CN102617521A - 具有抗肿瘤活性的γ-丁内酯聚酮类化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是从海洋动物海绵中分离到的具有抗肿瘤活性的γ-丁内酯聚酮类新化合物simplexolides A和B及其制备方法和用途。体外抗肿瘤试验表明，化合物simplexolides A和B对人结肠癌细胞HCT-116和SW480具有明显的抑制活性，因此可用于制备抗肿瘤药物。本发明为研制抗肿瘤药物提供了新的先导化合物，为开发利用我国海洋药用资源提供了科学依据。

Description

具有抗肿瘤活性的γ-丁内酯聚酮类化合物

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种从海洋动物海绵中分离到的具有抗肿瘤活性的γ-丁内酯聚酮类化合物simplexolides A和B及其制备方法和用途。

背景技术

海绵是一种生活在低温、高压、高盐、缺少阳光环境下的低等多细胞动物，常含有许多结构罕见有具有较强生物活性的代谢产物。能够为天然药物的研究提供潜在资源。简易扁板海绵(Plakortis simplex)属寻常海绵纲(Demospongiae)同骨海绵目(Hamosclerophorida)多板海绵科(Plakinidae)海绵。已从该属海绵中分离得到了大量的聚酮类次生代谢产物，其中最具特色的是聚酮类环状过氧化物(Rahm F，Hayes P.Kitching W Metabolites from marine sponges of the genus Plakortis，Heterocycles 2004，64，523-575)。但至今未见从该属海绵中分离到具有抗肿瘤活性的γ-丁内酯聚酮类化合物simplexolides A和B的报道。

发明内容

本发明提供一种从中国南海西沙海域的简易扁板海绵中分离到的新的γ-丁内酯聚酮类化合物，其化学结构式如下：

其立体构型为3S，4S，5E或3S，4R，5Z。

当立体构型为3S，4S，5E时，为化合物simplexolide A，当立体构型为3S，4R，5Z时，为化合物simplexolide B。

化合物simplexolides A和B的制备方法如下：

1.制备简易扁板海绵提取物浸膏

将干燥粉碎后的简易扁板海绵(Plakortis simplex)用甲醇按常规渗漉提取，得提取液，将提取液减压浓缩得提取物浸膏；

2.分离纯化

1)将上述提取物浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别浓缩萃取液，得正己烷提取浸膏、二氯甲烷提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏和正丁醇提取浸膏；

2)将二氯甲烷提取浸膏经减压柱色谱，以二氯甲烷∶甲醇＝50∶1，25∶1，15∶1，5∶1，2∶1，1∶1为溶剂梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份，得到4个组分Fr.1～Fr.4；

3)对组分Fr.1再次进行减压柱色谱，以石油醚∶乙酸乙酯＝50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，3∶1，1∶1为溶剂梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流分，得到4个组分Fr.11～Fr.14；

4)将组分Fr.13反复进行正、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱，再用高效液相纯化，高效液相纯化条件为95％甲醇/水，流速2.0ml/min，得化合物simplexolide A和组分Fr.131；

5)将组分Fr.131进一步用高效液相纯化，高效液相纯化条件为85％乙腈/水，流速2.0ml/min，保留时间66.9min，得到化合物simplexolide B。

经鉴定，化合物simplexolides A和B都为γ-丁内酯聚酮类新化合物。

体外抗肿瘤试验表明，化合物simplexolides A或B对人结肠癌细胞HCT-116均具有抑制活性，因此可用于制备抗肿瘤药物。

本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了新的先导化合物，为开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。

具体实施方式

现结合实施例对本发明作详细描述。

实施例1.制备化合物simplexolides A和B

1.制备简易扁板海绵提取物浸膏

(1)制备提取液：

取干燥粉碎后的简易扁板海绵(Plakortis simplex)2.0kg，分别用15L甲醇渗漉提取4次，每次渗漉3天，合并提取液；

(2)制备提取物浸膏

减压浓缩上述提取液，得到提取物浸膏500g；

2.分离纯化

1)将上述提取物浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别浓缩萃取液，得正己烷提取浸膏105g；二氯甲烷提取浸膏41g；乙酸乙酯提取浸膏1.2g和正丁醇提取浸膏22g；

2)将二氯甲烷提取浸膏经减压柱色谱，以二氯甲烷∶甲醇＝50∶1，25∶1，15∶1，5∶1，2∶1，1∶1为溶剂梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份得到4个组分Fr.1～Fr.4；

3)对组分Fr.1再次进行减压柱色谱，以石油醚∶乙酸乙酯＝50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，3∶1，1∶1为溶剂梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流分得到4个组分Fr.11～Fr.14；

4)将组分Fr.13反复进行正、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱，再用高效液相纯化，高效液相纯化条件为95％甲醇/水，流速2.0ml/min，得化合物simplexolide A 21.7mg和组分Fr.131。

5)将组分Fr.131进一步用高效液相纯化，高效液相纯化条件为85％乙腈/水，流速2.0ml/min，保留时间66.9min，得到化合物simplexolide B 8.3mg。

结构鉴定

按常规经NMR、HRESIMS、CD、IR等多种现代光谱技术，以及运用化学方法Mosher反应确定了simplexolides A和B的化学结构及立体构型，simplexolide A的立体构型为3S，4S，5E，simplexolide B的立体构型为3S，4R，5Z。

simplexolide A：无色油状； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{23}+1(c0.215,\mathrm{MeOH});$ IR(KBr)v_max3451，2960，2927，2873，1763，1655，1464，1412，1378，1343，1290，1248，1210，1182，1119，1103，1090，1071，1014，980，958，926，885，800cm^-1；HRESIMS m/z 305.2094[M+Na]⁺(calcd for C₁₇H₃₀O₃Na，305.2093).CD光谱(c 1.1mg/mL，CH₃CN)，193nm(Δε-0.65)，222nm(Δε0.84).¹H NMR(CDCl₃，600MHz)和¹³C NMR(CDCl₃，150MHz)数据见表1。

simplexolide B：Colorless oil； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{23}+2(c0.120,\mathrm{MeOH});$ IR(KBr)v_max 3439，2962，2930，2874，1758，1655，1460，1400，1379，1341，1280，1250，1208，1165，1111，1063，1023，972，954，916，879，799cm^-1；¹HNMR(CDCl₃，500MHz)and ¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)data，see Table1and 2；HRESIMS m/z 305.2095[M+Na]⁺(calcd for C₁₇H₃₀O₃Na，305.2093).CD spectrum(c 0.5mg/mL，CH₃CN)，196nm(Δε+5.16).¹HNMR(CDCl₃，600MHz)和¹³C NMR(CDCl₃，150MHz)数据见表1。

表1.Simplexolides A和B的¹H和¹³C核磁共振数据表

体外抗肿瘤活性实验

一、实验方法

对本发明的化合物simplexolides A和B进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用常规的MTT法。

1.肿瘤细胞株：HCT-116(人结肠癌细胞)，由上海天甲生物有限公司提供；

2.实验试剂、耗材和仪器：DMSO和MTT(sigma公司)，培养皿、移液管和96孔板(Corning公司)

3.实验用药：化合物simplexolide A和simplexolide B由实施例1制备；

4.细胞培养

按常规将生长于对数生长期的HCT-116细胞经0.01％的胰酶消化，调整细胞密度至2.0×10³个/毫升，以每孔100微升接种于96孔板中，接种两块板，置于5％CO₂培养箱内37℃培养过夜。

5.细胞活力检测实验

每块96孔板设8组，即阳性对照组、阴性对照组，药物的6个浓度组。阳性对照药为阿霉素，用DMSO配制成浓度为0.4克/毫升的溶液，将实验用药物simplexolide A或simplexolide B用DMSO分别配制成浓度为100，50，25，12.5，6.5，3.125(微克/毫升)的药物溶液，分别取不同浓度的药物溶液20微升加入到96孔板对应组的孔中，阴性对照组加入等体积DMSO，阳性对照组加入阿霉素溶液20微升，每一浓度设三复孔，在5％CO₂ 37℃培养箱内培养72小时，再每孔加入20微升的5mg/ml的MTT，继续于37℃孵育3小时，吸去孔中的溶液，再每孔加入100微升的DMSO溶解，使用SpectraMAX 340酶标仪于波长550nm检测光吸收值L1，于参考波长690nm检测光吸收值L2，将光吸收值之差(L1-L2)对抑制剂不同浓度作图，以sigmoidaldose-response(varible slope)为模型拟合，应用软件GraphpadPrism 4计算出IC₅₀，结果见表2。阳性对照药阿霉素对肿瘤细胞株HCT-116的IC₅₀值为0.039μM。

二、实验结果

化合物simplexolides A和B显示有体外细胞毒活性，化合物对肿瘤细胞HCT-116的IC₅₀值见表2。

表2.Simplexolides A和B对肿瘤细胞HCT-116的半数有效抑制浓度(μg/ml)

上述实验结果表明：化合物simplexolides A和B对人结肠癌细胞株具有明显抑制作用，因此可以用于制备抗肿瘤药物。

Claims (3)

1.一种γ-丁内酯聚酮类化合物，其化学结构式如下：

其立体构型为3S，4S，5E或3S，4R，5Z。

2.权利要求1所述化合物的制备方法，步骤如下：

1)制备简易扁板海绵提取物浸膏

将干燥粉碎后的简易扁板海绵用甲醇按常规渗漉提取，得提取液，将提取液减压浓缩得提取物浸膏；

2)分离纯化

(1)将上述提取物浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别浓缩萃取液，得到正己烷提取浸膏、二氯甲烷提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏和正丁醇提取浸膏；

(2)将二氯甲烷提取浸膏经减压柱色谱，以二氯甲烷∶甲醇＝50∶1，25∶1，15∶1，5∶1，2∶1，1∶1为溶剂梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份，得到4个组分Fr.1～Fr.4；

(3)对组分Fr.1再次进行减压柱色谱，以石油醚∶乙酸乙酯＝50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，3∶1，1∶1为溶剂梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流分，得4个组分Fr.11～Fr.14；

(4)将组分Fr.13反复进行正、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱，再用高效液相纯化，高效液相纯化条件为95％甲醇/水，流速2.0ml/min，保留时间17.0min，得化合物simplexolide A和组分Fr.131；

(5)将组分Fr.131进一步用高效液相纯化，高效液相纯化条件为85％乙腈/水，流速2.0ml/min，保留时间66.9min，得化合物simplexolide B。

3.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。