BRPI1013548B1 - método de purificação industrial de ficotoxinas biologicamente ativas - Google Patents

Abstract

método de purificação industrial de ficotoxinas biologicamente ativas esta invenção relaciona-se com um método de purificação industrial de ficotoxinas biologicamente ativas que permite proporcionar uma quantidade adequada de ficotoxinas; se a fonte de ficotoxinas for um pellet, ele é submetido à lise usando métodos apropriados; o material proveniente das lises de cianobactérias é submetido a uma extração a frio; obter um concentrado da fase aquosa obtida na etapa anterior ou do meio de cultura da primeira etapa; centrifugar o concentrado para obter um sobrenadante; passar o sobrenadante por uma coluna de terras de diatomáceas e obter um eluído da ficotoxina; o eluído obtido no passo anterior é passado por colunas de carvão ativado; o eluído da etapa anterior novamente é passado por uma coluna de terras de diatomáceas; o eluído da etapa anterior é colocado em fase aquosa; o extrato parcialmente purificado da etapa anterior é submetido à hplc preparado em vários passos, obtendo a ficotoxina biologicamente ativa pura.

Description

MÉTODO DE PURIFICAÇÃO INDUSTRIAL DE FICOTOXINAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS

CAMPO DE APLICAÇÃO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com a produção industrial, em grandes quantidades, sob condições controladas e em forma contínua das ficotoxinas paralisantes: neosaxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxina - gonyaulatoxinas 2 e gonyaulatoxinas 3 - a partir de cianobactérias produtoras de ficotoxinas paralisantes e particularmente com a publicação de tais ficotoxinas. Com o objetivo central de obter um composto totalmente puro e que mantenha sua poderosa atividade biológica até o final, onde é utilizado como matéria prima para o desenvolvimento de um novo fármaco.

Estas ficotoxinas têm aplicação em produtos cosméticos ou farmacêuticos como, por exemplo: em produtos cosméticos para combater as rugas e linhas de expressão ou em produtos farmacêuticos de aplicação clínica tais como anestésicos locais, medicamentos para o controle de patologias associadas à hiper-atividade muscular, para o controle da dor local e periférica, ou seja, produtos para melhorar a qualidade de vida.

DESECRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA

As ficotoxinas neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas são componentes ativos produzidos por florescimentos de algas nocivas, dos gêneros Alexandrium sp., Piridinium sp., e Gimnodinium sp. , (Lagos, N (1998) Microalgal blooms: A global issue with negative impact in Chile. Biol. Res. 31:375-386). Nos últimos 15 anos tem sido demonstrado que além de serem produzidas pelos

2/33 dinoflagelados no mar, estas ficotoxinas também podem ser produzidas por cianobactérias de água doce, tais como as algas verde-azuis fotossintéticas.

Até o presente momento, na literatura, têm sido identificados somente quatro gêneros de cianobactérias produtoras de ficotoxinas paralisantes, cada uma delas com composição diferente, tanto em quantidade como em tipos de ficotoxinas produzidas, ou seja, com diferentes perfis de ficotoxinas paralisantes (Lagos, N. , Onodera, H., Zagatto, P.A., Andrinolo, D., Azevedo, S.M.F.Q., e Oshima, Y., 1999, The first evidence of paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Cylindropermopsis raciborskii, isolated from Brazil. TOXICON, 37:1359 - 1373, Pereira, P., Onodera, H., Andrinolo, D., Franca, S., Araújo, F., Lagos, N., and Oshima, Y., 2000, Paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacteria Aphanizomenon flos-aquae, isolated from Montargil reservoir, Portugal, TOXICON, 38:1689 1702.

princípio ativo destas ficotoxinas paralisantes atua como bloqueador específico dos canais de sódio voltagem dependente, que são encontradas nas células excitáveis (Kao, C.Y., 1966, Tetrodotoxin, saxitoxin and their significance in the study of excitation phenomenon. Pharm. Ver. 18:997-1049) Devido à inibição dos canais de sódio, é bloqueado a transmissão do impulso nervoso e desta forma se impede a liberação de neuro-transmissores em nível de placa neuro-motora, o que impede então a contração muscular. Devido a estes efeitos fisiológicos, estes compostos são potencialmente úteis farmacologicamente ao usá-los como inibidores da atividade muscular em patologias associadas à hiperatividade muscular, como são os espasmos musculares e

3/33 distonias focais, quando aplicada em forma injetável e localmente. Somando-se a isso, devido ao fato de que é gerado um bloqueio em nível de transmissão do impulso nervoso, quando aplicado como uma infiltração local, estes não somente bloqueiam as vias eferentes de neurotransmissão, mas também bloqueiam as vias aferentes e por onde produzem também a inibição das vias sensoriais, gerando um efeito anestésico, ambos os efeitos inseparáveis quando injetados localmente, sendo este um efeito surpreendente, pois ambos se dão simultaneamente (Patente US 4.001.413).

As ficotoxinas neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas, na atualidade não são encontradas disponíveis comercialmente com uma produção em escala, apesar de suas grandes aplicações com fins terapêuticos e cosméticos. É evidente que se faz necessário um procedimento industrial de produção destes compostos, para satisfazer sua crescente demanda relacionada com sua grande quantidade de uso e aplicações clínicas e cosméticas recentemente desenvolvidas.

A invenção aqui apresentada corresponde à extração, fracionamento e purificação das ficotoxinas paralisantes neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas, partindo com um processo inovador de culturas celulares contínuas, em condições controladas e em grandes quantidades a partir de cepas de cianobactérias (algas verde-azuis). Tendo como objetivo central a manutenção da poderosa atividade biológica deste princípio ativo durante todo o processo industrial de purificação.

As cianobactérias produtoras de ficotoxinas

4/33 paralisantes pertencem aos gêneros: Cylindrospermopsis sp, Microcistis sp, Anabaena sp, Gomphosphaeria sp, Oscillatoria sp, Aphanizomenon sp (Aphanizomenon issatchenkoi, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon gracile), e Lyngbya wollei entre outros. Nenhuma destas cianobactérias tem sido empregada até o presente momento, na produção de ficotoxinas em níveis industriais.

A produção industrial de ficotoxinas a partir de cianobactérias deve resolver dois problemas técnicos, que embora estejam inter-relacionados, são diferentes entre si. Em primeiro lugar deve ser gerada uma grande quantidade de biomassa produtora de ficotoxinas, este problema técnico é resolvido na invenção protegida na solicitação CL 722-2009, também de nossa autoria. Em segundo lugar, uma vez produzida a biomassa e as ficotoxinas, estas últimas devem ser purificadas em determinadas condições, de maneira que seu princípio ativo seja farmacologicamente ativo, mantenha sua poderosa atividade biológica e que seus rendimentos sejam maciços. Este segundo problema técnico é o que é abordado na presente invenção.

O método proposto é a purificação de ficotoxinas a partir de uma cultura clonal de cianobactérias, que produz um perfil simples de ficotoxinas paralisantes (uma ou duas ficotoxinas ou onde uma ficotoxina representa 75% da composição do perfil) . Como, por exemplo: uma cepa que somente produza neo-saxitoxina e saxitoxina ou somente gonyaulatoxinas 2/3, como componentes majoritários. Ter rendimentos acima de 75% de um princípio ativo farmacologicamente é também um efeito surpreendente, o que é obtido neste procedimento industrial que se patenteia.

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A estrutura química destas ficotoxinas tem uma estrutura geral (I) , e sua estrutura particular são definidas pelos radicais Rl a R5, conforme indicado na tabela:

(I)

Composto	Rl	R2	R3	R4	R5
Saxitoxina	H	H	H	COONH2	OH
Neo-saxitoxina	OH	H	H	COONH2	OH
Gonyaulotoxina 1	OH	H	0S0'3	COONH2	OH
Gonyaulotoxina 2	H	H	0S0'3	COONH2	OH
Gonyaulotoxina 3	OH	OSO’3	H	COONH2	OH
Gonyaulotoxina 4	H	0S0'3	H	COONH2	OH
Gonyaulotoxina 5	H	H	H	COONHSO'3	OH

A revelação de que estes alcalóides são produzidos por cianobactérias é muito recente. Somente nos últimos 15 anos foi demonstrado que correspondem a metabolites secundários; os quais são encontrados dentro das células, mas que também sob certas condições, são liberadas ao meio de cultura. Portanto, em uma cultura contínua de cianobactérias, são gerados dois fluentes destes produtos:

o primeiro no pellet celular e o segundo no meio onde são cultivados as cianobactérias.

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Para a produção industrial destas ficotoxinas e para poder purificá-las é indispensável ter uma cultura maciça destas cianobactérias, como a que é protegida pela solicitação CL 722-2009. Antes do processo descrito na solicitação CL 722-2009, o desenvolvimento de processos industriais de alto volume para a obtenção das ficotoxinas não havia sido desenvolvido ainda, contudo estas eram purificadas em laboratórios de pesquisa básica, a partir de mariscos contaminados com maré vermelha, com o objetivo de obter uns poucos micro-gramas destas ficotoxinas como padrões analíticos (padrões para serem usados como material de referência em análises químicas).

Até a presente data não existem publicações de processos de purificação destas ficotoxinas a partir de mariscos contaminados e, tampouco, a partir de dinoflagelados em níveis industriais; neste caso os níveis industriais são considerados em uma ordem de grande escala de produção do metabólito ou ficotoxina. Tampouco foi publicado sobre isolamento de ficotoxinas a partir de cianobactérias, o que não é de se estranhar, sendo as cianobactérias fontes destas ficotoxinas, só recentemente descritas na literatura mundial (Lagos, 2003).

Nesta solicitação de patente é apresentada a purificação e a produção industrial de neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas 2/3, usando um processo biotecnológico inovado a partir de cianobactérias isoladas, clonadas e cuja produção industrial contínua e em condições controladas, permitem a otimização da produção destas ficotoxinas, as quais manifestam sua poderosa atividade biológica durante todo o processo industrial, gerando um

7/33 princípio ativo industrial útil para o desenvolvimento de novos fármacos.

A integração da proposta de produção com as tecnologias a ser empregada, passa pelo escalamento produtivo de cianobactérias anteriormente descrito, que permitem o acesso à produção de ficotoxinas em quantidades necessárias como para usos maciços farmacológicos e o desenvolvimento de novos fármacos ou princípios ativos de uso cosmético.

As vantagens da presente invenção para produzir estas ficotoxinas, através de produção maciça e em condições controladas de cianobactérias são:

• A disponibilidade de clones de cepas de cianobactérias selecionadas e produtoras de ficotoxinas com uma composição única e perfil de toxina simples;

• Processo de fácil purificação das ficotoxinas e com um alto rendimento;

• Relação custo-produção-rendimento muito favorável não obtido até o presente momento.

Campo de aplicação da produção maciça das ficotoxinas: neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxina

O campo de aplicação corresponde ao uso destes alcalóides em clínica, como agentes terapêuticos em patologias associadas à hiperatividade muscular, tais como: os espasmos musculares e distonias focais. Adicionalmente, seu uso como anestésicos locais em diferentes preparados farmacêuticos de amplo espectro, permite definir estas ficotoxinas como produto de grande utilidade no tratamento de diversas patologias, muitas delas de grande demanda comercial. Por outro lado, também podem ser aplicados em

8/33 produtos de natureza cosmética para combater rugas e linhas de expressão, aplicações de evidente demanda comercial. Contudo, estas ficotoxinas não estão disponíveis no mercado em quantidades industriais em nível dos requerimentos atuais, por isso o método de purificação, fracionamento e produção de neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas, resolve um problema bio-tecnológico que permanecia sem solução. A inovação aqui proposta permite satisfazer a grande demanda do mercado nacional e internacional pelo princípio destas ficotoxinas puras, em grande escala, para seu uso terapêutico, cosméticos e de outros produtos que melhorem a qualidade de vida das pessoas.

Estas ficotoxinas apresentam propriedades físicoquímicas muito favoráveis para as aplicações no campo da medicina e da indústria cosmética. Suas propriedades físicas e químicas são as seguintes: solúveis em água, estáveis à temperatura ambiente, altamente resistente nos meio ácidos e a temperaturas extremas (acima de 100 °C), baixíssimo peso molecular (298-445 g/mol), o que permite aplicações mais fáceis, menos perigosas e indolores, sem resposta alérgica e imune, diferentemente de outros compostos, como por exemplo, a proteína de alto peso molecular da toxina botulínica (Botox r).

Devido a estas propriedades físicas e químicas das toxinas, como são: baixo peso molecular e grande estabilidade química é possível realizar aplicações e desenvolvimento bio-tecnológico de muitos produtos e preparados farmacêuticos, como são o uso em cremes, géis, aplicações trans-dérmicas com aparelhos de ultra-som, infravermelhos e outros, adesivos de liberação controlada

9/33 patches (adesivos colados na pele de aplicação lenta e contínua). Tudo isto devido à grande estabilidade destes compostos e a possibilidade adicional de permitir fazer reações químicas com uniões covalentes a outros compostos químicos.

Estas vantagens posicionam as ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas como alternativas superiores à toxina botulínica, composto utilizado amplamente em dermo-cosmética, que é uma protease que tem a desvantagem de ser instável, de alto peso molecular, gerando resposta imune alérgica, que produz dano estrutural (digere o terminal nervoso e os terminais circundantes, produzindo efeitos adversos não desejados e atualmente questionados em nível mundial) e que é digerida por si mesma em períodos curtos de tempo.

As aplicações clínicas recentemente publicadas para as ficotoxinas: neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas, estão abrindo mercado para aplicações de demanda maciça: no âmbito cosmético, dores nas costas, enxaquecas, fissura anal, controle da dor em cirurgias laparoscópicas e controle da dor neuropática em geral, com milhões de pacientes potenciais, elevando uma demanda futura incalculável destes compostos.

Na tabela 1, são indicadas as vantagens das ficotoxinas: neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas ao compará-las, por exemplo, contra a toxina botulínica (Botox r) , com a qual produzem uma resposta fisiológica similar, portanto ambas de aplicações similares em terapia clínica e cosmética, embora a ação de cada uma delas seja por mecanismos moleculares muito diferentes.

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TABELA 1: Vantagens das ficotoxinas em relação à toxina botulínica

Propriedades	Botox	Ficotoxinas
Toxina ativa	Botulismo	neoSTX*;STX*;GTX*
Peso molecular	900,000	Faixa de 298 a 450
Estabilidade Química	Instável	Muito Estável
Armazenagem	Congelado	Temperatura ambiente
Mecanismo de ação	Inibidor da liberação de ACH*	Inibidor do impulso nervoso de liberação de qualquer neurotransmissor
Tempo de ativação	5-15 dias	Imediatamente (minutos)
Duração	2-4 meses	Dose-dependente
Aplicação Tópica e outras	Não é possível	Em creme, em géis, em adesivos, iontoforéticamente, ultra-som.

neoSTX: neo-saxitoxina

STX: saxitoxina

GTX: gonyaulatoxina

ACH: acetilcolina

A relativa facilidade na troca dos usuários de Botox r, ao uso de potenciais produto gerados com ficotoxinas (neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas) devido a aplicações indolores, de menor custo e de efeito instantâneo, geram vantagens competitivas das ficotoxinas sobre o Botox r.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

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O objetivo geral da invenção é de extração, purificação e produção industrial de ficotoxinas biologicamente ativas, componentes e metabólitos secundários produzidos por cianobactérias, que tenham grande valor agregado e comercial e que não são encontrados comercialmente disponíveis, em níveis de produção industrial. O surpreendente desta invenção é obter estes compostos biologicamente ativos durante todo o processo industrial sendo este, um processo bio-tecnológico único e surpreendente.

Um objetivo específico da invenção corresponde a um processo de purificação maciça, industrial e de alto rendimento de produção das ficotoxinas: neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas, biologicamente ativas, a partir de níveis praticamente ilimitados de cepas de cianobactérias produzidas em cultivo contínuo e em condições controladas.

Outro objetivo específico da invenção é conseguir um procedimento de purificação de ficotoxinas a partir de pellet úmido e/ou congelados de cianobactérias, eliminando os pigmentos e outros metabólitos secundários principais que acompanham as ficotoxinas no processo de purificação.

Um terceiro objetivo específico da invenção é conseguir um procedimento de purificação das ficotoxinas liberadas no meio a partir do meio de cultura em que se encontram as cianobactérias. Tendo como objetivo central, a purificação bio-tecnológica do princípio ativo, com poderosa atividade demonstrada.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 apresenta um cromatograma correspondente a

12/33 micro-litros de extrato de cianobactérias Aphanizomenon gracille, injetados em cromatografia líquida de alta resolução analítica (HPLC). Detecção realizada por cromatografia líquida de alta resolução analítica com detecção fluorescente em linha. Pico 1, Rt = 2,640 minutos pigmentos de bactérias. Pico 2, Rt = 7980 minutos neosaxitoxina. Pico 3, Rt = 11,970 minutos saxitoxina.

A figura 2 é um cromatograma correspondente a 10 micro-litros de extrato purificado de Aphanizomenon gracille por cromatografia líquida de alta resolução preparativa de separação por tamanho (exclusão por tamanho). Detecção realizada por cromatografia líquida de alta resolução com detecção fluorescente em linha. Pico 1, Rt = 3,067 minutos pigmentos de cianobactérias. Pico 2, Rt = 9,373 minutos neo-saxitoxina. Pico 3, Rt = 12,953 minutos saxitoxina.

A figura 3 apresenta um cromatograma de um padrão analítico que apresenta como componentes principais a neosaxitoxina e saxitoxina, com um pouco de mistura de gonyaulatoxinas (padrão NL2), determinado e quantificado por cromatografia líquida de alta resolução analítica com detenção fluorescente em linha. Primeiro pico, Rt = 3,653 minutos, corresponde a mistura de gonyaulatoxinas; segundo pico 2, Rt = 5,040 minutos, corresponde a neo-saxitoxina; terceiro pico, Rt = 7,440 minutos saxitoxina.

A figura 4 é um cromatograma de neo-saxitoxina purificada a partir de extratos de cianobactérias Aphanizomenon gracille (Rt = 4,933 minutos). Fração eluída de cromatografia líquida de alta resolução preparativa, em colunas de troca iônica com detecção fluorescente em linha.

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A figura 5 apresenta um cromatograma de padrões analíticos para gonyaulatoxinas. Da esquerda para a direita: iço 1: GTX4 (gonyaulatoxina 4); Pico 2, GTX1 (gonyaulatoxina 1); Pico 3 GTX 5 (gonyaulatoxina 5); Pico 4 GTX 3 (gonyaulatoxina 3); Pico 5 GTX2 (gonyaulatoxina 2).

A figura 6 é um cromatograma de amostra de extrato de cepa de cianobactérias C. raciborskii. Primeiro pico Rt = 8,873 minutos, segundo Pico Rt = 10,927 minutos, terceiro pico Rt = 13,260 minutos; quarto pico = 16,647.

A figura 7 é um cromatograma de fração parcialmente purificada por cromatografia líquida de alta resolução preparativa ou separação por tamanho (exclusão por tamanho) de C. raciborskii com presença dominante do epímero GTX 3 e GTX 2 respectivamente.

A figura 8 apresenta um cromatograma da fração final pura do epímero GTX 3 e GTX 2, obtido a partir de cianobactérias em cultura contínua de C. racborskii.

A figura 9 é um gráfico de eluição de uma cromatografia preparativa de separação por tamanho que mostra as frações obtidas e onde é identificada a faixa de frações onde aparecem os diferentes componentes presentes (compostos orgânicos, ficotoxinas e sais).

A figura 10 é um gráfico de eluição de uma cromatografia preparativa de separação por troca aniônica que mostra as frações obtidas e onde é identificada a faixa de frações onde aparecem os diferentes componentes presentes (ficotoxinas e sais).

A figura 11 é um gráfico de eluição de uma cromatografia preparativa de separação por troca catiônica que mostra as frações obtidas e onde é identificada a faixa

14/33 de frações onde aparecem os diferentes componentes presentes (ficotoxinas e sais).

A figura 12 é um gráfico de eluição de uma cromatografia preparativa de separação por tamanho que mostra as frações obtidas e onde é identificada a faixa de frações onde aparecem as ficotoxinas purificadas (saxitoxina, neo-saxitoxina).

RESUMO DA INVENÇÃO

Ê descrita a purificação e a produção industrial das ficotoxinas: neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas, as quais são biologicamente ativas a partir de culturas de cianobactérias produtoras destas ficotoxinas.

As cianobactérias utilizadas podem ser de dois gêneros: Cylindrospermopsis sp, Mocrocistis s, Anabaena sp, Gomphosphaeria sp, Oscillattoria sp, Aphanizomenon sp (Aphanizomenon issatchenkoi, Aphanizomenon fios-aquae, Aphanizomenon gracile).

As cianobactérias são obtidas preferentemente a partir de uma cultura contínua, em condições controladas, maciça, semi-automática, tal como o descrito na solicitação de patente chilena, correspondente ao mesmo solicitante, e apresentada simultaneamente com esta solicitação, CL 7222009.

A purificação industrial das ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas a partir de cianobactérias em cultura contínua, é realizada por um método de extração, fracionamento, partição por solventes, participação em fases sólidas e partição em fases líquidosólidas destas ficotoxinas (neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas) a partir da cultura (pellet) ou o

15/33 sobrenadante da cultura. Processo bio-tecnológico contínuo, sequencial e semi-automático, que gera quantidades industriais de um princípio ativo que mantém sua atividade biológica durante todo o processo de purificação até chegar ao seu produto final. O processo envolve procedimentos químicos e bioquímicos em várias etapas de fracionamento por centrifugação diferencial, extração com solventes aquosos e orgânicos, partição em fase de solventes hidrófobos, partição em fases sólidas, purificação através de colunas e diversos tipos de cromatografia de alta resolução preparativa (troca catiônica, aniônica e separação por tamanho), até obter extratos parcialmente purificados, sem pigmentos, correspondentes a frações de perfis de ficotoxinas simples e, a partir deles, ficotoxinas puras (Figuras 1 a 8) . Todas as etapas de um processo bio-tecnológico único e parte de um projeto industrial somente desenvolvido no Chile.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a um método de purificação de uma produção industrial das ficotoxinas: neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas, que apresenta e mantém sua atividade biológica durante todo o processo industrial de purificação a partir de cianobactérias produtoras destas ficotoxinas.

As cianobactérias produtoras destas ficotoxinas pertencem aos gêneros: Cylindrospermopsis sp, Mocrocistis sp, Anabaena sp, Gomphosphaeria sp, Oscillattoria sp, Aphanizomenon sp (Aphanizomenon issatchenkoi, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon gracile).

O material de partida é uma cultura unialgal de uma

16/33 espécie de cianobactérias; que seja unialgal, é indispensável para a obtenção destas ficotoxinas purificadas com altos rendimentos. Isto corresponde a um processo de crescimento e escalonamento em nível industrial, para obter uma alta quantidade de ficotoxinas no material de partida.

As cianobactérias são obtidas pelo desenvolvimento de um método e procedimento de cultura contínua, em condições controladas, maciça, semi-automãtica e de crescimento logarítmico permanente de cianobactérias, descrito na solicitação de patente chilena correspondente ao mesmo solicitante e apresentada, simultaneamente, com esta solicitação e com número de solicitação de patente Chilena CL 722-2009.

Durante o processo de cultura destas espécies de cianobactérias, as ficotoxinas acumulam-se no interior das células, mas também, são liberadas ao meio de cultivo, tendo, desta maneira, duas fontes de ficotoxinas.

Por exemplo: na cultura de Aphanizomenon gracile, o componente majoritário liberado a partir da cianobactérias é a neo-saxitoxina (Figura 2 e 4).

Portanto, existem duas fontes possíveis de obtenção de ficotoxina a partir de uma cultura industrial de cianobactérias.

• A partir dos sobrenadantes filtrados (sem células e filamentos) do meio de desenvolvimento de cianobactérias;

• A partir dos pellets úmidos obtidos por centrifugação do cultivo em desenvolvimento, que está composto por células e filamentos de cianobactérias.

A obtenção das ficotoxinas de interesse que depende em

17/33 cada caso da cianobactéria produtora cultivada, pode ser obtida para qualquer das cianobactérias mencionadas, tanto a partir do sobrenadante como a partir do pellet obtido.

A produção industrial das ficotoxinas: neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas, a partir de cianobactérias em cultura continua, realiza-se por um método de extração, fracionamento, partição por solventes, participação em fases sólidas e partição em fases líquido-sólidas destas ficotoxinas (neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxina) a partir de células de cultura (pellet) ou o sobrenadante da cultura. O processo envolve procedimentos químicos e bioquímicos em várias etapas de fracionamento por centrifugação diferencial, extração com solventes aquosos e orgânicos, partição em fase de solventes hidrofóbicos, partição em fases sólidas, purificação através de colunas e diversos tipos de cromatografias de alta resolução preparativas (troca catiônica, aniônica e separação por tamanho) , até obter extratos parcialmente purificados, sem pigmentos correspondentes a frações de perfis de ficotoxinas simples e a partir deles, ficotoxinas puras (Figura 1 a 8). O enfoque fundamental está dirigido para a obtenção de um princípio ativo, estável que mantenha todo o seu poder em sua atividade biológica, de tal maneira que este princípio ativo utilizado como base para o desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos.

Em uma forma simplificada, o método de purificação das ficotoxinas da invenção inclui os seguintes passos:

a. Obter um pellet e/ou um sobrenadante de uma cultura de cianobactérias;

b. Se a fonte for um pellet, isolar as cianobactérias

18/33 por meios convenientes de separação de células;

c. Realizar uma extração a frio usando uma mistura de solventes orgânicos em fase aquosa; separar as fases aquosa e orgânica do ponto anterior, sendo a fase aquosa a fase de interesse, já que estas ficotoxinas são solúveis em água;

d. Concentrar a fase aquosa obtida na etapa (c) ou o meio da etapa (a) pelo menos 10 vezes em volume;

e. Centrifugar a fase aquosa concentrada;

f. Passar o sobrenadante por uma matriz sólida de terra diatomácea. As ficotoxinas ficam retidas na coluna de diatomácea e devem ser eluídas com uma solução de eluição;

g. Passar o eluído que contém as ficotoxinas por uma matriz de carvão ativado. Novamente as ficotoxinas ficarão retidas na coluna de carvão ativado e devem ser eluídas com uma solução de eluição;

h. Passar o eluído do passo anterior, que inclui as ficotoxinas, novamente por uma matriz sólida de terra de diatomáceas, lavar e eluir;

i. Evaporar os componentes orgânicos do eluído do ponto anterior, obtendo um extrato de ficotoxinas parcialmente purificado;

j . Submeter o extrato de ficotoxinas parcialmente purificado obtido a um processo bioquímico de separação e fracionamento por HPLC preparativa (HPLC-Prep: cromatografia líquida de alta resolução preparativa) em vários passos, segundo o princípio físico ou químico de fracionamento utilizado, que podem incluir seqüencialmente: separação por tamanho, troca aniônica, troca catiônica e novamente separação por tamanho.

Deste modo obteremos preparados de ficotoxinas puras,

19/33 adequadas para fins farmacêuticos e cosméticos.

O método da presente invenção proporciona, pela primeira vez na técnica, um procedimento para purificar ficotoxinas, tais como a neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas a partir de cianobactérias produtoras destas ficotoxinas.

Este método inclui proporcionar uma quantidade adequada de uma fonte de ficotoxinas como, por exemplo: uma cultura de cianobactérias, o meio de cultura onde crescem as cianobactérias em tal cultura ou um pellet de cianobactérias.

Caso venha de uma cultura de cianobactérias, as células separam-se do meio de cultura, como por exemplo: usando uma etapa de centrifugação. Ê obtido assim uma fase líquida aquosa correspondente ao meio de cultura e um pellet correspondente às cianobactérias. Os pellets de cianobactérias podem ser congelados ou processados diretamente. A etapa de congelamento não afeta a posterior purificação das ficotoxinas: neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas.

Os pellets obtidos são submetidos a lise usando métodos apropriados, conhecidos na técnica, tais como homogeneização, extração por solventes (fase orgânica/fase aquosa), moinho de pedras, ciclos de congelamento/descongelamento, ultra-som, lise enzimática, entre outros.

O material proveniente da lise de cianobactérias é submetido a uma extração a frio usando uma mistura de solventes em fase aquosa (clorofórmio:metanol 1:1 mais ácido acético em uma concentração de lOmM que inclui 50% do

20/33 volume da mistura anterior), posteriormente é realizada uma separação de fases orgânica/aquosa, com uma fase orgânica com pH 5 de clorofórmio:metanol 1:1 em volume que se repete entre 1 e 5 vezes. São recolhidas todas as fases aquosas obtidas nas repetições, constituindo estas uma única fase aquosa com a que é dado o prosseguimento do procedimento.

A fase aquosa obtida ou o sobrenadante do meio de cultura é concentrado usando, por exemplo, um rotor vaporizador, a temperatura ambiente, até alcançar uma concentração entre 5 e 20 vezes o volume original.

concentrado é submetido à centrifugação a velocidades entre 15.000 xg até 25.000 xg por períodos de tempo entre 10 e 40 minutos.

O sobrenadante da centrifugação é passado por uma coluna de terras de diatomáceas, lavando a coluna entre 5 e 15 vezes seu volume com uma solução apropriada como, por exemplo, uma mistura alcoólica de extração, etanol:água:ácido acético 5 mM na proporção de 2:1:1 (vol/vol/vol).

O eluído obtido no passo anterior é passado por colunas de carvão ativado, lavam-se as colunas com água destilada para eliminar pigmento e impurezas retidas. Nas colunas ficam as ficotoxinas que são eluídas com uma solução apropriada como, por exemplo, ema mistura alcoólica de eluição etanol:água:ácido acético 1 mM na proporção de 3:2:1 (vol/vol/vol) com pH 5.

O eluído, da etapa anterior, novamente é passado por uma coluna de terras de diatomáceas. As colunas são lavadas com uma solução apropriada usando um volume equivalente a 10 vezes o volume da matriz de ácido 50mM e são eluídas as

21/33 ficotoxinas com uma solução apropriada como, por exemplo, por extração por solvente com uma mistura alcoólica apropriada com pH 5, por exemplo, de clorofórmio/metanol/água; 1:1:1 (vol/vol/vol).

O eluído da etapa anterior é deixado em fase aquosa, evaporando os solventes orgânicos, usando, por exemplo: um equipamento speed vac (Savant, NY,USA). Ê obtido um extrato de ficotoxina parcialmente purificado.

O extrato parcialmente purificado da etapa anterior é submetido a HPLC preparativa (cromatografia líquida de alta resolução preparativa) em vários passos que podem incluir seqüencialmente: separação por tamanho, troca aniônica, troca catiônica e novamente separação por tamanho. A realização de várias cromatografias sucessivas garante uma pureza analítica apta para os requerimentos da indústria farmacêutica. Não obstante, em certos casos, dependendo do grau de pureza requerido, as ficotoxinas podem purificar-se utilizando somente uma etapa de HPLC-Prep.

Deve ficar entendido que os valore mencionados das proporções dos ingredientes de cada solução, concentrações de ingredientes ou valores de pH podem variar em uma faixa de +-5% sem alterar o resultado da invenção.

De uma forma mais detalhada e esquemática, o método de purificação da invenção pode ser definido nos seguintes passos:

a. Proporciona uma quantidade adequada de uma fonte de ficotoxinas, por exemplo, a cultura da cianobactéria pura, de acordo com o descrito na solicitação chilena cultura de cianobactéria produtora de neo-saxitoxina e saxitoxina em escala industrial, do mesmo solicitante e

22/33 apresentado na mesma data da presente solicitação (CL 7222009).

• Separação das células e o meio de cultura mediante centrifugação. São utilizados volumes de 1 L de cultura, obtido de cada reator e centrifugado a 10.000 xg durante 25 minutos, obtendo-se um sobrenadante e um precipitado ou pellet úmido de cianobactéria;

• Etapa opcional de congelamento dos pellets obtidos. Podem ser congelados, para sua posterior purificação, ou se inicia a purificação de imediato.

b. O pellet obtido é submetido à lise com um método preferido de lise de pellet. Este é pesado e agregado ao volume em peso da mistura de solventes orgânicos em fase aquosa (clorofórmio:metanol; 1:1 _ ácido acético lOmM volume 50% da mistura anterior, para destruir a parede celular e membrana plasmática. Isto em meio levemente ácido (pH 5,0). Um pH levemente ácido é um fato importante e único, que permite a estabilidade do princípio ativo.

c. O material proveniente da lise é submetido a uma extração a frio e separação de fases (orgânica/aquosa).

• É repetida a extração da fase orgânica obtida;

• Juntam-se as duas fases aquosas obtidas;

• A fase aquosa é extraída duas vezes com fase orgânica com pH 5.0. Igual volume de mistura clorofórmio:metanol; 1:1 (vol/vol);

d. A fase aquosa assim extraída é concentrada 10 vezes seu volume (é obtido um décimo do volume inicial), utilizando, por exemplo, um rotor vaporizador a temperatura ambiente.

e. 0 concentrado é submetido a uma centrifugação,

23/33 preferentemente a 20.000 x g por 30 minutos;

f. A fase aquosa, sobrenadante da centrifugação. É tratada com matriz sólida de terras de diatomáceas que consiste em fazer passar o sobrenadante obtido através de uma colina de terra de diatomáceas. A coluna é lavada com ácido acético 50 mM em uma quantidade preferentemente 10 vezes o volume da coluna e extraída a ficotoxina requerida na coluna com uma mistura alcoólica de extração ou buffer de eluição (etanol:água:ácido acético 5 mM; 2:1:1 (vol/vol/voç).

g. 0 eluído da coluna, obtido no ponto anterior, é passado agora por colunas de carvão ativado. As colunas são lavadas com água destilada para eliminar pigmentos e impurezas retidos. Nas colunas ficam as ficotoxinas que são eluídas com a mistura alcoólica de eluição (etanol:água:ácido acético 1 mM; 3:2:1 (vol/vol/vol). Este fracionamento elimina grande parte dos pigmentos e moléculas de baixo peso molecular, mais freqüentes do lise de cianobactéria, como são aminoácidos, bases nucleotídicas, peptídeos, açúcares (mono-sacarídeo e dissacarídeo).

h. Novamente é realiza uma eluição diferencial a partir de matrizes sólidas empregando Terras de diatomáceas. Colunas de terras de diatomáceas são carregadas com o extrato eluído de carvão ativado. Aqui novamente ficam as ficotoxinas unidas à matriz sólida por interação do efeito hidrofóbico. Inicialmente estas colunas são lavadas, onde é eluída grande parte dos compostos contaminantes de baixo peso molecular, que correspondem a frações que são eliminadas. As ficotoxinas ficam retidas.

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Posteriormente são eluídas as toxinas a partir da coluna por extração por solvente com uma mistura de clorofórmio/metanol/água; 1:1:1 (vol/vol/vol). O uso de colunas de terras de diatomáceas gera um fracionamento estratifiçado total. Este procedimento maciço e para grandes quantidades, ao ser usado em uma técnica batch, não gera este fracionamento que consegue com as colunas. Também é um efeito surpreendente que, somente o fato de modificar a técnica de Batch, a coluna produz uma grande prépurificação inicial de material maciço e industrial, com a conseqüente redução de custos, além de grande eficiência.

i. 0 eluído da 2 ^o coluna de terra de diatomáceas é deixado em fase aquosa, evaporando os solventes orgânicos, por exemplo, com speed vac (Savante, NY, USA) , Ê obtido um extrato de ficotoxina parcialmente purificado.

j. Este extrato parcialmente purificado é submetido a HPLC preparativo (HPLC-Prep:cromatografia líquida de alta resolução preparativa).

A) Separação por tamanho (HPLC preparativa): para isto é utilizado, por exemplo, colunas de aço inoxidável de alta pressão, cheias com bio-gel p-2 (Bio-rad) Fine 45-90 microns (wet). Estas colunas são de 10 centímetros de diâmetro e 85 centímetros de comprimento, embaladas a pressão com resina seca de bio-gel p-2 e que apresenta um volume de exclusão de 1800 daltons. Esta resina separa, no esvaziamento, qualquer molécula de tamanho maior e que apresente um peso molecular acima de 1800 daltons. Desta maneira saem nas frações iniciais (início da corrida) todas as macro-moléculas e inclusive pequenos peptídeos de 10 aminoácidos, ficando retidos os compostos de menor peso

25/33 molecular como são estas ficotoxinas (298 a 445 daltons). Usando esta resina de separação por tamanho, são eliminados 90% do material orgânico não desejado, incluindo uma grande quantidade de pigmentos próprios destas cianobactérias. Todos estes compostos e as macro-moléculas solúveis saem nas primeiras frações (5 primeiros litros eluídos). As frações intermediárias próximas do final são as que contem as ficotoxinas. Nas frações finais saem grande parte do sal presente nos extratos. 0 uso de resina para separação por tamanho é um conceito inovador, especialmente na forma como é utilizada aqui. As colunas de fracionamento são de desenho próprio desta invenção, não só por seu tamanho, mas também da maneira como são cheias as colunas. Este passo de purificação é transcendental, eficiente e entrega praticamente o princípio ativo parcialmente purificado. Todos os fracionamentos de cromatografia líquida preparativa utilizada daqui por diante, possuem este processo bio-tecnológico inovador de enchimento de coluna com matriz sólida em alta pressão, o que gera superfícies de trocas praticamente ilimitadas e totalmente apropriadas para processos industriais de purificação de princípios ativos maciços. Também, nestes processos de HPLC preparativos, deve ser mencionado: a rapidez do processo, questão fundamental para conseguir um composto puro e, somando-se a isso, biologicamente ativo. A figura 9 mostra um gráfico de eluição de cromatografia preparativa que exemplifica este passo de separação por tamanho. As frações que apresentam as ficotoxinas são concentradas e a seguir é aplicado em um segundo processo de separação que corresponde a uma troca aniônica. A separação por tamanho

26/33 serve também para eliminar a maior quantidade de sais presentes nestes extratos e que não foram totalmente eliminados nos fracionamentos de fases realizados inicialmente neste processo de purificação; Isto é importante, pois estes sais irão intervir nos processos de trocas iônicas. Portanto, nesta separação não somente são eliminadas as macro-moléculas e moléculas de peso molecular acima de 1800 daltons, mas que também o maior percentual do conteúdo de sais de baixo peso molecular (sódio 23, cloretos 35, etc...).

B) Troca aniônica: De maneira similar a como foram realizadas as colunas preparativas, usando resina útil para separar por tamanho, são montadas colunas iguais, porém agora utilizando resina de troca aniônica. Aqui foi usado cellex-d (Bio-rad), com uma capacidade de troca de 0,56 miliequivalentes por grama. Nesta cromatografia preparativa, as ficotoxinas que têm carga líquida positiva (+2 e +1) em pH neutro, eluem nas primeiras frações (2,5 litros iniciais) , pois não são retidas na coluna por ter carga positiva. Portanto, eluem no esvaziamento. Nestas colunas, somente são retidos os compostos que apresentam carga negativa, os quais ficam presos na coluna e são eluídos ao final da cromatografia, em frações que não tem ficotoxinas e que por onde, são eliminadas. A fração inicial que contém o total de ficotoxina é novamente concentrada (liofilizador industrial) e é aplicado agora em colunas preparativas para troca catiônica. Esta fração é praticamente pura em ficotoxina com carga líquida +2 (neosaxitoxina e saxitoxina) e carga líquida +1 (gonyaulatoxinas).

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C) Troca catiônica: Nesta cromatografia preparativa (colunas igualmente espaçadas às anteriores, cheias com bio-rex r 70 de Bio-rad), ficarão retidas as ficotoxinas, as quais são separadas em dois grandes grupos: a com carga líquida +2 e as com carga líquida +1. Será eliminada nas frações iniciais o pouco de sais minerais com carga negativa (medidas por condutividade elétrica) e a seguir são eluídas as gonyaulatoxinas, para finalmente eluir a saxitoxina e a neo-saxitoxina. Estas últimas duas ficotoxinas separadas é mantida uma fração que contém uma mistura das duas ficotoxinas com uma proporção de 2/3 de neo-saxitoxina e 1/3 de saxitoxina. A fração final e última a eluir, praticamente só contém neo-saxitoxina pura.

D) Por último, várias frações finais de trocas catiônicas concentradas, são separadas novamente nas colunas de resina de separação por tamanho bio-gel p-2 (processo idêntico ao processo descrito em A)), para eliminar os restos de sal e obter neo-saxitoxina pura eluída em água destilada.

Deve ficar entendido que os valores mencionados das proporções dos ingredientes de cada solução, concentração de ingredientes ou valore de pH podem variar em uma faixa de +- 5% sem alterar o resultado da invenção.

As ficotoxinas suscetíveis de serem purificadas com o método anteriormente descrito correspondem a neosaxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas. A obtenção de uma toxina em particular dependerá da cepa de cianobactéria a partir da qual é realizada a purificação, devido a que certas cepas produzem preferentemente um tipo de ficotoxina em particular. Como critério de separação e fracionamento,

28/33 são considerados os tempos de retenção característicos do composto de interesse (ficotoxinas) como é apresentado a seguir, nos exemplos da presente solicitação.

A pureza de cada stock (lote) pode ser determinada por espectroscopia visível e ultravioleta, além de espectroscopia de massa. A detenção e quantificação final podem ser realizadas por espectrofluorometria. Este último método analítico de detenção quantitativa é específico para todas as ficotoxinas, como neo-saxitoxina, saxitoxina e gonyaulatoxinas (Lagos, 1998. Microalgal blooms: a global issue with negative impact in Chile. Biol. Res. 31:375386) .

EXEMPLOS

Exemplo 1: ficotoxinas obtidas e purificadas a partir de Aphanizomenon gracile mantida em cultura contínua e em condições controladas.

Como indicado, a cultura de Aphanizomenon gracile com urn clone selecionado e único, a ficotoxina majoritariamente produzida é a neo-saxitoxina. Neste caso particular, este clone também produz uma quantidade menor de saxitoxina.

A produção de neo-saxitoxina a partir de cianobactérias de Aphanizomenon gracile foi realizada a partir de uma quantidade inicial de 10 miligramas de pellet de células úmidas de Aphanizomenon gracile. O pellet obtido (etapa a.) foi submetido ao método descrito na memória descritiva, a saber:

b. para os 10 mg de pellet foi agregado 10 mL, mesmo volume em peso da mistura de solventes orgânicos em fase aquosa (clorofórmio:metanos; 1:1 + ácido acético 10 mM volume 50% da mistura anterior) para destruir a parede

29/33 celular e membrana plasmática. Isto em meio levemente ácido (pH 5.0);

c. As células lisadas da etapa b. são submetidas a uma extração a frio e separação de fases (orgânica/aquosa);

d. A fase aquosa extraída segundo a letra c., é concentrada 10 vezes seu volume (é obtido um décimo do volume inicial), utilizando, por exemplo, um rotor vaporizador a temperatura ambiente.

e. O concentrado é submetido a centrifugação a 20.000 x g por 30 minutos.

f. 0 sobrenadante da centrifugação, 2 mL, é passado através de uma coluna de terra de diatomáceas. Esta coluna é lavada com 10 vezes seu volume. Neste caso 20 ml com ácido acético 50 mM. Depois de lavado, é extraído a neosaxitoxina retida na coluna com uma mistura alcoólica de extração (Etanol:Água:Ácido acético 5 mM; 2:1:1 (vol/vol/vol)., 5 mL;

g. O eluído da coluna, obtido na letra f, é passado por colunas de carvão ativado. As colunas são lavadas com água destilada para eliminar pigmentos e impurezas retidas. Nas colunas ficam as ficotoxinas que são eluídas com uma mistura alcoólica de eluição (etanol:água:ac. Acético 1 mM; 3:2:1 (vol/vol/vol) pH 5 em 10 mL;

h. O eluído é passado por uma coluna de terra de diatomáceas, lavado com ácido acético 50 mM. Posteriormente, a toxina é eluída a desde a coluna com uma mistura de clorofórmio/metanol/água; 1:1:1 (vol/vol/vol), 5 mL;

i. O eluído da segunda coluna de terra de diatomáceas é deixada em fase aquosa, evaporando os solventes orgânicos

30/33 com speed vac (Savant, NY, USA) . É obtido um extrato de neo-saxitoxina parcialmente purificado.

j. O extrato parcialmente purificado é submetido a HPLC preparativo) cromatografia líquida de alta resolução preparativa), separação por tamanho.

Cada reator, após dois dias de cultura produz, em média, em torno de 652,4 micro-gramas de toxina total por cada litro coletado. A razão média entre neosaxitoxina/ saxittoxina é de 8,47. Em porcentagens, é obtida uma média aproximada de 11,8 % de saxitoxina e 88,2 % de neo-saxitoxina. Sendo evidentemente a produção de neosaxitoxina, que é a que se busca, é realçada e protegida, por ser este composto o princípio ativo a ser patenteado nas aplicações clínicas como fármaco ou como cosmético. A neo-saxitoxina é 25% mais poderosa em seu efeito biológico que a saxitoxina e também é a ficotoxina mais poderosa de todas as descritas até o presente momento.

As figuras 1, 2 e 4 mostra cromatograma de corridas de HPLC detectadas com fluorescência em linha, que descreve um perfil de ficotoxinas produzidas pela espécie Aphanizomenon gracile. Nas figuras 1 e 2, descrevemos perfis HPLC de frações em diferentes graus de purificação de extratos de Aphanizomenon gracile. Novamente, é importante recordar que estes são cromatograma de cromatografias líquidas de alta resolução analítica, que são executadas para detectar e quantificar as ficotoxinas. Não são os cromatograma preparativos do processo industrial. No fundo, estes cromatograma somente servem para mostrar o grau de pureza de cada fração purificada.

Na figura 1 é apresentado um cromatograma de um

31/33 extrato não purificado de Aphanizomenon gracile, para ser quantificado e conhecer o perfil de ficotoxinas presentes neste extrato original. 0 cromatograma apresenta um perfil simples com quantidades majoritárias de neo-saxitoxina e menor quantidade de saxitoxina (menos que 13%).

Na figura 2 é observada a purificação de 10 microlitros de extrato de Aphanizomenon gracile em cultura contínua e sob condições controladas, purificada parcialmente por cromatografia líquida de alta resolução preparativa de separação por tamanho (exclusão por tamanho). Neste extrato purificado parcialmente já se apresenta um pico a Rt = 9,373 minutos que satura o cromatograma e corresponde a neo-saxitoxina, indicando grande quantidade de neo-saxitoxina nesta fração.

Na figura 4, é observada a neò-saxitoxina purificada a partir de extratos de cianobactérias Aphanizomenon gracile (Rt = 4,933 minutos), que são obtidas na fração evasão de HLC em colunas de troca iônica que corresponde à última etapa de purificação (etapa final do método anteriormente descrito) . Ê obtido um só pico que corresponde a um só componente que neste caso é neo-saxitoxina pura.

TABELA 2: Produção de neo-saxitoxina e saxitoxina em função do número de filamentos e pellet peso úmido de Aphanizomenon gracile.

neoSTX mM	STX mM	neoSTX ugr/ml	STX ugr/ml	neoSTX pgr/fil.	STX pgr/fil	Ciano fil/ml*
8,98	3,50	2,83	1,05	2,42	0,90	1.170.000,00
13,66	4,91	4,30	1,47	3,44	1,18	1.250.000,00
3,42	1,03	1,08	0,31	1,71	0,49	630.000,00
17,82	4,78	5,61	1,43	9,42	2,41	596.000,00

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17,81	4,02	5,61	1,21	13,17	2,83	426.000,00
7,66	1,47	2,41	0,44	4,94	0,91	488.000,00
10,87	2,19	3,42	0,66	10,25	1,97	334.000,00
10,52	2,07	3,31	0,62	4,38	0,82	756.000,00
10,77	1,96	3,39	0,49	7,47	1,30	454.000,00
17,24	2,99	5,43	0,90	13,12	2,16	414.000,00
5,31	0,41	1,67	0,12	5,19	0,38	322.000,00
12,26	2,17	3,86	0,65	9,47	1,59	408.000,00
9,84	1,94	3,10	0,58	17,42	3,27	178.000,00

STX: saxitoxina neoSTX: neo-saxitoxina

Ciano fil: filamentos de cianobactérias * Os filamentos de cianobactérias correspondem a associações de 20 a 100 células de cianobactérias. Estas cianobactérias formam filamentos em solução e estas são os que são contados usando microscópio de fase invertida.

Os rendimentos obtidos correspondem a uma produção surpreendente de ficotoxinas puras (neo-saxitoxina e saxitoxina) por miligrama de cianobactéria úmida, quando comparada à produção de filamentos e pellet de cianobactérias postas em cultura em condições habituais e descritas até o presente momento; em frascos pequenos de cultura, sem micro-aeração contínua e com ciclos luz:dia e sem luz:noite.

No exemplo aqui descrito, as cianobactérias estão sempre em crescimento logarítmico, com luz permanente nas 24 horas e coletando permanentemente as cianobactérias, induzindo um permanente crescimento, mediante o aporte de nutrientes novos em volumes equivalentes ao volume coletado em cada troca.

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Exemplo 2: ficotoxinas obtidas e purificadas a partir de cylindrospermopsis raciborskii mantida em cultura contínua e em condições controladas.

Foi cultivada a cianobactéria Cylindrospermopsis raciborskii de acordo com o método de cultura contínua, em condições controladas, maciça, semi-automática e de crescimento logarítmico permanente, descrito na solicitação de patente chilena correspondente ao mesmo autor e apresentada simultaneamente com esta solicitação.

extrato da cepa Cylindrospermopsis raciborskii não purificado apresenta um perfil cromatografico de acordo com a figura 6. C. Raciborskii apresenta um perfil de toxina onde predominam GTX 3 e GTX 2 com os maiores tempos de retenção na coluna (os dois últimos picos à direita respectivamente)

O extrato de C. Raciborskii obtido da cultura contínua foi submetido ao processo de purificação correspondente às etapas jã assinaladas nas mesmas condições que no exemplo In e já na etapa de HLC preparativa por separação por tamanho, é obtido quase que exclusivamente os efímeros GTX3 e GTX2 de gonyaulatoxinas, como é mostrado na figura 7.

A fração final do método de purificação de ficotoxinas a partir de C. raciborskii tem somente GTX3 e GTX2 como é mostrado na figura 8 e podem desta maneira coletar as frações correspondentes a cada gonyaulatoxina para obter frações puras e em grandes quantidades de GTX3 e GTX2.

Claims (6)

1. Método de purificação industrial de ficotoxinas biologicamente ativas do grupo composto pelas neosaxitoxinas, saxitoxina e gonyaulatoxinas de cianobactérias CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:

a. proporcionar como uma fonte de ficotoxinas, nomeadamente uma cultura de um clone de cianobactérias, que é separada em um meio de cultura e um pellet celular úmido de cianobactérias ou um pellet celular congelado de cianobactérias;

b. o referido pellet ser lisado usando homogeneização, extração por solventes, moinho de pedras, ciclos de congelamento/descongelamento, ultra-som, ou lise enzimática;

c. o material proveniente da lise de células de cianobactérias obtido na etapa b) é submetido a uma extração a frio e separação de fases orgânica/aquosa, nomeadamente 50% em volume de uma mistura clorofórmio:metanol 1:1 e 50% em volume de ácido acético 1 mM, a um pH entre 4 e 5, e subsequentemente separar as fases orgânicas e aquosas usando clorofórmio:metanol 1:1 em

volume, o que é repetido entre 1 e 5 vezes; d. obter um concentrado da fase aquosa obtida na etapa (c) ; e. centrifugar o concentrado obtido na etapa d) para obter um sobrenadante; f. passar o sobrenadante por uma coluna de terras de

diatomáceas, e lavar a coluna com uma solução de lavagem; a seguir obter um eluído da ficotoxina com uma solução de eluição;

Petição 870190085806, de 02/09/2019, pág. 7/10

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a extração por solventes na etapa (c) é repetida por 3 vezes.

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g. o eluído obtido na etapa anterior é passado por colunas de carvão ativado e as referidas colunas de carvão ativado são então lavadas com água destilada para removar os pigmentos e impurezas retidas; as ficotoxinas são eluídas com uma solução de eluição;

h. o eluído da etapa anterior novamente é passado por uma coluna de terra de diatomáceas; as colunas são lavadas com uma solução como na etapa f) e as ficotoxinas são eluídas com uma solução de extração;

i. o eluído da etapa anterior é deixado em fase aquosa, evaporando os solventes orgânicos, para obter-se um extrato de ficotoxina parcialmente purificado;

j. o extrato parcialmente purificado da etapa anterior é submetido a cromatografia líquida de alta resolução preparativa (HPLC-Prep) em várias etapas para obter-se a ficotoxina biologicamente ativa pura.

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6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as etapas de cromatografia na etapa (j) são sequencialmente, separação por tamanho, troca aniônica, troca catiônica e separação por tamanho.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que nas etapas (f) e (h) a solução de lavagem é ácido acético 50 mM, na etapa (f) a coluna é lavada com 5 a 15 vezes o seu volume e a solução de eluição é uma mistura alcoólica de extração.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que na etapa (g) a solução de eluição é uma mistura alcoólica de eluição.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que na etapa (h) a solução é uma mistura de clorofórmio/metanol/água; 1:1:1 (vol/vol/vol).

Petição 870190085806, de 02/09/2019, pág. 8/10

5 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

6, CARACTERIZADO pelo fato de que as cianobactérias produtoras de ficotoxinas são dos gêneros: Cylindrospermopsis sp, Mycrocistis sp, Anabaena sp, Gomphosphaeria sp, Oscillattoria sp, Aphanizomenon sp e 10 Lyngbya wollei.