Sposób wytwarzania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (dalej zwane¬ go „7-ADCA") metoda enzymatycznej deacylacji kwasu 7-acyloaminodezacetoksycefalosporanowego, w szczególnosci sposobu wytwarzania 7-ADCA, a mianowicie kwasu 7-amino-3-metylo-A3-cefemokar- boksylowego-4 przy uzyciu preparatu enzymatycz¬ nego otrzymanego z hodowli szczepu Bacillus me- gaterium.Dotychczas 7-ADCA wytwarzany byl metoda ka¬ talitycznej redukcji cefalosporyny C w obecnosci palladu osadzonego na weglu w celu otrzymania kwasu 3-metylo-7-/o)-aminoadipoiloamido/-A3-ce- famokarboksylowego-4, który nastepnie deacylowa- no stosujac hydrolize, jak opisano w opisie patento¬ wym St. Zjedn. Ameryki nr 3124576. W tym samym opisie patentowym opisano sposób, w którym kwas 7-aminocefalosporanowy deacylowano metoda ka¬ talitycznej redukcji. Z belgijskich opisów patento¬ wych nr nr 717741 i 737761 znany jest sposób, w którym ester kwasu 3-metylo-7- fenoksyacetamido- A8-cefemokarboksylowego-4 otrzymuje sie w reak¬ cji fenoksymetylopenicyliny z PC15 w bezwodnym rozpuszczalniku organicznym, w obecnosci pirydy¬ ny, zas otrzymany imidochlorek zadaje sie alkoho¬ lem w celu otrzymania imidoesteru, który nastep¬ nie poddaje sie hydrolizie. Wymienione wyzej spo¬ soby sa sposobami rozkladu chemicznego, nato¬ miast dotychczas nieznany byl sposób wytwarza¬ nia 7-ADCA na drodze enzymatycznej. 10 15 30 Przedmiotem wynalazku jest enzymatyczna me¬ toda lub kwasu 3-metylo-7-fenyloacetamido-A8- -cefemokarboksylowego-4 wytwarzania 7-ADCA, która opracowano badajac szereg szczepów zdolnych do deacylacji kwasu 3-metylo-7-fenoksyacetami- do-A3-cefemokarboksylowego-4. W wyniku tych prac stwierdzono, ze szczep B-400, nalezacy do ro¬ dzaju Bacillus, wyizolowany z gleby, wytwarza od¬ powiedni enzym zdolny do rozerwania wiazan a- midowych kwasu 3-metylo-7-fenoksyacetamido-A8- -cefemokarboksylowego-4 oraz kwasu 3-metylo-7- -fenyloacetamido-A8-cefemokarboksylowego-4.Stwierdzono równiez, ze jesli kwas 3-metylo-7- -fenyloacetamido-A8-cefemokarboksylowy-4 zadaje sie preparatem enzymatycznym otrzymanym w ho¬ dowli wyzej wymienionego szczepu, tworzy sie zwiazek nieaktywny, który mozna przeksztalcic 7-ADCA ilosciowo przez dodanie chlorku fenylo- acetylu, a gdy kwas 3-metylo-7-fenyloacetamido- -A2-cefemokarboksylowy-4 zada sie wspomnianym preparatem enzymatycznym, mozna równiez otrzy¬ mac kwas 7-amino-3-metylo-A2-cefemokarboksy- lowy-4.Wlasciwosci taksonomiczne wymienionego szcze¬ pu B-400 sa nastepujace: Cechy morfologiczne (oznaczono na skosie agaro¬ wym po 18 i 24 godzinach hodowli w temperaturze 30°C).Komórki o ksztalcie paleczek, glównie w dlugich lancuchach, zakonczone okraglo 82 33382 333 Wielkosc 1,2—1,5X2,0—3,5 n Nie tworza kozuszka Ruchliwe z flagellami (umieszczone peryferycznie) Gram — dodatnie Spory (po 5 dniach hodowli na agarze sojowym w temperaturze 30°C): wielkosc 1,0—1,2X1,5—2,0 \l, ksztalt owalny, polozenie centralne do para-central- nego, sporangia niewyraznie napeczniale.Hodowla na róznych pozywkach: Plytka z agarem po 24 godzinach hodowli w tem¬ peraturze 30°C, wzrost dobry, kolisty, gwiazdzisty, nie rozprzestrzeniony, o barwie bialej do blado- -zóltej, powierzchnia blyszczaca, miekka, mokra, przezroczysta, nie powoduje zmiany zabarwienia podloza.Skos agarowy po 24 godzinach hodowli w tem¬ peraturze 30°C: wzrost dobry, powierzchnia gladka, nierozprzestrze- niona, blyszczaca, mokra; Kolonie o barwie mlecz¬ no bialej, przezroczyste; brak zmian zabarwienia podloza Bulion po 2 dniach hodowli w temperaturze 30°C: wzrost dobry, jednolite zmetnienie z osadem; brak kozuszka Slupek zelatynowy po 20 dniach hodowli w tem¬ peraturze 30°C: wzrost wzdluz linii naklucia do srodka, nie uplyn¬ nia zelatyny Mleko lakmusowe po 20 dniach hodowli w tem¬ peraturze 30°C: nie peptonizuje, eliminuje barwe lakmusu, hodowla plynna przechodzi w zabarwienie zóltawo-brazowe Skos agarowy z soja po 24 godzinach w tempe¬ raturze 30°C: wzrost dobry o barwie bialej do zóltawo-bialej, po¬ wierzchnia gladka i miekka, wyrazne tworzenie sie spor Skos agarowy z glukoza i azotanem po 3 dniach hodowli w temperaturze 30°C. Wzrost skapy Skos agarowy z tyrozyna po 3 dniach hodowli w temperaturze 30aC. Wzrost dobry, zabarwienie pod¬ loza brunatne Kartofel po 5 dniach hodowli w temperaturze 30°C: wzrost dobry, kolonie o barwie rózowej do brazo¬ wej, powierzchnia gladka i mokra w formie gwiaz¬ dek, blyszczaca, na trzeci dzien podloze zabarwia sie na kolor brazowy.Cechy fizjologiczne: Optymalne warunki wzrostu: tlenowe przy wartosci pH 7,0—8,0, w temperaturze 28—35°C Mozliwe warunki wzrostu: równiez w warunkach tlenowych przy wartosci pH 5,0—10,0 w tempera¬ turze 1° do. 45°C Opornosc na kwasy: mala, brak wzrostu ponizej wartosci pH 5,0 Wymagania tlenowe: hodowla tlenowa: w warun¬ kach beztlenowych brak wzrostu na podlozu z glu¬ koza Nie wytwarza indolu Wytwarza siarkowodór Denltryfikacja: nie wytwarza, gazu Redukuje azotany Tworzenie katalazy — dodatnie Tworzenie ureazy — dodatnie 35 40 50 60 65 Hydrolizuje skrobie Przyswaja cytryniany (w pozywce Kosera i Chris* tensena) Redukuje barwnik lakmusowy Redukuje blókit metylenowy Na podlozu kartoflanym tworzy w wodzie rozpusz¬ czalny pigment Zdolnosc fermentacji weglowodanów 10 15 Weglowodany arabinoza ksyloza glukoza mannoza fruktoza galaktoza Iriboza ramnoza maltoza sacharoza laktoza trehaloza rafinoza Icelebioza [sorbitol mannitol inozytol glyceryna [glucitol salicyna inulina [skrobia Tworzenie sie « kwasu — + + + — + — + — — + — + — + — + — — — + Tworzenie sie gazu — — —' — . (. —, ¦' . — — — — - — — — — — — — — — — — — | Na pod&tawie podanych cech taksonomicznych w oparciu o Bergey's Manual of Determinative Bac- teriology, wydanie VII stwierdzono, ze szczep opi¬ sany w niniejszym wynalazku nalezy do rodzaju Bacillus megaterium. Przeprowadzono badania po¬ równawcze szczepu B-400r z hodowla szczepu otrzy¬ manego z kolekcji American Type CuJture Collec- tion (ATCC) uznajac, ze szczep byl podobny do szczepu Bacillus megateriurn var. penicillatyticum ATCC 14945 jednakze wystepowaly nastepujace róz¬ nice: Uplynnianie zelatyny Mleko lak¬ musowe ' Skos karto¬ flany Tworzenie sie kwasu z mannozy Bacillus me¬ gaterium B-400 slabe zmniejsza za¬ barwienie tworzy sie* w wodzie roz¬ puszczalny pigment kolo¬ ru brazowego tworzy si^ Bacillus mega¬ terium var. pe- nicilatyticum ATCC 14§45 stopniowe zabarwienie przechodzi w alkaliczne i nie 1 zmniejsza sie 1 b»ak pigmentu nie tworzy sie- W oparciu o powyzsze uznano, ze szczep B-400 jest szczepem nowym., nalezacym do rodzaju Bacil¬ lus megaterium. Szczep B-400 zdeponowany zostal5 w Research Institute of Microorganism Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Ja¬ ponia pod nr „FERM-P 748".Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania 7-ADCA metoda deacylacji rozpuszczalnej w wodzie soli kwasu 7-acyloaminodezacetoksycefalosporanowego dzialajac w srodowisku wodnym zdolnym do deacy¬ lacji enzymem, otrzymanym w hodowli szczepu na¬ lezacego do rodzaju Bacillus. Sposób ten pozwala na uzyskanie wysokiej wydajnosci 7-ADCA, cho¬ ciaz nie mozna uznac tego sposobu za ekonomiczny ze wzgladu na to, ze wymaga sie aby enzym deacy¬ lujacy izolowany byl z hodowli szczepu.Stezenie otrzymanego 7-ADCA jest niskie i wy¬ dzielanie rozpuszczalnego w wodzie 7-ADCA jest kosztowne, a ponadto niemozliwe jest zasadniczo ponowne wykorzystanie enzymu deacylujacego. W zwiazku z powyzszym podjeto dalsze prace nad o- trzymywaniem enzymu deacylujacego metoda, w której mialby on zdolnosc dzialania w fazie stalej.I tak stwierdzono, ze jezeli odpowiedni nosnik zmieszany zostanie z przesaczem hodowlanym szcze¬ pu wytwarzajacego deacylujacy enzym, to nosnik ten adsorbuje enzym bez jego inaktywacji i nie uwalnia enzymu przy przemywaniu woda. Jesli na kolumne wypelniona nosnikiem z osadzonym na nim enzymem poda sie wodny roztwór rozpuszczal¬ nej w wodzie soli kwasu 7-acyloaminodezacetoksy- cefalosporanowego, to z kolumny wyplywa 7-ADCA w stanie wyjatkowo stezonym, gdy tymczasem en¬ zym w sposób ciagly rozklada kwas 7-acyloamino- dezacetoksycefalosporanowy i w ten sposób moze byc w pelni wykorzystany.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania 7-ADCA, o wzorze 1 polega na tym, ze kwas 7-acyloamino- dezacetoksycefalosporanowy (dalej zwany „Ce/I/") o wozrze 2, w którym R oznacza grupe benzylowa lub fenoksymetylowa, M oznacza atom metalu al¬ kalicznego, zdolnego do tworzenia w wodzie roz¬ puszczalnej soli, zadaje sie przesaczem hodowlanym enzymu wytwarzanego przez szczep nalezacy do rodzaju Bacillus, który ma zdolnosc rozrywania wiazania amidowego wymienionego wyzej zwiazku Ce/I/ lub tez traktuje sie w srodowisku wodnym preparatem enzymatycznym otrzymanym z hodowli wspomnianego szczepu.Ponadto 7-ADCA sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie przez adsorbowanie enzymu deacylu¬ jacego Ce/I/ na nosniku, który nie inaktywuje tego enzymu i dodawanie roztworu wodnego Ce/I/ do nosnika w celu jego deacylacji, po czym izoluje sie 7-ADCA.Sposób enzymatycznego wytwarzania pólproduktu stosowany jest w otrzymywaniu cefalosporyn, anty¬ biotyków wykorzystywanych w preparatach leczni¬ czych.Przedmiotem wynalazku jest wiec przemyslowa metoda wytwarzania 7-ADCA, w której 'wspom¬ niana wyzej reakcja enzymatyczna przebiega w spo¬ sób ciagly w fazie stalej przez adsorbowanie deacy¬ lujacego enzymu na nosniku bez jego inaktywacji.Stosowanym w sposobie wedlug wynalazku szcze¬ pem wytwarzajacym enzym deacylujacy Ce/I/ jest na przyklad szczep Bacillus megaterium B-400 FERM-P 748, zdolny do rozerwania wiazania ami- 333 6 dowego, otrzymany w hodowli tlenowej w ciagu 12—60 godzin, w temperaturze 25—37°C, w pozyw¬ ce powszechnie stosowanej w hodowli bakterii, a mianowicie w pozywce zawierajacej odpowiednie 5 zródlo azotu, takie jak pepton, ekstrakt miesny, na- mok kukurydziany, wyciag drozdzowy, drozdze su¬ szone, hydrolizaty maki sojowej oraz zródlo wegla, takie jak melasa, glukoza lub gliceryna i sole nie¬ organiczne, a w pewnych przypadkach stosuje sie io inne substancje pobudzajace wzrost. Hodowle plyn¬ na napowietrza sie przez mieszanie..Wspomnianym enzymem jest zwykle keto-enzym i znajduje sie w przesaczu hodowlanym pozbawio¬ nym komórek. Stad w reakcji enzymatycznej sto- 15 suje sie enzym w formie przesaczu hodowlanego lub preparatu enzymatycznego otrzymanego z przesa¬ czu hodowlanego. Preparat enzymatyczny otrzy¬ muje sie przez oczyszczenie go znanymi metodami: na przyklad przez zageszczenie lub nie przesaczu 20 hodowlanego, wytracanie enzymu przez odpowie¬ dnie wysycenie rozpuszczalna sola taka jak siar¬ czan amonu lub chlorek sodu lub tez przez wytra¬ cenie go dodatkiem hydrofilnego rozpuszczalnika organicznego, takiego jak metanol, etanol lub ace- 25 ton.Wytracona substancje rozpuszcza sie w wodzie i otrzymany roztwór dializuje, przy czym usuwa sie niskoczasteczkowe zanieczyszczenia. Ewentualnie, przyjmujac róznice w zdolnosci adsorpcji adsorben- 30 ta lub zelu stosowanego do saczenia, oddziela sie niskoczasteczkowe zanieczyszczenia, substancje bar¬ wne, bialkowe i inne znajdujace sie w plynie hodowlanym zwyklymi metodami takimi jak chro¬ matografia adsorpcyjna, chromatografia na wy- 35 mieniaczach jonowych lub filtracja zelowa. Tak otrzymany enzym mozna zagescic pod zmniejszo¬ nym cisnieniem, zliofilizowac w celu otrzymania standartowego produktu enzymatycznego w formie stalej lub tez wykorzystac go wprost, jak to po- 40 dano poprzednio, do deacylacji Ce/I/. Jezeli prepa¬ rat enzymatyczny powinien byc bardziej oczyszczo¬ ny, mozna zastosowac jeden z wielu sposobów wy¬ korzystywanych przy oczyszczaniu substancji bial¬ kowych lub enzymów, na przyklad przez adsorpcje, 45 filtracje zelowa lub inne.Reakcje enzymatyczna prowadzi sie w ten spo¬ sób, ze Ce/I/ rozpuszcza sie w wodzie lub w roz¬ tworze buforowym, a nastepnie traktuje opisanym wyzej preparatem enzymatycznym. Ce/I/ otrzyma- 50 ny jako rozpuszczalna w wodzie sól sodowa lub potasowa uzywa sie w stezeniu w granicach od 0,1—20 mg/ml, korzystnie od okolo 2—5 mg/ml.Korzystna wartosc pH reakcji jest zawarta w gra¬ nicach 7—8. Reakcje prowadzi sie w temperaturze 55 30—45°C, korzystnie 35—40QC. Czas reakcji zalezy od warunków, chociaz zwykle reakcja przebiega w ciagu od okolo 5—30 godzin i moze byc zakoncza¬ na w momencie, gdy wydajnosc 7-ADCA o wzorze 1 osiaga maksimum. 60 Rodzaj nosnika stosowanego w sposobie wedlug wynalazku zalezy od rodzaju szczepu wytwarzaja¬ cego enzym deacylujacy Ce/I/.Nosnik powinien byc tak dobrany, aby mógl ad- sorbowac enzym deacylujacy bez jego inaktywacji, 66 a ponadto nie moze byc wymywany woda lub in-7 nymi substancjami, nie moze wplywac szkodliwie na reakcje enzymatyczna rozkladajac Ce/I/ oraz powinien jedynie z trudem adsorbowac otrzymany 7-ADCA. Na przyklad jesli jako nosnik uzyje sie nosnik nieorganiczny taki jak celit, glinka biala, kaolin, wegiel aktywowany lub tez zel krzemion¬ kowy, wymieniacz jonowy taki, jak CM-Celluloza lub CM-Sephadex C-25 lub tez zywice jonowymien¬ na taka jak Abmerlite CG-50 lub Dowex-50, to wówczas enzym deacylujacy Ce/I/ adsorbuje sie bez inaktywacji. Natomiast gdy stosuje sie tlenek gli¬ nu, proszek celulozowy, DEAE-Cellulose, DEAE- -Sephadex-25 lub zywice jonowymienna anionowa, enzym deacylujacy jest slabo adsorbowany lub zo¬ staje inaktywowany jeszcze przed zaadsorbowa- niem.W czasie adsorpcji enzymu deacylujacego Ce/I/ na nosniku nalezy najpierw pH przesaczu hodowla¬ nego doprowadzic do wartosci stalej. Na przyklad przy adsorpcji enzymu na celicie wartosci pH prze¬ saczu hodowlanego doprowadza sie do okolo 6—8.Jednakze, zwlaszcza kiedy stosuje sie wymieniacz jonowy lub zywice jonowymienna, sila absorpcji lub stopien inaktywacji enzymu deacylujacego wplywa na wartosc pH tak, ze nalezy zwrócic na to uwage.Adsorpcje na nosniku enzymu deacylujacego moz¬ na przeprowadzic systemem szarzowym lub kolum¬ nowym. Ilosc uzytego nosnika zalezy od ilosci i miana enzymu w przesaczu hodowlanym oraz od stopnia jego adsorpcji na nosniku. Przy adsorpcji enzymu systemem szarzowym, ilosc uzytego nosni¬ ka wynosi okolo 5—15°/o w stosunku do ilosci przesaczu hodowlanego.W przypadku adsorpcji systemem wsadowym miesza sie przesacz hodowlany z nosnikiem po czym nosnik oddziela, przemywa woda, podczas gdy sto¬ sujac system kolumnowy, kolumne napelniona nos¬ nikiem zwilza sie woda lub roztworem buforowym, doprowadzonym do stalej wartosci pH enzymu deacylujacego, po czym przesacz hodowlany prze¬ puszcza sie przez kolumne, a nastepnie kolumne przemywa woda otrzymujac nosnik z zaadsorbo- wanym enzymem deacylujacym.Jezeli otrzymany tak nosnik z zaadsorbowanym enzymem deacylujacym zostanie wysuszony, to en¬ zym ma tendencje do inaktywacji. W zwiazku z tym pozadane jest aby nosnik stosowany w reakcji deacylacji Ce/I/ byl w stanie mokrym.Ce/I/ stosowany w sposobie wedlug wynalazku otrzymuje sie znanymi metodami, a mianowicie przez zwiekszenie pierscienia estru sulfotlenku pe¬ nicyliny,-jak opisano w opisach patentowych St.Zjedn. Ameryki nr 3275626, belgijskich opisach pa¬ tentowych nr nr 696026, 745845, 747118, 747119 i 747120, holenderskim opisie patentowym nr 6806532, brytyjskim opisie patentowym nr 1204394, a na¬ stepnie przeestryfikowanie otrzymanego estru kwa¬ su 7-acyloaminodezacetoksycefalosporanowego lub tez metoda, w której usuwa sie grupe acetoksyIo¬ wa z kwasu 7-acyloaminocefalosporanowego, jak opisano w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 3275626. Poniewaz enzymatyczna deacylacje Ce/I/ prowadzi sie w roztworze, jest Ce/T/ na ogól sto¬ suje sie w postaci rozpuszczalnej w wodzie soli 333 8 metalu alkalicznego, to jest soli sodowej lub po¬ tasowej.Nastepnym etapem sposobu jest traktowanie wodnego roztworu Ce/I/ nosnikiem z zaadsorbowa- 5 nym enzymem deacylujacym, przy czym roztwór nalezy uprzednio zbuforowac roztworem o wartos¬ ci pH równej pH enzymu deacylujacego.Reakcje enzymatyczna prowadzi sie w kolumnie z tego wzgledu, ze mozna wówczas stosowac pro- 10 ces ciagly. Stezenie dodawanego Ce/I/ rózni sie glównie w zaleznosci od miana enzymu, to jest zdolnosci deacylowania Ce/I/, szybkosci przeplywu, majac na wzgledzie aby ilosc nieprzereagowanego Ce/T/, pozostalego w plynie poreakcyjnym nie by- 15 la zbyt duza. Stezenie Ce/I/ wynosi 0,1—2,0%, ko¬ rzystnie 0,5—1,0%. Reakcja ma równiez korzystny przebieg jezeli stosuje sie wlasciwe pH i tempe¬ rature, korzystnie optimum pH i temperatury dla enzymu deacylujacego Ce/I/. Rózne warunki reakcji 20 powinny byc tak dobrane, aby w plynie poreakcyj¬ nym utworzony 7-ADCA wyplywal w mozliwie naj¬ wyzszym stezeniu. Czas reakcji rózni sie przy zwiekszeniu i obnizaniu ilosci dodawanego wodne¬ go roztworu Ce/I/. Reakcja jest zakonczona przed 25 uplywem czasu przejscia roztworu Ce/T/ przez war¬ stwe nosnika w kolumnie. W przypadku gdy mala jest deacylacja Ce/I/ i duza ilosc Ce/I/ pozostala w plynie poreakcyjnym, nalezy ponownie go prze¬ puscic przez warstwe nosnika lub dodac inna war- 30 stwe nosnika, który zaadsorbowal deacylujacy en^ zym.Jesli reakcje enzymatyczna prowadzi sie w spo¬ sób ciagly, wodny roztwór Ce/I/ przeplywa stale przez warstwe nosnika. O ile stopien deacylacji 35 Ce/I/ obniza sie nalezy przyjac, ze w plynie znaj¬ duja sie bakterie lub inne drobnoustroje i wów¬ czas na wierzch kolumny lub do substratu dodaje sie toluen, w ten sposób zmniejszajac do minimum szkodliwe ich dzialanie. 40 W sposobie wedlug wynalazku jeden nosnik mo¬ ze byc wykorzystywany przez 10 dni tak, ze otrzy¬ muje sie 7-ADCA z wysoka wydajnoscia i przy niskim koszcie produkcji.Izolowanie 7-ADCA z plynu poreakcyjnego pro- « wadzi sie znanymi metodami. Na przyklad plyn reakcyjny doprowadzony do wartosci pH okolo 2 przemywa sie hydrofobowym rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak octan etylu, butylu lub keton metyloizobutylowy w celu usuniecia nie- 50 przereagowanego Ce/I/, a nastepnie warstwe wod¬ na zageszcza sie i oziebiajac doprowadza do war¬ tosci pH okolo 3,7, co powoduje wytracenie 7-ADCA w punkcie izoelektrycznym. Ewentualnie plyn reakcyjny doprowadza sie do wartosci pH 55 okolo 3,7, zageszcza, nastepnie oziebia i wytracona substancje przemywa acetonem aby usunac nie- przereagowany Ce/I/ oraz kwas karboksylowy jako produkt uboczny.Oznaczanie aktywnosci zaadsorbowanego enzy- 60 mu prowadzi sie nastepujaco: Nosnik, który zaadsorbowal deacylujacy enzym wazy sie w rurce o ksztalcie litery L, do której dodaje sie 4,5 ml fosforanu (0,1 mola) jako roz¬ tworu buforowego o wartosci pH 7,5 i wytrzasa 65 w ciagu 10 minut na trzesawce termostatowanej82 333 9 typu Monod, w temperaturze 37°C. Nastepnie do¬ daje sie 0,5 ml (10 mg/ml w postaci wolnego kwa¬ su) wodnego roztworu soli sodowej kwasu 7-feny- loacetamidodezacetoksycefalosporanowego i otrzy¬ mana mieszanine poddaje reakcji w ciagu 30 mi¬ nut. Po tym czasie plyn reakcyjny natychmiast sie oziebia i oznacza 7-ADCA w plynie macierzystym, pozbawionym nosnika metoda TNBS. Miano en¬ zymu stanowiace 100 yfml 7-ADCA przyjmuje sie jako 100 jednostek /U/.Oznaczanie 7-ADCA prowadzi sie nastepujacy¬ mi metodami.Plyn reakcyjny oznacza sie metoda mikrobiolo¬ giczna w temperaturze 37°C w ciagu 16 godzin, metoda krazków bibulowych lub metoda cylinder- kowa stosujac Bacillus subtilis PCI-219 jako szczep testowy mierzac srednice strefy zahamowania wzrostu. Z krzywej standartowej Ce/I/ oblicza sie ilosc Ce/I/, a róznica miedzy poczatkowa iloscia Ce/T/ i pozostaloscia Ce/I/ stanowi procent w sto¬ sunku do poczatkowej ilosci Ce/I/. Procent ten jest wielkoscia rozkladu poczatkowego Ce/I/.Inna metoda polega na tym, ze okreslona ilosc plynu reakcyjnego doprowadza sie do wartosci pH 2,5 1 n kwasem solnym przemywa trzykrotnie polowa ilosci octanem butylu i pH doprowadza do wartosci 7,5 1 n roztworem wodorotlenku sodowe¬ go. Okreslona ilosc plynu poreakcyjnego zadaje sie chlorkiem kwasowym odpowiednio do kwasu bocz¬ nego lancucha poczatkowego Ce/I/ i oznacza mikro¬ biologicznie jak w metodzie wyzej opisanej. Z ilos¬ ci otrzymanego Ce/T/ oblicza sie ilosc 7-ADCA po¬ dana w procentach. Procent stanowi wydajnosc 7-ADCA.Metoda TNBS. Do 1 ml próbki dodaje sie 2 ml fosforanowego roztworu buforowego (0,3 mola) o pH 8,0 oraz 2 ml 0,1% roztworu TNBS i otrzyma¬ na mieszanine pozostawia do przereagowania w ciemnosci w temperaturze 50°C w ciagu 90 minut.Plyn po oziebieniu zadaje sie 1 ml 1 n kwasu sol¬ nego i oznacza z krzywej standartowej 7-ADCA.Sposób wedlug wynalazku ilustruja nastepujace przyklady.Przyklad I. Otrzymywanie enzymu 20 litrów plynnej pozywki o wartosci pH 7,0, zawierajacej l°/o polipeptonu, 1% wyciagu drozdzowego, 0,5% chlorku sodowego, sterylizuje sie w fermentorze o pojemnosci 30 litrów w ciagu 20 minut w tempe¬ raturze 120°C. 200 ml hodowli Bacillus megaterium J3-400 FERM-P nr 748 na pozywce posiewowej, o tym samym skladzie co poprzednio, inkubowanej w ciagu 24 godzin w temperaturze 30°, przenosi sie do pozywki hodowlanej i prowadzi fermentacje w ciagu 48 godzin w temperaturze 30°C, miesza¬ jac przy doprowadzeniu powietrza w ilosci 20 li¬ trów/min. i szybkosci mieszania 300 obr./min. Po zakonczeniu fermentacji usuwa sie komórki za po¬ moca wirówki Westfalia i otrzymuje 17,4 litrów przesaczu hodowlanego.Przyklad II. Przesacz hodowlany, otrzyma¬ ny w przykladzie I, zageszcza sie do V8 objetosci w temperaturze zewnetrznej 30—35i°C i zadaje siarczanem amonu az do uzyskania 80% nasyce¬ nia. Przechowany osad rozpuszcza sie w wodzie destylowanej i odsala przy zastosowaniu kolumny 10 wypelnionej Sephadexem G-25, po czym liofilizuje odsolony roztwór otrzymujac 24,3 g enzymu stan¬ dartowego.Przyklad III. 20 litrów pozywki hodowla- 5 nej o wartosci pH 7,0, zawierajacej 0,5% glukozy, 0,3% liceryny, 1% wyciagu miesnego oraz 1% po¬ liptonu wprowadza sie do fermentora o pojemnosci 30 litrów i sterylizuje w ciagu 20 minut w tempe¬ raturze 120oC. 200 ml Bacillus megaterium B-400 io FERM-P 748, na pozywce posiewowej o wyzej po¬ danym skladzie, inkubuje sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 3Q°C, przenosi w warunkach ste¬ rylnych do wyzej wspomnianej hodowli i prowa¬ dzi fermentacje w ciagu 72 godzin mieszajac przy 15 doprowadzeniu powietrza 20 litrów/min. i szybkos¬ cia mieszania 300 obr./min.Po zakonczonej fermentacji usuwa sie komórki przez odwirowanie i przesacz zageszcza doV8 ob¬ jetosci w temperaturze zewnetrznej 30—35°C, za¬ daje acetonem do uzyskania 60% nasycenia. Po- 20 zostaly osad przesacza sie i suszy otrzymujac 25,5 g standartowego preparatu enzymatycznego.Przyklad IV. 4g surowego preparatu enzy¬ matycznego, otrzymanego w przykladzie II, roz- 25 puszcza sie w 500 ml wody i doprowadza do war¬ tosci pH 7,5 1 n wodnym roztworem NaOH. Do roztworu tego dodaje sie 2 g soli sodowej kwasu 3-metylo-7-fenoksyacetamido-As-cefemokarboksy- lowego-4 i otrzymana mieszanine odstawia do prze- 30 reagowania na przeciag 15 godzin w temperaturze 37|°C.Plyn poreakcyjny uwalnia sie od substancji bial¬ kowych za pomoca Dia Filter-G-IOH (produkcji Nippon Vacuum Techniaue Co)., doprowadza do 35 wartosci pH 2,5 1 n kwasem solnym, przemywa trzykrotnie polowa ilosci octanu butylu, a nastep¬ nie 1 n wodnym roztworem NaOH do wartosci pH 6,5. Plyn adsorbuje sie na kolumnie o wymiarach 2X15 cm przez warstwe Dowex 1—8 (rodzaju kwa- 40 su octowego) i eluuje 1 n kwasem octowym.Nastepnie adsorpcje kazdej frakcji oznacza sie przy 260 mji lub testem mikrobiologicznym po roz¬ pyleniu na bibule chlorku fenoksyacetylu, po czym zbiera frakcje zawierajace kwas 7-amino-3-mety- 45 lo-A8-cefemókarboksylowego-4 i liofilizuje. Suchy produkt rozpuszcza sie w mozliwie najmniejszej ilosci wody, roztwór doprowadza do wartosci pH 3,7 dodatkiem 1 n kwasu solnego i pozostawia na przeciag nocy oziebiajac lodem, do powstania bez¬ barwnych krysztalów. 50 Krysztaly przemywa sie mozliwie najmniejsza iloscia zimnej wody, nastepnie acetonem i suszy.Otrzymuje sie 792 mg kwasu 7-amino-3-metylo- -A3-cefemokarboksylowego-4 o temperaturze top¬ nienia 240°C (z rozkladem) z wydajnoscia 69,6%. 55 Dla wzoru C8H10N2O3S — obliczono: C — 44,85%, H —70%, N —13,08% znaleziono: C —45,02%, H —4,58%, N —12,95% Przyklad V. Do 10 mg roztworu surowego 60 preparatu enzymatycznego, otrzymanego wedlug przykladu II, w 5 ml buforu fosforanowego (1 mol) o wartosci pH 7,5 dodaje sie 5 mg soli sodowej kwasu 3-metylo-7-fenyloacetamido-A3-cefemokar- boksylowego-4 i mieszanine pozostawia do prze- 65 reagowania na przeciag 5 godzin w temperaturze82 333 li 37°C. Wielkosc rozkladu kwasu 3-metylo-7-fenylo- acetamido-As~<^femokarboksylowego-4 oraz wy¬ dajnosc 7-ADCA okresla sie zgodnie ze wspom¬ niana wyzej metoda oznaczania, otrzymujac war¬ tosc 95% i 91*/o wydajnosci.Przyklad "VI. Postepuje sie jak w przykla¬ dzie IV z wyjatkiem tego, ze zamiast soli sodowej kwasu 3-metylo«7-fenoksyacetamido-A*-crefemo;kar- boksylowego-4 -stosuje sie ester kwasu 3-mety- lo-7-fenyloacetamido-A^cefemokarboksylowego-4.Temperatura topnienia otrzymanego zwiazku 239— —241,°C (z rozkladem), wydajnosc 73,5*/o.P r z y k l a d V11. 10 litrów przesaczu hodowla¬ nego szczepu Bacillus megaterium B-400 FEJtM-P 748, otrzymanego jak w przykladzie H ^doprowa¬ dza sie kwasem octowym do wartosci pH 7. Do przesaczu dodaje sie 500 g ziemi okrzemkowej i miesza sie w ciagu 30 minut przy czym wartosc pH utrzymuje sie 7,0. Nastepnie mieszanine poreak¬ cyjna odwirowuje sie za pomoca wirówki koszo¬ wej, przemywa woda i otrzymuje 750 g suchego celitu (miano preparatu enzymatycznego wynosi 1 200 U/g).Przyklad VIII. Przesacz hodowlany szczepu Bacillus megaterium B-400 FERM-P 748, otrzyma¬ ny jak w przykladzie II, doprowadza sie do war¬ tosci pH okolo 7,0. Do kazdego litra przesaczu ho¬ dowlanego dodaje sie 50 g celitu (Hyflo Super Cel), wegla aktywowanego (produkcji Wako Jun-yaku Co., stosowanego w chromatografii), wymieniacza jonowego CM-Cellulose (produkcji Serva Co 0,52 mcg/g) i Amerlite CG-50 (w formie wodorowej), calosc miesza sie w ciagu okblo 30 minut. W cza¬ sie mieszania utrzymuje sie stala wartosc pH oko¬ lo 7,0. Nastepnie kazdy z nosników odzyskuje sie przez saczenie i przemycie woda otrzymujac mo¬ kry nosnik. Adsorpcje kazdego nosnika oblicza sie przyjmujac jako 100§/o adsorpcji enzymu na celi- cie. 12 Nosnik celit wegiel aktywowany CM-celuloza Amberlite CG-50 Stosunek adsorpcji w */* 100 100 | 100 81,2 Przyklad IX. Enzym deacylujacy zaadsor- bowany na celicie (miano enzymu 1800 U/g), otrzy¬ many jak w przykladzie VIII, przemywa sie roz¬ tworem buforowym siarczanu (0,01 mola) przy wartosci pH 7,5, laduje do kolumny wyposazonej w rurke z plaszczem (5X50 cm), po czym ponownie przemywa wyzej wspomnianym roztworem bufo¬ rowym w ciagu 1 godziny przy okreslonej ilosci przeplywu (szybkosc objetosciowa 0,5).Utrzymuje sie stala temperature zewnetrzna ko¬ lumny 37t°C przy przeplywie goracej wody w plasz¬ czu rurki. Nastepnie 6 litrów (5 mg/ml w przeli¬ czeniu na wolny kwas) wodnego roztworu soli sodowej kwasu 7-fenyloacetamidodezacetoksycefa- losporanowego przepuszcza sie przez kolumne przy szybkosci objetosciowej 0,5 i odbiera sie poszcze¬ gólne frakcje (kazda 10,8 ml). Czas potrzebny do zakonczenia elucji wynosi okolo 16 godzin. 10 15 20 35 40 50 55 B,4 litra eluatu doprowadza sie do wartosci pH 6 i zageszcza do 1/10 objetosci po czym do wartosci pH 3,7 6 n kwasem solnym, przy czym utworzony 7-ADCA zaczyna sie wytracac.Dla pelnego wytracenia eluat oziebia sie lod«rn i osad saczy, przemywa mala iloscia oziebionej wo¬ dy, suszy dostatecznie acetonem i ponownie suszy tak, aby otrzymac 14,0 g czystego 7-ADCA o tem¬ peraturze topnienia 240—242°C z wydajnoscia 72,4°/t.Produkt nastepnie rozpuszcza sie w 2,5 n wod¬ nym roztworze wodorotlenku sodowego, roztwór odbarwia weglem aktywowanym^ 6 n kwasem sol¬ nym doprowadza do wartosci pH 3,7 i oziebia lo¬ dem do wytracenia 7-ADCA. 7-ADCA saczy sie, przemywa mala iloscia oziebionej wody i aceto¬ nem i suszy. Otrzymuje sie 11,4 g oczyszczonego produktu.Przyklad X. 7-ADCA otrzymuje sie jak w przykladzie IX z wyjatkiem tego* ze w miejsce stosowanego poprzednio celitu adsorbujacego en¬ zym deacylujacy stosuje sie wegiel aktywowany, CM-celulose i Amberlite CG-50. Uzyskane wyniki podano w ponizszej tablicy. 25 30 Rodzaj nosnika Wegiel akty* wowany CM-celuloza Amberlite CG-50 Otrzymana ilo&c w g 37,5 32,9 31,3 Wydajnosc 58,2 51,8 46,5 ' j 05 Przyklad Xl. i litr otrzymanej sposobem wedlug przypadku I, hodowli przenosi sie do tan¬ ku pojemnosci 250 litrów, zawierajacego 200 litrów pozywki o skladzie jak w przykladzie I i prowa¬ dzi fermentacje w ciagu 48 godzin w temperatu¬ rze 3ÓÓC.Aby otrzymac 350 litrów przesaczu hodowlanego proces prowadzi sie w dwu 250 litrowych tankach.Do uzyskanego przesaczu hodowlanego dodaje sie 3,5 fcg celitu i miesza przy Wartosci ptt 7 w ciagu 30 minut. Nastepnie mieszanine uwalnia sie ód wo¬ dy przez odwirowanie, a pozostalosc przeniywa Wó- da uzyskujac 5,2 kg mokrego Celitu (miano efizy- mu 5 000 Wg).Celltem wypelnia sie kolumne ó wymiar&th 120X900 mm z chlorku winylu i przez kblunine przepuszcza sie roztwór 5 fng/ml kwasu t-fenylo^ acetamidodeZacet&ksycefalóSpórahóWfego W buforze fosforanowym o wartosci pH *7,5 (0,05 mola), utrzyj mujac stala temperature 3t0C (calkowita ilosc 1,8 kg/360 litrów, przy przeplywie 5 iitrów/gódzlne), w 72 godzinie, po zakonczeniu elucji, otrzymuje sie 375 litrów eluatu, do którego dodaje sie 290 litrów acetonu i mieszanine doprowadza do Wartosci p& 4,0 6 n kwasem solnym, mieszajac pfzez przeciag. 30 minut, po czym pozostawia na hoc" do wytrace¬ nia psodu. Nastepnie osad bdsaczn sie, pfzertiyWa acetonem i suszy otrzymujac 1130,2 g krysztalów 7-ADCA (czystosc 90Vl) z WydftjriOseia 89,2°/ó. PL PL