CN102850372A

CN102850372A - 一种蓍草倍半萜内酯化合物及其提取方法和应用

Info

Publication number: CN102850372A
Application number: CN2012103889742A
Authority: CN
Inventors: 史清文; 张嫚丽; 董玫; 李勇
Original assignee: Hebei Medical University
Current assignee: Hebei Medical University
Priority date: 2012-10-15
Filing date: 2012-10-15
Publication date: 2013-01-02

Abstract

本发明公开了一种蓍草倍半萜内酯化合物及其提取方法和应用，该化合物根据取代基不同，分别为AchillininB或AchillininC。上述化合物由蓍草的花依次通过浸提、萃取、硅胶干柱层析、薄层层析、高效液相色谱分离得到。通过人肿瘤细胞株体外试验表明，本发明所述蓍草来源的倍半萜内酯类化合物具有抗肿瘤活性，其中，对于宫颈癌、肺癌、肝癌、脑胶质瘤或黑色素瘤的活性强，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种蓍草倍半萜内酯化合物及其提取方法和应用

技术领域

本发明涉及化合物及其制备方法和其医药用途，具体地说是一种倍半萜内酯化合物及其制备方法和其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

蓍草为菊科植物蓍草Achillea LIpina L的地上部分，也叫一支蒿、蜈蚣草、飞天蜈蚣。蓍草中常见的化学成分包括琥珀酸（succinic acid），延胡索酸（fumaric acid），α-呋喃甲酸（α-furoic acid），乌头酸（aconitic acid），可用于消肿、止血、止痛。随着科学技术的进步，研究、筛选、提取蓍草中更多的药理活性成分具有重要的现实意义。

中国专利申请CN101037428A公开了一种蓍草倍半萜内酯化合物以及该化合物的提纯方法和抗肿瘤细胞增殖活性，该申请所述化合物结构如下：

该申请所述提纯方法是将蓍草花在室温下用甲醇浸泡提取后，再将得到的固体用硅胶干柱层析技术进行分离，然后将倍半萜比较富集的流分再次采用柱层析进行分离，最后用制备型TLC进行纯化处理。

目前，对蓍草中倍半萜内酯类化合物的研究还不够充分，蓍草中所蕴藏的其他有潜在医药学价值的化合物尚有待于开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种来自蓍草的新的化合物，同时提供一种该化合物的提取方法以及该化合物的医药用途。

为实现本发明目的，本发明提供了一种蓍草倍半萜内酯化合物，其具有如下结构：

其中，R为-H或-CH₃；

本发明所述蓍草倍半萜内酯化合物的外观为白色结晶状固体；

当R为-H时，分子式为：C₃₁H₃₈O₈，命名为Achillinin B；

当R为-CH₃时，分子式为：C₃₀H₃₆O₈，命名为Achillinin C；

本发明所述蓍草倍半萜内酯化合物的质谱数据如下：

Achillinin B：HR-FABMS m/z: 561.2456 [M + Na]⁺；calcd. for C₃₁H₃₈O₈Na, 561.2464；

Achillinin C：HR-FABMS m/z: 523.2306 [M + Na]⁺；calcd. for C₃₀H₃₆O₈Na, 523.2308；

本发明所述蓍草倍半萜内酯化合物的核磁共振波谱数据包括氢谱，碳谱，具体数据见表1：

表1

本发明还提供了上述蓍草倍半萜内酯化合物的提取方法，包括以下步骤：

a、取菊科植物蓍草的花，用甲醇在23~25℃条件下浸泡8-24小时，过滤，减压蒸馏除去滤液中的甲醇，得到的提取物溶于饱和氯化钠水溶液中，用水饱和正己烷萃取1~3次，水层合并后，用水饱和乙酸乙酯萃取1~3次，乙酸乙酯层合并后用无水硫酸钠脱水，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到萃取物；

b、将步骤a所述萃取物用硅胶干柱层析技术进行分离，用体积比为95:5的乙酸乙酯-甲醇进行洗脱，再将硅胶柱分成15段，把第7~11段合并，得到富含倍半萜的流分；

c、将步骤b所述流分用体积比为5:1~1:3的环己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到10份梯度洗脱物，将第5份梯度洗脱物用制备型TLC处理，以体积比为4:1的二氯甲烷-乙腈为展开剂进行展开，展开后刮取在紫外灯下有吸收色带的部分，用丙酮对刮取物进行洗脱，回收丙酮，得到粗提物；

d、将步骤c所述粗提物用高效液相色谱进一步纯化，采用体积分数为30~70%乙腈水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱峰，减压浓缩后得到所述倍半萜内酯类化合物。

本发明步骤d中所述高效液相色谱，其所采用的检测波长为220 nm，所述梯度洗脱，其条件为乙腈的体积分数在50分钟内从25%递增到100%，流速为18 mL/min，，收集保留时间为27.37 min的洗脱峰，得到R基为-H的倍半萜内酯类化合物Achillinin B；收集保留时间为29.99 min的洗脱峰，得到R基为-CH₃的倍半萜内酯类化合物Achillinin C。

本发明从廉价易得的菊科植物蓍草中提取出新的倍半萜内酯化合物Achillinin B、Achillinin C。本发明的提取、分离方法，操作方便，所得产物纯度高、收率好。本发明所述蓍草最好为欧蓍草。

化合物的用途：本发明通过人肿瘤细胞株体外试验表明，所述蓍草倍半萜内酯化合物具有抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物，尤其是抗宫颈癌、肺癌、肝癌、脑胶质瘤或黑色素瘤的药物。当所述肿瘤是宫颈癌、肺癌、肝癌、脑胶质瘤或黑色素瘤时，所述蓍草倍半萜内酯化合物在低浓度时即具有良好的活性。

药物的用法、用量：本发明所述Achillinin B或Achillinin C在制备抗肿瘤药物时，可按照常规的制剂方法以Achillinin B或Achillinin C为药物活性成分，添加适宜的药物载体，制成各种剂型，如片剂、滴丸、胶囊剂、散剂、注射剂、缓控释剂等等。

在用于治疗肿瘤疾病时，口服制剂的用量一般可控制在每日服用Achillinin B或Achillinin C 300-600mg。其他剂型的用量可参考该用量。本发明的药物用法用量，也不完全限于此，临床医师也可以根据病人的具体情况决定药物的用法用量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：

实施例1

按照下述方法制备本发明的蓍草来源的倍半萜内酯类化合物。

a、取菊科植物欧蓍草的花4.2公斤，用16L甲醇在20~23℃条件下浸泡8~16小时，过滤，减压蒸馏除去滤液中的甲醇，得到的提取物溶于饱和氯化钠水溶液中，用水饱和正己烷萃取3次，水层合并，用水饱和乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层合并后用无水硫酸钠脱水，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到149g萃取物；

b、将步骤a所述萃取物用硅胶干柱层析技术进行分离，用体积比为95:5的乙酸乙酯-甲醇进行洗脱，再将硅胶柱分成15段，把第7~11段合并，得到59g富含倍半萜的流分；

c、将步骤b所述流分用体积比为5:1~1:3的环己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到10份梯度洗脱物，将第5份梯度洗脱物用制备型TLC（20cm×20 cm）处理，以体积比为4:1的二氯甲烷-乙腈为展开剂进行展开，展开后刮取在紫外灯下有吸收色带的部分，用丙酮对刮取物进行洗脱，回收丙酮，得到粗提物；

d、将步骤c所述粗提物用高效液相色谱进一步纯化，色谱条件如下：高效液相色谱仪器型号：Waters Delta Prep 3000 HPLC，检测器：UV 486，检测波长：220 nm；制备色谱柱型号：10 ODS-2 MAG-20，制备色谱柱规格：22 × 500 mm；流动相：体积分数为25~100%乙腈水溶液；洗脱条件：梯度洗脱，乙腈的体积分数在50分钟内从25%递增到100%；流速：18 mL/min。收集保留时间为27.37 min的洗脱峰，得到R基为-H的倍半萜内酯化合物Achillinin B；收集保留时间为29.99 min的洗脱峰，得到R基为-CH₃的倍半萜内酯化合物Achillinin C。

实施例2

a、取菊科植物欧蓍草的花4.3公斤，用16L甲醇在20~23℃条件下浸泡16~24小时，过滤，减压蒸馏除去滤液中的甲醇，得到的提取物溶于饱和氯化钠水溶液中，用水饱和正己烷萃取2次，水层合并，用水饱和乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯层合并后用无水硫酸钠脱水，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到121g萃取物；

b、将步骤a所述萃取物用硅胶干柱层析技术进行分离，用体积比为95:5的乙酸乙酯-甲醇进行洗脱，再将硅胶柱分成15段，把第7~11段合并，得到52g富含倍半萜的流分；

d、将步骤c所述粗提物用高效液相色谱进一步纯化，色谱条件如下：高效液相色谱仪器型号：Waters Delta Prep 3000 HPLC，检测器：UV 486，检测波长：220 nm；制备色谱柱型号：10 ODS-2 MAG-20，制备色谱柱规格：22 × 500 mm；流动相：体积分数为25~90%乙腈水溶液；洗脱条件：梯度洗脱，乙腈的体积分数在50分钟内从25%递增到90%；流速：18 mL/min。收集保留时间为27.37 min的洗脱峰，得到R基为-H的倍半萜内酯化合物Achillinin B；收集保留时间为29.99 min的洗脱峰，得到R基为-CH₃的倍半萜内酯化合物Achillinin C。

实施例3

测定实施例1中所得Achillinin B 和Achillinin C 的抗肿瘤活性。

选用的细胞系为HeLa（人子宫颈癌细胞）；HOC-21（人卵巢透明癌细胞）；HEC-1（人子宫内膜癌细胞）；T-98和U251SP（人脑神经胶质瘤细胞）；A549和QG-56（人肺癌细胞）；HLE（人肝癌细胞）；MM1-CB和HMV-1（人黑色素瘤细胞）；KT（人乳腺癌脑脑转移细胞）。

使用的实验方法为MTT实验法。

将上述各肿瘤细胞株悬液接种于96孔板，每孔90μL(含1×10⁴个细胞)，将本发明化合物Achillinin B和Achillinin C溶解于DMSO，分别加入加入终浓度为100μM的Achillinin B和Achillinin C各10μL，每组均设3个复孔。置于饱和湿度、37℃和5%CO₂培养箱中培养48小时。于培养结束前4小时，各培养孔加入5 mg/mL四氮唑盐(MTT)10μL，培养结束后，弃去培养上清，每孔加入15 %SDS100μL，过夜。次日用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度(OD)值，测定波长λ= 570 nm，参考波长λ= 630 nm。以只添加DMSO的培养基作为对照，计算抑制率。结果如下：

Achillinin B抑制肿瘤细胞增殖活性（%）

Achillinin C抑制肿瘤细胞增殖活性（%）

上述试验结果表明，本发明所述蓍草来源的倍半萜内酯类化合物具有抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。其中，对于宫颈癌、肺癌、肝癌、脑胶质瘤或黑色素瘤的活性强，可用于制备抗上述肿瘤的药物。

Claims

1.一种蓍草倍半萜内酯化合物，其特征在于其具有如下结构：

Figure 2012103889742100001DEST_PATH_IMAGE002

其中，R为-H或-CH₃。

2.权利要求1所述蓍草倍半萜内酯化合物的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

a、取菊科植物蓍草的花，用甲醇在20~25℃条件下浸泡8-24小时，过滤，减压蒸馏除去滤液中的甲醇，得到的提取物溶于饱和氯化钠水溶液中，用水饱和正己烷萃取1~3次，水层合并后，用水饱和乙酸乙酯萃取1~3次，乙酸乙酯层合并后用无水硫酸钠脱水，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到萃取物；

b、将步骤a所述萃取物用硅胶干柱层析技术进行分离，用体积比为95:5的乙酸乙酯、甲醇的混合液进行洗脱，再将硅胶柱分成15段，把第7~11段合并，得到富含倍半萜的流分；

c、将步骤b所述流分用体积比为5:1~1:3的环己烷、乙酸乙酯的混合液进行梯度洗脱，得到10份梯度洗脱物，将第5份梯度洗脱物用制备型TLC处理，以体积比为4:1的二氯甲烷、乙腈的混合液为展开剂进行展开，展开后刮取在紫外灯下有吸收色带的部分，用丙酮进行洗脱，回收丙酮，得到粗提物；

d、将步骤c所述粗提物用高效液相色谱进一步纯化，采用体积分数为25~100%的乙腈水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱峰，减压浓缩后得到所述倍半萜内酯类化合物。

3.根据权利要求2所述蓍草倍半萜内酯化合物的提取方法，其特征在于：步骤d中所述高效液相色谱，其所采用的检测波长为220 nm，所述梯度洗脱，其条件为乙腈的体积分数在50分钟内从25%递增到100%，流速为18 mL/min，收集保留时间为27.37 min的洗脱峰，得到R基为-H的倍半萜内酯类化合物Achillinin B。

4.根据权利要求3所述蓍草倍半萜内酯化合物的提取方法，其特征在于：步骤d中，收集保留时间为29.99 min的洗脱峰，得到R基为-CH₃的倍半萜内酯类化合物Achillinin C。

5.根据权利要求2~4中任意一项所述蓍草倍半萜内酯化合物的提取方法，其特征在于：所述蓍草为欧蓍草。

6.权利要求1所述蓍草倍半萜内酯化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述蓍草倍半萜内酯化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤是宫颈癌、肺癌、肝癌、脑胶质瘤或黑色素瘤。