DE2212276A1 - Verfahren zur Herstellung von 7-Aminodesacetoxy-cephalosporansaeure - Google Patents

Description

PATENTANWALTS3ÜR0 'hOMSEN - TlEDTKE - BöHLINQ

TEL. (0611) 530211 TELEX: 5-24 303 top«« LL I LL I Q

630212

PATENTANWÄLTE MOndwn: Frankfurt/M.: Dipl.-Chem. Dr. D. Thomeen Dlpl.-Ing. W. Walnkauff Dipl.-Ing. H. Tiedtke (Fudiihohl 1\\

Dipl.-Chem. Q. Bühling Dipl.-Ing. R.Kinne Dipl.-Chem. Dr. U. Eggere

8000 München 2

Kalser-Ludwlg-Platz 6 14. März 1972

Toyo Jozo Company, Ltd. Shizuoka (Japan)

Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-desacetoxy-cephalospQransäure

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-desacetoxy-cephalosporansäure (nachstehend als "7-ADCA" bezeichnet) durch enzymatisches Deacylieren einer 7-Acylamino-desacetoxy-cephalosporansäure. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von 7-ADCA„ d„h. 7-Amino-3-methyl- Δ -cepheni-4-carbonsäure durch Verwendung einer Enzymzubereitung, welche sich von Bacillus raegateriura herleitet.

Bisher wurde 7-ADCA hergestellt nach einem Verfahren, bei welchem Cephalosporin C katalytisch In Anwesenheit von Pai~ ladium-Kohle zur Erzieltmg von 3-Methyl-7-(td-aminoadipoylanid)- ~A -cephem-4-carbonsäure reduziert wird, welche dann durch

209852/1094

Hydrolyse deacyliert wird (USA-Patentschrift 3 124 576 von 1964); ferner nach einem Verfahren, bei welchem 7-Aminocephalosporansäure durch katalytische Reduktion deacyliert wird (die gleiche USA-Patentschrift wie oben erwähnt); und nach einem Verfahren, bei welchem S-Iiethyl^-phenoxyacetanid- Δ -cephen-4-carboxylat, welches von Phenoxymethylnenicillin hergeleitet ist, in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel in Anwesenheit von Pyridin rait PCl₅ behandelt wird, und das sich ergebende Imidehlorid mit einem Alkohol behandelt wird, wobei sich ein Imidester bildet, welcher dann der Hydrolyse unterworfen wird (belgische Patentschriften 717 741 von 1969 und 737 von 1970).

Sämtliche oben erwähnten Verfahren sind jedoch chemische Zerjetzungsprozesse und es ist kein Verfahren zur enzymatischen He: ellung von 7-ADCA vorgeschlagen worden.

Erfindungsgemäß soll nun 7-ADCA mit Vorteil auf enzymatischem liege erzeugt Herder, und es wurden nunmehr verschiedene Otamme erforscht, "eiche in der Lage sind, 3-Methyl-7-phenoxyac2tarai,c:- & "'■ ο ephem-4-carbonsäure oder 3-Methyl-7-phenylacetamid-'-i ^J-';.f^rv=u;-i-:, r^oäsäure zu deaeylieren. Als Ergebnis v'.irie r ·:^β] , ; finden, daß ein Stamm B-4OO, welcher zur Gattung "acUli Ji' t, und welcher aus Erdboden isoliert worden ist, ein EnsyiTt psx auzicrt, welches in der Lage ist, die Ainitlbindungen

209852/1094

von S-Methyl-^-phenoxyacetamid- Δ -cephem-4-carbonsäure und 3-Methyl-7-phenylacetamid~ Δ -cephera-4-cafbonsäure su zersetzen. Ferner wurde überraschenderweise gefunden, daß beim Behandeln von 3-Methyl-7-phenyI-acetamid- Δ ™cephen-4-carbonsäure mit einer Enzymzubereitung, welche sich von dem oben erwähnten Stamm ableitet, eine Verbindung erzeugt wird, welche an sich inaktiv ist, jedoch mit Hilfe von Phenylacetylchlorid quantitativ in 7-ADCA umgewandelt werden kann? und daß beim Behandeln von 3-Methy 1-7-phenoxyacetamid- A'"-cepIien-4-carbonsc5ure mit der oben

rs

erwähnten Engymzubereitungp auch 7-&iH±no-3-methyl- Δ -cephem-4-carbonsäure erzeugt werden kann_o

Mycologische Eigenschaften des oben erwähnten Stammes B-400 sind die folgenden §

I. Morphologische Eigenschaften iSetirägkialtur auf Agarbrühe, 18 oder 24 Stunden bei 30°C)s

(1) Zellen stabförmig, hauptsächlich in langen Ketten, runde Enden.

(2) Größe 1,2 bis 1,5 χ 2,0 bis 3,5 Mikron.

(3) Kein Häutchen.

(4) Beweglich mit Geiseln(am Umfang}_e

(5) Grampositiv.

(6) Sporen (Sojabohnenagar, 5 Tage bei 30°C)s Größe: .1*0 bis 1,2'x 1,5 bis 2,0 Mikron. Gestalt: pval.

Lage zentral bis para-zehtral. Sporangia nicht deutlich gequollen <i

209852/1094

II. Verhalten auf verschiedenen Kulturmedien:

(1) Agarbrühen-Strichplatte (30°C, 24 Stunden):

Gutes Wachstum, kreisförmig, konvex, sich nicht ausbreitend, weiß bis blaß-gelb, glänzend,, weich, naß, durchscheinend; keine Farbänderung des Mediums.

(2) Brühagar-Schrägrohre (30°C, 24 Stunden):

Gutes Wachstum, Oberfläche glatt, sich nicht ausbreitend, glänzend, naß. Kolonien milchig-weiß, durchscheinend; keine Farbänderung des Mediums. ?3) Brühe C3G°C, 2 Tage):

Gutes »Jachstiim, einheitliche Trübung mit Sediment; kein Häutchen.
■*} Brühen-Gelatinestich i30°C, 20 Tage) ι Qberflächenwachstum zum Zentrum IHngs Stichlinie. Keine Gelatineverflüssigung.

(5) Lakmusmilch {30°C, 20 Tage):

nicht peptonisiert; Lakmuspigment ist reduziert; Kulturflüssigkeit wird gelblich-braun.

(6) Sojabohnenagar-Schrägkulturen (30°C, 24 Stunden): Gutsa Wachstum, weiß bis gelblich-weiß, Oberfläche glatt und weich. Gute Sporenbildung,

(7) Glucosenitratagar-Schrägkultur (30°C, 3 Tage): Wachstum knapp.

(8) Tyrosinagar-Schrägkulturen (30°c, 3 Tage):

209852/1094

gutes Wachstum; Medium ist gebräunt. (9) Kartoffel (3O°C, 5 Tage)»

gutes Wachstum; Kolonien rosa bis braun, Oberfläche glatt und naß, konvex und glänzend; Medium ist an etwa dem 3. Tag gebräunt. III. Physiologische Eigenschaften:

(1) Optimale Wachstumsbedingungen:

aerob bei pH 7,0 bis 8,0 und 28 bis 35°C.

(2) Wachstumsbedingungen:

aerob, bei pH 5 bis 10 und 7°bis 45°C.

(3) Säurebeständigkeit:

gering, kein Wachstum bei unterhalb pH 5,0.

(4) Verhalten gegenüber Sauerstoff:

aerob, kein Wachstum in Glucosebrühe unter anaeroben Bedingungen.

(5) Indol wird nicht erzeugt.

(6) Schwefelwasserstoff wird erzeugt.

(7) Denitrifizierungsreaktion: keine Gasbildung.

' (8) Nitrate v/erden reduziert. (9) Katalasebildung: positiv.

(10) Ureasebildung: positiv.

(11) Stärke wird hydrolysiert.

(12) Citrate werden ausgenutzt(in Medien nach Koser und Christensen).

209852/109A

(13) Lakmuspigment wird reduziert.

(14) Methylenblau wird reduziert.

(15) wasserlösliches Pigraent wird in Kartoffelmedium gebildet.

IV. Fermentative Spaltbarkeit von Kohlehydraten: Kohlehydrate Säurebildung Gasbildung

Arabinose

Xylose

Glucose +

Mannose + -

Fructose + -

Galactose

Ribose +

Rhamnose

Maltose + -

Saccharose - " -

Lactose

Trehalose +

Raffinose

Cellobiose +

Sorbit

Mannit +

Inosit

Glycerin + -

Glucit

Salicin

Inulin

Stärke +

Bei der Prüfung der taxonomisehen Stellung des Stammes B-400 mit den oben erwähnten ideologischen Eigenschaften unter

?0985?/10!U

Bezugnahme auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe, wurde identifiziert, daß der Stamm zur Gattung Bacillus megaterium gehört. Demgemäß vrarde der Stamm B-400 mit der Typenkultur verglichen, weiche von der !American Type Culture Collection (ATCC) gesendet wurde, um zu erkennen, daß der Stamm ähnlich Bacillus megaterium var. penicillalyticum ÄTCC 14945 war, jedoch in den folgenden Punkten hiervon unterschiedlich ist:

• Bacillus megaterium Bacillus megaterium B-400 var. penicillalyticum ATCC 14945

Gelatineverflüssigung kaum Verflüssigung

Lakmusmilch Pigment ist reduziert Pigment wird alka

lisch und ist nicht

reduziert

Kartoffelagar-Schräg- Bildung von wasser-.

kulturen ' löslichem braunen keine Pigmentbildung

Pignent

Säurebildung aus Säurebildung keine Säurebildung Mannose

Aus dem obigen wurde erkannt, daß der Stamm B-400-ein neuer Stamm ist, welcher der Gattung Bacillus megaterium angehört. Der Stamm B-400 wurde hinterlegt unter der Nummer "FERM-P Nr, 748" im Research Institute of Microorganism Industry, Agency of Industrial Science & Technology/, Japan.

2/1094

Die Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Her stellung von 7-ADCA, welches darin besteht, daß man ein wasserlösliches Salz einer 7-Acylarnino-desacetoxy-cephalosporansäure deacyliert und zwar in Anwesenheit eines wäßrigen Mediums durch Behandlung mit einer Enzymzubereitung, welche sich von der Kultur eines deacylierenden, enzyraerzeugenden Stammes herleitet, welch letzterer zur Gattung Bacillus gehört. Dieses Verfahren gibt eine hohe Ausbeute an 7-ADCA, doch kann nicht gesagt werden, daß dies ein industriell vorteilhaftes Verfahren ist und zwar deshalb, weil es nötig ist, das deacylierende Enzym aus der Kultur des deacylierenden, enzynerzeugenden Stammes abzutrennen; weil ferner die Konzentration des sich ergebenden 7-ADCA niedrig ist, so daß die Abtrennung des wasserlöslichen 7-ADCA aus der ReaktionsflUssigkeit kostspielig ist; und weil schließlich der Wiedergebrauch des deacylierenden Enzyms im wesentlichen unmöglich ist'.

Es wurden daher weitere Untersuchungen an Verfahren angestellt, bei denen das deacylierende Enzym in fester Phase zur Reaktion gebracht wurde. Dabei wurde überraschenderweise gefunden, daß beim Vermischen mit einem Kulturfiltrat des deacylierenden, enzymbildenden Stammes ein bestimmter Träger das Enzym adsorbiert, ohne dieses Enzym zu entaktivieren, und daß der Träger das Enzym unter solchen Bedingungen wie Waschen mit Wasser nicht freisetzt; ferner wurde gefunden, daß beim

209852/1094

Strömen einer wäßrigen Lösung eines wasserlöslichen Salzes der 7-Acylaraino-desacetoxy-cephalosporansäure durch eine Kolonne dieses Trägers hindurch, die 7-ADCA in Sustand extrem hoher Konzentration ausfließt und außerdem das Enzym die 7-Acylamino-desacetoxy-cephalosporansäure kontinuierlich zersetzt und daher mit hohem Wirkungsgrad verwendet werden kann.

Demgemäß ist Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Herstellung von 7-ADCÄ der allgemeinen Formel (II)t

(ID

welches darin besteht, daß nan eine 7-Acylamino-desacetoxycephalosporansäure (nachstehend als "Ce(I)¹¹ bezeichnet), der allgemeinen Formel (I):

R-CO-NH , ,

COOM

in welcher R eine Benzyl- oder Phenoxymethylgruppe ist; und M ein Alkalimetallatom ist, welches in der Lage ist, ein wasserlösliches Salz zu bilden; mit einem Kulturfiltrat eines enzymerzeugendes Stammes behandelt, welcher zur Gattung Bacillus

2 0 9 8 5 ? / 1 0 9 4

- IO -

gehört und welcher die Amidbindung dieser Verbindung Ce(I) zersetzen kann? oder daß man Ce(I) in einem wäßrigen Medium mit einer Enzymzubereitung behandelt, Vielehe sich von diesem enzym erzeugenden Stamm ableitet.

Erfindungsgemäß wird 7-Amino-desacetoxy-cephalosporansäure der allgemeinen Formel

COOH

nach einem Verfahren erzeugt, bei welchem eine 7-Acylaminodesacetoxy-cephalosporansäure der allgemeinen Formel:

R-CO-NH₁ f

COOM

in welcher R eine Benzyl- oder Phenoxymethy1gruppe ist und M ein Alkalimetallatom ist, welches in der Lage ist, ein wasserlösliches Salz zu bilden, mit einem Kulturfiltrat eines enzymerzeugenden Stammes behandelt v/ird, welcher zur Gattung Bacillus gehört und welcher die Amidbindung dieeer Verbindung zersetzen kann, wobei dieser Stamm Bacillus megaterium B-400 FERII-P Nr. ist; oder in einem wäßrigen Medium mit einer Enzymzubereitung behandelt v/ird, welche sich von diesem enzymerzeugenden Stamm ableitet.

20985?/m<H

Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zum Herstellen des 7rADCA, welches sich dadurch gekennzeichnet, daß man das oben erv/ähnte Ce (I) -deacylierencle Enzym auf einem Träger adsorbiert/ weicher das Enzym, nicht entaktiviert; daß man zu diesem Träger zwecks Deacylieren des Ce(I) eine wäßrige Lösung von Ce(I) hinzusetzt; und daß man das 7-ADCA aus. der Reaktionsflüssigkeit gewinnt.

Erfindungsgemäß soll ein neuartiges Verfahren zum enzymatischen Erzeugen eines Zwischenproduktes für antibiotische Cephalosporine geschaffen werden, welch letztere als chemischtherapeutische Zubereitungen sehr brauchbar sind. Ferner soll erfindungsgemäß ein industriell vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von 7-ADCA geschaffen werden, bei welchem die oben erwähnte Enzymreaktion in der festen Phase durch Adsorbieren des entacylierenden Enzyms auf einem Träger kontinuierlich bewirkt wird und so das Enzym, ohne entaktiviert zu werden, wiederholt verwendet werden kann.

Der Ce(I)-deacylierende, enzymerzeugende Stamm, welcher erfindungsgemäß verwendet wird, ist beispielsweise Bacillus megaterium B-400, FERTI-P Nr. 748.

Das Enzym, welches in der-Lage ist, die Amidbindung von Ce(I) zu zersetzen und welches erfindungsgemäß verwendet

209R52/1GÖ4

wird, wird erhalten, indem man Bacillus megaterium 13-400 FERiI-P Nr. 748 bei 25 bis 37°C 12 bis 60 Stunden in einem Medium aerob kultiviert, welches gewöhnlich zum Kultivieren von Bakterien verwendet wird, beispielsweise in einen Uährmedium mit einem Gehalt an angemessenen Mengen einer Stickstoffquelle wie Pepton, Fleischextrakt, Getreideeinweichlauge, Hefeextrakt, Trockenhefe, zersetztes Sojabohnenprotein oder Sojabohnenextrakt; an einer Kohlenstoffquelle wie Melasse, Glucose oder Glycerin? und anorganischen Salzen; und, in einigen Fällen, anderen Wachstumsfördernden Substanzen. Im allgemeinen bewirkt man ein Luftrühren der Kultur in Flüssigkeit.

Das oben erwähnte Enzym ist gewöhnlich ein Exo-Enzyn und liegt in einem Kulturfiltrat vor, welches von den Zellen befreit ist. Bei der Enzymreaktion wird daher das Enzym in Form eines Kulturfiltrats oder eines: Enzynzubereitung verwendet, welche aus den Kulturfiltrat bereitet wurde. Diese Enzymzubereitung wird erhalten, indem man das Enzym einer bekannten Reinigungsmethode unterwirft. Beispielsweise wird es erhalten, indem man das Kulturfiltrat konzentriert oder nicht konzentriert und man das Enzym durch Halbsättigung oder Sättigung mit einem löslichen Salz wie Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid ausfällt, oder dieses durch Hinzusetzen einer hydrophilen organischen Verbindung wie Methanol, Äthanol oder Aceton ausfällt. Die Ausfällung löst man- in Wasser auf und die sich ergebende Lösung

209852/1094

wird unter Verwendung einer semipermeablen Membrane dialysiert, wodurch niedermolekulare Verunreinigungen entfernt werden können. Man kann aber auch, wobei man aus dem Unterschied der Adsorptionsaffinität für ein Adsorptionsmittel oder Gelfiltermittel Vorteil zieht, niedermolekulare Verunreinigungen, gefärbte Substanzen, Proteine und ähnliche Stoffe in der Kulturflüssigkeit wirksam abtrennen gemäß einer gewöhnlichen Arbeitsweise wie Adsorptionschromatographie, lonenaustauschchromatographie oder Gelfiltration. Die gemäß den oben erwähnten Arbeitsgängen erhaltene Enzymlösung kann der Konzentrierung unter vermindertem Druck, dem Gefriertrocknen oder ähnlichen Operationen unterworfen werden, um ein Standardenzymprodukt in Form eines Feststoffes zu erhalten, oder sie kann, wie sie ist, zur Behandlung des Ce(I) verwendet werden. Falls die Enzymzubereitung weiter gereinigt v/erden muß, kann man irgendeines der gewöhnlichen Mittel anwenden, welche man zum Reinigen von Proteinen und Enzymen anwendet, beispielsweise ein Adsorptionsmittel, ein Gelfiltermittel o.dgl.

Gewöhnlich v/ird die Enzymreaktion in solcher Weise durchgeführt, daß das Ce(I) in Wasser oder einer Pufferlösung aufgelöst und dann mit der oben erwähnten Enzymzubereitung behandelt wird. Das Ce(I) bringt man gewöhnlich in die Form eines wasserlöslichen Natrium- oder Kaliumsalzea und verwendet es in einer Konzentration innerhalb des Bereiches von 0,1 bis

>rzugsweise von e
209852/1094

20 Milligramm/cm , vorzugsweise von etwa 2 bis 5 Milligramm/cm «

Der pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit wird vorzugsweise innerhalb des Bereiches von etwa 7 bis 8 gehalten. Die Reaktionstemperatur beträgt 30 bis 45°C, vorzugsweise etwa 35 bis 40°C wodurch günstige Ergebnisse erzielt werden können. Die Reaktionszeit variiert je nach den Reaktionsbedingungen, beträgt jedoch gewöhnlich etwa 5 bis 30 Stunden. Die Reaktion kann in einem geeigneten Stadium beendet v/erden, wobei man die Zeit prüft, bei welcher die Ausbeute de3 7-ADCA, welches durch die allgemeine Formel (II) wiedergegeben wird, ein Maximum wird.

Die Art des beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Trägers variiert je nach der Art des verwendeten Ce(I)-deacylierenden, enzymerzeugenden Stammes. Jedoch ist es erforderlich, den Träger unter Betrachtung der Gesichtspunkte auszuwählen, daß er das deacylierende Enzym adsorbieren kann, ohne dieses zu inaktivieren; daß er das Enzyn, selbst beim Waschen mit Wasser o.dgl., nicht freigibt; daß er keinen nachteiligen Einfluß auf die Ce(I)-zersetzende Enzynreaktion ausübt; und daß er das sich ergebende 7-ADCA schwierig adsorbiert. Wenn beispielsweise ein anorganischer Träger wie Celite, Terra alba, aktiver Ton, Kaolin, Aktivkohle oder Silicagel, ein Ionenaustauscher wie CM-Cellulose oder CM-Cephadex C-25 oder ein Ionenaustauschharz wie Amberlite CG-50 oder Dowex-50 als Träger verwendet wird, so wird das durch Bacillus megaterium B-4OO erzeugte, Ce(I)-deacylierende Enzym gut adsorbiert ohne inaktiviert zu werden ι jedoch wenn Aluminiumoxyd, Cellulosepulver,

209852/1094

DEAE-Cellulose, DEAE-Cephadex-25 oder Anionenaustauschharz verwendet wird, so wird das deacylierende Enzym kaum adsorbiert oder es wird inaktiviert, selbst wenn es adsorbiert worden ist.

Beim Adsorbieren des Ce-(I)-deacylierenden Enzyms auf dem Träger ist es erwünscht, daß der pH-Wert des Kulturfiltrats des Ce-(I)-deacylierenden, enzynerzeugenden Stammes vorher auf den für das deacylierende Enzym stabilen pH-Wert eingestellt ist. Beispielsweise stellt man beim Adsorbieren auf Celite eines deacylierenden Enzyms welches durch Bacillus megaterium erzeugt wurde, den pH-V7ert des Kulturfiltrats im allgemeinen auf etwa 6 bis 0 ein. Jedoch, v/enn man insbesondere einen Ionenaustauscher bzw. ein Ionenaustauschharz verwendet, welches durch die Ionenstärke beeinflußt wird, so neigt die Adsorptionskraft bzw. der Inaktivierungsgrad des deacylierenden Enzyms dazu, durch den pll-Uert beherrscht zu werden, so daß der Träger unter ausreichender Betrachtung des Einflusses des pH-Wertes verwendet v/erden sollte.

Das Adsorbieren des deacylierenden Enzyms auf dem Träger, kann gemäß irgendeiner der ansatzmäßigen oder kolonnenmäßigen Arbeitsgänge ausgeführt werden. Die anzuwendende Trägermenge variiert je nach der Menge und dem Enzymtiter des Kulturfiltrats des deacylierenden, enzymerzeugenden Stammes, und je nach dem Adsprptionsverhältnis des deacylierenden Enzyms

209852/1094

zum Träger. Beim Adsorbieren des Enzyms nach der ansatzmäßigen Arbeitsweise, kann jedoch die Menge an verwendetem Träger etwa 5 bis 15% (Gew./Vol.) bezogen auf die Menge des KuIturfiltrats, sein. Im Falle der Adsorption nach der anoatzmäßigen Arbeitsweise, rührt man ein Gemisch des Kulturfiltrats und des Trägers, und dann trennt man den Träger ab und wäscht ihn mit Wasser. Im Falle des Adsorbierens nach der kolonnenmäßigen Arbeitsweise, benetzt man den in eine Kolonne gepackten Träger mit Wasser oder mit Pufferlösung, welche auf den stabilen pH-Wert des deacylierenden Enzyms eingestellt ist, nan läßt das Kulturfiltrat durch die Kolonne gehen, und dann wäscht man die Kolonne mit Wasser, wodurch ein Träger erhalten werden kann, auf welchem das deacylierende Enzym adsorbiert ist.

Wenn der so erhaltene Träger mit adsorbiertem deacylierendem Enzym getrocknet wird, so neigt das deacylierende Enzym dazu, inaktiviert zu werden. Demgemäß ist es erwünscht, daß der Träger in der nachfolgenden Ce(I)-deacylierenden Enzymreaktion in solch einem nassen Zustand verwendet wird, ohne getrocknet zu werden.

Das beim .erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ce(I) kann nach bekannten Verfahren bereitet werden, beispielsweise nach einem Verfahren, bei welchem man einen Penicilllnsulfoxydester der Ringausdehnung unterwirft (USA-Patentschrift 3 275 626,

209852/1094

belgische Patentschrift 696 026, niederländische Patentveröffentlichung 6 806 532, belgische Patentschrift 745 845, britische Patentschrift 1 204 394 und belgische Patentschriften 747 118, 747 119 und 747 120), und daß man den sich ergebenden 7-Acylamino-desacetoxy-cephalosporansUureester entestert. Das Ce(I) kann aber auch nach einem Verfahren hergestellt werden, bei welchem man eine 7-Acylamino-cephalosporansäure entacetoxydiert (USA-Patentschrift 3 275 626). Jedoch die darauffolgende Ce(I)-entacylierende En2ymreaktion führt man in einem LÖsungssystera so durch, daß man das Ce(I) im allgemeinen in Form eines wasserlöslichen Alkalisalzes, beispielsweise eines Natrium- oder Kaliumsalzes, verwendet.

Als nächstes behandelt man eine wäßrige Lösung des Ce(I) mit dem Träger, auf welchem das deacylierende Enzym adsorbiert ist. In diesem Falle ist es erwünscht, die Lösung vorher mit einer Pufferlösung abzupuffern, welche den gleichen pH-Uert besitzt wie der richtige pH-Wert des deacylierenden Enzyms. Die oben erwähnte Enzymreaktion wird im allgemeinen nach der kolonnenmäßigen Arbeitsweise durchgeführt, well diese Reaktion kontinuierlich bewirkt werden kann. Die Konzentration des hinzuzusetzenden Ce(I) variiert hauptsächlich je nach dem Enzymtiter, d.h. je nach dem Ce(I)-Deacylierungsyermögen des deacylierenden Enzyms, sowie nach der Strömungsgeschwindigkeit, doch wird sie erwünschtermaßen unter Betrachtung des Punktes entschieden, daß die Menge des nicht reagierten

209852/109/»

Ce(I), welche in der ausfließenden Reaktionsflüssigkeit zurückbleibt, nicht größer wird. Im allgemeinen beträgt die Konzentration an Ce(I) 0,1 bis 2,05 (Gew./Vol.), vorzugsweise etwa 0,5 bis 1,0% (Gew./Vol.), doch erübrigt es sich, auszuführen, daß die Konzentration, je nach der Art des verwendeten Trägers, mehr oder weniger variiert. Die oben erwähnte Reaktion vollzieht man natürlich bei angemessenem pH-Wert und angemessener Temperatur, vorzugsweise bei optimalem pH-Wert und optimaler Temperatur, des Ce(I)-deacylierenden Enzyms. Jedoch ist es wünschenswert, daß verschiedene Reaktionsbedingungen so ausgewählt v/erden, daß das in der Reaktionsflüssigkeit gebildete 7-ADCA mit einer Konzentration ausfließt, welche so hoch wie möglich ist. Die Reaktionszeit kann richtig variiert werden, indem man die Menge an zugesetzter wäßriger Ce(I)-Lösung steigert oder vermindert. In allgemeinen int die Reaktion vollendet, bevor wäßrige Ce(I)-Lösung durch die Trägerschicht in der Kolonne hindurchgegangen ist. Wenn jedoch das Ce(I)-Deacylierungsverhältnis niedrig gewesen ist und eine große Menge an Ce(I) in der Reaktionsflüssigkeit zurückgeblieben ist, so setzt man die Reaktionsflüssigkeit, so wie sie ist, erneut zu der Trägerschicht hinzu, oder man setzt sie zu einer anderen Trägerschicht hinzu, welche das deacylierende Enzym adsorbiert aufweist, wodurch eine Reaktionsflüssigkeit erhalten werden kann, deren Ce(I)-Deacylierungsverhältnis hoch ist.

209852/1094

Wenn es gewünscht ist, die oben erwähnte Enzymreaktion kontinuierlich durchzuführen, so ist es ausreichend, die wäßrige Ce(I)-Lösung kontinuierlich der Trägerschicht mit adsorbiertem, deacylierenden -Enzym hinzuzusetzen. Jedoch wiegen der Wanderung diverser Bakterien o.dgl., neigt das Ce(I)-Deacylierungsverhältnis dazu, allmählich täglich abzunehmen. Wenn man zum Oberteil der Kolonne oder zum Substrat Toluol hinzugesetzt hat, so kann die schädliche Auswirkung infolge Verunreinigung auf ein Mindestmaß herabgesetzt v/erden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann man eine Trägerschicht für mehr als 10 Tage verwenden, so daß das 7-ADCA in hoher Ausbeute gewonnen und mit geringen Kosten hergestellt werden kann. Demgemäß ist das erfindungsgemäße Verfahren ein höchst vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von 7-ADCA durch enzymatische Deacylierung von Ce(I).

Die Gewinnung des 7-ADCA aus der so erhaltenen Reaktionsflüssigkeit, kann gemäß bekannten Arbeitsgängen durchgeführt werden. Beispielsweise stellt man die Reaktionsflüssigkeit auf einen pH-Wert von etwa 2 ein und man wäscht mit einem hydrophoben organischen Lösungsmittel wie Äthylacetat, Butylacetat oder Methylisobutylketon zum Entfernen von nicht umge- . setztem Ce(I), und dann konzentriert man die wäßrige Schicht und stellt unter Abkühlen auf einen pH-Wert von etwa 3,7 ein,

209852/1094

um das 7-ADCA isoelektrisch auszufällen* Man kann aber auch die Reaktionsflüssigkeit auf einen pH-Viert von etwa 3,7 einstellen, konzentrieren und dann abkühlen, und man wäscht den sich ergebenden Niederschlag zwecks Entfernen von nicht umgesetztem Ce(I) und nebenher gebildeter Carbonsäure, mit Aceton. In obiger Weise kann das 7-ADCA gewonnen werden.

Methode zum Messen der Aktivität adsorbierten Enzyms: Ein Träger, auf welchem das deacylierte Enzym adsorbiert ist, wird in einem L-förmigen Testrohr gewogen. Zu deia Testrohr setzt man 4,5 cm einer 0,lmolaren Phosphatpufferlösung (pH 7,5) hinzu und das Testrohr schüttelt man 10 Minuten in einem Thermostatschüttler des Typs Monod, welcher bei 37°C gehalten wird. Anschließend setzt man 0,5 cm (10 Milligramm je cm³ als freie Säure ausgedrückt) einer wäßrigen Lösung des Natriumsalzes der 7-Phenylacetamid-desacetoicy-cephalosporansäure hinzu und das sich ergebende Gemisch läßt man 30 Minuten reagieren. Nach der Reaktion kühlt man die Reaktionsflüssigkeit sofort ab und 7-ADCA in der Reakfckmsmutterlauge, welche vom Träger befreit ist, wird gemäß der TNBG-Methode bestimmt.

Ein Enzymtiter, welcher 100 JT/cm³ 7-ADCA bildet, wird dafür gehalten, daß er 100 Einheiten (U) ist.

Methoden zur Bestimmung von 7-ADCA: (1) Bestimmungsmethode 1:

209852/1094

Die Reaktionsflüssigkeit unterwirft man dem Mikroorganismustest (37°C, 16 Stunden) gemäß der Papierscheibenmethode oder der Bechermethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI-219 als Teststamm, und man mißt den Durchmesser des Kreises, welcher das Wachstum hemmt. Aus der Standardkurve von Ce(I) berechnet man die Menge an Ce(I), und die Mengendifferenz zwischen dem Ausgangs-Ce(I) und dem restlichen Ce(I) wird wiedergegeben als Prozentsatz gegenüber dem.Ausgangs-Ce(I). Dieser Prozentsatz ist das Zersetzungsverhältnis des Ausgangs-Ce(I).

(2) Bestimmungsmethode 2:

Eine bestimmte Menge an Reaktionsflüssigkeit stellt man unter Verwendung von 1-n Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5 ein, man wäscht dreimal mit einer Hälfte dieser Menge an ßutylacetat, und man stellt dann unter Verwendung einer wäßrigen 1-n Natriuinhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,5 ein. Anschließend behandelt man eine bestimmte Menge der so behandelten Reaktionsflüssigkeit mit einem Säurechlorid, welches der Säure auf der Seitenkette des Ausgangs-Ce(I) entspricht, und dann unterwirft man dem gleichen Mikroorganismustest wie in Bestimmungsmethode 1. Aus der Menge des sich ergebenden Ce(I) berechnet man rückwärts die Menge an 7-ADCA, welche dann als Prozentsatz wiedergegeben wird. Dieser Prosentsatz ist die Ausbeute an 7-ADCA.

(3) Bestimmungsmethode 3, TNBS-Methodet

einer Probe setzt 209852/1094

3 3

Zu einem cm einer Probe setzt man 2 cm einer

Phosphatpufferlösung (pH 8,0) und 2 cm einer 0,l%igen THBS-Lösung hinzu und das sich ergebende Gemisch läßt man in der Dunkelheit bei 50⁰C 90 Hinuten reagieren. Nach dem Abkühlen gibt man zu der Reaktionsflüssigkeit 1 cm 6-n Salzsäure hinzu und man mißt die Absorption bei 395 mp. Die Menge an 7-ADCA wird aus der Standard-Kurve von 7-ADCA berechnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren sei nunmehr durch die folgenden Ausführungsbeispiele näher veranschaulicht. Die darin angegebenen Stämme, Reaktionsbedingungen und Arbeitsgänge können mannigfach variiert werden und es ist nicht beabsichtigt, mit den Ausführungsbeispielen über den Rahmen der Erfindung etwas auszusagen.

Beispiel 1

Herstellung der Enzymzubereitung:

20 Liter eines flüssigen Kulturmediums (pH 7,0) mit einem Gehalt an 1% Polypepton, 1% Hefeextrakt und 0,5% Natriumchlorid, gibt man in einen 30 Liter-Schüttelfermentator und man sterilisiert 20 Minuten mit Wasserdampf bei 120°C. Danach überträgt man 200 cm einer Saatkulturflüssigkeit von Bacillus megaterium B-400 FERM-P Nr.748» welche bei 30°C 24 Stunden in einem Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie oben kultiviert worden ist unter sterilen Bedingungen in das oben genannte Kulturmedium und man fermentiert 48 Stunden bei 30°C mit

209852/1094

Belüftung und Rühren bei einer Lufteinführungsgeschwindigkeit von 20 Litern je Minute und.einer Rührgeschwindigkeit von 300 U/Min. Nach der Fermentierung werden die Zellen mittels eines Westfalia-Zentrifugaltrenners entfernt und man erhält 17,4 Liter eines Kulturfiltrats.

Beispiel 2

Das Kulturfiltrat, welches in Beispiel 1 erhalten wurde, konzentriert man bei einer Außentemperatur von 30 bis 35 C auf 1/3 und das Konzentrat beschickt man mit Ammoniumsulfat, bis eine 80%ige Sättigung erreicht wird. Den abgeschiedenen Niederschlag löst man in destilliertem Wasser auf und man entsalzt unter Verwendung einer Kolonne Cephadex G-25. Die entsalzte Lösung wird gefriergetrocknet und man erhält 24,3 g eines, Standard-Enzymproduktes .

Beispiel 3

Herstellung von Enzymzubereitung:

20 Liter eines flüssigen Kulturmediums (pH 7,0) mit einem Gehalt an 0,5% Glucose, 0,3% Glycerin, 1% Fleischextrakt und 1% Polypepton, gibt man in einen Schüttelfermentator von 30 Liter Inhalt und man sterilisiert 20 Minuten mit Wasserdampf bei 120°C. Danach überträgt man 200 cm einer Saatkulturlauge von Bacillus megaterium B-400 FERM-P Nr.748,welche 24 Stunden bei

209852/1094

30 C in einem Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie oben kultiviert worden ist, unter sterilen Bedingungen in das oben genannte Kulturmedium und man fermentiert bei 30°C 72 Stunden mit Belüftung und Rühren bei einer Lufteinführungsgeschwindigkeit von 20 Litern je Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 300 U/Min. Mach dem Fermentieren v/erden die Zellen mittels eines Uestfalia-Zentrifugalabtrenners entfernt und das Filtrat konzentriert man bei einer Außentemperatur von 30 bis 35°C auf 1/3. Das Konzentrat beschickt man mit Aceton, bis die Acetonmenge 60% wird, und den ausgefallenen niederschlag gewinnt man durch Abfiltrieren und Trocknen, wobei 25,5 g eines Standard-Enzymproduktes erhalten werden.

Beispiel 4

4 g des rohen Enzyms, welches in Beispiel 2 erhalten wurde, löst man in 500 cm Wasser auf und die sich ergebende Lösung stellt man unter Verwendung einer wäßrigen 1-n Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,5 ein. Zu dieser Lösung setzt man 2 g Natrium-S-methyl^-phenoxyacetamid- Δ cephem-4-carboxylat und das sich ergebende Gemisch läßt man 15 Stunden bei 37°C reagieren. Danach befreit man die Reaktionsflüssigkeit von Proteinen mittels Dia Hlter-G-lOH (hergestellt von der Nippon Vacuum Technique Co.), man stellt mit 1-n Salzsäure auf einen pll-Uert von 2,5 ein, wäscht dreimal mit der Hälfte ihrer iienge an Butylacetat und stellt dann mit-

209852/1094

tels wäßriger 1-n Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6,5 ein» Diese Flüssigkeit adsorbiert man an einer 2 χ 15 cm-Dove χ 1-X8 Kolonne (Essigsäuretyp) und man eluiert mit 1-n Essigsäure. Danach mißt man die Adsorptionsfähigkeit jeder Fraktion bei 260 mu oder man führt biologischen Test nach dem Aufsprühen von Phenoxyacetylchlorid auf Filterpapier durch und Fraktionen, welche 7-Amino-3-methyl-A -cephem-4-carbonsäure enthalten, sammelt man und unterwirft sie dem Gefriertrocknen. Das getrocknete Produkt löst man in einer geringstmöglichen Menge destillierten Wassers auf und die sich ergebende Lösung stellt man durch Hinzusetzen von 1-n Salzsäure auf einen pH-Uert von 3,7 ein. Dann läßt man über Nacht unter Eiskühlung stehen, wobei sich farblose Kristalle abscheiden. Die Kristalle wäscht man mit einer geringstmöglichen Menge Eiswasser, wäscht dann mit Aceton und trocknet. Man erhält 792 ng 7-Amino-3- . methyl- ^ -cepheia-4-carbonsäure mit einem Schmelzpunkt (unter Zersetzung) von 240 bis 242°C. Ausbeute 69,6%.

Elementaranalyse (für ^cn^Hio^W2°3^S^^!

C % H % N %

berechnet 44,85 4,70 13,08

gefunden 45,02 4,58 12,95

209852/1094

- 26 Beispiel 5

Zu einer Lösung von IO mg des in Beispiel 2 erhaltenen

3
rohen Enzyms in 5 cm einer 1-m Phosphatpufferlösung (pH 7,5), setzt man 5 mg Ilatrium-S-methyl-T-phenylacetamid- A -cephen-4-carboxylat hinzu und das sich ergebende Genisch läßt man bei 37 C 5 Stunden reagieren. Dann mißt man gemäß der obigen Bestimmungsmethode (1) das Zersetzungsverhältnis von 3-Methyl-7-phenylacetar.iid-Δ -cepheri-4-carbonsäure und die Ausbeute an 7-ADCA, wobei man Werte von 95% bzw. 91% erhält.

Beispiel 6

Das Beispiel 4 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß man IIatrium-3-methyl-7-phenylacetamid~ Δ -cephem-4-carboxylat anstelle des Natrium-3-methyl-7-phenoxyacetanid- Δ -cephen-4-carboxylats verwendet. Man erhält 849 mg 7-Amino-3-methyl- -Δ -cephem-4-carbonsäure vom Schmelzpunkt 239 bis 241°C (Zersetzung) . Die Ausbeute beträgt 73,5%.

Beispiel 7

10 Liter des in Beispiel 2 erhaltenen Kulturfiltrats von Bacillus megaterium B-400 FERfI-P Ur. 743, stellt man unter Verwendung von Essigsäure auf einen pII-Nert von etwa 7 ein. Zu dem Kulturfiltrat setzt man 500 g Diatomeenerde hinzu und

209852/1094

das sich ergebende Geraisch rührt man etv/a 30 Hinuten. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert immer bei etwa 7. Danach zentrifugiert man die Reaktionsfltissigkeit mittels eines Zentrifugaltrenners des Korbtyps und wäscht dann mit Wasser. Man erhält 750 g nassen Celite (Enzymtiter 1200 U/g).

Beispiel 8

Das in Beispiel 2 erhaltene Kulturfiltrat von Bacillus megaterium B-400 FERIl-P Nr. 748, stellt man auf einen pH-Wert von etwa, 7 ein. Zu je 1 Liter des Kulturfiltrats setzt man einzeln je 50 g Celite (HyfIo Super CeI), Aktivkohle (der Wako Jun-yaku Co.; für Chromatographie), CM-Cellulose Ionenaustauscher (der Serva Co.; 0,52 mcg/g) und Araberlite CG-50 (H-Form) , hinzu und man rührt das entstehende Gemisch für etwa 30 Minuten. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert stets bei etwa Danach gewinnt man jeden Träger durch Abfiltrieren und wäscht dann mit Wasser, wobei man einen nassen Träger enthält. Das Enzymadsorptionsverhältnis jedes Trägers wird berechnet unter der Annahme eines 100%igen Iinzynadsorptionsverhältnisses von Celite. Die erzielten Ergebnisse sind die folgenden:

Träger relatives Adsorptionsverhältnis (%) Celite 100

Aktivkohle 100

Cn-Cellulose 100

Amberlite CG-50 81,2

209852/1094

- 23 -

Beispiel 9

Der in Beispiel 8 erhaltene Celite mit adsorbiertem deacylierendem Enzym (Enzymtiter 1800 U/g), wird durch Waschen mit einer 0,01-m Phosphatpufferlösung (pH 7,5) gepuffert, in eine mit Mantelrohr versehene Kolonne (5 χ 50 cm) gepackt, und dann etwa 1 Stunde bei einer bestimmten Strömungsgeschwindigkeit (Raumgeschwindigkeit Φ 0,5) mit der gleichen Pufferlösung v/ie oben gewaschen.

Die Außentemperatur der Kolonne wird bestimmt gehalten, indem man 37 C warmes Wasser zum Mantelrohr strömen läßt. Danach läßt man 6 Liter (5 mg/cm , ausgedrückt als freie Säure) einer wäßrigen Lösung von Natriura-7-phenylacetamid-desacetoxycephalosporanat durch die Kolonne mit einer bestimmten Strömungsgeschwindigkeit (Raumgeschwindigkeit Φ 0,5) strömen und die ausfließende Flüssigkeit fraktioniert man in Einzelfraktionen (Fraktionsinenge 10,8 cm ). Es wird eine Zeit von etwa 16 Stunden zum Vollenden des Ausfließens benötigt.

6,4 Liter der gesamten ausgeflossenen Flüssigkeit stellt man auf einen pH-Wert von 6 ein und dann konzentriert man auf etwa 1/10. Das Konzentrat stellt man unter Verwendung von 6-n Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,7 ein, wodurch das Ausfallen der gebildeten 7-ADCA eingeleitet wird. Dieses Konzentrat kühlt man zur Vollendung der Ausfällung mit Eis. Die Ausfällung gewinnt man durch Abfiltrieren, man wäscht mit einer

209857Π094

kleinen Menge Eiswasser, trocknet genügend mit Aceton und trock-* net dann zur Erzielung von 14,0 g an weißem 7-ADCA vom Schmelzpunkt 240 bis 242°C. Ausbeute: 72,4%, Dieses Produkt löst man in wäßriger 2,5-n Natriumhydroxydlösung auf. Die entstehende Lösung entfärbt man mit Aktivkohle, stellt unter Verwendung von 6-n Salzsäure den pH-Wert auf 3,7 ein und kühlt dann mit Eis ab, wobei sich 7-ADCA niederschlägt. Anschließend gewinnt man das 7-ADCA durch Abfiltrieren, Waschen mit einer kleinen Menge Eiswasser, Waschen mit Aceton und Trocknen, wodurch 11,4 g eines gereinigten Produktes erhalten werden.

Beispiel 10

Das Beispiel 9 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß man anstelle des Celite mit adsorbiertem deacylierendem Enzym, zur Bereitung von 7-ADCA, jeden der in Beispiel 8 erhaltenen Träger, d.h. Aktivkohle mit adsorbiertem Enzym, CH-Cellulose mit adsorbiertem Enzym und Amberlite CG-50 mit adsorbiertem Enzym verwendet. Die erzielten Ergebnisse sind die folgendens

Art ds Trägers erhaltene Menge (g) Ausbeute (%_:)

Aktivkohle 37,5 58,2

CM-Cellulose 32,9 51,8

Amberlite CG-50 31,3 48,5

209852/1094

Beispiel 11

Zur Erzielung einer Kultur bewirkt man die gleiche Kultivierung wie in Beispiel 1. Ein Liter dieser Kultur überträgt man in einen 250 t Kulturtank, v/elcher 200 Liter eines Mediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthält und nan kultiviert 48 Stunden bei 30°C. Es v/erden zweie dieser 250 t
Tanks gefahren, um 350 Liter eines Kulturfiltrats zu erhalten. Zu dem Kulturfiltrat setzt man 3,5 kg Gelite hinzu und das sich ergebende Gemisch rührt nan 30 Hinuten, wobei man den pH-T^Tert bei 7 hiilt. Anschließend entwässert man das Gemisch auf einer Zentrifuge und den Rückstand wäscht man mit Wasser. Man erzielt 5,2 kg an nassem Celite (Enzymtiter 5000 ü/g). Diesen Celite
packt man in eine Vinylchloridkolonne der Ausmaße 120 χ 900 mm und man läßt durch die Kolonne eine Lösung von 5 mg/cm 7-Phenylacetamid-desacetoxy-cephalosporansäure in einem 0,05-m Phosphatpuffer (pH 7,5) fließen, während man die Temperatur bei 37°C
hält (Gesamtmenge 1,8 kg/360 Liter, Strömungsgeschwindigkeit
5 Liter je Stunde}» Die Eluierung ist in 72 Stunden vollendet und man erhält insgesamt 375 Liter eines Eluats. Zu diesem
Eluat setzt man 290 Liter Aceton hinzu und das sich ergebende
Gemisch stellt man unter Verwendung von 6-n Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 ein. Man rührt hinreichend für 30 Minuten und läßt dann zum Absetzen eines Niederschlages über Nacht stehen. Der niederschlag wird durch Abfiltrieren gewonnen, mit Aceton
gewaschan und dann getrocknet. Man erhält 1130,2 gKristalle von

209852/Ί09Α

7-ADCA (Reinheit 90,0%ig), Ausbeute 89,2%.

209852/1094

Claims (2)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-desacetoxycephalosporansäure der allgemeinen Fornel:

(II) -CH₅

COOH

dadurch gekennzeichnet, daß man eine 7-Acylamino-desacetoxycephalosporansäure der allgemeinen Formel:

,S.

R-CO-NH

(D

O^

coon

in welcher R eine Benzyl- oder Phenoxymethylgruppe ist; und M ein Alkalimetallatom ist, welches fähig ist, ein wasserlösliches Salz zu bilden; mit einen Kulturfiltrat eines enzymerzeugenden Stammes behandelt, welcher zur Gattung Bacillus gehört und v/elcher die Amidbindung dieser Verbindung zersetzen kann, wobei dieser Stamm Bacillus megaterium B-400 FERIi-P Ur. 748 ist; oder mit einer Enzymzubereitung, welche sich von diesem enzymerzeugenden Stamm herleitet, in einem wäßrigen Medium behandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das KvdturfUtrat dis enzymerzeugenden Stammes auf einem Träger adsorbiert,

209857/1094

welcher das Enzym nicht inaktiviert; daß man zu diesem Träger
eine wäßrige Lösung einer V-Acylamino-desacetoxy-cephalosporansäure der allgemeinen Formel (I) hinzusetzt, um diese Säure zu deacyHeren; und daß man 7-Amino-desacetoxy-cephalosporansäure aus der sich ergebenden Reaktionsflüssigkeit gewinnt.

OBlGSNAL !HSPEGTED
209857/1094