CN118126868A - 一株枯草芽孢杆菌zmf7-2及其在降解多种霉菌毒素、胆固醇上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌ZMF7‑2，该菌株保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20232186。本发明提供的枯草芽孢杆菌ZMF7‑2在短时间内具有优异的呕吐毒素，黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮降解效果。ZMF7‑2处理48h后对浓度为20μg/mL的DON、AFB1和ZEN降解率分别为99.92％、90.69％、87.15％；对胆固醇的降解率达到88.73％。并且，在pH＝2、3、4的培养基中存活率达到38.58％、76.59％、80.52％；在含有0.1％、0.3％、0.5％牛胆盐的培养基中存活率达到127.53％、88.30％、71.20％。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌ZMF7-2及其在降解多种霉菌毒素、胆固醇上的应用。
背景技术
真菌毒素是真菌或霉菌在生长和繁殖过程中产生的次生代谢物，对动物和人类具有慢性或急性毒性作用。现在已经确定了500多种真菌毒素，但最常见的真菌毒素是呕吐毒素(Deoxynivalenol，DON)、黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)，它们广泛分布于饲料和食品中，如肉、蛋、牛奶、玉米、小麦、大米、豌豆、花生、小麦、大麦、坚果、油性饲料及其副产品，对全球食品和饲料安全构成挑战，对畜牧业产生严重威胁和人类健康威胁。然而常用的物理和化学降解方法会造成饲料和食品的营养损失、霉菌毒素的不完全消除、有毒化学溶剂残留和二次污染。因此迫切需要寻找对人类和动物没有负面影响和安全的降解方式来消除饲料和食品中的霉菌毒素。
胆固醇是动物以及人体内的重要物质，广泛存在于多种组织，在肾脏、肝脏等器官中含量较高，大脑和神经组织中最为丰富，在机体内发挥着许多重要的功能，但过量的胆固醇的摄入会导致心脑血管疾病的发生。目前国内外主流治疗的治疗方法是药物治疗，但存在着价格昂贵，且有肌溶解，肝损伤等副作用的危害，因此寻找对人体无害的降胆固醇的方法成为科研人员关注的重点问题。
生物降解尤其是微生物降解被认为是一种有前景的控制真菌毒素策略，因为其对霉菌毒素的特异性降解能力，同时对环境、饲料和食品安全没有危害以及提高动物产品质量具有积极影响，可以避免二次污染。微生物被证明对机体的胆固醇代谢具有重要的影响，同时益生菌也被证明对降低机体内的胆固醇水平有着积极的影响。
但目前报道的大多数菌种停留在单一霉菌毒素的降解能力的研究，缺乏对多种霉菌毒素降解及其造成的危害的研究，同时目前降解胆固醇的益生菌的研究大多停留在乳制品和植物发酵食品中得到的乳杆菌属，对于芽孢杆菌属中筛选得到降解胆固醇的细菌鲜有报道，而且既能降解降解霉菌毒素，又能降解对人体有害的胆固醇的益生菌还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株枯草芽孢杆菌ZMF7-2及其在降解多种霉菌毒素、胆固醇上的应用，用于降解呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1，以及体内胆固醇。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌ZMF7-2(Bacillus subtilis)，该菌株保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2023年11月10日，保藏编号为：CCTCC NO：M20232186。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌ZMF7-2在降解多种霉菌毒素上的应用。
优选的，所述霉菌毒素包括呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌ZMF7-2在降解胆固醇上的应用。
本发明提供的枯草芽孢杆菌ZMF7-2在短时间内具有优异的呕吐毒素，黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮降解效果。在48h后对浓度为20μg/mL的DON、AFB1和ZEN降解率分别为99.92％、90.69％、87.15％；在胆固醇浓度为0.1mg/mL的发酵培养基中，菌株ZMF7-2处理24h，对胆固醇的降解率达到88.73％。此外其在pH＝2的培养基中存活率达到38.58％，在pH＝3的培养基中存活率达到76.59％，在pH＝4的培养基中存活率达到80.52％；在含有0.1％牛胆盐的培养基中存活率达到127.53％，在0.3％牛胆盐的培养基中存活率达到88.30％，在0.5％牛胆盐的培养基中存活率达到71.20％，证明其具有的较强的胃肠道生存能力。
附图说明
图1为实施例1枯草芽孢杆菌ZMF7-2基因系统进化树；
图2为实施例2枯草芽孢杆菌ZMF7-2在AFB1筛选固体培养基、DON筛选固体培养基、ZEN筛选固体培养基上的生长情况；
图3为实施例3枯草芽孢杆菌ZMF7-2在胆固醇特异性选择培养基上的生长情况。
保藏说明
枯草芽孢杆菌ZMF7-2，拉丁文为Bacillus subtilis，该菌株保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2023年11月10日，保藏编号为：CCTCC NO：M 20232186。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
枯草芽孢杆菌ZMF7-2的分离：
(1)称取5g发酵饲料(浙江大学饲料科学研究所和浙江科盛饲料股份有限公司联合生产)，加入50mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中，并使用旋转振荡器(n＝200rpm)混合1h。上清液用PBS稀释(10-1-10-9)后，取10mL上清稀释入到LB培养基，37℃，200r/min培养得到细菌富集液。
(2)富集培养结束后，用无菌水将富集培养基作梯度稀释(10-1-10-9)，将梯度稀释液分别涂布于MRS固体培养基上，在37℃下孵育48h后，待平板长出单菌落后，挑取代表性菌落于含10mL LB液体培养基中进行摇床培养48h得到菌液，用于后续实验。
(3)将步骤(2)的菌液划线于AFB1筛选固体培养基(含有2g/L的香豆素)，恒温培养箱37℃培养72h，待平板长出单菌落后，挑取代表性菌落于含10mL LB液体培养基中进行摇床培养48h后，重复之前步骤划线于AFB1筛选固体培养基(含有3g/L的香豆素)，取代表性菌落于含10mL LB液体培养基中进行摇床培养48h后，再重复之前步骤划线于AFB1筛选固体培养基(含有4g/L的香豆素)，挑取代表性菌落于含10mL LB液体培养基中进行摇床培养48h得到菌液。
(4)将步骤(3)的菌液划线于DON筛选固体培养基(每1L溶液含有2mL的98％氧化苯乙烯)，恒温培养箱37℃培养72h后，挑取代表性菌落接种于10mL LB液体培养基中进行摇床培养48h后，重复之前步骤划线于DON筛选固体培养基(每1L溶液含有3mL的98％氧化苯乙烯)，挑取代表性菌落接种于10mL LB液体培养基中进行摇床培养48h后，重复之前步骤划线于DON筛选固体培养基(每1L溶液含有4mL的98％氧化苯乙烯)，挑取代表性菌落于含10mLLB液体培养基中进行摇床培养48h得到菌液。
(5)将步骤(4)的菌液，划线于ZEN筛选固体培养基(20μg/mL)，恒温培养箱37℃培养72h后，挑取代表性菌落于含10mL LB液体培养基中进行摇床培养48h后，重复之前步骤划线于ZEN筛选固体培养基(30μg/mL)，取代表性菌落于含10mL LB液体培养基中进行摇床培养48h后，再重复之前步骤划线于ZEN筛选固体培养基(40μg/mL)，挑取代表性菌落于含10mLLB液体培养基中进行摇床培养48h得到菌液。
(6)将步骤(5)的菌液，划线于胆固醇特异性选择培养基，以验证其是否具有降解胆固醇的能力，待平板长出单菌落后挑选得到枯草芽孢杆菌ZMF7-2，进行16s rDNA测序用于后续实验。
上述实验所用培养基的制备：
LB培养基的制备方法为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，pH值调节到7.2，加入蒸馏水定容至1L。
MRS固体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉浸粉8g，酵母浸粉4g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温80 1ml，20g琼脂，加入蒸馏水定容至1L。
AFB1筛选固体培养基的制备方法为：香豆素-无水乙醇溶液：配置0.10、0.15、0.20g/mL的香豆素-无水乙醇溶液，加热溶解后使用0.22μm注射器微孔滤膜过滤除菌。
0.25g KH2PO4，1.0g NH4NO3，1.0g CaCl2，0.25g MgSO4·7H2O，1.0mg FeSO4·7H2O，20g琼脂，加入蒸馏水定容至1L，121℃高温灭菌20min后，添加香豆素-无水乙醇溶液20mL。
DON筛选固体培养基的制备方法为：(NH4)2SO42g，KH2PO41.5 g，K2HPO41.5 g，NaCl1.5g，CaCl20.01g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O0.001g，玉米浆0.1g，20g琼脂。pH值调节到6.0，加入蒸馏水定容至1L，121℃高温灭菌20min后，梯度添加2，3，4mL 98％氧化苯乙烯。
ZEN筛选固体培养基的制备方法为：(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，Na2HPO42.44g,K2HPO41.52g，CaCl2·2H2O 0.066g，调pH至6.8，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌冷却后，梯度添加20，30，40mg ZEN，ZEN用无水乙醇溶解，浓度为10，15，20mg/mL，溶解后使用0.22μm注射器微孔滤膜过滤除菌。
胆固醇特异性选择培养基的制备方法为：磷酸二氢钾2.5g，磷酸氢二钾2.0g，牛胆盐0.2g，硫酸镁0.2g，硝酸钠3.0g，硫酸亚铁0.1g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1L。胆固醇用无水乙醇溶解配置成10mg/mL的母液，使用0.22μm注射器微孔滤膜过滤除菌，待培养基冷却至50-60℃时按照1:100比例配置成0.1mg/mL。
菌株鉴定：
16s rDNA鉴定：设计用于扩增菌株ZMF7-216s rDNA序列的一段通用引物：
序列SEQ ID NO.1：27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
序列SEQ ID NO.2：1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
提取菌株ZMF7-2的基因组DNA作为模版，进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序。菌株ZMF7-2的16s rDNA序列如SEQ ID NO.3所示，并将其序列在NCBI数据库中进行对比，确定菌株ZMF7-2为枯草芽孢杆菌。菌株ZMF7-2的基因系统发育进化树如图1所示。
实施例2
菌株ZMF7-2的霉菌毒素降解能力鉴定
取实施例1得到的菌株ZMF7-2，接种于含10mL LB液体培养基中进行摇床培养48h，得到ZMF7-2菌液，将ZMF7-2菌液按照实施例1的方法顺次接种至AFB1筛选固体培养基、DON筛选固体培养基、ZEN筛选固体培养基，检测其对呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素(AFB1)的降解能力。结果如图2所示。
霉菌毒素降解效率测定
取ZEN筛选固体培养基(40μg/mL)平板上的菌落，接种于含10mL LB液体培养基中进行摇床培养48h，得到枯草芽孢杆菌ZMF7-2菌液，将菌液接种于发酵培养基中，37℃，200rpm培养48h后，取1mL菌液用无菌水稀释(10-1-10-8)，涂板于LB培养基上，测定其活菌数，后统一菌液浓度为1ⅹ1010CFU/mL，得到枯草芽孢杆菌ZMF7-2发酵菌液。分别取20μL10mg/mL DON，AFB1，ZEN溶液(使用0.22μm注射器微孔滤膜过滤除菌)，另外加入980μL枯草芽孢杆菌ZMF7-2发酵菌液，混匀(终浓度为20μg/mL)，对照组用未接种的发酵培养基代替。37℃，200rpm培养48h后，8000r/min条件下离心10min，去除菌体，上清液通过酶免呕吐毒素、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮ELISA试剂盒测定霉菌毒素残留量，结果如表1所示。
霉菌毒素降解率＝(对照组霉菌毒素浓度-试验组霉菌毒素浓度)/对照组霉菌毒素浓度ⅹ100％，每个处理三个重复。
发酵培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖3g，牛肉膏4g，氯化钠5g，Na2HPO43g，MgSO4·7H2O 1g，调pH至7.0-7.4，加蒸馏水定容至1L。
由表1可知，在48h后对浓度为20μg/mL的DON,AFB1和ZEN降解率分别为99.92％、90.69％、87.15％。
表1ZMF7-2对霉菌毒素的降解率
实施例3
菌株ZMF7-2的胆固醇降解效率测定
取实施例1得到的菌株ZMF7-2，用平板划线法于胆固醇特异性选择培养基，以验证其是否具有降解胆固醇的能力，结果如图3所示。
取990μL实施例2得到的浓度为1ⅹ1010CFU/mL的枯草芽孢杆菌ZMF7-2发酵菌液，取10μL 10mg/mL胆固醇溶液(使用0.22μm注射器微孔滤膜过滤除菌)，混匀(终浓度为0.1mg/mL)，对照组用未接种的发酵培养基代替。37℃，200rpm培养24h后，8000r/min条件下离心10min，去除菌体，上清液通过艾迪生总胆固醇含量试剂盒微板法测定其降解率，结果如表2所示。
总胆固醇降解率＝(对照组总胆固醇浓度-试验组总胆固醇浓度)/对照组总胆固醇浓度ⅹ100％，每个处理三个重复。
表2ZMF7-2对胆固醇的降解率
实施例4
菌株ZMF7-2耐胆盐能力鉴定
取1mL实施例2得到的浓度为1ⅹ1010CFU/mL枯草芽孢杆菌ZMF7-2发酵菌液，于5000r/min条件下离心5min收集菌体，菌体悬浮于10mL含0.1％、0.3％、0.5％(m/v)牛胆盐的LB液体培养基(对照组为不含牛胆盐的LB液体培养基)中。37℃，200rpm培养3h后，然后菌液用无菌水稀释(10-1-10-7)，采用倾注平板法对样品中的活菌数进行计数，结果如表3所示。倾注后的平板于37℃培养24h。
菌株的耐胆盐能力计算公式为：存活率(％)＝试验组测试样品的活菌数/对照组测试样品的活菌数，每个处理六个重复。
由表3可知，菌株在ZMF7-2在含有0.1％牛胆盐的培养基中存活率达到127.53％，在0.3％牛胆盐的培养基中存活率达到88.30％，在0.5％牛胆盐的培养基中存活率达到71.20％。
表3ZMF7-2的耐胆盐能力
菌株ZMF7-2耐酸能力鉴定
取1mL实施例2得到的浓度为1ⅹ1010CFU/mL的枯草芽孢杆菌ZMF7-2发酵菌液，于5000r/min条件下离心5min收集菌体，菌体悬浮于10mLpH＝2、pH＝3、pH＝4的LB液体培养基(对照组为未进行pH调节的LB液体培养基)中。37℃，200rpm培养3h后，然后菌液用无菌水稀释(10-1-10-7)，采用倾注平板法对样品中的活菌数进行计数，结果如表4所示。倾注后的平板于37℃培养24h。
菌株的耐胆盐能力计算公式为：存活率(％)＝试验组测试样品的活菌数/对照组测试样品的活菌数，每个处理六个重复。
由表4可知，菌株在ZMF7-2在pH＝2的培养基中存活率达到38.58％，在pH＝3的培养基中存活率达到76.59％，在pH＝4的培养基中存活率达到80.52％。
表4ZMF7-2的耐酸能力
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一株枯草芽孢杆菌ZMF7-2(Bacillus subtilis)，该菌株保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2023年11月10日，保藏编号为：CCTCC NO：M 20232186。
2.一种权利要求1所述枯草芽孢杆菌ZMF7-2在降解多种霉菌毒素上的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述霉菌毒素包括呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1。
4.一种权利要求1所述枯草芽孢杆菌ZMF7-2在降解胆固醇上的应用。
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