JP2844214B2 - ４ａ―ヒドロキシミルベマイシンα類の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高い生理活性を示す16員マクロライドのC4位
側鎖変換物質の合成原料として重要な4a−ヒドロキシミ
ルベマイシンα類の製造法に関するものである。

（従来の技術） 16員マクロライド物質にはミルベマイシン類、アベル
メクチン類等が殺虫、殺ダニ、殺線虫ならびに駆虫活性
をもつことが知られており、また、それらの化学合成誘
導体も同様な作用を呈することが報告されている。

特開昭50−29742号公報明細書にある抗生物質Ｂ−41
（ミルベマイシン）の殺ダニ試験ではミルベマイシンC1
ならびにC2の製造にみられる16員マクロライドのC4位に
２−ピロリカルボニルオキシメチル基を持つ物質は類縁
物質の中で最も高い性質を示している。また、特願昭62
−184620号、特願昭62−184621号および特願昭63−2254
3号にて本特許出願人が出願した特異的な生理活性作用
を示すミルベマイシン系16員マクロライド物質の記載に
示したように、16員マクロライドのC4位にアルカノイル
オキシメチル基またはアルケノイルオキシメチル基が連
続した物質は強力な殺虫、殺ダニ活性をもっていること
が明かとなった。

このように、16員マクロライドC4位のオキシメチル基
を介しての側鎖をもつ物質には生物活性上注目すべきも
のが多く、化学合成的手法により新たな活性物質を求め
ることは重要な課題と考えられている。そこでC4位側鎖
の化学修飾における中間原料として、4a−ヒドロキシミ
ルベマイシン類を容易に生産する技術の確立が必要であ
る。

4a−ヒドロキシ化合物は4a−未置換化合物を化学的に
酸化することによって得る方法があり、本製造法の発明
当該物質である4a−ヒドロキシミルベマイシンα類は4a
−置換アベルメクチンとしてアベルメクチン類またはミ
ルベマイシン類の４−メチル基の選択的酸化法により製
造されることが知られている。即ち、微生物により生産
されたミルベマイシンα類を選択的化学手段によりヒド
ロキシル体に変える技法がとられている（特開昭58−59
988号公報明細書）。しかしながら、化学的方法をとら
ずに微生物により直接生産させる方法については知られ
ていない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は4a−ヒドロキシミルベマイシンα類の微生物
による直接生産法に関するものである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは16員マクロライドのC4位のメチル基を酸
化して得られる4a−ヒドロキシメチル体を直接発酵法に
より生産することを意図にその生産菌を各地の土壌から
検索した。その中で、和歌山県新宮市街の土壌から分離
された放線菌KSB−1939株が生産する物質の化学構造を
解析した結果、目的とするC4位がヒドロキシメチル体で
あり、且つそれらの構造が4a−ヒドロキシミルベマイシ
ンα類であることを確認し、さらにその培養方法を確立
することにより本発明の完成に至った。

即ち、本発明は下記の化学式〔Ｉ〕を有する4a−ヒド
ロキシミルベマイシンα類を製造するにあたり、ストレ
プトミセス属に属する4a−ヒドロキシミルベマイシン生
産菌を培地に培養し、培養物から当該化合物を採取する
ことを特徴とする当該化合物の製造法に関するものであ
る。

式 （式中、R1は水酸基またはメトキシ基を示し、R2はメチ
ル基またはエチル基を示す。） 以下さらに具体的に本発明の詳細を述べる。

生産菌の同定 KSB−1939株の同定は，国際ストレプトミセス計画（I
SP）の方法とワックスマン氏の方法により、また、その
記載はISPの例に準じて行なった。

（１）形態的性質 基生菌糸は分岐しながら成長し、菌糸の分離は、観察
されない。気中菌糸はグルコース・アスパラギン寒天培
地、オートミール寒天培地等で旺盛に着生し、胞子形成
も良好である。気中菌糸は分岐しながら空中に伸長し、
短い主軸または分枝上に胞子鎖を単軸分岐する。胞子鎖
は通常コイル状螺旋を呈する。長期間培養すると、胞子
鎖先端が黒粘質塊化し、更に進んだ部分は、気中菌糸全
体が黒褐色粘質塊化する（グルコース・アスパラギン寒
天培地、オートミール寒天培地）。胞子鎖の幅は0.5な
いし0.8ミクロン、胞子表面はシワ状（Warty）を呈し、
胞子の区切りが不鮮明なため、詳しい個々の胞子の形状
及び連結数は不明であるが、10胞子以上の連結が認めら
れる。また胞子は運動性を示さず、胞子嚢、菌核等は観
察されない。

（２）ジアミノピメリン酸分析 全菌体加水分解物の分析からLL−ジアミノピメリン酸
が認められ、細胞壁タイプＩ型である。

（３）各種培地における生育状態 培養３週間目の生育状態は、第１表に示す通りであ
る。なお、色調の判定は「Color Harmony Manual」（Ta
ylor:1948）に拠った。

（４）生理的性質 生育温度範囲 ： 20〜40℃ 最適温度範囲 ： 25〜35℃ ゼラチンの液化 ： ＋ 澱粉の加水分解 ： ＋ 脱脂牛乳の凝固 ： ＋ ペプトン化 ： ＋ メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地 ： − ペプトン・イースト・鉄寒天培地 ： − トリプトン・イースト・ブロス ： − 硝酸塩の還元 ： ＋ （５）各炭素源の同化性 （プリドハム・ゴドリーブ寒天培地上） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトース、シユクロース、Ｌ−ラムノース、ラ
フイノース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−イノシトールの全
ての炭素源を同化する。

上記の菌学的性質をインターナショナル・ジャーナル
・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Internat
ional Journal of Systimatic Bacteriolgy）第22巻、
第307〜311頁（1972年）の記載を参照し同定を行った結
果、KSB−1939株は、シュクロース、ラフイノースの同
化の点で僅かに差を認めるものの、基本性状（形態及び
各種培地での生育状態）がストレプトミセス・ハイグロ
スコピカス（Streptomyces hygroscopicus）とよく一致
することから、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス
KSB−1939と命名した。KSB−1939株は昭和62年６月26
日付で通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第1901号（FERM BP−1901）として寄託されて
いる。尚、KSB−1939株は他の放射菌の場合にみられる
ように、その性状が変化しやすい。例えば、KSB−1939
株又はこの株に由来する突然変異株（自然発生又は誘発
性）、形質融合体又は遺伝子組変え体であっても、KSB
−1939株にその形質起源を依存し4a−ヒドロキシミルベ
マイシン類を生産するものは総て本発明に使用出来る。

製造方法 本発明はKSB−1939株の培養と培養物からの精製を主
たる製造法としている。培養に用いる栄養源としては、
従来放射線菌の培養に利用されている公知のものが使用
できる。例えば、炭素源として、グルコース、グリセリ
ン、マルトース、ラクトース、水飴、デキストリン、澱
粉、糖蜜、動植物油等を使用できる。また窒素源として
はビースト、大豆粉、小麦胚芽、コーンステイープリカ
ー、落花生粉、綿実粉、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等が使用でき
る。その他、必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カ
ルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸
及びその他のイオンを生成することが出来る。無機塩類
を添加することも有効である。また菌の発育を助け、4a
−ヒドロキシミルベマイシン類の生産を促進するような
有機物及び無機物を適当に添加することも出来る。

培養法としては好気的条件下での培養法、特に深部タ
ンク培養法が最も適している。培養に適当な温度は、15
〜37℃であるが、多くの場合、26〜30℃付近で培養す
る。4a−ヒドロキシミルベマイシン類の生産は、培地や
培養条件により異なるが、振とう培養、タンク培養とも
５〜10日の間でその培養が最高に達する。

このようにして生産される4a−ヒドロキシミルベマイ
シン類は培養物から抽出、精製することにより採取され
るが、特に以下の方法により効率的に抽出し、精製でき
る。即ち、4a−ヒドロキシミルベマイシン類は大部分が
培養菌体中に生産されるので、培養物は濾過又は遠心分
離によって菌体を分離し、アセトン又はアルコールで抽
出し、抽出液を減圧濃縮して溶剤を除いた後、酢酸エチ
ル、クロロホルムのような転溶性溶剤に転溶させるか、
いきなり培養物又は濃縮液を前述のような転溶性溶剤に
て抽出する。転溶液を濃縮乾燥させると粉末又は油状の
粗製品として回収することができる。

粗精製物質は主として4a−ヒドロキシミルベマイシン
α類の混合物として集められるが併せて多くの目的外物
質も含まれるため、脂溶性物質の精製に通常用いられる
公知の方法、例えばシリカゲル、アルミナ等の担体を用
いたカラムクロマトグラフィーにより分画精製すること
が必要である。このクロマトグラフィーの条件の選択に
より目的とする4a−ヒドロキシミルベマイシンα類を高
収率かつ高純度に回収することができるが、更に純化品
の採取を期待する場合には精製品を順相又は逆相カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーによる分画が有効
である。通常順相系のクロマトグラフィーではα３、α
２、α１の順に溶離され、逆相系のクロマトグラフィー
ではα１、α２、α３の順に分画溶離する。この他にゲ
ル濾過法、吸着剤を用いた分画法、結晶化等の方法の採
用も可能である。

4a−ヒドロキシミルベマイシン類の分析・検出には、
ODS逆相カラムを用い、毎分1mlの75％アセトニトリルを
溶出溶媒に用い、240nmの紫外部吸収値を検出するHPLC
定量法の他、薄層クロマトグラフィーによる分離・定量
の手段が一般的な方法として挙げられる。

物質の同定 化学構造の決定には通常の構造解析手法に従った。即
ち、純化品の理化学的性質、特に紫外線吸収スペクト
ル、赤外線吸収スペクトル、プロトン及びカーボン核磁
気共鳴スペクトルの解析から本物質の構造解析を行なっ
た。その結果本物質は16員マクロライドのミルベマイシ
ン類似物質であり、 マクロライド環部の基本骨格は、ミルベマイシンα系
列に属すること、 スピロ環上の24位にメチル基を、また25位にはメチル
基またはエチル基を有していること、 ４位の炭素にはヒドロキシメチル基をもつこと、 ５位の炭素には水酸基またはメトキシ基をもつこと、 が判り、これら諸データから4a−ヒドロキシミルベマイ
シンα１、α２ならびにα３に該当する物質であること
が判明した。

次いで、4a−ヒドロキシミルベマイシンα１、α２お
よびα３の理化学的性質を以下に記載する。

（１）4a−ヒドロキシミルベマイシンα１ 4a−ヒドロキシミルベマイシンα１は前記一般式
〔Ｉ〕でR1が水酸基、R2がメチル基を示し、下記の理化
学的性質を有する。

物質の色 ：無色 元素分析値:C;68.38％ H; 8.09％ O;23.53％ 分子式 :C₃₁H₄₄O₈ 分子量 :544（EI−MS）、第１図に示す。

融点 :159〜161℃ 紫外線吸収スペクトル：第２図に示す。

赤外線吸収スペクトル：第３図に示す。

核磁気共鳴スペクトル：第４図に示す。

呈色反応 ：シリカゲル薄層上で ヨウ素反応、硫酸反応、2,4−ジニトロフエニルヒド
ラジン反応 ；＋ ニンヒドリン反応、アニスアルデヒド反応、塩化第二
鉄反応 ；− 溶解性 ：水に不溶。メタノール、アセトン、酢
酸エチル、クロロホルム、ヘキサンに可溶。

塩基性、酸性、中性の区分：中性 （２）4a−ヒドロキシミルベマイシンα２ 4a−ヒドロキシミルベマイシンα２は前記一般式
〔Ｉ〕でR1がメトキシ基、R2がメチル基を示し下記の理
化学的性質を有する。

物質の色 ：無色 元素分析値:C;68.82％ H; 8.24％ O;22.94％ 分子式 :C₃₂H₄₆O₈ 分子量 :558（EI−MS）、第５図に示す。

融点 :201〜203℃ 紫外線吸収スペクトル：第６図に示す。

赤外線吸収スペクトル：第７図に示す。

核磁気共鳴スペクトル：第８図に示す。

呈色反応 ：シリカゲル薄層上で ヨウ素反応、硫酸反応、2,4−ジニトロフエニルヒド
ラジン反応 ；＋ ニンヒドリン反応、アニスアルデヒド反応、塩化第二
鉄反応 ；− 溶解性 ：水に不溶。メタノール、アセトン、酢
酸エチル、クロロホルム、ヘキサンに可溶。

塩基性、酸性、中性の区分：中性 （３）4a−ヒドロキシミルベマイシンα３ 4a−ヒドロキシミルベマイシンα３は前記一般式
〔Ｉ〕でR1が水酸基、R2がエチル基を示し下記の理化学
的性質を有する。

物質の色 ：無色 元素分析値:C;68.82％ H; 8.24％ O;22.94％ 分子式 :C₃₂H₄₆O₈ 分子量 :558（EI−MS）、第９図に示す。

融点 :141〜143℃ 紫外線吸収スペクトル：第10図に示す。

赤外線吸収スペクトル：第11図に示す。

核磁気共鳴スペクトル：第12図に示す。

呈色反応 ：シリカゲル薄層上で ヨウ素反応、硫酸反応、2,4−ジニトロフエニルヒド
ラジン反応 ；＋ ニンヒドリン反応、アニスアルデヒド反応、塩化第二
鉄反応 ；− 溶解性 ：水に不溶。メタノール、アセトン、酢
酸エチル、クロロホルム、ヘキサンに可溶。

塩基性、酸性、中性の区分：中性 次に、4a−ヒドロキシミルベマイシンα１、α２なら
びにα３の製造の具体例を実施例として述べるが、本物
質の製造法はこれに限定されるものではない。

実施例 １ KSB−1939株の継代スラントからその１片を、グルコ
ース２％、マルトース１％、乾燥酵母0.5％、燐酸二カ
リウム0.2％の組成からなる培地100mlを入れた500ml三
角フラスコに移し、回転振とう培養機にて、28℃で８日
間種培養を行った。培養物は遠心分離にて固形物を集
め、培養液と当量のメタノールで抽出した。抽出液を高
速液体クロマトグラフィーによる定量分析を行なった結
果、抽出液中濃度として4a−ヒドロキシミルベマイシン
α１は5ppm、同α２は2ppm、同α３はppmがそれぞれ検
出された。

実施例 ２ KSB−1939株のUV変異株であるKSB−1939YO−４株の継
代スラントからその１片を、麦芽エキス1.0％、酵母エ
キス0.4％、グルコース0.4％、脱脂大豆0.2％の組成か
らなる種培養培地100mlを入れた500ml三角フラスコに移
し、振とう培養機にて、28℃で３日間種培養を行った。
次にグルコース３％、酵母エキス0.5％、脱脂大豆0.2
％、燐酸二カリウム0.2％、硫酸マグネシュウム0.05
％、プロナール502（製造：東邦化学工業株式会社）0.0
5％の組成からなる20の生産用培地をジャーファーメ
ンターに入れ、滅菌冷却後、前述の種培養液を接種し、
通気量20／毎分、培養温度28℃、回転数150回転／毎
分の条件にて９日間培養を行った。培養終了後、セライ
トを助剤として吸引濾過を行い、菌体を集めた。湿菌体
を10のメタノールに分散させ、１時間撹拌して抽出を
行った後、濾過により清澄なメタノール液を回収した。
抽出液に水を加えてメタノール濃度を60％になるよう希
釈し、ダイアイオンHP20（製造：三菱化成工業株式会
社）を詰めた内径50mm高さ650mmカラムを通し吸着させ
た後、70％メタノールで洗浄し、100％メタノールで溶
離、回収した。溶離液を濃縮乾固し、少量のメタノール
に加温溶解して放置後、生じる沈殿を集め粗精製品2.3g
を回収した。粗精製品400mgを5mlのアセトニトリルに溶
解し、内径20mm、長さ250mmのODSカラムをセットした分
取用高速液体クロマトグラフィーにその1mlを注入し
た。75％アセトニトリル10ml/毎分を溶出液として流
し、240mm.の紫外部吸収検出器により得られるピークか
ら4a−ヒドロキシミルベマイシンα１、α２、α３の順
に集め、各々の分画液を濃縮乾固することにより4a−ヒ
ドロキシミルベマイシンα１を55mg、同α２を32mg、同
α３を17mgそれぞれ得た。

（発明の効果） 16員マクロライドのC4位に特有の側鎖を持つ物質群の
開発は、更に有効な生理活性を期待できる可能性が高
く、その合成的誘導化にはC4位にヒドロキシメチル基を
もつ物質、即ち4a−ヒドロキシミルベマイシンα類等が
合成原料として極めて重要な役割を果たすものである。
さらに、本合成原料を化学的方法に拠らず、微生物によ
る直接法で生産できる点に特徴がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は4a−ヒドロキシミルベマイシンα１の質量スペ
クトル、第２図は同物質の紫外線吸収スペクトル、第３
図は同物質の赤外線吸収スペクトル、第４図は同物質の
プロトン核磁気共鳴スペクトル、第５図は4a−ヒドロキ
シミルベマイシンα２の質量スペクトル、第６図は同物
質の紫外線吸収スペクトル、第７図は同物質の赤外線吸
収スペクトル、第８図は同物質のプロトン核磁気共鳴ス
ペクトル、第９図は4a−ヒドロキシミルベマイシンα３
の質量スペクトル、第10図は同物質の紫外線吸収スペク
トル、第11図は同物質の赤外線吸収スペクトル、第12図
は同物質のプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 17/00 - 17/18 C07D 493/22 A01N 43/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 （式中、R1は水酸基またはメトキシ基を示し、R2はメチ
   ル基またはエチル基を示す。）にて表される4a−ヒドロ
   キシミルベマイシンα類を製造するにあたり、ストレプ
   トミセス（Streptomyces）属に属する4a−ヒドロキシミ
   ルベマイシン生産歯を培地に培養し、培養物から当該化
   合物を採取することを特徴とする当該化合物の製造法。