CN115197238B - 一种具有降糖活性的吉玛烷倍半萜类化合物的制备方法及其应用 - Google Patents
一种具有降糖活性的吉玛烷倍半萜类化合物的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及具有降糖活性的吉玛烷倍半萜类化合物的制备方法及其应用，可有效解决降糖药物的问题，其解决的技术方案是，该具有降糖活性的吉玛烷倍半萜类化合物是由蓍草中分离得到的吉玛烷型倍半萜achigermalide D或achigermalide E，本发明制备工艺稳定可靠，所得化合物的纯度高，易于工业化推广，为降糖药物的研发开辟了新的途径，具有实际的临床意义。
Description
技术领域
本发明涉及医药化学领域，特别是一种具有降糖活性的吉玛烷倍半萜类化合物的制备方法及其应用。
背景技术
近年来，对于T2DM的治疗和干预主要依赖于控制血糖的药物维持，并不能从根本上逆转T2DM的进程。胰岛素抵抗(IR)是指胰岛素敏感组织对胰岛素的敏感性下降，是T2DM发病的主要环节，并贯穿于其发生、发展的整个过程。如今临床上针对IR的药物主要有胰岛素分泌促进剂(磺酰胺类、格列奈类)，胰岛素增敏剂(双胍类、噻唑烷二酮类)和α-葡萄糖苷酶抑制剂(阿卡波糖)，但它们常具有不同程度的副作用，如低血糖、肝肾功能损害、心血管副作用等。开发作用于新靶点、避免传统抗IR药物副作用的新型T2DM治疗药物成为国内外研究的趋势。
中药是我国古代劳动人民用来祛病延年、强身健体的重要物质条件之一，至今在我国疾病的防治和治疗方面起着重要作用。中药不仅来源广泛、种类丰富、不良反应小，在复杂的糖尿病治疗方面有着独特的优势，从中药中寻找或源于中药的新型T2DM治疗药物研发已成为研究热点。近年来，中药治疗T2DM取得了显著的成果，但我们也注意到目前对具有降糖作用的中药的开发利用还非常有限。
蓍属(Achillea)(菊科)约有200种，广泛分布于北温带，我国产有10种，如今从中分离得到的化合物主要有倍半萜、黄酮、木质素等。现代药理学研究表明该属植物除具有显著的抗炎活性外，还具有显著降糖活性，如A.santolina在埃及、巴基斯坦等国常作为传统降糖药物，其提取物能明显降低链脲霉素诱导的糖尿病小鼠血糖水平。A.millifolium甲醇提取物可以修复受损的糖尿病小鼠胰岛β细胞并释放胰岛素发挥降糖作用。而如今蓍属植物研究较少，其降糖作用的有效成分并不明确。
蓍草(A.alpina)为蓍属多年生草本植物，又名高山蓍、羽衣草、蚰蜒草、锯齿草等。性平，味酸、苦。《中国药典》记载中，蓍草具有清热解毒、活血止痛的作用。《中华本草》中描述蓍草具有很好的抗炎、解热镇痛等活性。现代药理学研究也表明蓍草中化学成分具有显著的抗炎活性，但是如今缺少对该植物系统的化学成分及相关药理学研究，现仅报道了少量的倍半萜、生物碱以及挥发油等。
本发明涉及的化合物achigermalide D和achigermalide E是从蓍草二氯甲烷提取物分离得到的两个新的吉玛烷倍半萜类化合物，关于其制备方法以及降糖的活性研究尚未见文献报道。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种具有降糖活性的吉玛烷倍半萜类化合物的制备方法及其应用，可有效解决糖尿病的治疗问题。
本发明解决的技术方案是，该具有降糖活性的吉玛烷倍半萜类化合物是由蓍草中分离得到的吉玛烷型倍半萜achigermalide D或achigermalide E，为自然界中不存在的全新结构，化学结构式分别为：
其制备方法，包括以下步骤：
1)蓍草地上部分剪切成小段，加入药材6倍量的二氯甲烷溶液，冷浸一周，提取三次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得到浓缩物；将所得浸膏用甲醇溶解与聚酰胺填料1:1拌样装载于MCI色谱柱树脂上依次用体积比为10:90、30:70、60:40、80:20、90:10、100:0的甲醇-水溶液系统进行梯度洗脱，收集洗脱液，经薄层色谱分析并合并相似流份，得到6个主流份BM1-BM6；
2)对步骤1)得到的亚流份BM3经Sephadex LH-20柱色谱，以纯甲醇为洗脱剂洗脱，流速为1.0mL/min，收集色带流份，加压浓缩，得到BM3N1-BM3N6；
3)对步骤2)得到的亚流份BM3N4经反相C18色谱柱，以纯甲醇/水为洗脱剂，依次用体积比为10:90、30:70、60:40、80:20、90:10、100:0的溶剂系统进行梯度洗脱，收集洗脱液，经薄层色谱分析并合并相似流份，得到15个主流份BM3N4O1-BM3N4O15；
4)对步骤3)得到流分BM3N4O10用反相制备型HPLC分离纯化，以30-70％ MeCN/H2O乙腈-水梯度洗脱，总时间为50min，流速为3ml/min，在tR为24.1min得到化合物achigermalide D；流分BM3N4O11用反相制备型HPLC分离纯化，以20-65％ MeCN/H2O乙腈-水梯度洗脱，总时间为60min，流速为3ml/min，在tR为50.8min得到化合物achigermalideE。
所述的化合物achigermalide D或化合物achigermalide E及其可药用盐在制备降血糖药物中的应用。
本发明的再一个目的是提供一种治疗糖尿病的药物，其有效成分为achigermalide D或achigermalide E，或以上两个化合物的可药用盐，至少含有一种药学上可接受的载体。
将化合物achigermalide D或achigermalide E，和药学上可接受的载体制备成胶囊剂、注射剂、片剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊或滴丸的一种，上述各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明制备工艺稳定可靠，所得化合物的纯度高，易于工业化推广，为降糖药物的研发开辟了新的途径，具有实际的临床意义。
附图说明
图1为本发明的化合物achigermalide D的氢谱图。
图2为本发明的化合物achigermalide D的碳谱图。
图3为本发明的化合物achigermalide E的氢谱图。
图4为本发明的化合物achigermalide E的碳谱图。
图5为本发明的化合物achigermalide D和achigermalide E糖消耗测定结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
蓍草(Stereum hirsutum)：河南中医药大学中药与天然药物化学研究室，保藏编号No.202005，药材20120年5月采自云南省昆明市。
实施例1
本发明在具体实施时，制备方法具体包括以下步骤：
1)将5.0kg蓍草地上部分剪切成小段，加入药材6倍量的二氯甲烷溶液，冷浸一周，提取三次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得到总浸膏52g；将所得浸膏用甲醇溶解与聚酰胺填料1:1拌样装载于MCI色谱柱树脂上依次用体积比为10:90、30:70、60:40、80:20、90:10、100:0的甲醇-水溶液系统进行梯度洗脱，收集洗脱液，经薄层色谱分析并合并相似流份，得到6个主流份BM1-BM6；
2)对步骤1)得到的亚流份BM3(8.4g)经Sephadex LH-20柱色谱，以纯甲醇为洗脱剂洗脱，流速为1.0mL/min，收集色带流份，加压浓缩，得到BM3N1-BM3N6；
3)对步骤2)得到的亚流份BM3N4经反相C18色谱柱，以纯甲醇/水为洗脱剂，依次用体积比为10:90、30:70、60:40、80:20、90:10、100:0的溶剂系统进行梯度洗脱，收集洗脱液，经薄层色谱分析并合并相似流份，得到15个主流份BM3N4O1-BM3N4O15；
4)对步骤3)得到100.5mg流分BM3N4O10用反相制备型HPLC分离纯化，以30-70％MeCN/H2O乙腈-水梯度洗脱，总时间为50min，流速为3ml/min，在tR为24.1min得到为得到7.9mg化合物achigermalide D；79.8mg流分BM3N4O11用反相制备型HPLC分离纯化，以20-65％ MeCN/H2O乙腈-水梯度洗脱，总时间为60min，流速为3ml/min，在tR为50.8min得到为得到2.3mg化合物achigermalide E。
化合物achigermalide D和achigermalide E结构鉴定：制备所得的化合物加0.5mL的氘代氯仿溶解，在核磁共振仪(德国布鲁克Avance III 500MHz)上检测氢谱和碳谱(如图1-4所示)，其化学结构及编号如下：
本发明制备得到的化合物achigermalide D为白色无定形粉末，高分辨质谱测得该化合物分子量为373.1991[M+Na]+，推算其分子式为C20H30O5。紫外光谱在λmax210 nm显示有双键的特征吸收峰；红外光谱显示在3422cm-1处存在羟基的吸收峰，1758cm-1和1732cm-1为两个酯羰基的特征吸收峰；1H NMR谱(500MHz,CDCl3)数据如下1H NMR谱(500M数Hz,CDCl3)据如下:5.18(1H,dd,J＝10.5,6.0Hz,H-3),5.12(1H,dd,J＝12.0,3.0Hz,H-1),4.75(1H,t,J＝9.5Hz,H-6),4.69(1H,d,J＝10.0Hz,H-5),4.11(1H,dd,J＝10.0,3.5Hz,H-9),2.71(1H,p,J＝8.0Hz,H-11),2.54(1H,m,H-2a),2.30(1H,m,H-2b),2.24(3H,m,H-7,H-2'),2.12(1H,m,H-3'),1.85(2H,m,H-8),1.72(3H,s,H-15),1.48(3H,s,H-14),1.25(3H,d,J＝8.0Hz,H-13),0.97(6H,d,J＝7.0Hz,H-4',H-5')。13C NMR谱(125MHz,CDCl3)数据如下:126.1(C-1),31.5(C-2),78.6(C-3),137.2(C-4),125.9(C-5),78.9(C-6),45.9(C-7),33.6(C-8),79.5(C-9),140.7(C-10),40.6(C-11),179.1(C-12),11.2(C-13),11.1(C-14),12.7(C-15),172.2(C-1'),43.7(C-2'),25.9(C-3'),22.5(C-4'),22.6(C-5')。
本发明制备得到的化合物achigermalide E为白色无定形粉末，高分辨质谱测得该化合物分子量为345.1676[M+Na]+，紫外光谱在λmax212nm显示有双键的特征吸收峰；红外光谱在3402cm-1处出现羟基的吸收峰，1755cm-1和1733cm-1为两个羰基的特征吸收峰；1HNMR谱(500MHz,CDCl3)据如下:5.17(1H,dd,J＝10.5,6.0Hz,H-3),5.13(1H,dd,J＝12.0,3.0Hz,H-1),4.75(1H,t,J＝9.5Hz,H-6),4.70(1H,d,J＝10.0Hz,H-5),4.12(1H,dd,J＝10.0,3.5Hz,H-9),2.71(1H,p,J＝7.7Hz,H-11),2.55(1H,m,H-2a),2.38(1H,q,J＝7.5Hz,H-2'),2.31(1H,m,H-2b),2.26(1H,m,H-7),1.87(2H,m,H-8),1.72(3H,s,H-15),1.49(3H,s,H-14),1.25(3H,d,J＝8.0Hz,H-13),1.17(6H,t,J＝7.5Hz,H-3')。13C NMR谱(125MHz,CDCl3)数据如下:126.2(C-1),31.5(C-2),78.7(C-3),137.3(C-4),125.9(C-5),79.7(C-6),46.0(C-7),33.8(C-8),79.7(C-9),140.7(C-10),40.8(C-11),179.2(C-12),11.2(C-13),11.1(C-14),12.7(C-15),173.5(C-1'),27.8(C-2'),9.3(C-3')。
以上描述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明制备的吉玛烷倍半萜类化合物经试验，具有通过逆转胰岛素抵抗发挥降糖活性，相关实验资料数据如下：
一、化合物的纯度检测
采用高效液相色谱检测新化合物的纯度。色谱条件如下，色谱柱：ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇/水梯度洗脱(10％→100％)；时间：60min；流速：1.0ml/min；检测波长：210nm、230nm；柱温：25℃；进样量：8μl。经面积归一化法测定，achigermalide D和achigermalide E的纯度分别为99.5％和98.5％。
二、降糖活性实验
(1)化合物achigermalide D和achigermalide E细胞毒活性实验
HepG2细胞以8×103个/ml密度种入96孔板，100μl/孔；24h后，弃去96孔板中培养基，以100ul/孔加入配制好的各浓度药物(50μM)，每个药物浓度设3个复孔，空白组(CON)组换液；在药物作用24h后，弃去96孔板中培养基(移液枪头不要触及孔底)，每孔加入100μlD-PBS，再轻轻吸出，重复一次；每孔加入完全培养基100μl，然后再各加入10μl CCK-8溶液，置于CO2培养箱中，37℃，5％CO2，孵育2h，酶标仪450nm波长测定OD值。通过筛选确定化合物在achigermalide D和achigermalide E在50μM时在HepG2细胞上仍不具有细胞毒，可用于后续后行筛选。
(2)棕榈酸细胞毒活性实验
HepG2细胞以8×103个/ml密度种入96孔板，100μl/孔；24h后弃去96孔板中培养基，以100ul/孔加入配制好的各浓度棕榈酸(0、1、10、100、200、250、350μM)，每个药物浓度设3个复孔，CON组(为空白组)换液；在药物作用24h后进行CCK-8实验测定，操作如(1)。通过筛选确定棕榈酸在最高浓度为200μM时在HepG2细胞上仍不具有细胞毒，可作为诱导建立胰岛素抵抗模型的的浓度。
(3)棕榈酸诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗模型
HepG2细胞以2×105个/ml密度种入96孔板，100μl/孔，待细胞贴壁后，各组均更换为MEM基础培养基进行饥饿处理；6h后，按照分组，以100ul/孔加入配制好的各浓度棕榈酸(0、1、10、100、200、250、350μM)处理细胞，CON组换液处理；24h后，各组更换为基础培养基继续培养；24h后进行后续糖消耗测定实验。吸取培养液，2500rpm，离心10min，取上清备用，按照如下表格内容进行加样孵育及测定：
根据下列公式计算糖消耗：
葡萄糖含量(mM))＝(A样本-A空白)/(A校准-A空白)*C标准；
葡萄糖消耗量(mM)＝培养基葡萄糖含量(mM)-样本葡萄糖含量(mM)；
注：C标准＝5.55mM。
(4)化合物achigermalide D和achigermalide E糖消耗测定
HepG2细胞以2×105个/ml密度种入96孔板，100μl/孔，待细胞贴壁后，各组均更换为MEM基础培养基进行饥饿处理；6h后，按照分组，对模型组及药物组加入100ul的浓度为200μM的棕榈酸，CON组换液处理；24h后，药物组加入对应浓度的药物(1.5625,3.125,6.25,12.5,25,50μM)，阳性对照组为罗格列酮，CON组及模型组换液处理；24h后各组均更换为含1×10-8mol/L的胰岛素的无血清培养基，继续培养；12h后进行后续糖消耗测定实验，方法如(3)，结果如图5所示。
本发明化合物的降糖作用具体体现在：逆转由于2型糖尿病出现的胰岛素抵抗，促进糖的消耗，从而发挥降血糖作用。
实验证明，化合物achigermalide D和achigermalide E可以明显抑制2型糖尿病中出现的胰岛素抵抗现象，促进糖的消耗，具有作为制备新型医用降糖药物的潜在用途。
四、结论
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、目前临床使用的降糖药物主要是列酮类或二甲双胍类等药物。本发明所涉及结构是一类新的吉玛烷倍半萜类化合物，与目前临床使用的降糖药物的骨架类型完全不同。基于此类化合物进一步开发成的专属降糖药物可完全避开现有上市药物专利，为市场提供更多选择。
2、本发明是首次揭示吉玛烷倍半萜的降糖活性，将来可使科学界将目光投入到中药或天然植物中寻找具有降糖活性的先导化合物。
3、本发明拟保护其用途的两个化合物achigermalide D和achigermalide E，均可通过从填完植物中分离得到。全部生产过程无化学污染，绿色环保。
综上所述，本发明从中药蓍草中提取分离得到的两种全新结构的吉玛烷倍半萜类化合物achigermalide D和achigermalide E，实验证明，该类化合物对2型糖尿病出现的胰岛素抵抗可以显著促进葡萄糖的利用，且相对阳性药罗格列酮，achigermalide D在高浓度(50μM)时具有相同的作用效果，同时achigermalide E(1.5625μM)在低浓度时具与阳性药罗格列酮相同的活性。本发明中的achigermalide D和achigermalide E具有临床降糖药物不同的全新吉玛烷骨架结构，且可方便制备成多种药物剂型，方便临床服用。新的吉玛烷倍半萜化合物的发现为研制新型降糖药物提供了新的先导化合物，具有很好的开发应用前景。
Claims (3)
1.一种具有降糖活性的吉玛烷倍半萜类化合物，其特征在于，该化合物是从中药蓍草中分离得到的achigermalide D或achigermalide E，化学结构式分别为：
2.权利要求1所述的具有降糖活性的吉玛烷倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)蓍草地上部分剪切成小段，加入药材6倍量的二氯甲烷溶液，冷浸一周，提取三次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得到浸膏；将所得浸膏用甲醇溶解与聚酰胺填料1:1拌样装载于MCI色谱柱树脂上依次用体积比为10:90、30:70、60:40、80:20、90:10、100:0的甲醇-水溶液系统进行梯度洗脱，收集洗脱液，经薄层色谱分析并合并相似流份，得到6个主流份BM1-BM6；
2)对步骤1)得到的亚流份BM3经Sephadex LH-20柱色谱，以纯甲醇为洗脱剂洗脱，流速为1.0mL/min，收集色带流份，加压浓缩，得到BM3N1-BM3N6；
3)对步骤2)得到的亚流份BM3N4经反相C18色谱柱，以纯甲醇/水为洗脱剂，依次用体积比为10:90、30:70、60:40、80:20、90:10、100:0的溶剂系统进行梯度洗脱，收集洗脱液，经薄层色谱分析并合并相似流份，得到15个主流份BM3N4O1-BM3N4O15；
4)对步骤3)得到流分BM3N4O10用反相制备型HPLC分离纯化，以30-70％乙腈-水梯度洗脱，总时间为50min，流速为3ml/min，在tR为24.1min得到化合物achigermalideD；流分BM3N4O11用反相制备型HPLC分离纯化，以20-65％乙腈-水梯度洗脱，总时间为60min，流速为3ml/min，在tR为50.8min得到化合物achigermalide E。
3.权利要求1所述的具有降糖活性的吉玛烷倍半萜类化合物在制备抗降糖药物中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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