JP2844214B2 - 4a―ヒドロキシミルベマイシンα類の製造法 - Google Patents
4a―ヒドロキシミルベマイシンα類の製造法Info
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- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
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Description
側鎖変換物質の合成原料として重要な4a−ヒドロキシミ
ルベマイシンα類の製造法に関するものである。
メクチン類等が殺虫、殺ダニ、殺線虫ならびに駆虫活性
をもつことが知られており、また、それらの化学合成誘
導体も同様な作用を呈することが報告されている。
(ミルベマイシン)の殺ダニ試験ではミルベマイシンC1
ならびにC2の製造にみられる16員マクロライドのC4位に
2−ピロリカルボニルオキシメチル基を持つ物質は類縁
物質の中で最も高い性質を示している。また、特願昭62
−184620号、特願昭62−184621号および特願昭63−2254
3号にて本特許出願人が出願した特異的な生理活性作用
を示すミルベマイシン系16員マクロライド物質の記載に
示したように、16員マクロライドのC4位にアルカノイル
オキシメチル基またはアルケノイルオキシメチル基が連
続した物質は強力な殺虫、殺ダニ活性をもっていること
が明かとなった。
を介しての側鎖をもつ物質には生物活性上注目すべきも
のが多く、化学合成的手法により新たな活性物質を求め
ることは重要な課題と考えられている。そこでC4位側鎖
の化学修飾における中間原料として、4a−ヒドロキシミ
ルベマイシン類を容易に生産する技術の確立が必要であ
る。
酸化することによって得る方法があり、本製造法の発明
当該物質である4a−ヒドロキシミルベマイシンα類は4a
−置換アベルメクチンとしてアベルメクチン類またはミ
ルベマイシン類の4−メチル基の選択的酸化法により製
造されることが知られている。即ち、微生物により生産
されたミルベマイシンα類を選択的化学手段によりヒド
ロキシル体に変える技法がとられている(特開昭58−59
988号公報明細書)。しかしながら、化学的方法をとら
ずに微生物により直接生産させる方法については知られ
ていない。
による直接生産法に関するものである。
化して得られる4a−ヒドロキシメチル体を直接発酵法に
より生産することを意図にその生産菌を各地の土壌から
検索した。その中で、和歌山県新宮市街の土壌から分離
された放線菌KSB−1939株が生産する物質の化学構造を
解析した結果、目的とするC4位がヒドロキシメチル体で
あり、且つそれらの構造が4a−ヒドロキシミルベマイシ
ンα類であることを確認し、さらにその培養方法を確立
することにより本発明の完成に至った。
ロキシミルベマイシンα類を製造するにあたり、ストレ
プトミセス属に属する4a−ヒドロキシミルベマイシン生
産菌を培地に培養し、培養物から当該化合物を採取する
ことを特徴とする当該化合物の製造法に関するものであ
る。
ル基またはエチル基を示す。) 以下さらに具体的に本発明の詳細を述べる。
SP)の方法とワックスマン氏の方法により、また、その
記載はISPの例に準じて行なった。
されない。気中菌糸はグルコース・アスパラギン寒天培
地、オートミール寒天培地等で旺盛に着生し、胞子形成
も良好である。気中菌糸は分岐しながら空中に伸長し、
短い主軸または分枝上に胞子鎖を単軸分岐する。胞子鎖
は通常コイル状螺旋を呈する。長期間培養すると、胞子
鎖先端が黒粘質塊化し、更に進んだ部分は、気中菌糸全
体が黒褐色粘質塊化する(グルコース・アスパラギン寒
天培地、オートミール寒天培地)。胞子鎖の幅は0.5な
いし0.8ミクロン、胞子表面はシワ状(Warty)を呈し、
胞子の区切りが不鮮明なため、詳しい個々の胞子の形状
及び連結数は不明であるが、10胞子以上の連結が認めら
れる。また胞子は運動性を示さず、胞子嚢、菌核等は観
察されない。
が認められ、細胞壁タイプI型である。
る。なお、色調の判定は「Color Harmony Manual」(Ta
ylor:1948)に拠った。
D−フラクトース、シユクロース、L−ラムノース、ラ
フイノース、D−マンニトール、L−イノシトールの全
ての炭素源を同化する。
・オブ・システマチック・バクテリオロジー(Internat
ional Journal of Systimatic Bacteriolgy)第22巻、
第307〜311頁(1972年)の記載を参照し同定を行った結
果、KSB−1939株は、シュクロース、ラフイノースの同
化の点で僅かに差を認めるものの、基本性状(形態及び
各種培地での生育状態)がストレプトミセス・ハイグロ
スコピカス(Streptomyces hygroscopicus)とよく一致
することから、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス
KSB−1939と命名した。KSB−1939株は昭和62年6月26
日付で通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第1901号(FERM BP−1901)として寄託されて
いる。尚、KSB−1939株は他の放射菌の場合にみられる
ように、その性状が変化しやすい。例えば、KSB−1939
株又はこの株に由来する突然変異株(自然発生又は誘発
性)、形質融合体又は遺伝子組変え体であっても、KSB
−1939株にその形質起源を依存し4a−ヒドロキシミルベ
マイシン類を生産するものは総て本発明に使用出来る。
たる製造法としている。培養に用いる栄養源としては、
従来放射線菌の培養に利用されている公知のものが使用
できる。例えば、炭素源として、グルコース、グリセリ
ン、マルトース、ラクトース、水飴、デキストリン、澱
粉、糖蜜、動植物油等を使用できる。また窒素源として
はビースト、大豆粉、小麦胚芽、コーンステイープリカ
ー、落花生粉、綿実粉、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等が使用でき
る。その他、必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カ
ルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸
及びその他のイオンを生成することが出来る。無機塩類
を添加することも有効である。また菌の発育を助け、4a
−ヒドロキシミルベマイシン類の生産を促進するような
有機物及び無機物を適当に添加することも出来る。
ンク培養法が最も適している。培養に適当な温度は、15
〜37℃であるが、多くの場合、26〜30℃付近で培養す
る。4a−ヒドロキシミルベマイシン類の生産は、培地や
培養条件により異なるが、振とう培養、タンク培養とも
5〜10日の間でその培養が最高に達する。
シン類は培養物から抽出、精製することにより採取され
るが、特に以下の方法により効率的に抽出し、精製でき
る。即ち、4a−ヒドロキシミルベマイシン類は大部分が
培養菌体中に生産されるので、培養物は濾過又は遠心分
離によって菌体を分離し、アセトン又はアルコールで抽
出し、抽出液を減圧濃縮して溶剤を除いた後、酢酸エチ
ル、クロロホルムのような転溶性溶剤に転溶させるか、
いきなり培養物又は濃縮液を前述のような転溶性溶剤に
て抽出する。転溶液を濃縮乾燥させると粉末又は油状の
粗製品として回収することができる。
α類の混合物として集められるが併せて多くの目的外物
質も含まれるため、脂溶性物質の精製に通常用いられる
公知の方法、例えばシリカゲル、アルミナ等の担体を用
いたカラムクロマトグラフィーにより分画精製すること
が必要である。このクロマトグラフィーの条件の選択に
より目的とする4a−ヒドロキシミルベマイシンα類を高
収率かつ高純度に回収することができるが、更に純化品
の採取を期待する場合には精製品を順相又は逆相カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーによる分画が有効
である。通常順相系のクロマトグラフィーではα3、α
2、α1の順に溶離され、逆相系のクロマトグラフィー
ではα1、α2、α3の順に分画溶離する。この他にゲ
ル濾過法、吸着剤を用いた分画法、結晶化等の方法の採
用も可能である。
ODS逆相カラムを用い、毎分1mlの75%アセトニトリルを
溶出溶媒に用い、240nmの紫外部吸収値を検出するHPLC
定量法の他、薄層クロマトグラフィーによる分離・定量
の手段が一般的な方法として挙げられる。
ち、純化品の理化学的性質、特に紫外線吸収スペクト
ル、赤外線吸収スペクトル、プロトン及びカーボン核磁
気共鳴スペクトルの解析から本物質の構造解析を行なっ
た。その結果本物質は16員マクロライドのミルベマイシ
ン類似物質であり、 マクロライド環部の基本骨格は、ミルベマイシンα系
列に属すること、 スピロ環上の24位にメチル基を、また25位にはメチル
基またはエチル基を有していること、 4位の炭素にはヒドロキシメチル基をもつこと、 5位の炭素には水酸基またはメトキシ基をもつこと、 が判り、これら諸データから4a−ヒドロキシミルベマイ
シンα1、α2ならびにα3に該当する物質であること
が判明した。
よびα3の理化学的性質を以下に記載する。
〔I〕でR1が水酸基、R2がメチル基を示し、下記の理化
学的性質を有する。
ラジン反応 ;+ ニンヒドリン反応、アニスアルデヒド反応、塩化第二
鉄反応 ;− 溶解性 :水に不溶。メタノール、アセトン、酢
酸エチル、クロロホルム、ヘキサンに可溶。
〔I〕でR1がメトキシ基、R2がメチル基を示し下記の理
化学的性質を有する。
ラジン反応 ;+ ニンヒドリン反応、アニスアルデヒド反応、塩化第二
鉄反応 ;− 溶解性 :水に不溶。メタノール、アセトン、酢
酸エチル、クロロホルム、ヘキサンに可溶。
〔I〕でR1が水酸基、R2がエチル基を示し下記の理化学
的性質を有する。
ラジン反応 ;+ ニンヒドリン反応、アニスアルデヒド反応、塩化第二
鉄反応 ;− 溶解性 :水に不溶。メタノール、アセトン、酢
酸エチル、クロロホルム、ヘキサンに可溶。
びにα3の製造の具体例を実施例として述べるが、本物
質の製造法はこれに限定されるものではない。
ース2%、マルトース1%、乾燥酵母0.5%、燐酸二カ
リウム0.2%の組成からなる培地100mlを入れた500ml三
角フラスコに移し、回転振とう培養機にて、28℃で8日
間種培養を行った。培養物は遠心分離にて固形物を集
め、培養液と当量のメタノールで抽出した。抽出液を高
速液体クロマトグラフィーによる定量分析を行なった結
果、抽出液中濃度として4a−ヒドロキシミルベマイシン
α1は5ppm、同α2は2ppm、同α3はppmがそれぞれ検
出された。
代スラントからその1片を、麦芽エキス1.0%、酵母エ
キス0.4%、グルコース0.4%、脱脂大豆0.2%の組成か
らなる種培養培地100mlを入れた500ml三角フラスコに移
し、振とう培養機にて、28℃で3日間種培養を行った。
次にグルコース3%、酵母エキス0.5%、脱脂大豆0.2
%、燐酸二カリウム0.2%、硫酸マグネシュウム0.05
%、プロナール502(製造:東邦化学工業株式会社)0.0
5%の組成からなる20の生産用培地をジャーファーメ
ンターに入れ、滅菌冷却後、前述の種培養液を接種し、
通気量20/毎分、培養温度28℃、回転数150回転/毎
分の条件にて9日間培養を行った。培養終了後、セライ
トを助剤として吸引濾過を行い、菌体を集めた。湿菌体
を10のメタノールに分散させ、1時間撹拌して抽出を
行った後、濾過により清澄なメタノール液を回収した。
抽出液に水を加えてメタノール濃度を60%になるよう希
釈し、ダイアイオンHP20(製造:三菱化成工業株式会
社)を詰めた内径50mm高さ650mmカラムを通し吸着させ
た後、70%メタノールで洗浄し、100%メタノールで溶
離、回収した。溶離液を濃縮乾固し、少量のメタノール
に加温溶解して放置後、生じる沈殿を集め粗精製品2.3g
を回収した。粗精製品400mgを5mlのアセトニトリルに溶
解し、内径20mm、長さ250mmのODSカラムをセットした分
取用高速液体クロマトグラフィーにその1mlを注入し
た。75%アセトニトリル10ml/毎分を溶出液として流
し、240mm.の紫外部吸収検出器により得られるピークか
ら4a−ヒドロキシミルベマイシンα1、α2、α3の順
に集め、各々の分画液を濃縮乾固することにより4a−ヒ
ドロキシミルベマイシンα1を55mg、同α2を32mg、同
α3を17mgそれぞれ得た。
開発は、更に有効な生理活性を期待できる可能性が高
く、その合成的誘導化にはC4位にヒドロキシメチル基を
もつ物質、即ち4a−ヒドロキシミルベマイシンα類等が
合成原料として極めて重要な役割を果たすものである。
さらに、本合成原料を化学的方法に拠らず、微生物によ
る直接法で生産できる点に特徴がある。
クトル、第2図は同物質の紫外線吸収スペクトル、第3
図は同物質の赤外線吸収スペクトル、第4図は同物質の
プロトン核磁気共鳴スペクトル、第5図は4a−ヒドロキ
シミルベマイシンα2の質量スペクトル、第6図は同物
質の紫外線吸収スペクトル、第7図は同物質の赤外線吸
収スペクトル、第8図は同物質のプロトン核磁気共鳴ス
ペクトル、第9図は4a−ヒドロキシミルベマイシンα3
の質量スペクトル、第10図は同物質の紫外線吸収スペク
トル、第11図は同物質の赤外線吸収スペクトル、第12図
は同物質のプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。
Claims (1)
- 【請求項1】式 (式中、R1は水酸基またはメトキシ基を示し、R2はメチ
ル基またはエチル基を示す。)にて表される4a−ヒドロ
キシミルベマイシンα類を製造するにあたり、ストレプ
トミセス(Streptomyces)属に属する4a−ヒドロキシミ
ルベマイシン生産歯を培地に培養し、培養物から当該化
合物を採取することを特徴とする当該化合物の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15030089A JP2844214B2 (ja) | 1989-06-13 | 1989-06-13 | 4a―ヒドロキシミルベマイシンα類の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15030089A JP2844214B2 (ja) | 1989-06-13 | 1989-06-13 | 4a―ヒドロキシミルベマイシンα類の製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0317082A JPH0317082A (ja) | 1991-01-25 |
JP2844214B2 true JP2844214B2 (ja) | 1999-01-06 |
Family
ID=15493993
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP15030089A Expired - Lifetime JP2844214B2 (ja) | 1989-06-13 | 1989-06-13 | 4a―ヒドロキシミルベマイシンα類の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2844214B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5262400A (en) * | 1991-06-20 | 1993-11-16 | Merck & Co., Inc. | 4α-substituted avermectin derivatives |
-
1989
- 1989-06-13 JP JP15030089A patent/JP2844214B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0317082A (ja) | 1991-01-25 |
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