CN110294764B - 一种偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物，其结构式如下式所示
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE002

Description

一种偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种鬼臼毒素衍生物，尤其涉及一种偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物及其制备方法，属于药物合成技术领域。
背景技术
鬼臼毒素是从足叶草及八角莲的根茎中分离得到的具有优异抗肿瘤活性的木脂素类化合物，以鬼臼毒素为母体通过结构改造得到的衍生物依托泊苷和替尼泊苷在临床已被广泛应用于包括小细胞肺癌、睾丸癌、淋巴癌、卡波西肉瘤等癌症的治疗。然而，由于具有水溶性差和易产生多药耐药性的问题，依托泊苷和替尼泊苷的临床治疗效果受到很大限制。为了改善这一状况，研究人员合成了大量的鬼臼毒素衍生物，以期能够发现治疗效果更优的鬼臼毒素类衍生物。GL-331是一种鬼臼毒素4β-芳基胺修饰的衍生物（结构见图1），其具有优异的DNA拓扑异构酶ΙΙ的抑制活性，活性为同类上市药物依托泊苷的5倍。类似于鬼臼毒素上市药物和其它衍生物，如何在保持GL-331高抗肿瘤活性基础上有效提高GL-331水溶性、增加其靶向性对于其最终成药意义重大 (K. H. Lee, et al. J. Med. Chem.,1991, 34, 3346-3350; K. H. Lee, et al. J. Med. Chem., 1996, 39, 1396-1402; K.H. Lee, et al. J. Med. Chem., 2004, 47, 5140-5148.）。
Figure 948925DEST_PATH_IMAGE001
偶氮键是一类化学性质非常惰性的化学键，在正常生理条件下都可保持稳定，仅在体内缺氧环境产生的酶系作用下发生断裂，如实体瘤缺氧环境产生的CYP450还原酶系，结肠特有的厌氧菌系产生的偶氮还原酶。目前已有研究利用这些酶系构筑偶氮键连接的前药体系用于实体瘤靶向治疗、诊断及结肠靶向给药，并已有药物用于临床。如治疗肠炎的药物柳氮磺胺吡啶即利用结肠特有的偶氮还原酶实现药物在结肠的靶向释放。GL-331进入体内后，可经 Ι 相代谢转化为活性代谢产物GL331-NH2而发挥其抗肿瘤活性，GL331-NH2分子结构中含有苯胺结构，可用于设计偶氮键连接的衍生物，从而实现在实体瘤或结肠中GL-331的靶向释放 (T. Nagano, et al. J.Am Chem.,2010, 132, 15846-15848; Saphier,et al. J. Med. Chem., 2012, 55, 10781-10785; M. E. H. EISayed, et al.Biomaterials, 2013, 34, 4655-4666; S Y. Urano, et al. ACS Chem. Biol., 2017,12, 558-563.）。
聚乙二醇（PEG）是一类水溶性和生物相容性都非常优良的聚合物，常被用于改善药物水溶性和延长药物体内循环时间。在前期研究中，我们构筑了以酯键、亚胺键、二硫键等环境敏感共价键连接的PEG修饰的疏水性抗肿瘤药物，该类两亲性前药可显著改善药物的水溶性和靶向性。因此设计合成PEG与GL-331通过偶氮键连接的两亲性衍生物可在保持GL-331高抗肿瘤活性基础上有效提高GL-331水溶性，增加其针对实体瘤和结肠给药的靶向性，极大改善GL-331的成药性（W. Ha, et al. J. Mater. Chem. B, 2013, 1, 5532–5538; J. Yu, et al. RSC Advances, 2014, 4, 58982–58989; W. Ha, et al. ACS Appl. Mater. Interfaces2018, 10, 21149−21159.）。
发明内容
本发明的目的是提供一种偶氮键连接的抗肿瘤鬼臼毒素衍生物；
本发明的另一目的是提供上述偶氮键连接的抗肿瘤鬼臼毒素衍生物的制备方法。
（一）4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）的制备和表征
GL331-azo，命名为4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素，其结构式如下：
Figure 310768DEST_PATH_IMAGE002
GL331-azo的制备：将4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素溶解于干燥的二氯甲烷中，氮气保护下加入缚酸剂搅拌2~10 min，随后加入对二胺基偶氮苯，室温搅拌2~12 h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得目标产物GL331-azo。GL331-azo的反应式如下：
Figure 867651DEST_PATH_IMAGE003
缚酸剂为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶、氨水中的任意一种。
中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素的合成参见文献方法J. Med. Chem,.1990, 33, 1364-1368)。其反应式如下：
Figure 728159DEST_PATH_IMAGE004
中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素与缚酸剂的摩尔比为1: 0.1 ~ 1:10（优选为1: 1 ~1: 4）；4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素与对二胺氨基偶氮苯的摩尔比为1: 0.1 ~1: 10（优选为1:1~ 1:3）。
对得到的产物4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素进行核磁共振分析（400 MHz），所使用的核磁共振仪为Bruker AVANCE Ш-400，溶剂为氘代二甲基亚砜。图1、2分别为GL331-azo的1H-NMR谱图和13C-NMR谱图。在1H-NMR谱图，7.63-7.55,6.82-6.63ppm处的峰显示出了偶氮苯骨架中的特征氢信号峰；6.83,6.57 ppm处的两个单峰为GL-331骨架中5位和8位的特征质子峰；6.01和5.99处的两个单峰为GL-331结构中-O-CH2-O-中的特征质子峰，5.00-3.05 ppm处的多组峰显示出了GL-331结构中其它质子的特征信号。13C-NMR谱图也显示出了偶氮苯结构单元和GL-331骨架中所有的特征碳信号。此外，高分辨质谱（HRMS）结果如下: C33H30N4O7Na for [M+Na]+, calculated 617.2007, found 617.2014。以上信息证明GL331-azo的结构式如上式所示。
（二）聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物PEG-azo-GL331的制备和表征
聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物PEG-azo-GL331的结构式如下式所示：
Figure 395901DEST_PATH_IMAGE005
PEG-azo-GL331的制备方法，包括以下步骤：
（1）中间体对甲苯磺酰基取代聚乙二醇单甲醚（mPEG-TS）合成：将聚乙二醇单甲醚（mPEG）溶解于干燥二氯甲烷中，氮气保护下加入三乙胺搅拌2~10 min，随后加入对甲苯磺酰氯，室温搅拌2~12 h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得目标物mPEG-TS。其反应式如下：
Figure 143408DEST_PATH_IMAGE006
反应式中n为8-200之间的整数。mPEG与三乙胺摩尔比为1:1~1:10，mPEG与对甲苯磺酰氯摩尔比为1:1~1:20。
对产物mPEG-TS进行核磁共振分析（400 MHz），检测数据如下：1H NMR (400 MHz,CDCl3): δ 7.75 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.30 (d, J=8.0 Hz, 2H), 4.10-4.13 (m, 2H),3.60-3.63 (m), 3.34 (s, 3H), 2.41 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 144.7,133.0, 129.8, 127.9, 71.9, 70.6, 69.2, 68.7, 59.0, 21.6。
（2）聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物（PEG-azo-GL331）合成：将上述制备的4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒（GL331-azo）溶解于干燥的二氯甲烷中，氮气保护下加入缚酸剂搅拌2~5 min，随后加入mPEG-TS，室温搅拌12~36 h，过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得目标产物PEG-azo-GL331。GL331-azo的反应式如下：
Figure 605614DEST_PATH_IMAGE007
缚酸剂为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶、氨水中的任意一种。
GL331-azo与缚酸剂的摩尔比为1: 0.1 ~1: 10（优选为1:1~1:4）；GL331-azo与mPEG-Ts摩尔比为1: 0.1 ~ 1:10（优选为1: 1 ~1:3）。
对得到的产物聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物（PEG-azo-GL331）进行核磁共振分析（400MHz），所使用的核磁共振仪为Bruker AVANCE Ш-400，溶剂为氘代氯仿。图3为聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物（PEG-azo-GL331）的核磁共振氢谱图。图3所示，7.83-7.74 ppm处的峰显示出了偶氮苯骨架中的氢信号峰；5.97-6.80 ppm，4.43-4.62 ppm处的多组峰显示出了GL331-azo的特征质子峰；3.2-3.81 ppm处的峰显示出了mPEG中重复亚甲基和末端甲氧基的特征质子峰；4.22 ppm处的亚甲基信号显示出了mPEG末端亚甲基与苯胺基团相连；以上信息证明PEG-azo-GL331的结构式如上式所示：其中PEG通过偶氮键与GL331相连接。
（三）PEG-azo-GL331释放GL-331的能力
为了考察PEG-azo-GL331在酶系存在下偶氮键断裂从而释放GL-331的能力，我们做了以下实验：分别称取5 mg PEG-azo-GL331至五个圆底烧瓶中，分别加入2 mL PBS溶液（pH 7.4）溶解，随后分别加入1 mL PBS溶液、蛋白酶溶液（10 mg/mL）、脂肪酶溶液（10 mg/mL）、连二亚硫酸钠溶液（10 mg/mL，模拟偶氮还原酶）、1mL鼠结肠内容物溶液（含有偶氮还原酶），上述溶液通入氮气5min后置于水浴摇床中培养，控制水温为37℃。培养12 h后，取出0.5 mL样品，用色谱纯甲醇稀释至2 mL，超滤，用HPLC进行检测。结果如图4所示：12 h内，PEG-azo-GL331在PBS、脂肪酶、蛋白酶存在下都可保持稳定，无GL-331释放，说明鬼臼毒素衍生物PEG-azo-GL331在正常生理条件下具有优良的稳定性。在连二亚硫酸钠（模拟偶氮还原酶）和鼠结肠内容物（含有偶氮还原酶）存在下，GL-331的释放量都超过30%，说明PEG-azo-GL331具有偶氮还原酶敏感特性，在还原酶系存在下，可发生偶氮键的断裂从而释放GL-331。
四、GL-331、GL331-NH2、GL331-azo、PEG-azo-GL331和伊立替康的MTT实验
体外抗肿瘤实验采用MTT比色法，以临床抗癌药物伊立替康为阳性对照。收集处于指数生长期的结肠癌HCT116细胞，1000 rpm离心5 min，弃上清，加入2 mL培养基重悬细胞，吸取10 μL细胞悬液至血细胞计数板，在倒置显微镜下计数。调整细胞密度至1×104/ mL，以1×104 /孔密度接种于细胞96孔培养板，每孔100 μL，37℃，5% CO2饱和湿度培养4小时。加入不同浓度的药物溶液，每个药物考察点设6~8个复孔，37℃，5% CO2饱和湿度培养48小时。每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，37℃，5% CO2饱和湿度条件下反应4小时。终止反应：小心地吸取96孔板每孔的反应液，加入100 μL浓度为10%的SDS溶液，37℃，5% CO2饱和湿度条件下过夜。利用酶标仪测定每个反应孔在490 nm处的光密度OD值，从而计算不同药物对HCT116细胞的抑制率。
图5是GL-331、GL331-NH2、GL331-azo、PEG-azo-GL331和伊立替康对HCT-116结肠癌细胞的细胞毒活性图。在0~100 μM范围内，GL331-NH2与GL331具有一致的细胞毒活性，说明GL331-NH2是GL-331进入细胞后的活性代谢产物。在整个浓度范围内，GL331-NH2显示出了比阳性药物伊立替康更为优异的细胞毒活性。在整个浓度范围内，GL331-azo和PEG-azo-GL331两类以偶氮键连接的鬼臼毒素类衍生物与GL-331具有相似细胞毒活性，说明在进入结肠癌肿瘤细胞后，肿瘤细胞内的还原酶系会断裂偶氮键从而释放出GL331。
综上所述，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明创新性利用偶氮键连接两亲性鬼臼毒素衍生物，可在保持GL-331高抗肿瘤活性基础上有效提高GL-331水溶性，增加其针对实体瘤和结肠给药的靶向性，极大改善GL-331的成药性；
2、本发明中偶氮键连接的抗肿瘤鬼臼毒素衍生物制备方法简单、快速、高效。
附图说明
图1为4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素的核磁共振氢谱图。
图2为4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素的核磁共振碳谱图。
图3为聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物的核磁共振氢谱图。
图4为PEG-azo-GL331在不同条件下GL-331释放图。
图5为GL-331、GL331-NH2、GL331-azo、PEG-azo-GL331和伊立替康对HCT-116结肠癌细胞的细胞毒活性图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明鬼臼毒素衍生物4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）和聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物（PEG-azo-GL331）的制备做进一步说明。
实施例1：4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）的制备
（1）中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素的合成：将去甲表鬼臼毒素（1.0 g，2.4 mmol）溶解于25 mL的干燥二氯甲烷中，冰浴冷却至0℃，通入干燥的溴化氢气体45min，随后通入N2除去多余的溴化氢，减压浓缩即得目标物（1.1 g）；
（2）4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）合成：取步骤（1）所得的中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素（462 mg，1mmol）溶解于10 mL的干燥二氯甲烷中，氮气保护下加入无水碳酸钾（414 mg，3 mmol）搅拌5min，随后加入对二胺基偶氮苯（254 mg，1.2 mmol），室温搅拌4h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得目标物GL331-azo（315 mg），产率53.3%。
实施例2：4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）的制备
（1）中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素的合成：同实施例1；
（2）4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）合成：取步骤（1）所得中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素（462 mg，1mmol）溶解于10 mL的干燥二氯甲烷中，氮气保护下加入三乙胺（0.42 mL，3 mmol）搅拌5min，随后加入对二胺基偶氮苯（254 mg，1.2 mmol），室温搅拌4h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离即得目标物GL331-azo（350 mg），产率59.2%。
实施例3：聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物（PEG-azo-GL331）的制备
（1）中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素的合成：将去甲表鬼臼毒素（1.0 g，2.4 mmol）溶解于25 mL的干燥二氯甲烷中，冰浴冷却至0℃，通入干燥的溴化氢气体45min，随后通入N2除去多余的溴化氢，减压浓缩即得目标物（1.1 g）；
（2）4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）合成：取步骤（1）所得的中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素（462 mg，1mmol）溶解于10 mL的干燥二氯甲烷中，氮气保护下加入无水碳酸钾（414 mg，3 mmol）搅拌5min，随后加入对二胺基偶氮苯（254 mg，1.2 mmol），室温搅拌4h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得目标物GL331-azo（315 mg）；
（3）对甲苯磺酰基取代聚乙二醇单甲醚（mPEG-TS）合成：将聚乙二醇单甲醚（Mw =1900，5.0 g，2.63 mmol）溶解于30 mL干燥二氯甲烷中，氮气保护下加入三乙胺（1.11 mL，7.89 mmol）搅拌5 min，随后加入对甲苯磺酰氯（1.0 g，5.26 mmol），室温搅拌4 h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得目标物mPEG-TS（4.5 g）；
（4）聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物（PEG-azo-GL331）合成：将GL331-azo（0.59 g，1 mmol）溶解于20 mL干燥的二氯甲烷中，氮气保护下加入无水碳酸钾（414mg，3 mmol）搅拌5 min，随后加入mPEG-TS（3.1 g，1.5 mmol），室温搅拌24 h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离即得目标物PEG-azo-GL331（1.5 g），产率60.2%。
实施例4：聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物（PEG-azo-GL331）的制备
（1）中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素的合成：同实施例1；
（2）4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）合成：取步骤（1）所得中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素（462 mg，1mmol）溶解于10 mL的干燥二氯甲烷中，氮气保护下加入三乙胺（0.42 mL，3 mmol）搅拌5min，随后加入对二胺基偶氮苯（254 mg，1.2 mmol），室温搅拌4h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离即得目标物GL331-azo（350 mg）；
（3）对甲苯磺酰基取代聚乙二醇单甲醚（mPEG-TS）合成：将聚乙二醇单甲醚（Mw =1900，5.0 g，2.63 mmol）溶解于30 mL干燥二氯甲烷中，氮气保护下加入三乙胺（1.11 mL，7.89 mmol）搅拌5 min，随后加入对甲苯磺酰氯（1.0 g，5.26 mmol），室温搅拌4 h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离即得目标物mPEG-TS（4.5 g）；
（4）聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物（PEG-azo-GL331）合成：将GL331-azo（0.59 g，1 mmol）溶解于20 mL干燥的二氯甲烷中，氮气保护下加入4-二甲氨基吡啶（367 mg，3 mmol）搅拌5 min，随后加入mPEG-TS（3.1 g，1.5 mmol），室温搅拌24 h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得目标物PEG-azo-GL331（1.6 g），产率64.2%。

Claims (6)

1.一种聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物，其结构式如下式所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式中，n为8~200之间的整数。
2.如权利要求1所述聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物的制备方法，包括如下步骤：
（1）偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物的制备：将4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素溶解于干燥的二氯甲烷中，氮气保护下加入缚酸剂搅拌2~10 min，随后加入对二胺基偶氮苯，室温搅拌2~12 h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得目标产物，标记为GL331-azo；
（2）对甲苯磺酰基取代聚乙二醇单甲醚的制备：将聚乙二醇单甲醚溶解于干燥二氯甲烷中，氮气保护下加入三乙胺搅拌2~10 min，随后加入对甲苯磺酰氯，室温搅拌2~12h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得目标物，标记为mPEG-TS；
（3）聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物的制备：将GL331-azo溶解于干燥的二氯甲烷中，氮气保护下加入缚酸剂搅拌2~10 min，随后加入mPEG-TS，室温搅拌12~36h，过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得目标产物聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物PEG-azo-GL331。
3.如权利要求2所述聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素与缚酸剂的摩尔比为1: 0.1 ~ 1:10；4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素与对二胺基偶氮苯的摩尔比为1: 0.1 ~1:10。
4.如权利要求2所述聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，聚乙二醇单甲醚与三乙胺的摩尔比为1: 1~1:10，聚乙二醇单甲醚与对甲苯磺酰氯摩尔比为1:1~1:20。
5.如权利要求2所述聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（1）、（3）中，缚酸剂可为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶、氨水中的任意一种。
6.如权利要求2所述聚乙二醇修饰偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，GL331-azo与缚酸剂的摩尔比为1: 0.1 ~1: 10；GL331-azo与mPEG-TS的摩尔比为1: 0.1 ~ 1:10。
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