COD (mg/ℓ)
0.736	8∼15	5.66	17.3	1.4	12	9,060	22,000

TS : 총 고형분, SS : 부유성 고형분, VS : 휘발성 고형분

수소와 유기산 분석

배양 중 발생된 가스양은 발효기에서 운전할 경우, 0.1N NaOH 용액을 통과하여 메스실린더의 눈금을 읽어서 측정하였다. 수소의 함량은 발효기의 헤드 공간 가스를 주사기로 100㎕를 채취하여 가스 크로마토그라프로 분석하였다. 사용된 칼럼은 300mm×200mm (길이×내경) 스테인레스 스틸재질에 분자체 5A (Supelco. Inc)로 충진하여 사용하였으며, 검출기로서 열전도 검출기 (TCD)를 사용하였다. 칼럼온도 80℃, 주입기온도 100℃, 검출기 온도 120℃를 분석조건으로 사용하였으며, 아르곤 유속은 35 ㎖/분으로 유지하였다.

실험에 사용된 바이오매스와 혐기균주에 의한 발효산물은 배양액을 일정시간 간격으로 채취하여 시료 중 불순물과 상등액을 분리하고, 배양액은 균체와 상등액을 분리한 후 상등액 20 ㎕를 0.2 마이크로 필터가 장착된 주사기로 여과한 후, 분석하였다. 유기산 분석용 컬럼인 Aminex HPX-87H, 300 mm×7.8mm (길이×내경)를 장착한 HPLC를 사용하여 실온에서 유기산을 분석하였으며, 각종 유기산 피크는 UV 검출기를 이용하여 파장 210nm에서 측정하였으며, 0.01N H₂SO₄를 이동상으로 하여 유속 0.6㎖/분으로 용출하였다.

<표 4>

	시간(min)	계 산 식
아세테이트	14.95	y = 0.0000148x - 0.9693
락테이트	11.03, 11.63, 12.41	y =0.00000619x + 0.1961
부티레이트	22.0	y = 0.00001106x - 0.1529
포르메이트	13.7	y = 0.00000788x - 0.0131

환원당 및 전분 정량

배양액의 환원당 정량은 디나이트로스알리사이클산 (DNS) 발색법을 이용하였고, 전분의 농도는 5.5N HCl 0.2㎖과 2㎖ 시료를 100℃ 물에 30분간 가열시킨 후 2.2㎖ Na₂CO₃를 첨가하여 중화시키고, DNS방법으로 정량하였다. 표준곡선은 가용성전분을 이용하여 동일한 방법으로 정량하였으며 표준선 식은 하기식과 같다.

포도당 표준선 식: y = 4.34x - 0.46

(y = 포도당 (g/ℓ), x = 540nm 에서의 흡광도)

전분 표준선 식: y = 53.8x - 0.59

(y = 전분 (g/ℓ), x = 540nm 에서의 흡광도)

본 발명에 의하면, 하수처리장의 침전조로부터 발생하는 슬러지를 채집하여 일정시간 동안 열처리하는 것으로부터 수소만을 발생할 수 있는 미생물 복합체를 얻고, 이를 이용하는 혐기발효공정을 통해 밤, 낮의 구분없이 안정적이면서 대량으로 수소를 생산할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

하수처리장의 침전조에서 발생된 농축슬러지를 85℃∼95℃에서 10∼30분간 열처리하여 수소생성 미생물을 농축하는 단계; 농축된 수소생성 미생물을 혐기분위기하에서 계대배양하는 단계; 및 계대배양된 수소생성 미생물을 기질에 첨가하여 혐기발효공정에 의해 수소를 생성하는 단계를 포함하며, 상기 수소가스의 생성과정은 연속적인 반응물의 교반 및 생성된 가스의 제거단계를 포함하는 혐기 미생물 복합체를 이용한 수소의 제조방법.
삭제
제 1항에 있어서, 열처리는 1회 동안 수행되어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
제 1항에 있어서, 기질은 두부제조 폐수인 것을 특징으로 하는 제조방법