CN102875564A

CN102875564A - 具抗肿瘤活性的氮取代鬼臼类衍生物及其制备方法和用途

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Publication number: CN102875564A
Application number: CN2012103743596A
Authority: CN
Inventors: 汤亚杰; 肖黎
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2012-09-29
Filing date: 2012-09-29
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-09-29
Also published as: CN102875564B

Abstract

本发明公开了具抗肿瘤活性的氮取代鬼臼类衍生物及其制备方法和用途。本发明通过氮取代反应将1-(3-氨基丙基)咪唑、苯并咪唑、2-噻吩甲胺或三羟甲基氨基甲烷引入到4′-去甲基表鬼臼毒素活化的C环4位，得到具有良好抗肿瘤活性的式(Ⅴ)所示的氮取代鬼臼类衍生物。本发明氮取代鬼臼类衍生物可通过多途径、多靶点作用于肿瘤细胞，达到更好的抗肿瘤疗效。本发明式(Ⅴ)所示化合物的抗肿瘤活性较4′-去甲基表鬼臼毒素的抗肿瘤活性有显著提高，本发明式(Ⅴ)化合物能制备成抗肿瘤药物应用于抗肿瘤治疗。

Description

具抗肿瘤活性的氮取代鬼臼类衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及鬼臼毒素类衍生物，尤其涉及4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位取代后所得到的氮取代鬼臼类衍生物及其制备方法，本发明还涉及所述氮取代鬼臼类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，属于鬼臼毒素类衍生物的制备及应用领域。

背景技术

鬼臼毒素(Podophyllotoxin)和4′-去甲基表鬼臼毒素(4′-Demethylepipodophyllotoxin)是从鬼臼类植物中（例如：小檗科植物桃儿七、山荷叶、八角莲等）提取得到的具有独特抗肿瘤活性的天然活性先导化合物。但是，鬼臼毒素(Podophyllotoxin)或4′-去甲基表鬼臼毒素均不同程度的存在着抗肿瘤活性较低等缺陷，严重限制了它们在临床上的使用。

发明内容

本发明目的之一提供具有抗肿瘤活性的氮取代鬼臼类衍生物；

本发明目的之二是提供一种制备或纯化所述氮取代鬼臼类衍生物的方法；

本发明目的之三是将所述氮取代鬼臼类衍生物应用于制备成临床用抗肿瘤药物；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

具有抗肿瘤活性的氮取代鬼臼类衍生物，其结构式为式(Ⅴ)所示：

式(Ⅴ)

其中，R₁选自

此外，式（Ⅴ）化合物的酸成盐也当然包括在本发明的保护范围之内，优选的，所述的酸成盐包括盐酸盐或磷酸盐等酸成盐。

苯并咪唑，咪唑，噻吩等是抗肿瘤药物的医药中间体，这些杂环类化合物含有氧、氮、硫这一类活性原子，这些活性原子有可能增强化合物与拓扑异构酶Ⅱ的结合能力，使其更好的作用于拓扑异构酶Ⅱ的活性位点从而使药物的抗肿瘤活性提高。本发明根据药物拼合原理，以这些化合物为母核的衍生物苯并咪唑、咪唑-3-丙烷胺以及噻吩-2-甲胺作为4′-去甲基表鬼臼毒素结构修饰的功能基团。相对于杂环而言，烷烃缺少氧、氮、硫这一类活性原子，不利于化合物与拓扑异构酶Ⅱ的结合，但也不会由于极性过大而与酶的活性位点发生排斥。为比较不同的电负性基团对4′-去甲基表鬼臼毒素活性的影响，本发明还选择了三羟甲基氨基甲烷作为4′-去甲基表鬼臼毒素结构修饰的功能基团，将1-(3-氨基丙基)咪唑、苯并咪唑、2-噻吩甲胺或三羟甲基氨基甲烷引入到4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位，得到本发明式(Ⅴ)所示的化合物。

本发明目的之二是提供一种制备上述式(Ⅴ)化合物的方法，该方法包括以下步骤：通过氮取代反应，将1-(3-氨基丙基)咪唑、苯并咪唑、2-噻吩甲胺或三羟甲基氨基甲烷引入到4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位，即得式(Ⅴ)化合物。

所述的氮取代反应优选在以下条件下进行：（1）将4′-去甲表鬼臼毒素的C环4位活化；（2）将C环4位活化后的4′-去甲表鬼臼毒素溶于有机溶剂中，加入1-(3-氨基丙基)咪唑、苯并咪唑、2-噻吩甲胺或三羟甲基氨基甲烷，搅拌进行氮取代反应。

其中，4′-去甲表鬼臼毒素C环4位的活化方式可以采用对甲基苯环酰氯对4′-去甲表鬼臼毒素C环4位进行活化；更优选的，所述的活化方式包括以下步骤：将4’-去甲基表鬼臼毒素干燥后在氮气保护下，冰浴下边搅拌边滴加对甲基苯磺酰氯再滴加三乙胺；加料完毕后，撤去冰浴，20-25℃反应1-5小时。

步骤（2）中所述的有机溶剂优选为乙腈；

为了达到更好的合成效果，在氮取代反应中，4′-去甲表鬼臼毒素与1-(3-氨基丙基)咪唑、苯并咪唑、2-噻吩甲胺或三羟甲基氨基甲烷的摩尔比优选为1∶3。

步骤（2）所述的搅拌优选为在真空条件下进行搅拌，其搅拌转速优选为50-800转/分钟，更优选为600转/分钟；所述的氮取代反应温度优选为80℃；所述的氮取代反应时间优选为24-48小时，更优选为48小时。

为了达到更好的技术效果，可以将上述反应产物在以下条件下进行初步纯化得到初步纯化的氮取代鬼臼类衍生物产物：

将反应产物旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯提取过滤得滤渣，再用体积比为1：1的二氯甲烷：甲醇复溶，真空干燥，得到初步纯化的氮取代鬼臼类衍生物产物。

本发明还提供了一种将上述初步纯化的硫取代鬼臼类衍生物产物进一步纯化的方法，包括：

(1)待分离纯化样品的制备：将初步纯化的氮取代鬼臼类衍生物产物通过乙酸乙酯溶剂溶解，并用水反复洗涤，收集有机层，真空干燥，备用；

(2)分离纯化：将步骤（1）所制备的样品依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离，即得。

优选的，所述的硅胶柱层析的分离方法包括：(1)硅胶柱层析为正相硅胶柱层析，正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱剂平衡；所述的洗脱剂优选是由体积比为20：1的氯仿和丙酮组成；(2)将样品以洗脱液溶解，进行上样吸附，然后用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；

优选的，所述的凝胶柱层析分离方法包括：（1）凝胶以甲醇浸泡；将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；（2）将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶。

本发明将4′-去甲基表鬼臼毒素与1-(3-氨基丙基)咪唑、苯并咪唑、2-噻吩甲胺或三羟甲基氨基甲烷通过氮取代反应，得到具有良好抗肿瘤活性的式(Ⅴ)化合物，该化合物可通过多途径、多靶点作用于肿瘤细胞，从而达到更好的抗肿瘤疗效。体外BGC823、Hela细胞活性抑制的测试表明，本发明式(Ⅴ)所示化合物的抗肿瘤活性较4′-去甲基表鬼臼毒素的抗肿瘤活性有显著提高。试验结果表明，本发明式(Ⅴ)化合物可制备成抗肿瘤药物，临床应用于抗肿瘤治疗。

本发明的另一目的在于提供一种抗肿瘤的药物组合物，该药物组合物由式(Ⅴ)所示的化合物和药学上可接受的载体配合而成，即：将治疗上有效量的式(Ⅴ)化合物与药学上可接受的载体配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一类适宜的药物制剂。例如，可以是片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂、口服液或无菌胃肠外悬液等液体制剂形式，还可以是大或小容量注射剂、冻干粉针、无菌粉分装等制剂形式。通常该药物组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法，例如经皮给药。

为了达到给药的一致性，本发明药物组合物优选为单剂形式。用于口服给药的单剂形式可以是片剂和胶囊，并可含有常规赋形剂诸如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸镁；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉乙醇酸钠或微晶纤维素，或药学上可接受的湿润剂，诸如十二烷基硫酸钠。

附图说明

图1 4′-去甲基表鬼臼毒素的结构式。

图2 1-(3-氨基丙基)咪唑、苯并咪唑、2-噻吩甲胺、三羟甲基氨基甲烷结构式。

图3 本发明氮取代鬼臼类衍生物的结构式。

图4 本发明氮取代鬼臼类衍生物的通式结构式。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

4′-去甲基表鬼臼毒素：均购自西安和霖生物工程有限公司，纯度为98％。

1-(3-氨基丙基)咪唑、苯并咪唑、2-噻吩甲胺、三羟甲基氨基甲烷：均购自阿拉丁试剂。

预备实施例1 4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位的活化

二氯甲烷的干燥：称取1.5g氢化钙于1000ml圆底四口瓶中，将干净的漏斗放入侧口，倒入500ml二氯甲烷，加入3-4颗玻璃珠防止暴沸，加热调整温度至二氯甲烷呈微沸状态，加回流管回流2-3h后冷凝回收至装有无水氯化钙的试剂瓶中，收集完液体后，向瓶中通入少许氮气，盖上盖子即可，以后每次用完后补充氮气。

称取2克4′-去甲基表鬼臼毒素，45℃真空干燥2小时；氮气保护下，将干燥的4′-去甲基表鬼臼毒素和40ml干燥好的二氯甲烷加入250ml四口瓶中，冰浴冷却至0℃，搅拌下慢慢滴加1.68ml对甲基苯磺酰氯后再缓慢滴加0.84ml三乙胺，加料完毕后，撤去冰浴，25℃反应3小时。反应结束后，用20ml水萃取反应液，取下层有机相，再用饱和食盐水反复萃取三次，取有机相于无水硫酸钠中干燥过夜，取上清旋转蒸干后，加入20ml乙酸乙酯溶解，然后向溶液中缓慢滴加正己烷并不断摇匀至无晶体析出，于4℃过夜，将液体与结晶物分离，所得化合物即为4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位的活化产物。

实施例1 4-N-(1-(3-氨基丙基)咪唑-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素（化合物(1)）的合成和纯化

(1)4-N-(1-(3-氨基丙基)咪唑-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的合成：称取1mol4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位的活化产物（预备实施例1所制备），45℃真空干燥2小时；氮气保护下，将干燥好的乙腈（乙腈的干燥方法同预备实施例1的二氯甲烷的干燥方法）加入四口瓶中，加入干燥好的4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位的活化产物和3mol 1-(3-氨基丙基)咪唑，80℃搅拌反应48小时，将反应液旋干后所得即为4-N-(1-(3-氨基丙基)咪唑-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素粗产品。

(2)分离和纯化4-N-(1-(3-氨基丙基)咪唑-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：

使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统；色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿：丙酮（20：1）系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮（5：1）系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮（5：1）系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-N-(1-(3-氨基丙基)咪唑-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素。

4-N-(1-(3-氨基丙基)咪唑-1)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒：白色粉末：C₂₇H₃₂O₈N₃；508，δ6.761(s，2H)，6.471(s，1H)，6.228(s，2H)，5.936(d，3H,)，4.299(d，1H)，4.236(s，1H)，4.236(d，6H)，3.402(s，1H)，3.192(s，1H)，1.185(s，6H)；¹³C-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ175.101(C-12；C)，152.631(C-7，C-6；C)，148.722(C-3’，C)，147.076(C-5’；C)，139.833(C-4’’，C-5’’；CH)，131.827(C-9；C)，129.340(C-1’，C-4’；C)，127.428(C-10，C)，111.144(C-6’’；CH)，109.875(C-5，C-8；CH)，107.990(C-2’，C-6’；CH)，101.798(-OCH₂O)，67.679(C-11；CH₂)，56.521(3’，5’-OCH₃；CH3)，44.249(C-4)，41.160(C-1；CH)，40.018(C-2，CH)，38.533(C-3；CH)，29.917(C-1”，C-2”，C-3”；CH₂).

实施例2 4-N-(苯并咪唑)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素（化合物(2)）的合成和纯化

(1)4-N-(苯并咪唑)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的合成：称取1mol4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位的活化产物（预备实施例1所制备），45℃真空干燥2小时；氮气保护下，将干燥好的乙腈（干燥方法同预备实施例1的二氯甲烷的干燥方法）加入四口瓶中，加入干燥好的4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位的活化产物和3mol苯并咪唑，80℃搅拌反应48小时；反应结束后将反应液旋干，加入50ml乙酸乙酯溶解后用超声波清洗仪超声5分钟，此时会有不溶物，用滤纸过滤后所得的不溶物即为4-N-(苯并咪唑)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素粗产品。

(2)分离和纯化4-N-(苯并咪唑)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：

使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统；色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿：丙酮（30：1）系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮（10：1）系统作为展开剂，将Rf值0.7的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮（10：1）系统作为展开剂，将Rf值0.7的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-N-(苯并咪唑)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素。

4-N-(苯并咪唑)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：白色粉末，C₂₈H₂₆O₈N₂；¹H NMR(DMSO，300MHz)，518，δ7.740(d，2H)，7.454(d，2H)，6.947(s，1H)，6.524(s，1H)，6.272(s，2H)，6.007(d，2H，)，5.467(d，1H)，4.743(q，1H)，4.584(d，1H)，4.371(m，1H)，4.177(m，1H)，3.449(d，6H)，3.296(s，1H)，2.781(m，1H)，¹³C-NMR(75MHz，DMSO)：δ175.498(C-12；C)，152.469(C-7，C-6；C)，148.877(C-3’，C)，147.119(C-5’；C)，145.502(C-1”，C)，141.010(C-2”，C)，134.722(C-3”，CH)，134.722(C-6”，CH)，131.346(C-9；C)，130.166(C-1’，C-4’；C)，128.542(C-10，C)，126.739(C-4”，C-5”；CH)，110.631(C-5；CH)，110.008(C-8；CH)，108.048(C-2’，C-6’；CH)，101.847(-OCH₂O)，68.442(C-11；CH₂)，56.331(3’，5’-OCH₃；CH₃)，43.899(C-4)，39.922(C-1；CH)，39.786(C-2，CH)，38.971(C-3；CH).

实施例3 4-N-(2-噻吩甲胺)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素（化合物(3)）的合成和纯化

(1)4-N-(2-噻吩甲胺)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的合成：称取1mol4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位的活化产物（预备实施例1所制备），45℃真空干燥2小时；氮气保护下，将干燥好的乙腈（干燥方法同预备实施例1的二氯甲烷的干燥方法）加入四口瓶中，加入干燥好的4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位的活化产物和3mol噻吩-2-甲胺（80℃搅拌反应48小时，将反应液旋干后所得即为粗产品

(2)分离和纯化：

使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统：色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿：丙酮30：1系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮（2：1）系统作为展开剂，将Rf值0.6的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮（2：1）系统作为展开剂，将Rf值0.6的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-N-(2-噻吩甲胺)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素。

4-N-(2-噻吩甲胺)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：白色粉末，C₂₆H₂₇O₈NS，495，¹H NMR(DMSO,300MHz)δ6.95(s，2H)，6.52(s，2H)，6.33(s，3H)，6.00(d，2H，)，5.49(s，1H)，4.47(t，1H)，4.60(d，2H)，4.37(t，1H)，4.21(t，1H)，3.67(s，7H)，3.30(m，1H)，2.81(m，1H)，¹³C NMR(DMSO，75MHz)δ175.54，152.41，147.87，147.10，134.04，131.37，110.61，126.87，106.98，108.09，101.83，68.46，65.55，56.62，39.87，39.73，38.95.

实施例4 4-N-(三羟甲基氨基甲烷)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素（化合物(4)）的合成和纯化

(1)4-N-(三羟甲基氨基甲烷)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的合成：称取1mol4’-去甲基表鬼臼毒素C环4位的活化产物（预备实施例1所制备），45℃真空干燥2小时；氮气保护下，将干燥好的乙腈（干燥方法同预备实施例1的二氯甲烷的干燥方法）加入四口瓶中，加入干燥好的4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位的活化产物和3mol三羟甲基氨基甲烷，80℃搅拌反应48小时，将反应液旋干后所得即为4-N-(三羟甲基氨基甲烷)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素粗产品。

(2)分离和纯化4-N-(三羟甲基氨基甲烷)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：

使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统：色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿：丙酮（20：1）系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮（5：1）系统作为展开剂，将Rf值0.6的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：丙酮（5：1）系统作为展开剂，将Rf值0.6的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-N-(三羟甲基氨基甲烷)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素。

4-N-(三羟甲基氨基甲烷)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：白色粉末；C₂₅H₂₉O₁₀N,503，¹H NMR(CH3Cl，300MHz)，δ7.01(s，1H)，6.57(s，1H)，6.42(s，2H)，6.00(q，2H，)，406.53(d，1H)，4.35(t，1H)，4.27(d，1H)，3.74(s，6H)，.3.32(s，1H)，3.28(m，1H).

试验例1本发明化合物抑制肿瘤细胞的活性试验

一、试验材料

1、供试化合物：实施例1-4所制备的化合物，分别编号为化合物（1）、化合物（2）、化合物（3）、化合物（4）；

2、对照化合物：4′-去甲表鬼臼毒素（DMEP）购自西安和霖生物工程有限公司，纯度98％；依托泊苷(Etoposide)；

3、细胞株：A549细胞株、BGC823细胞株、Hela细胞株以及人正常肝细胞株购自武汉博士得生物科技有限公司；

二、试验方法

将对数生长期的A549细胞株、BGC823细胞株、Hela细胞株以及人正常肝细胞株，1000rpm离心5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至3.5×10⁴个/孔。将细胞以100μL等量接种于96孔培养板中，分成阴性对照组，阳性对照组和6个同浓度同序列的试验组，即：化合物(1)组，化合物(2)组，化合物(3)组，化合物(4)组，4′-去甲表鬼臼毒素组，依托泊苷组；用含有10％小牛血清的培养液（A549细胞株、Hela细胞株以及人正常肝细胞株用DMEM液；BGC823细胞株用RPMI-1640培养液）37℃、5％CO₂及饱和湿度下培养24h后，往96孔板中加入不同浓度的药物1μL(药物用DMSO溶解，使其终浓度分别为500μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.02μg/mL、0.004μg/mL，DMSO的终浓度<0.1％)，每个样品浓度做6个复孔，并设置对照组。置5％C0₂，37℃继续培养48h，每孔加入5mg/ml的MTT10μl，37℃，5％C0₂避光放置4h后吸出培养液。每孔加入100μl DMSO，37℃摇床振荡30min，492nm测吸光度（OD），计算MTT比值＝药物组OD值/阴性对照组OD值。

三、试验结果

试验结果见表1。由表1可知，两个氮取代鬼臼类衍生物化合物（2）和化合物（3）对正常肝细胞细胞的毒性相比4′-去甲基表鬼臼毒素以及目前已做为抗肿瘤药物上市的鬼臼类衍生物依托泊苷而言，其毒性呈明显降低且抗肿瘤活性增加。由表2可知，化合物（1）对A549细胞株的抗肿瘤活性相比4′-去甲基表鬼臼毒素以及鬼臼类衍生物依托泊苷，其抗肿瘤活性有明显提高。化合物（4）对BGC823细胞株的抗肿瘤活性相比4′-去甲基表鬼臼毒素以及鬼臼类衍生物依托泊苷，其抗肿瘤活性有明显提高。

表1氮取代鬼臼类衍生物对正常细胞及Hela的EC₅₀值

表2氮取代鬼臼类衍生物对体外肿瘤株的EC₅₀值

Claims

1.具有抗肿瘤活性的氮取代鬼臼类衍生物或其盐，其特征在于，其结构式为式(Ⅴ)所示：

式(Ⅴ)

其中，R₁选自

2.一种制备权利要求1所述氮取代鬼臼类衍生物或其盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：通过氮取代反应，将1-(3-氨基丙基)咪唑、苯并咪唑、2-噻吩甲胺或三羟甲基氨基甲烷引入到4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位，得到氮取代鬼臼类衍生物粗产物。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的氮取代反应包括：（1）将4′-去甲表鬼臼毒素的C环4位活化；（2）将C环4位活化后的4′-去甲表鬼臼毒素溶于有机溶剂中，加入1-(3-氨基丙基)咪唑、苯并咪唑、2-噻吩甲胺或三羟甲基氨基甲烷，搅拌进行氮取代反应。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：4′-去甲表鬼臼毒素C环4位的活化方式是用对甲基苯环酰氯对4′-去甲表鬼臼毒素C环4位进行活化；优选的，所述的活化方式包括以下步骤：将4′-去甲基表鬼臼毒素干燥，在氮气保护下，冰浴下边搅拌边滴加对甲基苯磺酰氯再滴加三乙胺；加料完毕后，撤去冰浴，20-25℃反应2-3小时。

5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的有机溶剂优选为乙腈；所述的搅拌为在真空条件下进行搅拌，其搅拌转速为50-800转/分钟，优选为600转/分钟；所述的氮取代反应温度为80℃；所述的氮取代反应时间为24-48小时。

6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：在氮取代反应中，4′-去甲表鬼臼毒素与1-(3-氨基丙基)咪唑、苯并咪唑、2-噻吩甲胺或三羟甲基氨基甲烷的摩尔比为1∶3。

7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括：(1)将氮取代鬼臼类衍生物粗产物旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯提取过滤得滤渣，再用体积比为1：1的二氯甲烷：甲醇复溶，真空干燥，得到待分离纯化样品；

(2)将待分离纯化样品依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离，即得式(Ⅴ)化合物的纯品。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的硅胶柱层析的分离方法包括：(1)硅胶柱层析为正相硅胶柱层析，正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱剂平衡；所述的洗脱剂优选是由体积比为20：1的氯仿和丙酮组成；(2)将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，进行上样吸附，然后进行梯度洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶。

所述的凝胶柱层析分离方法包括：(1)以石油醚：氯仿：甲醇=5∶5∶1为洗脱剂，凝胶以洗脱剂浸泡，装柱，以洗脱剂平衡；(2)将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于以上洗脱剂中，进行上样吸附，洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶。

9.权利要求1所述氮取代鬼臼类衍生物或其盐在制备抗肿瘤药物中的用途。

10.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于：包括有效量的权利要求1所述的氮取代鬼臼类衍生物或其盐和药学上可接受的载体。