CN110862944B - 一种地衣芽孢杆菌及其在去除玉米赤霉烯酮中的应用 - Google Patents

一种地衣芽孢杆菌及其在去除玉米赤霉烯酮中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于功能微生物筛选与应用技术领域，提供了一种地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）及其在去除玉米赤霉烯酮中的应用。所述菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2019973，能高效去除常规饲料日粮中的玉米赤霉烯酮毒素，减少毒素对养殖动物的伤害，提高经济效益。

Description

一种地衣芽孢杆菌及其在去除玉米赤霉烯酮中的应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌及其在去除玉米赤霉烯酮中的应用。
背景技术
霉菌毒素是一种天然的生物性污染物，是霉菌在生长繁殖过程中产生的有毒次级代谢产物。霉菌毒素普遍存在于饲料及原料中。被霉菌毒素污染的饲料营养价值降低、适口性下降，如被动物误食后，可引起机体免疫抑制、生产性能下降等，并对肝脏和肾脏造成较大危害。动物饲料中霉菌毒素的污染是一个全球性问题，霉菌毒素既可在作物田间生长时产生也可在仓储期间产生。对畜禽危害较大的主要有玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素和呕吐毒素等，这些霉菌毒素可以污染饲料和动物性食品(奶、肉、蛋)，对动物生产性能和人类健康有极大的危害。近年来，饲料中霉菌毒素超标问题频现，对养殖生产造成巨大的影响。
霉菌毒素的危害引起了业内学者的高度重视，做好饲料原料的防霉和去毒工作是目前防制霉菌及霉菌毒素危害最关键的两个环节。其中，最理想的脱毒方法应是减少霉菌毒素的产生，如在谷物成熟后，低水分含量时进行收割，低温干燥条件下贮存。但是在高温高湿的季节和地区要做到这一点非常困难，而且一些自然灾害(如虫害、鼠害等)也无法避免，因此霉菌毒素对谷物和饲料的污染是不可避免的，必须对被污染的饲料进行脱毒处理，以降低对动物的危害。霉菌毒素的脱毒是指通过物理、化学、微生物学等方法，使饲料中的霉菌毒素得到不同程度的失活或去除，目前霉菌毒素常见的脱毒方法有：1)物理脱毒法，主要是通过物理的方法除掉霉变饲料中的霉菌毒素，从而不影响饲料的营养价值及动物的正常生长。物理脱毒法主要包括吸附法、剔除法、辐射法及溶剂提取法等；2)化学脱毒法，主要是在饲料中添加一些化学物质达到脱毒的作用。主要包括石灰水浸泡法、氨水去毒法、氧化法、浸提法等；3)生物脱毒法，主要有酶去除法、生物去除法、微生物发酵法。生物去除法主要是通过筛选出可以代谢霉菌毒素的微生物，将其加入到饲料中，动物在采食后，在动物肠道复活，对特定霉菌毒素进行代谢去除，以产生无毒的代谢物排出体外。
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，又称F-2毒素，是世界上污染范围最广的一种真菌毒素。玉米赤霉烯酮是一类2，4-二羟基苯甲酸的内酯化合物，酯环开环可使其毒性去除。据报道，粉红黏帚霉(Gliocladium roseum)和解毒毛孢酵母(Trichosporonmycotoxinivorans)可使玉米赤霉烯酮开环生成无毒的非雌激素类化合物。来源于粉红黏帚霉的内酯水解酶(lactonohydrolase)能使玉米赤霉烯酮转化成非雌激素化合物而成为无害的代谢物排出体外。来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)去除玉米赤霉烯酮的解毒酶基因被克隆并成功转化到大肠杆菌中进行表达。
本发明提供了一种去除玉米赤霉烯酮的地衣芽孢杆菌，将有助于提高对玉米赤霉烯酮等霉菌毒素的脱毒效果。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)及其在去除玉米赤霉烯酮中的应用。所述地衣芽孢杆菌能高效去除常规饲料日粮中的玉米赤霉烯酮毒素，减少毒素对养殖动物的伤害，提高经济效益。
本发明一方面提供了一种地衣芽孢杆菌VL-E9(Bacillus licheniformis VL-E9)，已于2019年11月25日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019973。
本发明一方面提供了所述地衣芽孢杆菌在去除玉米赤霉烯酮中的应用。
一种微生物制剂，包含上述地衣芽孢杆菌。
所述微生物制剂中地衣芽孢杆菌的活菌量至少为108CFU/g。
本发明还提供了上述微生物制剂在饲料中的应用。
本发明筛选到的地衣芽孢杆菌VL-E9能高效去除玉米赤霉烯酮毒素；当发酵液添加量为2.0mL时，地衣芽孢杆菌VL-E9发酵液对玉米赤霉烯酮的去除率达到100％，效果显著。地衣芽孢杆菌VL-E9的发酵上清液对玉米赤霉烯酮的去除率仅有13.6％，而发酵液对玉米赤霉烯酮的去除率高达100％。从而说明，地衣芽孢杆菌VL-E9对玉米赤霉烯酮起脱毒作用的应该是菌体细胞本身或者细胞表面的代谢产物。地衣芽孢杆菌VL-E9菌粉可以高效去除受污染粮食中的玉米赤霉烯酮，去除率超过93％，可广泛应用于畜禽饲料中，有效去除饲料日粮中的玉米赤霉烯酮毒素，减轻玉米赤霉烯酮对养殖动物的毒害作用，提高生产性能，增加养殖经济效益。
具体实施方式
本发明实施例中选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
ZEN标准品购自Sigma公司；其余所用的实验材料，如无特殊说明，均可选购自市售任意一种；
LB液体培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，去离子水定容至1L，调节pH至7.0；
LB固体培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，16g琼脂粉，去离子水定容至1L，调节pH至7.0；
实施例1菌株的分离筛选与鉴定
1、菌株初筛
将从青岛平度市采集到的土壤、猪粪、玉米秸秆等样品精准称取10g，放入盛有90ml灭菌生理盐水的250mL三角烧瓶中，37℃，150r/min震荡培养2h，抽取1mL上清液转移至50mL LB培养基中，37℃，150r/min培养18h，进行第一次富集培养，以相同的方法富集培养三次。
取培养好的上述菌液，抽取1mL置于9mL的无菌生理盐水中，混匀，依次将菌液进行梯度稀释，然后从不同梯度的稀释液中抽取100uL涂布于ZEN初筛平板培养基(硝酸铵0.05％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.15％，氯化钠0.1％，七水硫酸镁0.002％，玉米赤霉烯酮0.2％，琼脂粉2％，调pH至7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min)上，37℃培养5-7d，每个稀释梯度三个平行。将长出的单菌落分别在新的初筛培养基平板上划线，重复三次划线后，将得到的纯化菌落接种于斜面培养基保存菌株。
采用上述筛选分离方法，申请人共获得12株能够在ZEN初筛平板上生长的菌株，分别为1-B1，2-A3，1-A10，2-B1，1-E9，1-B10，2-H1，2-A2，1-H7，2-C9，1-B8，2-D2。2、具有ZEN去除作用的菌株的复筛
将初筛得到的12株菌分别接种于5mL LB培养基中，37℃，220r/min震荡培养16h，然后以0.5％的接种量接种于50mL LB培养基中，37℃，220r/min震荡培养16h。培养结束后，抽取400uL发酵液于96孔板中，加入50ul的4.5mg/L的ZEN标准品，使毒素终浓度为0.5ppm。以无菌LB培养基400uL加50ul的4.5mg/L ZEN标准品为空白对照，37℃，220r/min震荡培养6h，离心取上清，按照GB/T 2876-2012的方法测定ZEN含量。分别计算各菌株对ZEN的去除率，具体结果见表1。
ZEN去除率(％)＝(X1-X2)/X1；
其中X1为空白对照中ZEN的含量，X2为样品中ZEN的含量。
表1不同菌株对玉米赤霉烯酮的去除效果
Figure BDA0002295746910000041
从表1的结果可知，本发明筛选到的12株菌中1-E9菌株对玉米赤霉烯酮的去除效果最好，达到了100％，远远高于其余的11株菌，效果极其显著。
3、VL-E9菌株的鉴定
对1-E9菌株进行分子生物学鉴定，测得其16S rDNA序列，并在GenBank核酸数据库中进行Blast比对。结合1-E9菌株的生物学特性和16S rDNA比对结果，申请人确认1-E9菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，命名为地衣芽孢杆菌VL-E9(Bacilluslicheniformis VL-E9)。
申请人已于2019年11月25日将上述地衣芽孢杆菌VL-E9(Bacilluslicheniformis VL-E9)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019973。
实施例2地衣芽孢杆菌VL-E9在去除玉米赤霉烯酮中的应用
1、发酵液制备
将地衣芽孢杆菌VL-E9接种于LB培养基中，37℃，220r/min培养24h，得到活菌含量约为107CFU/mL的发酵液。
将发酵液在4℃条件下，5000rpm，离心10mim，得到发酵上清液。
2、地衣芽孢杆菌VL-E9对玉米赤霉烯酮的去除效果分析
分别取地衣芽孢杆菌VL-E9发酵液2mL和发酵上清液2mL，各添加ZEN毒素至1ppm，30℃，220r/min震荡培养6h，培养结束后，5000rpm离心10mim，取上清，进行ZEN含量的测定，结果如表2所示。
表2地衣芽孢杆菌VL-E9发酵上清液和发酵液对ZEN的去除效果
Figure BDA0002295746910000051
从表2的结果可知，本发明提供的地衣芽孢杆菌VL-E9的发酵上清液对玉米赤霉烯酮的去除率仅有13.6％，而发酵液对玉米赤霉烯酮的去除率高达100％。从而说明，地衣芽孢杆菌VL-E9对玉米赤霉烯酮起主要作用的应该是菌体细胞本身或者细胞表面的代谢产物。
3、菌液添加量对ZEN的去除效果
分别取0.1mL、0.5mL、1.0mL和2.0mL地衣芽孢杆菌VL-E9发酵液进行ZEN去除率的测定，其中ZEN毒素添加量为5ppm，反应总体积为2.0mL，不足2.0mL的用LB培养基补足，30℃，220r/min震荡培养6h，培养结束后离心取上清进行ZEN含量的测定，计算ZEN去除率。具体结果如表3所示。
表3地衣芽孢杆菌VL-E9发酵液添加量对ZEN去除率的影响
Figure BDA0002295746910000052
从表3的结果可以看出，随着添加量的增加，本发明提供的地衣芽孢杆菌VL-E9发酵液对ZEN的去除效果也逐渐加强，当发酵液添加量为2.0mL时，地衣芽孢杆菌VL-E9发酵液对ZEN的去除率达到100％，效果显著。
实施例3地衣芽孢杆菌VL-E9菌粉制备
1、种子液制备：挑取地衣芽孢杆菌VL-E9单菌落，接种于LB培养基中，pH为7.0±0.5，37℃，200rpm振荡培养24h，即为种子液；
2、发酵培养：以5％的接种量将种子液接种至3吨发酵罐中进行液体发酵，当镜检芽孢率达到90％以上时停止发酵；
3、5000rpm离心10min，去除发酵上清液，将菌泥进行喷雾干燥，制得活菌量为108CFU/g的菌粉。
实施例4地衣芽孢杆菌VL-E9菌粉对粮食中玉米赤霉烯酮的去除效果
1、玉米
将实施例3制得的菌粉10g与1kg受玉米赤霉烯酮污染的玉米(所述玉米中ZEN的浓度为61ppm)充分混合；向混合物中加入1L蒸馏水，室温处理6h后，通过高效液相色谱检测其中ZEN含量，计算ZEN的去除率为96.2％。
2、小麦
将实施例3制得的菌粉8g与1kg受玉米赤霉烯酮污染的小麦(所述小麦中ZEN的浓度为53ppm)充分混合；向混合物中加入1L蒸馏水，室温处理6h后，通过高效液相色谱检测其中ZEN含量，计算ZEN的去除率为93.1％。
3、高粱
将实施例3制得的菌粉10g与1kg受玉米赤霉烯酮污染的高粱(所述高粱中ZEN的浓度为68ppm)充分混合；向混合物中加入1L蒸馏水，室温处理6h后，通过高效液相色谱检测其中ZEN含量，计算ZEN的去除率为93.8％。
上述结果表明，本发明提供的地衣芽孢杆菌VL-E9菌粉能高效去除受污染粮食中的玉米赤霉烯酮，效果非常显著。
实施例5地衣芽孢杆菌VL-E9菌粉对蛋鸡生产性能的影响
1、研究对象
27周龄的海兰褐蛋鸡，处于产蛋高峰期，产蛋率较为稳定。
2、研究方法
选用500只27周龄海兰褐蛋鸡，随机分为5组，每组10个重复，每个重复10只鸡。A组为对照组，饲喂基础饲粮，饲粮中未检测出ZEN，B、C、D和E组日粮具体见表4。预试期7天，正试期35天。试验预试期统计各组产蛋率，并根据统计结果进行调整，以使各组在试验正试期开始时的产蛋率差异不显著。每天记录各组采食量、产蛋数，计算产蛋率和料蛋比，具体结果见表5。
表4各实验组饲喂的日粮
Figure BDA0002295746910000061
Figure BDA0002295746910000071
3、结果分析
表5各处理组生产性能结果
Figure BDA0002295746910000072
从表5的数据可以看出，与对照组A组相比，饲喂含ZEN日粮的B、C、D组蛋鸡的产蛋率明显下降，料蛋比显著提高，从而说明，ZEN对于蛋鸡的生产性能产生了明显的不利影响。而与D组相比，在ZEN添加量相同的情况下，E组通过饲喂本发明提供的地衣芽孢杆菌VL-E9菌粉，蛋鸡的产蛋率和平均单重比D组分别提高了1.8％和2.8％，与对照组相当；料蛋比比D组下降了3.3％，比对照组下降了1.0％。
上述结果表明，本发明提供的地衣芽孢杆菌VL-E9菌粉能有效去除日粮中的玉米赤霉烯酮毒素，不但能减轻玉米赤霉烯酮对蛋鸡的毒害作用，还有助于提高蛋鸡的生产性能。
4、经济效益分析
从表5中可以看出：在高毒素日龄中添加本发明提供的地衣芽孢杆菌VL-E9菌粉能够显著降低料蛋比。以1万只蛋鸡场为例，每提高1克平均蛋重，月收益提高2500元，每降低0.01料蛋比，每月增收700元，在高剂量毒素组添加VL-E9菌粉能够月均收益提高3200元。

Claims (5)

1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌VL-E9（Bacillus licheniformis VL-E9），已于2019年11月25日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019973。
2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在去除玉米赤霉烯酮中的应用。
3.一种微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌。
4.如权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂中地衣芽孢杆菌的活菌量至少为108CFU/g。
5.权利要求3或4所述的微生物制剂在制备饲料中的应用，其特征在于，所述的应用为去除饲料中的玉米赤霉烯酮。
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