CZ305944B6

CZ305944B6 - Izolovaný sinicový kmen Nostoc sp. a izolovaný sinicový kmen Nodularia, sinicový metabolit, způsob přípravy sinicového metabolitu a použití sinicového metabolitu jako léčiva

Info

Publication number: CZ305944B6
Application number: CZ2015-218A
Authority: CZ
Inventors: Pavel Hrouzek; Kateřina Voráčová; Marek Kuzma; Jan Hájek; Petra Urajová; José Cheel Horna; Jan Mareš; Alena Lukešová; Ludmila Voloshko; Alexander Pinevich; Jiří Kopecký; Andreas Villunger
Original assignee: Mikrobiologický Ústav Av Čr V.V.I.; Biologické Centrum Av Čr, V.V.I.; Saint-Petersburg State University
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2016-05-11
Also published as: CZ2015218A3

Abstract

Vynález se týká sinicového metabolitu nocuolinu A izolovaného ze sinicového kmene Nostoc sp. CCAP 1453/38 a/nebo ze sinicového kmene Nodularia sp. CCAP 1452/7 obecného vzorce I, kde molekulová hmotnost sinicového metabolitu je 298,421 g/mol a elementární složení je C.sub.16.n.H.sub.30.n.N.sub.2.n.O.sub.3.n. a centrální heterocyklus sinicového metabolitu je 5,6-dihyro-1,2,3-oxadiazin. Vynález se dále týká způsobu přípravy sinicového metabolitu a jeho použití jako léčiva.

Description

Izolovaný sinicový kmen Nostoc sp. a izolovaný sinicový kmen Nodularia, sinicový metabolit, způsob přípravy sinicového metabolitu a použití sinicového metabolitu jako léčiva

Oblast techniky

Vynález se týká nového izolovaného sinicového kmene Nostoc sp. a nového izolovaného sinicového kmene Nodularia, sinicového metabolitu izolovaného z kmene Nostoc sp. a Nodularia, způsobu izolace tohoto sinicového metabolitu a použití sinicového metabolitu jako léčiva, konkrétně jako induktoru autofagie a apoptózy v rakovinných lidských buňkách.

Dosavadní stav techniky

Apoptóza je jedním z klíčových procesů udržující homeostázi v organismu. Jejím prostřednictvím se organismus zbavuje nefunkčních či poškozených buněk a je též součástí důležitých vývojových procesů. Jejím úkolem je odstranit poškozené buňky tak aby v těle nevznikla jejich degradací zánětlivá reakce. Poruchy v apoptické dráze mohou znamenat vážné poškození organismu, včetně vzniku nádorových onemocnění. Na druhou stranu apoptóza selektivně navozená v rakovinných buňkách je důležitým terapeutickým postupem při léčbě rakoviny. Proto látky způsobující indukci apoptózy v rakovinných buňkách mohou být potenciálními léčivy. Zároveň takovéto látky slouží ke studiu apoptické dráhy uvnitř lidských buněk. Celý proces apoptózy je komplexní kaskádou biochemických dějů vedoucí k fragmentaci jaderné DNA, rozpadu organel, extemalizaci cytoplasmatické membrány a konečnému rozpadu buňky na apoptická tělíska. Ústřední roli v řízení apoptických procesů hrají autokatalytické enzymy kaspázy (zejména pak kaspáza 3 a 7), které štěpí celou řadu enzymů důležitých pro fungování buňky.

Autofagie je proces, jímž se buňka vyrovnává s různými stresovými faktory a slouží k recyklaci energetických zdrojů uvnitř buňky. Tento proces probíhá prostřednictvím specializovaných membránových organel autofagozomů, které vznikají v buňce de novo v průběhu autofagie. Při excesivním průběhu autofagie může dojít až k buněčné smrti.

Sinice jsou producenty celé řady malých organických molekul - metabolitů. V současné době je u sinic známá produkce alkaloidů, laktonů, polyaromatických sloučenin a polyketonů. Skupinou látek nejčastěji se vyskytujících v sinicových extraktech jsou však atypické cyklické a lineární peptidy.

Mezi sinicovými metabolity jsou biologicky aktivní látky působící proti různým organismům. Ze sinic byly v posledních dvou dekádách izolovány látky antibiotické, antivirální, fungicidní, inhibitory celé řady enzymů a v neposlední řadě látky vzájemně reagující s metabolismem lidských buněk (cytotoxiny). Tak zvané cytotoxiny mohou sloužit pro vývoj protinádorových léčiv. V současnosti je známá celá řada sinicových cytotoxinů, avšak prominentní roli z farmaceutického hlediska hrají metabolity indukující v postižených buňkách apoptózu (programovanou smrt). Pouze u několika sinicových metabolitů byla zaznamenána indukce apoptózy ve fyziologicky relevantních koncentracích. Jedná se především o peptidy cryptophycin a dolastatin, u nichž byla prokázána inhibiční aktivita proti buněčným mikrotubulům vedoucí k mitotickému bloku a následné apoptóze. Obě tyto látky byly též zahrnuty do klinického testování jako potenciální protirakovinná léčiva. Velmi málo je zatím známo o schopnosti sinicových metabolitů indukovat autofagii v lidských buňkách. Pouze v jedné vědecké studii byla jednoznačně dokázána indukce autofagie, a to v případě sinicového barviva scytoneminu.

Úkolem vynálezu je nalezení sinicového kmene vhodného pro izolaci sinicového metabolitu pro indukci apoptózy a autofagie v lidských rakovinných buňkách a způsobu jeho přípravy.

- 1 CZ 305944 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je Izolovaný sinicový kmen Nostoc sp. uložený ve sbírce CCAP(Culture Collection of Algae and Protozoa, SAMS Research Services Ltd., Scottish Marine Institute) pod přírůstkovým číslem CCAP 1453/38 produkující sinicový metabolit nocuolin A, l-(4,6-dipentyl5,6-dehydro-2//-l,2,3-oxadiazin-2-yl)-3-hydroxypropan-l-on a izolovaný sinicový kmen Nodularia uložený ve sbírce CCAP pod přírůstkovým číslem CCAP 1452/7 produkující sinicový metabolit nocuolin A, l-(4,6-dipentyl-5,6-dihydro-27/-l,2,3-oxadiazin-2-yl)-3-hydroxypropan-lon.

Předmětem vynálezu také je sinicový metabolit nocuolin A strukturního vzorce I:

ch₃

ch₃ kde molekulová hmotnost sinicového metabolitu je 298,421 g/mol a jeho elementární složení je C16H30N2O3. Centrální heterocyklus sinicového metabolitu je 5,6-dihydro-l,2,3-oxadiazin. Centrální heterocyklus (5,6-dihydro-l,2,3-oxadiazin) sloučeniny nocuolin nebyl doposud znám z přírodních zdrojů.

Předmětem vynálezu také je způsob přípravy sinicového metabolitu nocuolinu A l-(4,6-dipentyl5,6-dihydro-2H-l,2,3-oxadiazin-2-yl)-3-hydroxypropan-l-onu. Podstata vynálezu spočívá vtom, že sinicový metabolit nocuolin A se extrahuje z lyofilizované biomasy sinicového kmene Nostoc sp. CCAP 1453/38 a/nebo z lyofilizované biomasy sinicového kmene Nodularia CCAP 1452/7 v 70% vodném roztoku methanolu. Methanol je ze směsi odstraněn odpařováním a získaný vodný roztok je nanesen na sorbent Cj₈, sorbent je promyt vodou a následně n-hexanem. Obohacený roztok nocuolinu A je získán vymytím sorbentů dichlormethanem. Po odstranění dichlormethanu odpařením je suchý odparek rozpuštěn v metanolu. Získaný roztok se dále frakcionuje v sorbentů pomocí gelové permeační chromatografie (sephadex), následně se frakce obsahující sinicový metabolit nocuolin A purifikuje pomocí protiproudé vytřepávací chromatografie. Nakonec se provádí finální purifikace preparativní kapalinovou chromatografii na reverzní fázi.

Sinicový metabolit nocuolin A se purifikuje na čistotu vyšší než 98 %. V čistém stavu nocuolin A indukuje apoptózu a autofagii v lidských rakovinných liniích in vitro.

Sorbent pro frakcionaci extraktu je C₎₈ a Sephadex LH-20.

Preparativní kolonová kapalinová chromatografie se provádí na reverzní fázi (kolona C|₈) a v druhém kroku na fenylové koloně, čímž je dosažena velmi vysoká čistota sloučeniny nocuolinu A, více než 98 %.

-2CZ 305944 B6

Předmětem vynálezu je i použití sinicového metabolitu nocuolinu A jako léčiva, konkrétně jako induktoru autofagie a apoptózy, zejména u rakovinných buněk.

Vzhledem ke stále vznikajícím rezistencím rakovinných buněk na standardně používaná léčívaje stále větší tlak na vývoj nových chemických látek indukujících apoptózu v rakovinných buňkách. Vzhledem k faktu, že nocuolin A je dosud kompletně neznámou chemickou látkou představuje alternativní léčivo k dosud používaným látkám.

Objasnění výkresů

Vynález bude blíže objasněn pomocí obrázků na výkresech, na nichž znázorňují obr. 1 graf znázorňující zvýšenou aktivitu kaspáz (enzymů účastnících se apoptózy) v rakovinných buňkách HeLa po expozici nocuolinem A a obr. 2 graf znázorňující zvýšení počtu autofagozómů v lidských buňkách po aplikaci nocuolinu A dokazující indukci autofagie v ranných expozičních časech po aplikaci nocuolinu A.

Příklady uskutečnění vynálezu

Rozumí se, že dále popsané konkrétní příklady uskutečnění vynálezu jsou představovány pro ilustraci, nikoli jako omezení příkladů provedení vynálezu n a uvedené případy. Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zjistit za použití rutinního experimentování větší či menší počet ekvivalentů ke specifickým uskutečněním vynálezu, která jsou zde speciálně popsána.

1) Extrakce a frakcionace

13,5 g lyofílizované biomasy sinice Nostoc sp. (CCAP 1453/38) bylo homogenizováno s mořským pískem a následně dvakrát extrahováno v 250 ml 70% methanolu. Získané extrakty byly smíchány a zbaveny methanolu za sníženého tlaku při 30 °C. Výsledný vodný extrakt o objemu 170 ml byl nanesen na Ci₈-SPE kolonku (20 ml, 5 g). Kolonka byla promyta 20 ml vody, nhexanu a následně byl nocuolin A eluován dichlormethanem. Po odpaření rozpouštědla byl pevný zbytek rozpuštěn v 5 ml methanolu. Roztok byl přefiltrován přes PTFE filtr (0,45 pm) a permeován v koloně (29x3) s gelovou náplní Sephadex LH-20. Jako mobilní fáze byl použit methanol při průtoku 0,33ml/minFrakce obsahující nocuolin A byly smíchány a zbaveny rozpouštědla odpařením za sníženého tlaku. Pevný zbytek byl rozpuštěn v systému n-hexan/ethylacetát/methanol/voda (8:2:5:5, v:v:v:v) a podroben separaci pomocí protiproudé vytřepávací chromatografie. Průběh separace byl monitorován UV-Vis detektorem při vlnové délce 250 nm. Frakce byly sbírány ručně podle odezvy detektoru a ty, které obsahovaly nocuolin A (ověřeno za pomoci HPLCHRMS) byly smíchány a zakoncentrovány při 30 °C s použitím rotační vakuové odparky. Takto koncentrovaný roztok byl nanesen na semipreparativní kolonu Reprosil Cjg (250 x 8 mm, 5pm), jako mobilní fáze byl použit systém voda-methanol s následujícím gradientem: 0 až 20 min. 55 až 100 % methanolu, 20 až 25 min. 100 % methanolu, 25 až 27 min. 100 až 55 % methanolu. Látka se eluovala v čase 21 min. Získaná frakce byla zakoncentrována a dále přečištěna na semipreparativní fenylové HPLC koloně (Watrex Reprosil 100 Phenyl, 250 χ 8 mm, 5pm). Jako mobilní fáze byl použit systém voda-methanol s následujícím gradientem: 0 až 15 min 60 až 80 % methanolu, 15 až 20 min 80 % methanolu, 20 až 25 min 80 až 100 % methanolu, 25 až 30 min 100 % methanolu 30 až 35 min 100 až 60 % methanolu. Eluce nocuolinu A byla v čase 17,8 min. Po odpaření rozpouštědla bylo získáno 0,67 mg lehce nažloutlé látky, což odpovídá 98% čistotě a výtěžku přibližně 0,005 %.

-3CZ 305944 B6

2) Indukce apoptózy in vitro

Nocuolin A indukuje apoptózu v lidských rakovinných buňkách HeLa, HepG2 a PATU. Do 96jamkové mikrotitrační destičkou je nanesena suspenze buněk (HeLa, HepG2 a PATU) o koncentraci 5000 až 50 000 v 200 pl patřičného kultivačního média (RPMI či DMEM) a jsou ponechány k přilnutí na dno jamek po dobu 24 h. Poté je k buňkám přidáno 10 μΙ roztoku nocuolinu (5% MeOH v patřičném kultivačním médiu) o koncentraci minimálně 20μΜ, tak aby finální expoziční koncentrace byla větší než 1 μΜ a koncentrace methanolu nepřesáhla 1 %. V takovéto koncentraci nocuoliu A dochází k indukci apoptózy, doprovázené zvýšení hladiny kaspáz (obr. 1) a následné řízené destrukci rakovinné buňky. V prvních hodinách dochází též k tvorbě autofagozómů charakteristických organel pro autofagii (obr. 2).

Průmyslová využitelnost

Izolovaný sinicový kmen Nostoc sp. a izolovaný sinicový kmen Nodularia se používá pro izolaci sinicového metabolitu, sloučeniny nocuolinu A pro indukci autofagie a apoptózy v lidských rakovinných buňkách a proto jej lze využít jako nástroj (biologickou probu) pro studium těchto dějů. Sloučeninu nocuolin A lze využít jako léčivo.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný sinicový kmen Nostoc sp. uložený ve sbírce Culture Collection of Algae and Protozoa, SAMS Research Services Ltd., Scottish Marine Institute pod přírůstkovým číslem CCAP 1453/38 produkující sinicový metabolit nocuolin A, l-(4,6-dipentyl-5,6-dihydro-2/Z-l,2,3oxadiazin-2-yl)-3-hydroxypropan-1 -on.
2. Izolovaný sinicový kmen Nodularia uložený ve sbírce Culture Collection of Algae and Protozoa, SAMS Research Services Ltd., Scottish Marine Institute pod přírůstkovým číslem CCAP 1452/7 produkující sinicový metabolit nocuolin A, l-(4,6-dipentyl-5,6-dihydro-2//-l,2,3oxadiazin-2-yl)-3-hydroxypropan-1 -on.
3. Sinicový metabolit nocuolin A izolovaný ze sinicového kmene Nostoc sp. CCAP 1453/38 podle nároku 1 a/nebo ze sinicového kmene Nodularia sp. CCAP 1452/7 podle nároku 2 obecného vzorce

CH₃

-4CZ 305944 B6 kde molekulová hmotnost sinicového metabolitu je 298,421 g/mol a elementární složení je C16H30N2O3a centrální heterocyklus sinicového metabolitu je 5,6-dihyro-l,2,3-oxadiazin.
4. Způsob přípravy sinicového metabolitu nocuolinu A podle nároku 3, vyznačující se tím, že sinicový metabolit se extrahuje z lyofilizované biomasy sinicového kmene Nostoc sp. CALU 1833 podle nároku 1 a/nebo z lyofilizované biomasy sinicového kmene Nodularia HBU 26 podle nároku 2 v 70% roztoku methanolu, získaný extrakt se frakcionuje v sorbentu, následně se frakce obsahující sinicový metabolit nocuolin A purifikuje protiproudou vytřepávací chromatografií a nakonec se provádí finální purifikace preparativní kolonovou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že sinicový metabolit nocuolin A se purifikuje na čistotu alespoň 98 %.
6. Způsob podle nároků 4a 5, vyznačující se tím, že sorbent je hydroxypropylovaný dextran zesíťovaný epichlorhydrinem o velikosti částic 70 až 103 pm.
7. Způsob podle některého z nároků 4 až 6, vyznačující se tím, že preparativní kapalinová chromatografie se provádí nejprve na reverzní fázi C_]8 a následně na fenylové koloně.
8. Sinicový metabolit nocuolin A podle nároku 3 pro použití jako léčivo.
9. Sinicový metabolit nocuolin A podle nároku 8 pro použití jako induktor autofagie a apoptó- zy, zejména u rakovinných buněk.